專利名稱：微生物抗干擾快速檢測(cè)方法及試劑的制作方法
專利說(shuō)明微生物抗干擾快速檢測(cè)方法及試劑 本發(fā)明屬于檢測(cè)、測(cè)定微生物的方法及試劑，尤其涉及一種利用生物發(fā)光對(duì)含菌量較少的樣品進(jìn)行微生物快速檢測(cè)的方法及用于這種方法的試劑。目前，作為微生物最大宗的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目——細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)量的檢測(cè)，依然沿用一百多年前由巴斯德建立的瓊脂平板計(jì)數(shù)法。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法依賴于特殊的微生物培養(yǎng)基來(lái)分離培養(yǎng)樣品中存活的微生物，這些方法靈敏、直觀，能同時(shí)提供食品中微生物數(shù)量和種類的信息。然而常規(guī)方法從開始培養(yǎng)到肉眼可見的菌落需要1～5天時(shí)間，且操作繁瑣，局限于實(shí)驗(yàn)室，對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求高，容易出現(xiàn)人為的誤差；而迄今為止作為自然環(huán)境中的微生物，能夠進(jìn)行人工培養(yǎng)的一般認(rèn)為只有5～10％，沒(méi)有單獨(dú)一種培養(yǎng)基或一套物理、化學(xué)條件能夠滿足樣品中所有微生物的生理要求；同時(shí)，培養(yǎng)基的制備、平板培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)和生化鑒定工作量大、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，提供的是歷史性信息，不能達(dá)到企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量控制、衛(wèi)生監(jiān)督檢測(cè)快速獲得微生物信息的要求。近年來(lái)，隨著科技的進(jìn)步和自動(dòng)化技術(shù)的應(yīng)用，傳統(tǒng)方法在樣品處理、平板培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)和鑒定系統(tǒng)上所做的許多改進(jìn)，已使操作更加簡(jiǎn)易和方便，同時(shí)亦降低了花費(fèi)和減少了工作量。但居于培養(yǎng)的方法仍需以時(shí)間為代價(jià)，無(wú)法快速得到結(jié)果，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足食品工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)督現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。因此，微生物快速檢測(cè)的技術(shù)和儀器便順勢(shì)而生，其中ATP生物發(fā)光在線微生物快速檢測(cè)方法是目前認(rèn)為最有可能實(shí)現(xiàn)微生物數(shù)量在線檢測(cè)的新技術(shù)。
ATP生物發(fā)光技術(shù)于20世紀(jì)60年代由NASA(美國(guó)航空航天局)的科學(xué)家們(Chappelle和Levin等)提出，其原理是螢火蟲熒光素酶(Luciferase)以熒光素(D-Luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2為底物，在Mg2+存在時(shí)，能將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。反應(yīng)式表示為
ATP既是熒光素酶催化發(fā)光的必需底物，又是所有生物生命活動(dòng)的能量來(lái)源，在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線形關(guān)系。D’Eustachio和Levin的研究表明，各生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)菌均有較恒定水平的ATP含量，因此，提取細(xì)菌的ATP，利用生物發(fā)光法測(cè)出ATP的含量后即可推算出樣品中的含菌量，整個(gè)過(guò)程僅為十幾分鐘。由于生物發(fā)光法無(wú)需培養(yǎng)過(guò)程，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，數(shù)分鐘內(nèi)可得到結(jié)果，Sharpe等(1970)首先應(yīng)用該法檢測(cè)食品中存在的微生物，但高水平的非微生物細(xì)胞ATP降低了靈敏度。盡管如此，許多科研人員依然對(duì)該法用來(lái)評(píng)估食品中的微生物污染具有濃厚的興趣，并為此作出了很大的努力。一直到20世紀(jì)90年代早期，ATP生物發(fā)光技術(shù)才真正應(yīng)用到食品工業(yè)的衛(wèi)生質(zhì)量控制(Giffiths，1993，1995；Kyriakides和Patel，1994)和環(huán)境監(jiān)測(cè)。最成功的應(yīng)用是生產(chǎn)開始前生產(chǎn)線和環(huán)境的衛(wèi)生狀況檢測(cè)，該法可在2分鐘內(nèi)得到設(shè)備表面清潔狀況的檢測(cè)結(jié)果，具有其它微生物檢測(cè)方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，ATP生物發(fā)光法還應(yīng)用到原材料、終產(chǎn)品的微生物檢測(cè)。Bautista、JoaoNiza-Ribeiro等應(yīng)用ATP生物發(fā)光法分別檢測(cè)禽肉、粗乳中的微生物含量，在數(shù)分鐘內(nèi)得到結(jié)果以判斷微生物的污染狀況，他們認(rèn)為該法與平板計(jì)數(shù)法相比快速、可靠、準(zhǔn)確。Russell、Sinell等認(rèn)為ATP生物發(fā)光法是唯一適合HACCP的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)方法，是執(zhí)行HACCP的基礎(chǔ)，同時(shí)也是目前檢測(cè)微生物最快的方法。國(guó)外一些公司根據(jù)生物發(fā)光的原理研制出成套的生物發(fā)光檢測(cè)裝置和試劑盒用于微生物數(shù)量快速測(cè)定，該檢測(cè)系統(tǒng)由生物發(fā)光檢測(cè)儀和測(cè)定試劑盒兩大部分組成，其微生物數(shù)量的檢測(cè)限一般為細(xì)菌105～6cells/mL，最高的靈敏度也只達(dá)到103cells/mL，微生物含量在103cells/mL以上的樣品可在十幾分鐘內(nèi)迅速檢測(cè)出結(jié)果。迄今許多國(guó)家已將ATP生物發(fā)光法作為食品工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)督現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的有效手段，而國(guó)內(nèi)尚處于起步階段。
與食品工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)督一樣，食品飲料產(chǎn)品的微生物檢測(cè)同樣是生物發(fā)光法的重要應(yīng)用對(duì)象，但ATP生物發(fā)光法在這方面存在嚴(yán)重缺陷，因?yàn)樵摲ㄒ髽悠分屑?xì)菌濃度最低不少于103cells/mL，這種靈敏度經(jīng)常達(dá)不到衛(wèi)生學(xué)的要求。當(dāng)樣品帶菌量小于100cells/mL，甚至小于1cell/mL時(shí)，直接使用生物發(fā)光法微生物快速檢測(cè)技術(shù)則不能有效地檢出其中的含菌量。同時(shí)，樣品中存在的微生物為休眠狀態(tài)的芽孢或孢子時(shí)，ATP含量極低，達(dá)不到發(fā)光檢測(cè)的靈敏度。另外，在食品工業(yè)等生產(chǎn)過(guò)程中，廣泛的使用著防腐劑和消毒劑，樣品中微生物受到防腐劑和消毒劑的影響，處于抑制或受傷狀態(tài)，ATP含量亦極低，同樣達(dá)不到發(fā)光檢測(cè)的要求。因此，ATP生物發(fā)光法雖然靈敏、快速，但由于上述不足之處使它的應(yīng)用受到了很大的限制。本發(fā)明的目的在于克服目前ATP生物發(fā)光法存在的靈敏度不足的問(wèn)題，解決樣品中存在的一些防腐劑或殘留消毒劑的干擾問(wèn)題，提供一種增加靈敏度、抗干擾的微生物快速檢測(cè)方法及試劑，提高檢測(cè)的靈敏度和縮短檢測(cè)所需的時(shí)間。
本發(fā)明中所提供的微生物快速檢測(cè)技術(shù)由兩部分組成，一是用抗干擾微生物培養(yǎng)基對(duì)有防腐劑或消毒劑等干擾物質(zhì)的樣品進(jìn)行液體大樣法或最近似數(shù)(MPN)法增菌，使受損傷的微生物復(fù)蘇或休眠狀態(tài)的芽孢、孢子萌發(fā)；二是用細(xì)胞ATP釋放劑Ec對(duì)樣品進(jìn)行處理，釋放出樣品中的微生物細(xì)胞ATP，然后進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)。
本發(fā)明可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，細(xì)菌6小時(shí)內(nèi)可完成檢測(cè)，酵母12小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，霉菌24小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，同時(shí)大幅度提高檢測(cè)靈敏度，其中生物發(fā)光液體大樣法可達(dá)到10cells/100mL，生物發(fā)光最近似數(shù)(MPN)法可達(dá)到30cells/100mL，比生物發(fā)光法的檢測(cè)靈敏度最少提高1000倍。
本發(fā)明的微生物數(shù)量快速檢測(cè)方法的具體操作方法1)抗干擾細(xì)菌和真菌液體大樣法及MPN法快速測(cè)定(1)抗干擾細(xì)菌和真菌液體大樣法快速測(cè)定本方法適于含有防腐劑、消毒劑等干擾物質(zhì)的樣品的無(wú)菌度檢測(cè)，按照樣品含干擾物質(zhì)的類別和檢測(cè)項(xiàng)目的不同，分別選擇抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型細(xì)菌或真菌液體培養(yǎng)基a.培養(yǎng)基的配制參照抗干擾細(xì)菌和真菌液體培養(yǎng)基說(shuō)明配制50mL/瓶三料液體培養(yǎng)基，分裝到250mL三角瓶中，并準(zhǔn)備其它配套用品，滅菌備用；
b.微生物的培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中，將已混合并分散好的100mL(g)樣品加入到裝有冷卻后的50mL/瓶三料培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖勻混合后細(xì)菌在35-37℃下培養(yǎng)3～6h，真菌在30-32℃下培養(yǎng)10～24h；c.微生物細(xì)胞ATP提取方法分別取10mL培養(yǎng)液，于10000r/min離心5分鐘，去上清液，沉淀加入1mL微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec，作用1～5min；d.ATP生物發(fā)光測(cè)定方法吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入適量解抑劑和25mmol/L Tricine緩沖液，使體積為0.9mL，再加入0.1mL熒光素酶-熒光素試劑，立刻搖勻，置于25℃生物發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)；e.作標(biāo)準(zhǔn)ATP檢測(cè)和培養(yǎng)基與樣品混合不作培養(yǎng)的對(duì)照樣液檢測(cè)；f.結(jié)果判定當(dāng)樣品發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)CPM樣＞對(duì)照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽(yáng)性。
(2)抗干擾細(xì)菌和真菌MPN法快速測(cè)定要確定含有防腐劑、消毒劑等干擾物質(zhì)的低菌數(shù)樣品的微生物數(shù)量，可采用最近似數(shù)法(MPN法)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。按照樣品含干擾物質(zhì)的類別和檢測(cè)項(xiàng)目的不同，分別選擇抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型細(xì)菌或真菌液體培養(yǎng)基a.培養(yǎng)基的配制按國(guó)標(biāo)大腸菌群數(shù)量多管發(fā)酵法配制抗干擾細(xì)菌和真菌液體培養(yǎng)基(無(wú)需在試管中加入小倒管)，并準(zhǔn)備其它配套用品，滅菌備用；b.微生物的培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中，將已混合并分散好的樣品按國(guó)標(biāo)大腸菌群數(shù)量多管發(fā)酵法加入到測(cè)定系統(tǒng)中，搖勻混合后細(xì)菌在35-37℃下培養(yǎng)3～6h，真菌在30-32℃下培養(yǎng)10～24h；c.微生物細(xì)胞ATP提取方法各管培養(yǎng)液，于10000r/min離心5分鐘，去上清液，沉淀加入1mL微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec，作用1～5min；d.ATP生物發(fā)光測(cè)定方法吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入適量解抑劑和25mmol/L Tricine緩沖液，使體積為0.9mL，再加入0.1mL熒光素酶-熒光素試劑，立刻搖勻，置于25℃生物發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)；e.作標(biāo)準(zhǔn)ATP檢測(cè)和培養(yǎng)基與樣品混合不作培養(yǎng)的對(duì)照樣液檢測(cè)；f.結(jié)果表示當(dāng)樣品發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)CPM樣＞對(duì)照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽(yáng)性，記錄樣品陽(yáng)性管數(shù)，查MPN表，即得結(jié)果。
2)普通細(xì)菌和真菌液體大樣法及MPN法快速測(cè)定(1)普通細(xì)菌和真菌液體大樣法快速測(cè)定本方法適于不含防腐劑、消毒劑等干擾物質(zhì)的樣品的無(wú)菌度檢測(cè)。
A.培養(yǎng)基的配制參照普通細(xì)菌和真菌液體培養(yǎng)基說(shuō)明配制50mL/瓶三料液體培養(yǎng)基，分裝到250mL三角瓶中，并準(zhǔn)備其它配套用品，然后滅菌；B.微生物的培養(yǎng)在100級(jí)超凈工作臺(tái)中，將已混合并分散好的100mL(g)樣品加入到裝有冷卻后的50mL/瓶三料培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖勻混合后細(xì)菌在35-37℃下培養(yǎng)3～6h，真菌在30-32℃下培養(yǎng)10～24h；C.微生物細(xì)胞ATP提取方法分別取10mL培養(yǎng)液，于10000r/min離心5分鐘，去上清液，沉淀加入1mL微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec，作用1～5min；D.ATP生物發(fā)光測(cè)定方法吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入適量解抑劑和25mmol/L Tricine緩沖液，使體積為0.9mL，再加入0.1mL熒光素酶-熒光素試劑，立刻搖勻，置于25℃生物發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)；同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)ATP檢測(cè)和培養(yǎng)基與樣品混合不作培養(yǎng)的對(duì)照樣液檢測(cè)；E.結(jié)果判定當(dāng)樣品發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)CPM樣＞對(duì)照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽(yáng)性。
(2)最近似數(shù)法(MPN法)快速測(cè)定要確定低菌數(shù)樣品的微生物數(shù)量，可采用最近似數(shù)法(MPN法)，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。
A.培養(yǎng)基的配制按國(guó)標(biāo)大腸菌群數(shù)量多管發(fā)酵法配制普通細(xì)菌和真菌液體培養(yǎng)基(無(wú)需在試管中加入小倒管)，并準(zhǔn)備其它配套用品，然后滅菌；B.微生物的培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中，將已混合并分散好的樣品按國(guó)標(biāo)大腸菌群數(shù)量多管發(fā)酵法加入到測(cè)定系統(tǒng)中，搖勻混合后細(xì)菌在35-37℃下培養(yǎng)3～6h，真菌在30-32℃下培養(yǎng)10～24h；C.微生物細(xì)胞ATP提取方法各管培養(yǎng)液，于10000r/min離心5分鐘，去上清液，沉淀加入1mL微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec，作用1～5min；D.ATP生物發(fā)光測(cè)定方法吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入適量解抑<p>實(shí)施例15用菌株MG442Δ90yjfAΔpckA生產(chǎn)L-蘇氨酸15.1菌株MG442Δ90yjfAΔpckA的制備如實(shí)施例3所述，用ΔpckA等位基因(見實(shí)施例1和2)置換菌株MG442Δ90yjfA的pckA基因。所得菌株稱為MG442Δ90yjfAΔpckA。
15.2L-蘇氨酸的生產(chǎn)如實(shí)施例4所述用菌株MG442Δ90yjfAΔpckA生產(chǎn)L-蘇氨酸。結(jié)果示于表9。
表9
表2 抗干擾微生物液體培養(yǎng)基可以消除的干擾物質(zhì)及其濃度
本發(fā)明所提及的微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec含有1～30g/L TritonX-1000.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化銨(CTAB)0.1～3.0g/L二甲亞砜(DMSO)0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.01～0.1g/L硫酸鎂(MgSO4)制作過(guò)程為每升無(wú)菌超純水中加入1～30g TritonX-100、0.1～5.0g CTAB、0.1～3.0g DMSO、0.01～0.1g EDTA、0.01～0.1g MgSO4，加熱使其溶解，振勻即成，所有試劑采用分析純，可在室溫條件下1～5min內(nèi)完成微生物細(xì)胞ATP的提取，簡(jiǎn)便、快速。
本發(fā)明所提及的樣品處理解抑劑為內(nèi)含葡萄糖單元分別為6、7、8的環(huán)糊精等環(huán)狀化合物，具體制作過(guò)程為取0.1～15.0g分析純環(huán)糊精溶解于pH 7.8 Tricine緩沖液(內(nèi)含50mmol/L Tricine、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使終體積為1000mL，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后分裝至5個(gè)滅菌的小瓶，于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。該解抑劑可以排除?yáng)離子、陰離子和兩性離子表面活性劑等物質(zhì)對(duì)分析的干擾。實(shí)施例1瓶裝飲用天然礦泉水中細(xì)菌液體大樣快速測(cè)定因瓶裝飲用天然礦泉水通常用臭氧進(jìn)行消毒處理，因此選用抗臭氧型細(xì)菌液體大樣檢測(cè)培養(yǎng)基a.培養(yǎng)基的配制參照抗臭氧型細(xì)菌液體大樣檢測(cè)培養(yǎng)基說(shuō)明配制50mL/瓶三料液體培養(yǎng)基，分裝到250mL三角瓶中，并準(zhǔn)備其它配套用品，然后滅菌；b.微生物的培養(yǎng)在100級(jí)超凈工作臺(tái)中，將100mL待檢樣品加入到裝有冷卻后的50mL/瓶三料培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖勻混合后在35-37℃下培養(yǎng)6h；c.微生物細(xì)胞ATP提取方法取10mL培養(yǎng)液，于10000r/min離心5分鐘，去上清液，沉淀加入1mL微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec，作用1～5min；d.ATP生物發(fā)光測(cè)定方法吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入適量解抑劑和25mmol/L Tricine緩沖液，使體積為0.9mL，再加入0.1mL熒光素酶-熒光素試劑，立刻搖勻，置于25℃生物發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)；e.作標(biāo)準(zhǔn)ATP檢測(cè)和培養(yǎng)基與樣品混合不作培養(yǎng)的對(duì)照樣液檢測(cè)；f.發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)結(jié)果樣品發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)CPM樣＝13450對(duì)照樣液CPMCK＝1103結(jié)果判定樣品發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)CPM樣＞對(duì)照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽(yáng)性。
實(shí)例2果汁飲料的酵母菌和霉菌的MPN法快速測(cè)定果汁飲料通常添加有防腐劑以延長(zhǎng)保質(zhì)期，但剛生產(chǎn)出來(lái)的產(chǎn)品其含菌量是很低的，因此要確定含有防腐劑的低菌數(shù)樣品的微生物數(shù)量，可采用最近似數(shù)法(MPN法)，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)a.培養(yǎng)基的配制按國(guó)標(biāo)大腸菌群數(shù)量多管發(fā)酵法(9管法)配制抗防腐劑型真菌液體大樣檢測(cè)培養(yǎng)基(無(wú)需在試管中加入小倒管)，每管10mL，并準(zhǔn)備其它配套用品，然后滅菌；b.微生物的培養(yǎng)在100級(jí)超凈工作臺(tái)中，將已混合并分散好的樣品按國(guó)標(biāo)大腸菌群數(shù)量多管發(fā)酵法加入到測(cè)定系統(tǒng)中，搖勻混合后在30-32℃下培養(yǎng)12h；c.微生物細(xì)胞ATP提取方法各管培養(yǎng)液，于10000r/min離心5分鐘，去上清液，沉淀加入1mL微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec，作用1～5min；d.ATP生物發(fā)光測(cè)定方法吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入適量解抑劑和25mmol/L Tricine緩沖液，使體積為0.9mL，再加入0.1mL熒光素酶-熒光素試劑，立刻搖勻，置于25℃生物發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)；e.作標(biāo)準(zhǔn)ATP檢測(cè)和培養(yǎng)基與樣品混合不作培養(yǎng)的對(duì)照樣液檢測(cè)；f.結(jié)果表示樣品發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)CPM樣＞對(duì)照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽(yáng)性；記錄樣品陽(yáng)性管數(shù)，查MPN表，即得結(jié)果，樣品含菌量為460MPN/100mL。
表3發(fā)光檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種微生物抗干擾快速檢測(cè)方法，其特征在于首先根據(jù)樣品含干擾物質(zhì)的類別和檢測(cè)項(xiàng)目的不同選用抗干擾或普通微生物培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行液體大樣法或最近似數(shù)(MPN)方法增菌；然后用細(xì)胞ATP釋放劑Ec對(duì)樣品進(jìn)行處理，再加入適量的解抑劑和熒光素酶—熒光素試劑后利用發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)。
2.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，對(duì)樣品進(jìn)行液體大樣法按下述步驟進(jìn)行a.培養(yǎng)基的配制按照樣品含干擾物質(zhì)的類別和檢測(cè)項(xiàng)目的不同，分別選擇抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型細(xì)菌或真菌液體培養(yǎng)基；對(duì)不含有防腐劑、消毒劑等干擾物質(zhì)的樣品根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的不同選擇普通細(xì)菌或真菌液體培養(yǎng)基；測(cè)霉菌時(shí)則選用霉菌液體培養(yǎng)基；按說(shuō)明配制50mL/瓶三料液體培養(yǎng)基，分裝到250mL三角瓶中，并準(zhǔn)備其它配套用品，滅菌備用；b.微生物的培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中，將已混合并分散好的100mL(g)樣品加入到裝有冷卻后的50mL/瓶三料培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖勻混合后細(xì)菌在35-37℃下培養(yǎng)3～6h，真菌在30-32℃下培養(yǎng)10～24h；c.微生物細(xì)胞ATP提取方法分別取10mL培養(yǎng)液，于10000r/min離心5分鐘，去上清液，沉淀加入1mL微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec，作用1～5min；d.ATP生物發(fā)光測(cè)定方法吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入適量解抑劑和25mmol/L Tricine緩沖液，使體積為0.9mL，再加入0.1mL熒光素酶—熒光素試劑，立刻搖勻，置于生物發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)；e.作標(biāo)準(zhǔn)ATP檢測(cè)和培養(yǎng)基與樣品混合不作培養(yǎng)的對(duì)照樣液的發(fā)光檢測(cè)；f.結(jié)果判定當(dāng)樣品發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)CPM樣＞對(duì)照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽(yáng)性。
3.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，對(duì)樣品進(jìn)行MPN法增菌按下述步驟進(jìn)行a.培養(yǎng)基的配制按照樣品含干擾物質(zhì)的類別和檢測(cè)項(xiàng)目的不同，分別選擇抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型細(xì)菌或真菌液體培養(yǎng)基；對(duì)不含有防腐劑、消毒劑等干擾物質(zhì)的樣品根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的不同選擇普通細(xì)菌或真菌液體培養(yǎng)基；測(cè)霉菌時(shí)則選用霉菌液體培養(yǎng)基；按國(guó)標(biāo)大腸菌群數(shù)量多管發(fā)酵法配制液體培養(yǎng)基(無(wú)需在試管中加入小倒管)，并準(zhǔn)備其它配套用品，滅菌備用；b.微生物的培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中，將已混合并分散好的樣品按國(guó)標(biāo)大腸菌群數(shù)量多管發(fā)酵法加入到測(cè)定系統(tǒng)中，搖勻混合后細(xì)菌在35-37℃下培養(yǎng)3～6h，真菌在30-32℃下培養(yǎng)10～24h；c.微生物細(xì)胞ATP提取方法各管培養(yǎng)液，于10000r/min離心5分鐘，去上清液，沉淀加入1mL微生物細(xì)胞ATP釋放劑Ec，作用1～5min；d.ATP生物發(fā)光測(cè)定方法吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入適量解抑劑和25mmol/L Tricine緩沖液，使體積為0.9mL，再加入0.1mL熒光素酶—熒光素試劑，立刻搖勻，置于生物發(fā)光檢測(cè)儀中進(jìn)行發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)，同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)ATP檢測(cè)和培養(yǎng)基與樣品混合不作培養(yǎng)的對(duì)照樣液的發(fā)光檢測(cè)；e.結(jié)果表示當(dāng)樣品發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)CPM樣＞對(duì)照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽(yáng)性；記錄樣品陽(yáng)性管數(shù)，查MPN表，得樣品含菌量。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的檢測(cè)方法，ATP釋放劑Ec內(nèi)含1～30g/L TritonX-1000.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化銨(CTAB)0.1～3.0g/L二甲亞砜(DMSO)0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.01～0.1g/L硫酸鎂(MgSO4)
5.權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，ATP釋放劑Ec的制作過(guò)程為每升無(wú)菌超純水中加入1～30gTritonX-100、0.1～5.0g CTAB、0.1～3.0g DMSO、0.01～0.1g EDTA、0.01～0.1g MgSO4，加熱使其溶解，振勻即成。
6.權(quán)利要求1、2或3所述的檢測(cè)方法，解抑劑含有葡萄糖單元分別為6、7、8的環(huán)糊精等環(huán)狀化合物。
7.權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，解抑劑的制作過(guò)程為取0.1～15.0g環(huán)糊精溶解于pH7.8Tricine緩沖液(內(nèi)含50mmol/L Tricine、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使終體積為1000mL。
8.權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)方法，普通細(xì)菌或真菌液體培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，使用濃度為22-24g/L；抗防腐劑型細(xì)菌培養(yǎng)基的使用濃度為22-28g/L；抗消毒劑型細(xì)菌培養(yǎng)基的使用濃度為20-24g/L；抗臭氧型細(xì)菌培養(yǎng)基的使用濃度為19-23g/L；霉菌液體培養(yǎng)基的使用濃度為14-18g/L；抗防腐劑型真菌培養(yǎng)基使用濃度為21-25g/L；抗防腐劑型真菌培養(yǎng)基使用濃度為17-21g/L；抗臭氧型真菌培養(yǎng)基使用濃度為16-20g/L。
9.權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，普通細(xì)菌或真菌液體培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，使用濃度為22-24g/L；抗防腐劑型細(xì)菌培養(yǎng)基的使用濃度為22-28g/L；抗消毒劑型細(xì)菌培養(yǎng)基的使用濃度為20-24g/L；抗臭氧型細(xì)菌培養(yǎng)基的使用濃度為19-23g/L；霉菌液體培養(yǎng)基的使用濃度為14-18g/L；抗防腐劑型真菌培養(yǎng)基使用濃度為21-25g/L；抗防腐劑型真菌培養(yǎng)基使用濃度為17-21g/L；抗臭氧型真菌培養(yǎng)基使用濃度為16-20g/L。
10.權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，普通細(xì)菌或真菌液體培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，使用濃度為22-24g/L；抗防腐劑型細(xì)菌培養(yǎng)基的使用濃度為22-28g/L；抗消毒劑型細(xì)菌培養(yǎng)基的使用濃度為20-24g/L；抗臭氧型細(xì)菌培養(yǎng)基的使用濃度為19-23g/L；霉菌液體培養(yǎng)基的使用濃度為14-18g/L；抗防腐劑型真菌培養(yǎng)基使用濃度為21-25g/L；抗防腐劑型真菌培養(yǎng)基使用濃度為17-21g/L；抗臭氧型真菌培養(yǎng)基使用濃度為16-20g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微生物抗干擾快速檢測(cè)方法及試劑，首先根據(jù)樣品含干擾物質(zhì)的類別和檢測(cè)項(xiàng)目的不同選用抗干擾或普通微生物培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行液體大樣法或最近似數(shù)(MPN)法增菌；然后用細(xì)胞ATP釋放劑Ec對(duì)樣品進(jìn)行處理，再加入適量的解抑劑和熒光素酶－熒光素試劑后進(jìn)行ATP發(fā)光檢測(cè)。如樣品發(fā)光脈沖計(jì)數(shù)CPM
文檔編號(hào)G01N21/76GK1680804SQ20041002679
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2004年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月8日
發(fā)明者吳清平, 張菊梅, 吳慧清, 郭偉鵬 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所, 廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司