專利名稱：肝癌組織特異性粘附肽、體內(nèi)外結(jié)合篩選方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤導(dǎo)向治療中的導(dǎo)向肽、該導(dǎo)向肽的篩選方法，以及該導(dǎo)向肽的應(yīng)用，尤其是涉及一種能特異性結(jié)合肝癌組織/細(xì)胞的粘附肽、該粘附肽的篩選方法以及該粘附肽的應(yīng)用，屬于分子藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝癌作為一種最常見(jiàn)的惡性腫瘤對(duì)人類健康造成了極大的威脅，據(jù)估計(jì)，全世界每年死于肝癌的患者達(dá)125萬(wàn)。目前用于肝癌治療的方法主要有手術(shù)療法、放射療法和化學(xué)療法等，但這些方法對(duì)人體的健康組織和器官都存在不同程度副作用。
導(dǎo)向治療技術(shù)為腫瘤的治療開(kāi)辟了廣闊的前景。腫瘤導(dǎo)向治療是指應(yīng)用針對(duì)腫瘤特異性或相關(guān)抗原的單克隆抗體與殺傷腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)如化療藥物、毒素、放射性核素等相偶聯(lián)，將活性物質(zhì)選擇性地運(yùn)送到腫瘤部位，定向殺傷腫瘤細(xì)胞的方法。腫瘤導(dǎo)向治療作為近年來(lái)興起的第四種腫瘤療法即生物治療法中的重要組成部分而受到了人們很大的重視。
關(guān)于利用噬菌體肽庫(kù)技術(shù)對(duì)腫瘤組織特異性粘附肽的篩選，1996年P(guān)asqualinii和Ruoslahti首先在Nature上報(bào)道了該方法，并且利用該方法篩選出了特異結(jié)合腦和腎的噬菌體結(jié)合肽。1997年他們成功篩選到一條對(duì)惡性黑素瘤和乳腺癌組織上的αv整合素特異性親和的包含RGD的短肽，其與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性較與腦和腎正常組織結(jié)合高20倍以上；到目前為止，人們已發(fā)現(xiàn)多條特異性親和人腫瘤血管的短肽，如RGD_4C，CNGRC，GSL，SMSIARL，CPGPEGAGC等，前述的兩條短肽已在動(dòng)物身上進(jìn)行了抗腫瘤活性測(cè)定，抗癌效果良好。
在導(dǎo)向治療中非常關(guān)鍵的在于如何篩選得到具有很強(qiáng)特異性的導(dǎo)向肽，目前噬菌體肽庫(kù)技術(shù)是一種比較有效的篩選方法。噬菌體肽庫(kù)技術(shù)自20世紀(jì)90年代誕生以來(lái)給探索生物大分子間相互作用的結(jié)合位點(diǎn)、尋找高親和力生物活性的配體分子以及給藥物篩選、新型診斷試劑和疫苗等領(lǐng)域的研究帶來(lái)了革命，其最大優(yōu)點(diǎn)就是無(wú)需知道蛋白質(zhì)的任何性質(zhì)，就可篩選到特異性的結(jié)合肽，因而方法方便快速有效。目前用噬菌體肽庫(kù)技術(shù)篩選導(dǎo)向肽分為體內(nèi)篩選和體外篩選兩種。體內(nèi)篩選法尤其在篩選組織或腫瘤組織特異性結(jié)合肽時(shí)有其明顯的優(yōu)越性其一，噬菌體肽庫(kù)進(jìn)入機(jī)體的血液系統(tǒng)，在血液循環(huán)過(guò)程中可以去除大量與靶組織無(wú)關(guān)的噬菌體肽，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)操作后可以得到所需的組織或腫瘤特異性結(jié)合肽，其原理是不同的組織都有其特異細(xì)胞膜標(biāo)志，如淋巴細(xì)胞的歸巢、腫瘤細(xì)胞定向轉(zhuǎn)移等；其二，在體內(nèi)篩選到的是自然狀態(tài)下的組織或腫瘤特異性結(jié)合肽，這在診斷和導(dǎo)向治療中更有使用價(jià)值；其三，用體內(nèi)篩選法經(jīng)常能篩選到與腫瘤新生血管特異性結(jié)合的多肽，而腫瘤新生血管壁上存在著正常血管所沒(méi)有或很少有的粘附分子，這些分子與腫瘤抗原相比其異質(zhì)性和調(diào)變要少得多，也無(wú)需克服腫瘤的生物屏障，因此作為導(dǎo)向治療的“彈頭”有更多的優(yōu)越性。但體內(nèi)篩選法明顯的缺陷在于在篩選和鑒定方面都比體外篩選法來(lái)得麻煩和困難，因此大多數(shù)報(bào)道還是采用細(xì)胞的體外篩選法。但是體外篩選雖然篩選和鑒定都較體內(nèi)篩選簡(jiǎn)單，其缺點(diǎn)也是很明顯的，因?yàn)轶w外培養(yǎng)的細(xì)胞所處的環(huán)境與體內(nèi)差異較大，因此無(wú)法準(zhǔn)確判斷篩選出的導(dǎo)向肽的特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能特異性結(jié)合肝癌組織/細(xì)胞粘附肽；本發(fā)明的另一目的在于提供該肝癌組織/細(xì)胞粘附肽的體內(nèi)外結(jié)合篩選方法；本發(fā)明的目的還在于提供該肝癌組織/細(xì)胞粘附肽的用途。
本發(fā)明提供的肝癌組織/細(xì)胞粘附肽，其多肽序列為序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH為得到上述肝癌組織/細(xì)胞粘附肽，本發(fā)明采取體內(nèi)外結(jié)合的篩選方法，具體包括以下步驟第一步將正常肝細(xì)胞株加入噬菌體肽庫(kù)中，回收不與正常肝細(xì)胞結(jié)合的噬菌體肽，進(jìn)行擴(kuò)增；第二步將回收的不與正常肝細(xì)胞結(jié)合的噬菌體肽注射到荷瘤鼠體內(nèi)，這些噬菌體經(jīng)過(guò)血液循環(huán)后含有肝癌組織特異性肽的噬菌體會(huì)吸附到癌細(xì)胞或被癌細(xì)胞內(nèi)吞，從肝癌組織回收噬菌體肽，感染大腸桿菌K91Kan感受態(tài)細(xì)胞，然后將該噬菌體擴(kuò)增后純化；第三步將第二步經(jīng)過(guò)擴(kuò)增和純化的噬菌體注射到新的荷瘤鼠體內(nèi)，重復(fù)第二步，從肝癌組織回收得到更多與肝癌組織結(jié)合特異性強(qiáng)、親和力高的噬菌體多肽。
第四步篩選得到的噬菌體單克隆化，用細(xì)胞ELISA方法對(duì)單克隆的噬菌體進(jìn)行鑒定，以正常肝細(xì)胞作為陰性對(duì)照，選擇結(jié)合系數(shù)大的克隆為與腫瘤細(xì)胞結(jié)合特異性好的陽(yáng)性克隆。
在第四步中克隆的特異性結(jié)合系數(shù)是指噬菌體肽與腫瘤細(xì)胞結(jié)合得OD490值除以同樣條件下與正常細(xì)胞結(jié)合的OD490的百分比。
本發(fā)明還可以在第三步結(jié)束后，再進(jìn)行一到兩次和第三步一樣的體內(nèi)篩選過(guò)程，以回收得到更多與肝癌組織結(jié)合特異性強(qiáng)、親和力高的噬菌體多肽。
篩選結(jié)束后為進(jìn)一步證明篩選得到的粘附肽的導(dǎo)向效果，可以用免疫熒光等方法來(lái)驗(yàn)證，證明篩選得到的陽(yáng)性克隆的多肽能有效地導(dǎo)向肝癌組織。同時(shí)再將得到的陽(yáng)性克隆的噬菌體純化后回輸?shù)胶闪雎闶篌w內(nèi)，用免疫組化的方法來(lái)測(cè)定其組織分布特異性，驗(yàn)證其導(dǎo)向效果。并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了序列分析，從而可以得到該多肽的序列。
本發(fā)明還提供序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH和序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH的肝癌組織/細(xì)胞特異性粘附肽在制備肝癌的導(dǎo)向藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的肝癌組織/細(xì)胞粘附肽導(dǎo)向效果好，組織分布特異性強(qiáng)，是一個(gè)很好的肝癌導(dǎo)向治療中的粘附肽，具有較廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明提供的體內(nèi)外結(jié)合的肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法比體內(nèi)篩選方法和體外篩選方法都具有明顯的優(yōu)勢(shì)因?yàn)槠渲薪?jīng)過(guò)體內(nèi)篩選的步驟，所以篩選出的粘附肽與體內(nèi)環(huán)境更相吻合，從而克服了單純體外篩選的缺點(diǎn)；另外由于在篩選的后期采用的是體外篩選的方法，所以克服了體內(nèi)篩選時(shí)鑒定困難的缺點(diǎn)，鑒定起來(lái)比較簡(jiǎn)單。最后通過(guò)回輸荷瘤鼠體內(nèi)進(jìn)一步鑒定粘附肽的結(jié)合特異性，彌補(bǔ)了體外篩選的缺陷，所以可以明顯看出本發(fā)明克服了單純體內(nèi)和單純體外篩選方法的缺陷，而同時(shí)兼有了兩者的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
在說(shuō)明具體實(shí)施方式
前，先對(duì)本發(fā)明要用到的材料和試劑以及試劑的配置進(jìn)行簡(jiǎn)單的說(shuō)明試驗(yàn)材料與試劑(一)試劑1.噬菌體隨機(jī)15-肽文庫(kù)(多樣性為108)、K91Kan由美國(guó)密蘇里大學(xué)G.P.Smith教授惠贈(zèng)，因?yàn)镚.P.Smith教授長(zhǎng)期以來(lái)一直無(wú)償提供這兩種試劑，這在業(yè)內(nèi)是眾所諸知的，所以任何人都可以在需要的時(shí)候得到這兩種試劑。
2.人肝臟細(xì)胞株L-02、人肝癌細(xì)胞株BEL-7402購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)3.兔抗噬菌體M13抗血清、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗M13單克隆抗體購(gòu)自瑞典Pharmacia公司。
4.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(HRP-羊抗兔IgG)、異硫氰酸熒光黃(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、碘化丙錠(PI)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)等購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司5.硝酸纖維薄膜(NC膜)(美國(guó)進(jìn)口分裝)
6.酵母提取物Yeast Extract、蛋白胨Bacto-Tyrptone購(gòu)自英國(guó)OXOID公司7.RPMI-1640干粉劑、新生小牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司8.二甲基亞砜購(gòu)自德國(guó)SERVA公司9.胰蛋白酶由Difco進(jìn)口分裝(二)試劑的配制培養(yǎng)基1、噬菌體擴(kuò)增培養(yǎng)基(1)大腸桿菌K91Kan液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L、酵母粉(Yeast Extract) 5g/LNaCl 10g/L、加入適量的dH2O充分溶解后，用1N的NaOH將pH值調(diào)到7.0-7.5之間，最后用dH2O定容至1L，分裝后高壓滅菌。
(2)LB固體培養(yǎng)基上述分裝好的液體培養(yǎng)基加入1.5％的瓊脂糖后再進(jìn)行高壓滅菌即可(3)高營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基(terrific broth，TB)a、K-PBS(0.17M KH2PO4-0.72M K2HPO4)KH2PO4(anhydrous) 2.31g；K2HPO4(anhydrous)12.54g；dH2O加至100ml，高壓滅菌。
b、TB培養(yǎng)基蛋白胨(Bacto-Tryptone)12g；酵母粉(Yeast Extract)24g；甘油(Glycerol)4ml；dH2O加至900ml，高壓滅菌。
使用前a∶b以1∶9混勻(4)選擇培養(yǎng)基將高壓滅菌后的LB固體培養(yǎng)基加熱完全溶解，待到冷卻至50℃左右時(shí)加入所需的抗生素，小心搖動(dòng)三角燒瓶充分混勻，注意掌握時(shí)間在培養(yǎng)基凝固之前澆制平板。保存條件含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基應(yīng)保存在4℃，卡那霉素的有效期為7天，四環(huán)素的為5天2、細(xì)胞培養(yǎng)基1640培養(yǎng)基(1)RPMI1640培養(yǎng)基a、基本培養(yǎng)基800ml的三蒸水中加入RPMI-1640干粉劑溶解，加入2gNaHCO3，溶解后定容至1000ml。5％NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0，0.22um過(guò)濾除菌，-20℃保存。
b、培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基90％；56℃滅活30min的新生小牛血清10％；雙抗100IU/ml，用時(shí)配制，4℃?zhèn)溆谩?br> (2)D-hank’s母液(10×)NaCl 10g、KCl 0.4g、KH2PO40.06g、Na2HPO40.12g、ddH2O 100ml，配好后，用5％NaHCO3調(diào)pH至7.0左右，高壓滅菌，4℃保存。(3)胰蛋白酶消化液稱250mg胰蛋白酶(1∶250，Difco進(jìn)口分裝)粉末于燒杯中，先用加入D-Hanks液至100ml，攪拌均勻，置室溫4hr或4℃過(guò)夜，經(jīng)常振搖使其完全溶解；用0.22um的微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝每只1ml，-20℃保存，臨用前解凍。
(4)雙抗高溫高壓滅菌D-Hanks液，用5ml無(wú)菌D-Hanks溶解80萬(wàn)單位的青霉素鈉，吸取5ml；另用5ml無(wú)菌D-Hanks溶解100萬(wàn)單位的硫酸鏈霉素，吸取4ml，補(bǔ)充無(wú)菌D-Hanks至80ml，-20℃保存。
(5)細(xì)胞凍存液基本培養(yǎng)基70％、小牛血清20％、二甲基亞砜(DMSO)10％；抗生素的配制1、卡那霉素儲(chǔ)備液的配制卡那霉素(kanamycin)1000×用ddH2O溶解100mg/ml，-20℃保存2、四環(huán)素儲(chǔ)備液的配制四環(huán)素(tetracycline)1000×用50％甘油溶解40mg/ml，-20℃避光保存PEG-NaClPEG8000，100g；NaCl，116.9g；dH2O，475ml；于1L的燒杯中攪拌溶解(可以加熱至65℃)，高壓滅菌，終體積應(yīng)為600ml，4℃避光保存洗板液1、pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)10×NaCl 80g、KH2PO42g、Na2HPO4·12H2O29g、KCL 2g，dH2O定容至1000ml2、洗板液apH7.4 PBS 0.05％，Tween 20(PBST05)；Tween 20 0.5ml1×PBS加至 1000ml3、洗板液bpH7.4 PBS 0.5％，Tween 20(PBST05)Tween 20 5ml1×PBS加至 1000ml封阻液PBST05-3％BSA，同時(shí)也是酶標(biāo)抗體的稀釋液TBS1M Tris-HCl pH7.5，5ml；NaCl，0.9g；dH2O加至100ml，高壓滅菌OPD(鄰苯二胺)底物顯色液1、OPD底物緩沖液(PCS)檸檬酸4.66g、Na2HPO4·12H2O，18.4g；dH2O加至1000ml，于4℃保存2、OPD底物顯色液PCS9ml、30％過(guò)氧化氫10ul、OPD4mg酶終止液2M H2SO4DAB底物顯色液10mM Tris-HCl pH7.5，9ml；30％過(guò)氧化氫10ul；DAB6mg；30％NiCl，100ul篩選前期的準(zhǔn)備工作1.肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞BEL-7402；正常肝細(xì)胞L-02均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞在含1％雙抗、10％小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，以37℃，5％CO2傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)采用0.25％胰蛋白酶消化，于-70℃冰箱中冷凍保存。
2.荷瘤裸鼠動(dòng)物模型的建立及飼養(yǎng)與中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心合作完成肝癌細(xì)胞株BEL-7402荷瘤裸鼠動(dòng)物模型的建立。方法是采用2周齡裸鼠，腋下注射200μl約106個(gè)腫瘤細(xì)胞BEL-7402。4-6周后選用腫瘤直徑達(dá)到1cm左右的荷瘤裸鼠進(jìn)行體內(nèi)篩選或體內(nèi)鑒定。
本發(fā)明的噬菌體的擴(kuò)增及效價(jià)測(cè)定采用如下方法在含有卡那霉素(100μg/ml)的LB中過(guò)夜培養(yǎng)(37℃ 270rpm)大腸桿菌K91Kan，次日110轉(zhuǎn)入10ml TB培養(yǎng)基中繼續(xù)震蕩培養(yǎng)2小時(shí)45分鐘37℃震蕩(100rpm)培養(yǎng)10--15分鐘，即為感受態(tài)細(xì)胞。
將待擴(kuò)增噬菌體加入到感受態(tài)細(xì)胞中，37℃震蕩(100rpm)培養(yǎng)15分鐘，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入100ml LB-0.02Tet(0.02％四環(huán)素)中37℃震蕩(270rpm)培養(yǎng)30分鐘，加入100ul四環(huán)素(20mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
培養(yǎng)物于4℃8000rpm離心15分鐘，取上清夜加入15％PEG-NaCl充分混合并置于4℃下沉淀過(guò)夜；沉淀過(guò)夜后溶液于4℃ 10000rpm離心20min，棄上清，加入TBS 1ml充分溶解，4℃ 10000rpm離心10min除去剩余的菌體，將上清夜轉(zhuǎn)入到另一干凈的小離心管中，加入200μl PEG-NaCl后充分混合，4℃沉淀1小時(shí)，4℃ 10000rpm離心后200μl TBS溶液溶解，60℃水浴中恒溫20min。加入0.7％二甲基亞砜與0.02％疊氮化鈉-70℃保存。
噬菌體效價(jià)測(cè)定取大腸桿菌K91Kan感受態(tài)細(xì)胞10ul于15-ml指管中并與10ul一定稀釋度(10-x)的噬菌體溶液混合，室溫保持10分鐘；加入1ml LB-0.02Tet液體培養(yǎng)基，37℃震蕩(270rpm)培養(yǎng)30分鐘；取100ul培養(yǎng)液涂平板(Kan100-Tet40 LB固體培養(yǎng)基平板)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；對(duì)培養(yǎng)皿中的菌落進(jìn)行記數(shù)(y)，效價(jià)＝y(tǒng)×10x×103TU/ml，(其中10x代表稀釋度。y代表平板上藍(lán)斑數(shù)目)下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明具體的篩選步驟1、噬菌體體外反向吸收正常肝細(xì)胞與噬菌體15肽庫(kù)共同37℃孵育1小時(shí)，離心，取上清，擴(kuò)增、純化噬菌體，用于下一步荷瘤裸鼠體內(nèi)篩選。
2、噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)的活體篩選挑選腫瘤直徑1cm見(jiàn)方的荷瘤裸鼠用乙醚麻醉后，將1010的噬菌體肽庫(kù)靜脈注射入荷瘤裸鼠體內(nèi)，這些噬菌體經(jīng)過(guò)血液循環(huán)后，含肝癌細(xì)胞特異性肽的噬菌體將會(huì)吸附與肝癌細(xì)胞上或被癌細(xì)胞內(nèi)吞，5分鐘后先用10ml的DMEM、后用100ml生理鹽水對(duì)小鼠進(jìn)行心臟灌流，盡量洗去血液，以便以后組織切片的觀察，減少背景。取出小鼠的主要器官和一部分腫瘤組織，浸入3％的甲醛中，以備組織切片用。剩下的腫瘤組織用PBS洗三次，研磨后，感染大腸桿菌，37℃230rpm振蕩1小時(shí)，取100ul測(cè)效價(jià)。其余的繼續(xù)搖24小時(shí)。
3、擴(kuò)增純化后噬菌體進(jìn)入第二輪篩選，重復(fù)步驟2。
4、噬菌體的單克隆化將第三次篩選得到的噬菌體感染大腸桿菌K91Kan所形成的單菌落投入已放有1ml LB-Kan100-Tet40液體培養(yǎng)基的15ml-指管中，37℃震蕩(×270rpm)培養(yǎng)24小時(shí)；離心除去菌體，取上清液，測(cè)效價(jià)后保存并測(cè)序。
5、用細(xì)胞ELISA方法對(duì)得到的單克隆化的噬菌體進(jìn)行鑒定篩選把體外培養(yǎng)的BEL-7402人肝癌細(xì)胞和L-02人正常肝細(xì)胞分別消化下來(lái)，記數(shù)后制成相同濃度的細(xì)胞懸液。分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使培養(yǎng)板上下各兩個(gè)孔分別對(duì)應(yīng)相同濃度的肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞。
(1)細(xì)胞板每孔加100ul細(xì)胞懸濁液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。
(2)固定每孔加入100ul 3％多聚甲醛固定，1hr后用PBST-05、PBST-5分別洗板3次，(3)封阻每孔加封阻液(PBST05-3％BSA)100ul，37℃封阻1hr，同上洗板(4)每孔加噬菌體單克隆100ul，并留一孔不加噬菌體作空白對(duì)照。在37℃溫育1hr，同上洗板(5)每孔加噬菌體M13抗血清100ul，37℃度溫育2hr，洗板(6)每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG100ul，37℃溫育1hr。洗板(7)每孔加OPD底物顯色液，振蕩顯色(8)每孔加酶終止液(2M H2SO4)，(9)終止顯色(10)細(xì)胞板離心，將每孔中的上清顯色液以在細(xì)胞板上同樣位置轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)讀數(shù)。
按下列公式計(jì)算每個(gè)克隆的特異結(jié)合系數(shù) 每個(gè)孔的OD值讀數(shù)均為為某噬菌體單克隆在肝癌細(xì)胞孔中或在正常肝細(xì)胞孔中的讀數(shù)的均值6、免疫組織化學(xué)鑒定(1)取出浸在3％多聚甲醛中的樣品，自然干燥后，切片，然后將切片貼到玻片上，晾干，丙酮固定5min，PBST洗3次，每次3min。
(2)1％過(guò)氧化氫甲醇混合液室溫浸泡30min，PBST洗3次，每次5min。
(3)5％脫脂奶粉室溫封阻20min，加入按1∶1000稀釋的噬菌體M13抗血清，37℃濕盒中溫育1hr，PBST洗3次，每次5min。
(4)加入1∶300稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃濕盒中溫育1hr，PBST洗3次，每次5min，(5)DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)(約12min)，用流水終止反應(yīng)(6)蘇木青復(fù)染核約3min，自來(lái)水沖洗，加飽和碳酸鋰分色，用酒精逐級(jí)脫水，二甲苯3min透明，最后用中性樹(shù)脂封片觀察。
7、熒光免疫細(xì)胞鑒定(1)把體外培養(yǎng)的BEL-7402人肝癌細(xì)胞和L-02人正常肝細(xì)胞分別用胰酶消化，把兩種細(xì)胞制成相同濃度的懸液，分裝于小離心管(2)每管加1ml 3％多聚甲醛固定30min，用PBST洗3次(3)每管加1ml PBST05-3％BSA，37℃封阻1hr，加入PBST洗3次(4)加入噬菌體，37℃溫育1hr。用PBST洗3次(5)加噬菌體M13抗血清37℃溫育2hr。用PBST洗3次(6)每孔加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG和PI，振蕩，冰育15min。
(7)取一滴緩沖甘油溶液滴片，熒光顯微鏡鏡檢，拍照。
8、體內(nèi)鑒定取噬菌體肽擴(kuò)增測(cè)得效價(jià)為1.26×1011。通過(guò)荷瘤裸鼠的尾靜脈注射回輸?shù)铰闶篌w內(nèi)，經(jīng)5分鐘的體內(nèi)循環(huán)后，對(duì)裸鼠進(jìn)行心臟灌流，隨后取其心、腦、肝及肝癌組織進(jìn)行組織冰凍切片，行免疫組織化學(xué)觀察。
通過(guò)兩輪的體內(nèi)篩選得到目標(biāo)噬菌體。將目標(biāo)噬菌體單克隆化后隨機(jī)挑取144個(gè)單克隆進(jìn)行擴(kuò)增、純化，并調(diào)整每個(gè)噬菌體克隆為相同的濃度(1010左右)。對(duì)每個(gè)單克隆化的噬菌體肽分別進(jìn)行細(xì)胞ELISA的免疫熒光鑒定、體內(nèi)鑒定，挑選結(jié)合特異性好的噬菌體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序前將噬菌體單克隆化擴(kuò)增，離心取上清液500μl，加入200μl PEG/NaCL，反復(fù)顛倒至混勻，室溫靜置10分鐘，10000rpm離心去上清，然后低速離心，去除剩余上清。加100μl Iodide緩沖液將沉淀溶解，再加250μl無(wú)水乙醇室溫孵育10分鐘，這樣可以使單鏈的噬菌體DNA沉淀而溶解噬菌體蛋白，10000rpm離心去上清，用70％乙醇清洗沉淀，真空干燥，加30μl TE緩沖液溶解沉淀。樣品送華大基因上海鼎安生物科技有限公司測(cè)序，結(jié)果經(jīng)GENG RUNNER、CLONE MANNAGER等軟件翻譯、分析。對(duì)它們DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩種多肽序列序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH
權(quán)利要求
1.一種肝癌組織特異性粘附肽，其特征在于多肽序列為序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH
2.一種肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法，其特征在于包括以下步驟第一步將正常肝細(xì)胞株加入噬菌體肽庫(kù)中，回收不與正常肝細(xì)胞結(jié)合的噬菌體肽，進(jìn)行擴(kuò)增；第二步將回收的不與正常肝細(xì)胞結(jié)合的噬菌體肽注射到荷瘤鼠體內(nèi)，從肝癌組織回收噬菌體肽，感染大腸桿菌K91Kan感受態(tài)細(xì)胞，然后將該噬菌體擴(kuò)增后純化；第三步將第二步經(jīng)過(guò)擴(kuò)增和純化的噬菌體注射到新的荷瘤鼠體內(nèi)，重復(fù)第二步，從肝癌組織回收得到更多與肝癌組織結(jié)合特異性強(qiáng)、親和力高的噬菌體多肽；第四步將篩選得到的噬菌體單克隆化，用細(xì)胞ELISA方法對(duì)單克隆的噬菌體進(jìn)行鑒定，以正常肝細(xì)胞作為陰性對(duì)照，選擇結(jié)合系數(shù)大的克隆為與腫瘤細(xì)胞結(jié)合特異性好的陽(yáng)性克隆。
3.如權(quán)利要求2所述的肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法，其特征在于在第三步結(jié)束后，再進(jìn)行一到兩次和第三步一樣的體內(nèi)篩選過(guò)程，以回收得到更多與肝癌組織結(jié)合特異性強(qiáng)、親和力高的噬菌體多肽。
4.如權(quán)利要求2或者3所述的肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法，其特征在于在第四步中克隆的特異性結(jié)合系數(shù)是指噬菌體肽與腫瘤細(xì)胞結(jié)合得OD490值除以同樣條件下與正常細(xì)胞結(jié)合的OD490的百分比。
5.如權(quán)利要求2或者3所述的肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法，其特征在于將得到的陽(yáng)性克隆的噬菌體純化后回輸?shù)胶闪雎闶篌w內(nèi)，用免疫組化的方法來(lái)測(cè)定其組織分布特異性，驗(yàn)證其導(dǎo)向效果。
6.序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH和序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH的肝癌組織特異性粘附肽在制備肝癌的導(dǎo)向藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種能特異性結(jié)合肝癌組織/細(xì)胞的粘附肽、該粘附肽的篩選方法以及該粘附肽的應(yīng)用，屬于分子藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的體內(nèi)外結(jié)合的篩選方法，兼?zhèn)淞梭w內(nèi)和體外篩選的優(yōu)點(diǎn)，克服了其缺點(diǎn)，篩選出兩種肝癌組織/細(xì)胞粘附肽，并測(cè)定了其多肽序列。該肝癌組織/細(xì)胞特異性粘附肽導(dǎo)向效果好，組織分布特異性強(qiáng)，在制備肝癌的導(dǎo)向藥物中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1563078SQ200410017049
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者錢旻, 周忠良, 章平, 杜冰, 于靜, 金怡, 郁萌 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)