專利名稱：一種硅烷化云母基底及其在蛋白質(zhì)晶體生長中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)晶體生長的基底材料領(lǐng)域，特別涉及一種硅烷化云母基底及其在作為蛋白質(zhì)晶體生長的基底材料中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組測序的完成，由基因控制表達(dá)的各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的測定成為當(dāng)今生物學(xué)家的首要任務(wù)。確切地了解每一種蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，無論是對于客觀地了解蛋白質(zhì)的各項功能，還是研究出直接有效的治療藥物都是非常重要的。目前蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的測定很大程度上還是通過X射線衍射來實現(xiàn)的，因此如何獲得衍射能力強(qiáng)的蛋白質(zhì)晶體是結(jié)構(gòu)測定的前提條件。但由于蛋白質(zhì)分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、容易失活等特點，蛋白質(zhì)晶體生長要比其他晶體困難得多。現(xiàn)在如何獲得適合于衍射試驗的蛋白晶體已經(jīng)成為了制約蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的瓶頸。正是因為如此，研究蛋白質(zhì)晶體生長的機(jī)理，改善蛋白質(zhì)晶體生長的方法和條件成為研究熱點。在結(jié)晶基底材料的選擇上，現(xiàn)實驗室常用的是硅烷化玻璃片，但曾有過多種其它嘗試，如多種礦物質(zhì)表面、高分子聚合膜及多孔硅等等，但效果并不明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題是改善用于蛋白質(zhì)晶體生長用基底材料的表面性質(zhì)，提供一種更適合于蛋白質(zhì)晶體生長的基底材料及在該特殊基底上生長蛋白質(zhì)晶體的方法。
故而本發(fā)明的目的之一是提供一種硅烷化云母基底。
上述目的是通過下列技術(shù)方案來實現(xiàn)
一種硅烷化云母基底，其由新解理的云母經(jīng)清洗、干燥預(yù)處理后，進(jìn)行硅烷化修飾，再鈍化處理后制得，其特征在于該預(yù)處理中選用去離子水、乙醇或醋酸清洗。
其中，該去離子水是指其電阻率至少為18.2兆歐的水。
上述硅烷化修飾的具體步驟參見專利號ZL 00 1 16715.4，國際專利分類號GO1N 13/16，發(fā)明名稱為一種用于DNA操縱的云母襯底的制造方法的中國發(fā)明專利。
而其鈍化處理是指在80-150℃范圍內(nèi)進(jìn)行30分鐘至4小時的熱處理。
本發(fā)明的另一目的是上述硅烷化云母基底在作為蛋白質(zhì)晶體生長的基底材料中的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，將常規(guī)蛋白質(zhì)結(jié)晶實驗中的基底材料換成本發(fā)明的硅烷化云母基底，具體而言1)將各種蛋白質(zhì)分別用相應(yīng)的緩沖液溶解至一定濃度后取5微升滴在本發(fā)明的硅烷化云母基底表面，再取5微升相應(yīng)的槽液(沉淀劑)滴入上述蛋白質(zhì)溶液，充分混勻，并防止氣泡生成。
2)將該滴有各種蛋白質(zhì)溶液的云母基底分別覆蓋到結(jié)晶板上，結(jié)晶孔中一般含有1毫升左右的槽液，并用凡士林密封。
3)將結(jié)晶板靜置在相應(yīng)的溫度中結(jié)晶。
其中，該醋酸清洗過的硅烷化云母基底較佳的是適用于天花粉蛋白晶體生長。
在經(jīng)本發(fā)明特殊方法處理后的硅烷化云母基底上進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體生長，可以加快蛋白質(zhì)晶體的生長過程，明顯放寬其晶體生長的條件，且有效地控制蛋白質(zhì)晶體生長過程中的晶核數(shù)量。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在我們的實際應(yīng)用過程中得以充分證實，下面將予實施例配以附圖具體說明。


圖1的A為溶菌酶晶體在硅烷化的蓋玻片上，當(dāng)沉淀劑的濃度下降至45％時，28天后的生長情況照片；B為溶菌酶晶體在本發(fā)明的硅烷化云母基底上，當(dāng)沉淀劑的濃度下降至35％時，20天后的生長情況照片。
圖2的A為溶菌酶晶體在硅烷化的蓋玻片上，當(dāng)沉淀劑的濃度下降至60％時，29小時后的生長情況照片；B為溶菌酶晶體在本發(fā)明的硅烷化云母基底上，當(dāng)沉淀劑的濃度下降至60％時，29小時后的生長情況照片；C為溶菌酶晶體在硅烷化的蓋玻片上，同樣濃度下，4天后的生長情況照片；D為溶菌酶晶體在本發(fā)明的硅烷化云母基底上，同樣濃度下，4天后的生長情況照片。
圖3的A為天花粉蛋白在硅烷化的蓋玻片上形成的晶體照片；B為天花粉蛋白在相同條件下、本發(fā)明的硅烷化云母基底上形成的晶體照片。
具體實施例方式
實施例11)用去離子水徹底清潔新解理的云母表面，然后吹干；2)取配置好的1％(體積百分?jǐn)?shù))3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)水溶液置于封口膜上(1μl/cm2，即每平方厘米云母片需用1％的APTES 1微升)，將步驟1所得的云母覆蓋于液滴將其鋪開，放置2分鐘左右，然后用鑷子夾取云母片，用重蒸水或去離子水清洗三次，再吹干(具體步驟參見專利號為ZL 00 1 16715.4的發(fā)明專利說明書)；3)對步驟2)所得硅烷化后的云母表面在80℃范圍內(nèi)進(jìn)行約4小時的熱鈍化處理后即得本發(fā)明的硅烷化云母基底。
實施例21)用乙醇溶液徹底清潔新解理的云母表面，然后吹干；
2)同實施例1的步驟2)；3)對步驟2)所得硅烷化后的云母表面在120℃范圍內(nèi)進(jìn)行約2小時的熱鈍化處理后即得本發(fā)明的硅烷化云母基底。
實施例31)用去離子水徹底清潔新解理的云母表面，然后吹干；2)同實施例1的步驟2)；3)對步驟2)所得硅烷化后的云母表面在150℃范圍內(nèi)進(jìn)行約30分鐘的熱鈍化處理后即得本發(fā)明的硅烷化云母基底。
實施例41)用醋酸溶液徹底清潔新解理的云母表面，然后吹干；2)同實施例1的步驟2)；3)對步驟2)所得硅烷化后的云母表面在120℃范圍內(nèi)進(jìn)行約1.5小時的熱鈍化處理后即得本發(fā)明的硅烷化云母基底。
實施例51)用去離子水或乙醇溶液徹底清潔新解理的云母表面，然后吹干；2)同實施例1的步驟2)；3)對步驟2)所得硅烷化后的云母表面在80℃范圍內(nèi)進(jìn)行約3小時的熱鈍化處理后即得本發(fā)明的硅烷化云母基底。
應(yīng)用實施例1溶菌酶晶體生長選用實施例1-3的任一本發(fā)明硅烷化云母基底作為溶菌酶晶體生長的基底材料，溶菌酶的結(jié)晶的實驗過程請參見Hampton公司出版的《Crystallization Research Tools》一書中關(guān)于懸滴法的介紹。其具體步驟為
1)將溶菌酶蛋白粉末用緩沖液(0.1M醋酸鈉，pH4.8)溶解，濃度為50mg/ml，取5微升滴在實施例1-3的任一本發(fā)明硅烷化云母基底上，再取5微升相應(yīng)的槽液(8％W/V(重量/體積百分比)氯化鈉，0.1M醋酸鈉，pH4.8)滴入上述溶菌酶溶液中，充分混勻，并防止氣泡生成。
2)將滴有溶菌酶溶液的本發(fā)明硅烷化云母基底覆蓋到結(jié)晶板上，結(jié)晶孔中含有1毫升上述槽液，并用凡士林密封。
3)將結(jié)晶板靜置在室溫環(huán)境中結(jié)晶。
4)逐漸降低上述槽液中的鹽離子濃度，直至上述濃度的35％(即2.8％W/V氯化鈉，0.035M醋酸鈉)，重復(fù)步驟1)～3)。
每隔一定時間用光學(xué)顯微鏡觀察一次晶體生長情況，并用數(shù)碼相機(jī)拍照紀(jì)錄。
將現(xiàn)常用的硅烷化蓋玻片替換上述本發(fā)明的云母基底，重復(fù)步驟1)～4)，也每隔一定時間用光學(xué)顯微鏡觀察一次晶體生長情況，并用數(shù)碼相機(jī)拍照紀(jì)錄以作對照。
實驗結(jié)果如圖1所示當(dāng)槽液的濃度降低至上述濃度的45％時，在硅烷化的蓋玻片上28天后還觀察不到有晶體生成(圖A)，但槽液的濃度降低至35％時，在本發(fā)明的云母基底上，20天后就可以觀察到有較大的蛋白質(zhì)晶體生成(圖B)。另外，如圖2所示，當(dāng)槽液的濃度為上述濃度的60％時，實驗開始29小時后，在本發(fā)明的云母片上就有較大的蛋白質(zhì)晶體出現(xiàn)(圖B)，而在硅烷化的蓋玻片上沒有觀察到任何晶體(圖A)，實驗開始4天之后，在蓋玻片上也出現(xiàn)了較大的蛋白質(zhì)晶體(圖C)，此時生長在本發(fā)明的云母基底上的蛋白質(zhì)晶體尺度更大了(圖D)。這說明用本發(fā)明的硅烷化云母基底作為蛋白晶體生長的基底，可促進(jìn)蛋白質(zhì)晶體的生長，能夠?qū)⑸傻鞍踪|(zhì)晶體所必需的槽液濃度范圍放寬，在同樣條件下，常規(guī)的基底上長不出晶體，而在本發(fā)明的云母基底上能生長出很好的蛋白質(zhì)晶體。
應(yīng)用實施例2天花粉蛋白晶體生長選用實施例4或5的本發(fā)明硅烷化云母基底作為天花粉蛋白晶體生長的基底材料，天花粉蛋白的結(jié)晶的實驗過程請參見科學(xué)通報(1985)，30卷，1396頁。其具體步驟為1)天花粉蛋白用純水溶解，濃度為40mg/ml，完全溶解后，1萬5千轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清5微升滴在實施例4或5的本發(fā)明硅烷化云母基底上，再取5微升相應(yīng)的槽液(0.075M檸檬酸緩沖液，14％W/V氯化鉀，pH5.4)滴入上述天花粉蛋白溶液中，充分混勻，并防止氣泡生成。
2)將滴有天花粉蛋白溶液的本發(fā)明硅烷化云母基底覆蓋到結(jié)晶板上，結(jié)晶孔中含有1毫升上述槽液，并用凡士林密封。
3)將結(jié)晶板靜置在室溫環(huán)境中結(jié)晶。
每隔一定時間用光學(xué)顯微鏡觀察一次晶體生長情況，并用數(shù)碼相機(jī)拍照紀(jì)錄。
將現(xiàn)常用的硅烷化蓋玻片替換上述本發(fā)明的云母基底，重復(fù)步驟1)～3)，也每隔一定時間用光學(xué)顯微鏡觀察一次晶體生長情況，并用數(shù)碼相機(jī)拍照紀(jì)錄以作對照。
實驗結(jié)果如圖3所示在相同的條件下，在兩種基底上都有晶體生成，但相比較而言，在常規(guī)使用的硅烷化蓋玻片上(圖A)生成的晶體數(shù)目較多，尺度較小，而在本發(fā)明的云母基底上(圖B)，形成的蛋白晶體數(shù)目較少，尺度較大，更適合于X射線衍射試驗。
上述實施例中所用的云母為購自四川雅安云母公司的白云母；溶菌酶蛋白購自Sigma公司；天花粉蛋白取自中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所；去離子水為電阻率至少為18.2兆歐的水，本發(fā)明是用Millipore公司生產(chǎn)的Milli-Q純水系統(tǒng)制得；乙醇與醋酸為市售分析純。
權(quán)利要求
1.一種硅烷化云母基底，其由新解理的云母經(jīng)清洗、干燥預(yù)處理后，進(jìn)行硅烷化修飾，再鈍化處理后制得，其特征在于該預(yù)處理中選用去離子水、乙醇或醋酸清洗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硅烷化云母基底，其特征在于該去離子水是指其電阻率至少為18.2兆歐的水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硅烷化云母基底，其特征在于其鈍化處理是指在80-150℃范圍內(nèi)進(jìn)行30分鐘至4小時的熱處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的硅烷化云母基底在作為蛋白質(zhì)晶體生長的基底材料中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于該蛋白質(zhì)是指溶菌酶或天花粉蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于該醋酸清洗過的硅烷化云母基底適用于天花粉蛋白晶體生長。
全文摘要
本發(fā)明公開一種硅烷化云母基底，其由新解理的云母經(jīng)清洗、干燥預(yù)處理后，進(jìn)行硅烷化修飾，再鈍化處理后制得，其特征在于該預(yù)處理中選用去離子水、乙醇或醋酸清洗。本發(fā)明還公開上述經(jīng)過特殊處理的硅烷化云母基底在作為蛋白質(zhì)晶體生長的基底材料中的應(yīng)用。其可以加快蛋白質(zhì)晶體的生長過程，明顯放寬晶體生長的條件，并有效地控制蛋白質(zhì)晶體生長過程中的晶核數(shù)量。
文檔編號G01N23/20GK1707252SQ20041002513
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月11日
發(fā)明者唐琳, 黃一波, 何建華, 胡鈞 申請人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所