專利名稱：膠體金層析法檢測雙鏈dna抗體的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，特別是涉及一種利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測雙鏈DNA抗體的試紙條。
背景技術(shù)：
雙鏈脫氧核糖核酸抗體(雙鏈DNA抗體)是一種能夠與天然DNA結(jié)合的自身抗體。在90％以上活動的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病人的血清中均存在抗雙鏈DNA抗體，雙鏈DNA抗體與SLE的病理變化、活動性、療效及預(yù)后有很密切的關(guān)系。
早期的對流免疫電泳、間接血凝，補體結(jié)合試驗等方法因靈敏度和特異性差而被淘汰。現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的檢測方法大致如下放射免疫法(RIA)，免疫熒光法(IFT)、ELISA和斑點免疫金滲濾法(DIGFA)。
放射免疫法(RIA)，免疫熒光法(IFT)、ELISA均不同程度的存在不足和缺點。RIA是以同位素標(biāo)記的雙鏈DNA與檢測樣品中的雙鏈DNA抗體結(jié)合，有放射性污染，有其它干擾物質(zhì)容易有假陽性；檢測需要特殊的儀器設(shè)備，檢測時間長；不能實現(xiàn)單項檢測。
IFT也存在檢測時間長，觀察結(jié)果需要特殊的儀器設(shè)備，需要專業(yè)人員操作，有其它干擾物質(zhì)容易有假陽性。
ELISA法操作步驟繁瑣，需要三個小時左右，亦需要專業(yè)人員利用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。
免疫滲濾法(Immunofiltration Assay，IFA)以斑點免疫印跡法(Immunoblotting，DIB)為原理，采用膠體金或酶標(biāo)記抗原或者抗體。其檢測時間需要20分鐘左右，操作簡便，是目前檢測雙鏈DNA抗體最佳的方法。但由于所需的一些試劑為液體，需要低溫儲存。
膠體金免疫層析法(Immunochromatography Assay)始于上世紀(jì)90年代中期，是在免疫滲濾法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它是免疫親和技術(shù)、印跡技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)和層析技術(shù)的組合。將包被抗原，膠體金標(biāo)記抗體固相化，與樣本吸附材料等組合在一起，制備為免疫層析診斷試條/板，使用時只需要把試紙條下插入樣本溶液，數(shù)分鐘就可以判斷結(jié)果。與免疫滲濾法比較，穩(wěn)定性好，操作更簡便、快速，且由于為試條/試板形式，無需低溫保存，儲運方便。
目前，現(xiàn)有的檢測雙鏈DNA抗體的方法存在如下不足之處(1)檢測步驟繁瑣，檢測時間長，例如ELISA法、RIA法及IFT法。
(2)檢測試劑需要冷藏，例如ELISA法、RIA法、IFT法和免疫滲慮法。
(3)檢測需要特殊的儀器設(shè)備。例如，ELISA法需要酶標(biāo)儀檢測，IFT法需要熒光電鏡檢測，RIA法需要γ-計數(shù)儀或γ-閃爍計數(shù)儀檢測。
(4)檢測時存在放射性污染，例如RIA法。
(5)不適合單人/份操作，對于ELISA、RIA和IFT試劑盒，都是多人/份同時檢測才能節(jié)約成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條，能實現(xiàn)一步操作即可快速、簡便的檢測雙鏈DNA抗體。
本發(fā)明所述的膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條，是在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的玻璃纖維膜、包被膜以及吸水紙而形成的膜條，包被膜有檢測區(qū)和控制區(qū)，檢測區(qū)包被雙鏈DNA抗原，控制區(qū)包被抗鼠抗體。
所述的包被膜上，檢測區(qū)所包被的抗原為是純化的天然雙鏈DNA或者質(zhì)粒DNA抗原，自行制備或購自商品化的產(chǎn)品；控制區(qū)所包被的抗鼠抗體，是用純化的IgG免疫小鼠得到的。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條的制備方法。
本發(fā)明所述的膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條的制備方法，包括以下步驟A.抗原的制備選用純化的天然雙鏈DNA或者質(zhì)粒DNA抗原；B.包被膜的制備用包被膜緩沖液稀釋抗原至濃度為5～20μg/ml，噴印在包被膜上，涼干后在25℃～37℃封閉液中浸泡60分鐘，取出后于25℃～37℃烘干2小時，封袋備試紙板貼板用；C.金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的制備用0.1M碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH值至7.0～8.0，按9～15μg蛋白/ml膠體金加入抗雙鏈DNA抗體，混勻后靜置，離心處理，棄去上清，將沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌，將沉淀用十分之一初始膠體金的金標(biāo)保存液溶解，置2℃～8℃?zhèn)渫扛膊ＡЮw維膜用；D.將制備好的金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體涂覆在玻璃纖維膜上；E.在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的玻璃纖維膜、包被膜以及吸水紙，得到試紙板，按照要求切割成不同寬度的試紙條。
其中，所述的步驟D中，金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的涂覆方法是將制備好的金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體均勻的鋪在玻璃纖維膜上，每毫升溶液鋪4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小時，封袋，置2℃～8℃?zhèn)湓嚰埌遒N板用。
將本發(fā)明所述的試紙條固定在試劑盒的底板上，合上上蓋板，使上蓋的加樣窗對應(yīng)試紙條的樣品墊，結(jié)果顯示窗對應(yīng)檢測區(qū)和控制區(qū)，就成為可檢測雙鏈DNA抗體的試劑盒。
與現(xiàn)有的檢測試紙條相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)通過對試紙條的改進(jìn)，首次在試紙條中實現(xiàn)雙鏈DNA抗體的膠體金層析法快速檢測。(2)本發(fā)明既能克服現(xiàn)有檢測技術(shù)檢測步驟繁瑣，檢測時間長，檢測試劑需要冷藏等缺點，又能快速、簡單的、不需要儀器設(shè)備的實現(xiàn)雙鏈DNA抗體的檢測。
本發(fā)明所述的試紙條具有高度特異性、靈敏度、檢測速度快等優(yōu)點，不需使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作簡便，可用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)檢測以及預(yù)后回復(fù)性調(diào)查，也可用于醫(yī)院診所、血站、防疫站、衛(wèi)生檢疫部門、大專院校和科研機構(gòu)的疾病診斷和科學(xué)研究。


圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明的檢測結(jié)果示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條，如圖1所示，該試紙條是在底襯1上順次相互搭接地粘貼樣品墊2、涂覆金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的玻璃纖維膜3、包被膜4以及吸水紙5而形成的膜條，包被膜4有檢測區(qū)6和控制區(qū)7，檢測區(qū)6包被雙鏈DNA抗原，控制區(qū)7包被抗鼠抗體。
本發(fā)明采用純化的天然雙鏈DNA或者質(zhì)粒DNA抗原作為包被抗原，利用間接法原理檢測血清中是否含有雙鏈DNA抗體。當(dāng)待測樣本中含有雙鏈DNA抗體，抗體先和金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體結(jié)合，由于層析作用反應(yīng)復(fù)合物沿包被膜向前移動，當(dāng)遇到包被抗原時，形成抗原-抗體-金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體復(fù)合物而富集在包被線上，形成紫紅色沉淀線，為陽性結(jié)果，從而快速診斷自身免疫性疾病。
如圖2所示，加樣后，反應(yīng)1～2分鐘即可看到檢測區(qū)(T區(qū))6和控制區(qū)(C區(qū))7相應(yīng)的位置上出現(xiàn)紫紅色條帶，如圖2a所示，當(dāng)C區(qū)7和T區(qū)6均出現(xiàn)紫紅色條帶，結(jié)果為陽性，說明血清中含有雙鏈DNA抗體；如圖2b所示，如只在C區(qū)7出現(xiàn)一條紅色條帶，T區(qū)6不出現(xiàn)紫紅色條帶，結(jié)果為陰性，說明樣品不含雙鏈DNA抗體。如果C區(qū)7不出現(xiàn)紫紅色條帶，無論T區(qū)6是否有條帶出現(xiàn)，說明試紙條失效。
本發(fā)明所述的膠體金層析法檢測血液HIV1/2抗體的試紙條的制備方法見以下實施例實施例一本實施例的制備方法包括以下步驟A、抗原制備采用純化的天然雙鏈DNA或質(zhì)粒DNA抗原；質(zhì)粒DNA購自德國DIARECT AG公司。
B、抗原膜的制備
包被緩沖液的制備0.05M pH9.6硫酸鹽緩沖液為包被溶液，0.22μ膜過濾后，置2℃～8℃?zhèn)溆茫行谝恢堋?br> 封閉液的配制配制0.01M pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.22μ膜過濾后，置2℃～8℃?zhèn)溆?，有效期一周。配制封閉工作液2％BSA，2％脫脂奶，0.01M pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.22μ膜過濾后，置2℃～8℃?zhèn)浞忾]包被膜用，有效期一周。
包被膜5制備調(diào)試噴膜機(Bio-Dot)，膜液量為20ul/35cm，用包被緩沖液稀釋包被抗原，濃度為5～20μg/ml，機器劃線，兩線間隔5mm，應(yīng)細(xì)致均勻，室溫涼干20分鐘。25℃～37℃在封閉液浸泡60分鐘，取出后置25℃～37℃烘干處理2小時，封袋備試紙板貼板用。
C、膠體金、膠體金標(biāo)記抗雙鏈DNA抗體的制備氯金酸的配制用雙蒸水溶解氯金酸，配成1％溶液，置2℃～8℃?zhèn)溆?，有效期三天?000ml 1％氯金酸溶液配方10g氯金酸溶解于1000ml雙蒸水。
檸檬酸三鈉的配制用雙蒸水溶解檸檬酸三鈉，配成1％溶液，置2℃～8℃?zhèn)溆?，有效期三天?000ml 1％檸檬酸三鈉溶液配方10g檸檬酸三鈉溶解于1000ml雙蒸水。
0.1M碳酸鉀的配制用雙蒸水配制，0.22μ膜過濾，置2℃～8℃?zhèn)溆茫行谝恢堋?000ml 0.1M碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀溶解于1000ml雙蒸水。
3％PEG-20000的配制用雙蒸水配制，0.22μ膜過濾，置2℃～8℃?zhèn)溆?，有效期一周?000ml 3％PEG溶液配方30Gpeg-20000溶解于1000ml雙蒸水。
標(biāo)記洗滌液的配制2％牛血清白蛋白BSA，0.01M pH7.0 PBS溶液，0.22μ膜過濾，置2℃～8℃?zhèn)溆茫行趦芍堋?000ml標(biāo)記洗滌液配方20gBSA溶解于1000ml 0.01M pH7.0 PBS溶液。
金標(biāo)物保存液的配制1％牛血清白蛋白BSA，0.5％脫脂奶，5/萬疊氮鈉NaN3，1％吐溫-20(Tween-20)，0.01M pH7.0 PBS溶液，0.22μ膜過濾，置2℃～8℃?zhèn)溆?，有效期十五天?br> 1000ml金標(biāo)物保存液配方10gBSA；5g脫脂奶；1mlTween-20；0.5g NaN3溶解于1000ml 0.01M pH7.0 PBS溶液。
膠體金的燒制用雙蒸水將1％氯金酸溶液稀釋成0.01％，置電爐煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入4ml 1％檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫補足失水。外觀應(yīng)純凈、透亮，無沉淀和漂浮物。
金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的制備用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金pH值至7.0～8.0，按照9～15μg抗體/ml膠體金加入雙鏈DNA天然或者重組抗原，混勻，靜置30分鐘，13000rpm離心30分鐘，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清，將沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標(biāo)物保存液溶解，置2℃～8℃?zhèn)渫扛蚕跛崂w維素膜用，有效期一周。
D、金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的干燥將標(biāo)記好的膠體金均勻地鋪在玻璃纖維膜上，每毫升溶液鋪4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小時，封袋，置2℃～8℃?zhèn)湓嚰埌遒N板用。
E、試紙板地生產(chǎn)金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體玻璃纖維膜的裁切根據(jù)滴配實驗確定的寬度，將金標(biāo)抗體玻璃纖維膜進(jìn)行裁切，置干燥房間備貼板用。
吸水紙的操切用裁紙機將吸水紙切成35厘米長，4.2厘米寬，置干燥房間備貼板用。
玻璃纖維膜的裁切將玻璃纖維膜切成35厘米，寬2厘米的長條，置干燥房間備貼板用。
大板的粘貼按要求把包被膜5、加樣墊6、玻璃纖維膜7、吸水紙8粘貼在塑料底板上，組成大板。組裝車間溫度控制在25℃～30℃，濕度20％～30％。
F、切條用切條機將大板切成單個人份，每人份寬度按照一定要求2.5mm～4mm，隨機抽檢，靈敏度能檢出室內(nèi)質(zhì)控，條帶顯色程度達(dá)到一個“+”號，無非特異性條帶，能夠通過衛(wèi)生部panel。
G、組裝、包裝將1人份已切好的試紙條與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，將50人份放入一包裝盒，每盒一份說明書。于4-25℃避光保存，不得凍存。
將本發(fā)明所述的試紙條固定在試劑盒的底板上，合上上蓋板，使上蓋的加樣窗對應(yīng)試紙條的樣品墊，結(jié)果顯示窗對應(yīng)檢測區(qū)和控制區(qū)，就成為可檢測雙鏈DNA抗體的試劑盒。
實施例二本實施例的制備方法與實施例一基本相同，不同點在于步驟B中，包被膜的制備方法是用包被膜緩沖液稀釋抗原至濃度為10μg/ml，噴印在包被膜上，涼干后在25℃～37℃封閉液中浸泡60分鐘，取出后于25℃～37℃烘干2小時，封袋備試紙板貼板用。
實施例三本實施例的制備方法與實施例一基本相同，不同點在于所述的步驟C中，金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的制備用0.1M碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH值至7.0～8.0，按12μg蛋白/ml膠體金加入抗雙鏈DNA抗體，混勻后靜置，離心處理，棄去上清，將沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌，將沉淀用十分之一初始膠體金的金標(biāo)保存液溶解，置2℃～8℃?zhèn)渫扛膊ＡЮw維膜用。
權(quán)利要求
1.膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條，其特征在于該試紙條是在底襯(1)上順次相互搭接地粘貼樣品墊(2)、涂覆金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的玻璃纖維膜(3)、包被膜(4)以及吸水紙(5)而形成的膜條，包被膜(4)有檢測區(qū)(6)和控制區(qū)(7)，檢測區(qū)(6)包被雙鏈DNA抗原，控制區(qū)(7)包被抗鼠抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條，其特征在于所述的包被膜(4)上的包被抗原是純化的天然雙鏈DNA或者質(zhì)粒DNA抗原。
3.如權(quán)利要求1所述的膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟A.抗原的制備選用純化的天然雙鏈DNA或者質(zhì)粒DNA抗原；B.包被膜的制備用包被膜緩沖液稀釋抗原至濃度為5～20μg/ml，噴印在包被膜上，涼干后在25℃～37℃封閉液中浸泡60分鐘，取出后于25℃～37℃烘干2小時，封袋備試紙板貼板用；C.金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的制備用0.1M碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH值至7.0～8.0，按9～15μg蛋白/ml膠體金加入抗雙鏈DNA抗體，混勻后靜置，離心處理，棄去上清，將沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌，將沉淀用十分之一初始膠體金的金標(biāo)保存液溶解，置2℃～8℃?zhèn)渫扛膊ＡЮw維膜用；D.將制備好的金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體涂覆在玻璃纖維膜上；E.在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的玻璃纖維膜、包被膜以及吸水紙，得到試紙板，按照要求切割成不同寬度的試紙條。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟B中，包被膜的制備方法是用包被膜緩沖液稀釋抗原至濃度為10μg/ml，噴印在包被膜上，涼干后在25℃～37℃封閉液中浸泡60分鐘，取出后于25℃～37℃烘干2小時，封袋備試紙板貼板用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟C中，金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的制備用0.1M碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH值至7.0～8.0，按12μg蛋白/ml膠體金加入抗雙鏈DNA抗體，混勻后靜置，離心處理，棄去上清，將沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌，將沉淀用十分之一初始膠體金的金標(biāo)保存液溶解，置2℃～8℃?zhèn)渫扛膊ＡЮw維膜用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟D中，金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的涂覆方法是將制備好的金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體均勻的鋪在玻璃纖維膜上，每毫升溶液鋪4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小時，封袋，置2℃～8℃?zhèn)湓嚰埌遒N板用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條。本發(fā)明所述的膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條，是在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆金標(biāo)抗雙鏈DNA抗體的玻璃纖維膜、包被膜以及吸水紙而形成的膜條，包被膜有檢測區(qū)和控制區(qū)，檢測區(qū)包被雙鏈DNA抗原，控制區(qū)包被抗鼠抗體。本發(fā)明所述的試紙條具有高度特異性、靈敏度、檢測速度快等優(yōu)點，不需使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作簡便，能實現(xiàn)一步操作即可快速、簡便地檢測雙鏈DNA抗體。
文檔編號G01N33/531GK1580776SQ20041002729
公開日2005年2月16日 申請日期2004年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月21日
發(fā)明者王繼華, 李文美 申請人:王繼華