專利名稱：煙草花葉病毒云南分離物tas－elisa檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)產(chǎn)品，具體涉及一種煙草花葉病毒(Tobacco mosaicvirus，TMV)云南分離物三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(TAS-ELISA)檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
植物病毒是農(nóng)作物病毒病害的重要病原，隨著植物脫病毒種苗產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展和現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)的興起，植物病毒的檢測(cè)與防控技術(shù)日益受到重視。目前植物病毒的檢測(cè)技術(shù)有血清學(xué)技術(shù)、指示植物測(cè)定、電子顯微鏡檢測(cè)、分子檢測(cè)(包括對(duì)病毒核酸及蛋白的檢測(cè))4個(gè)方面的方法。各種方法相互印證，同時(shí)又存在檢測(cè)的靈敏度、?；浴⒃O(shè)備設(shè)施條件及成本等因素的局限。各國(guó)都在探索簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確而又經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)辦法，其中以血清學(xué)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-Linked immunosorbent assay，ELISA)是被廣泛改進(jìn)和應(yīng)用的方法。
1969年，Avrameas將酶聯(lián)抗體應(yīng)用于血清學(xué)技術(shù)中，1971年Engvall和Perlmann將該方法進(jìn)一步完善發(fā)明了ELISA方法。1974年Voller等將ELISA技術(shù)應(yīng)用于人和動(dòng)物的抗體檢測(cè)，Voller等和Clark、Adams分別于1976年和1977年將ELISA方法應(yīng)用于植物病毒的檢測(cè)。之后，ELISA方法得到進(jìn)一步發(fā)展，并廣泛應(yīng)用人和動(dòng)植物病毒的檢測(cè)中。與其它檢測(cè)方法相比，ELISA方法具有成本顯著降低，檢測(cè)的設(shè)備設(shè)施簡(jiǎn)單，快速高效的特點(diǎn)，并始終在不斷被改進(jìn)中，有直接ELISA、間接ELISA(I-ELISA)、單抗體ELISA(SPA-ELISA)。微波ELISA、雙抗體夾心ELISA(Double-antibody sandwich-ELISA，DAS-ELISA)等。目前市售的ELISA檢測(cè)試劑盒主要有I-ELISA和DAS-ELISA。如美國(guó)的Agdia公司，英國(guó)的PD公司、意大利的Agritest公司、德國(guó)的Loewe生物技術(shù)公司、瑞士的BIOREBA公司是植物病毒檢測(cè)試劑盒的主要營(yíng)銷公司。我國(guó)的植物病毒檢測(cè)試劑盒銷售公司大多為這些公司的代理或進(jìn)口試劑盒分裝銷售，也有自行研制的報(bào)道，但涉及植物病毒種類較少。
目前市售的ELISA檢測(cè)試劑盒可用于脫毒種苗和植物病毒樣品的批量化檢測(cè)，但同時(shí)也存在非特異性反應(yīng)(即假陽(yáng)性或假陰性反應(yīng))、檢測(cè)靈敏度不夠高(一般為1ng/ml-10ng/ml病毒濃度)。尤其在我國(guó)，許多種類的植物病毒抗體依賴于進(jìn)口，一方面受到進(jìn)口血液制品的限制，難以穩(wěn)定供應(yīng)，另一方面國(guó)外的抗體生產(chǎn)成本高而導(dǎo)致價(jià)格昂貴，未能滿足生產(chǎn)的需求。近年來國(guó)外的相關(guān)公司對(duì)植物病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了改進(jìn)，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了操作程序，如英國(guó)PD公司的試紙條檢測(cè)方法已實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)，但價(jià)格高昂，每樣次的檢測(cè)需100多元人民幣。國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)中規(guī)模化應(yīng)用的仍然是I-ELISA和DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，根據(jù)病毒種類的不同，每樣次的試劑成本約10-30元人民幣不等。
Roggero和Ogliara等1996年在DAS-ELISA基礎(chǔ)上，加入單克隆抗體，開展了番茄班萎病毒(TSWV)的三抗體夾心ELISA(Triple-antibody sandwich ELISA，TAS-ELISA)檢測(cè)，繼承了DAS-ELISA簡(jiǎn)便快速的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)結(jié)合了單克隆抗體?；詮?qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可高效、快速和靈敏地檢測(cè)待測(cè)樣中的病毒抗原。本發(fā)明的技術(shù)人員近年來用TAS-ELISA檢測(cè)了雙生病毒云南分離物(已發(fā)表多篇相關(guān)論文)，郭興啟等(2003)應(yīng)用TAS-ELISA檢測(cè)了馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)、美國(guó)和我國(guó)臺(tái)灣分別報(bào)道了TAS-ELISA檢測(cè)康乃馨蝕環(huán)病毒(CarERV)和壞死病毒(LNV)，F(xiàn)ranconi(2002)報(bào)道了TAS-ELISA檢測(cè)PVX，Bowman等(2002)應(yīng)用該辦法檢測(cè)黃瓜花葉病毒(CMV)，Tavert等(2002)應(yīng)用TAS-ELISA檢測(cè)煙草花葉病毒(TMV)運(yùn)動(dòng)蛋白。目前從現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道來看，有關(guān)TAS-ELISA方法研究植物病毒的報(bào)道近年雖然有所增加，但專門研制TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于植物病毒的規(guī)模化檢測(cè)尚未發(fā)現(xiàn)，同時(shí)市場(chǎng)中尚無TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒的出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、高效的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，該方法簡(jiǎn)便易行、易于規(guī)模化生產(chǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的煙草花葉病毒云南分離物三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(TAS-ELISA)檢測(cè)試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的用液，盒體內(nèi)的用液包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物，其特征在于，盒體內(nèi)的用液還包括煙草花葉病毒多克隆抗體、煙草花葉病毒單克隆抗體，所述的煙草花葉病毒多克隆抗體和所述的煙草花葉病毒單克隆抗體由20～30mg/ml病毒濃度的煙草花葉病毒提取液作為免疫抗原，分別采用免疫家兔和免疫小鼠法制備而成。
所述的煙草花葉病毒提取液的制備方法為先將含有煙草花葉病毒的病葉破碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1～3(克/毫升)，勻漿，過濾，濾液中加入濾液體積20～30％的氯仿，攪拌，收集上清液；然后在上清液中加入聚乙二醇(PEG)至濃度為4～8％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后靜置取沉淀，沉淀用0.01M磷酸鹽緩沖液懸浮，重復(fù)沉淀、懸浮處理1～3次，取上清液加入離心管離心，沉淀用含0.01M MgCl2的0.02M磷酸鉀鹽緩沖液(KPB)懸浮，離心，上清液即為病毒提純液。
具體地說，所述的煙草花葉病毒提取液的制備方法為1)病葉剪碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1(克/毫升)，攪拌充分勻漿，過濾；2)濾液中加入濾液體積25～30％氯仿，攪拌5～20min，4℃下6000rpm離心5～20min，收集上清；3)上清液中加入PEG至濃度為6～8％(克/毫升)，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃下放置4h～24h；4℃下離心力為10000g下離心10～30min；4)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下懸??；5)懸浮液中加入PEG至濃度為4～8％，NaCl終濃度為0.1M，，溶解后4℃放置4h～24h；4℃下離心力為10000g下離心10～30min；6)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下懸浮；7)在4℃、6000rpm離心轉(zhuǎn)速下5～20min，取上清液；8)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下33000rpm離心2-3h，沉淀用pH7.4～7.5，含0.01M MgCl2的0.02M磷酸鉀鹽緩沖液(KPB)懸浮，低速離心，取上清液即為病毒提純液。
所述的抽提緩沖液為0.02M磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH為7.4～7.5，含0.1％巰基乙醇。
本發(fā)明所述的勻漿、過濾、離心和懸浮，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù)。
經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明所述的病毒提純液為乳白色液體，病毒濃度為20～30mg/ml。本發(fā)明所述的病毒提純液純度及含量采用電鏡負(fù)染法及紫外分光光度儀進(jìn)行檢測(cè)，具體方法為1.電鏡負(fù)染法檢測(cè)病毒的純度病毒提純液上置電鏡銅網(wǎng)吸附3min，2％鉬酸銨染色3min，放置5min，置于JEM100CX-II型透射電子顯微鏡下觀察。在電鏡下觀察，可見其含大量的TMV病毒粒子，未見雜質(zhì)。
2.檢測(cè)病毒的純度及含量病毒提純液用PBS緩沖液稀釋10倍于BECKMAN DU640型紫外分光光度儀上測(cè)定190nm-450nm全波長(zhǎng)掃描圖、260nm和280nm吸收值。
病毒提純液經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè)，190nm～450nm全波長(zhǎng)掃描圖顯示為典型病毒掃描圖，所得病毒濃度為20～30mg/ml。其中優(yōu)選的提純樣品稀釋100倍液中A260＝0.741，A280＝0.5935，A260/A280＝1.25，病毒濃度＝A260/A0.1％260＝0.741/2.7×10＝27.44mg/ml。每克病葉得病毒0.274mg。
其中，所述的煙草花葉病毒(TMV)云南分離物多克隆抗體由20～30mg/ml病毒濃度的煙草花葉病毒提取液作為免疫抗原，采用免疫家兔法制備而成。其制備方法為選用2公斤以上健康雄性家兔作為免疫動(dòng)物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
然后進(jìn)行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點(diǎn)1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得TMV云南分離物多克隆抗體。
對(duì)所采集的TMV云南分離物多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)分析，將病毒提純液稀釋至0.01mg/ml，備用。將多克隆抗體倍比稀釋為1/10、1/20、1/40......1/20480，以間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。結(jié)果，經(jīng)四次免疫家兔后采血，分離得到35ml抗血清，間接ELISA法測(cè)的效價(jià)為1∶10000-12000。
將多克隆抗體稀釋至1mg/ml，備用。將病毒提純液稀釋為1mg/ml、0.1mg/ml0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml、0.000001mg/ml，以間接ELISA法測(cè)定抗體靈敏度。結(jié)果，經(jīng)四次免疫家兔后采血，分離得到35ml抗血清，最低檢出濃度(檢測(cè)靈敏度)達(dá)0.01-0.001ng/ml。
在組裝本發(fā)明所述的試劑盒時(shí)，所述的多克隆抗體可將所得的多克隆抗血清中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封、冷貯(-70℃)、備用。在使用時(shí)可保存于4℃中，不宜反復(fù)凍融，有效期2年。每個(gè)試劑盒中100ul，使用時(shí)可用洗滌液或蒸餾水按1∶500稀釋。
所述的煙草花葉病毒單克隆抗體由20-30mg/ml病毒濃度的煙草花葉病毒提取液作為免疫抗原，采用克隆抗體法制備而成。其制備方法選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進(jìn)行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體。
對(duì)所得單克隆抗體進(jìn)行分析，篩選出一個(gè)TMV廣譜單克隆抗體細(xì)胞株，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)為1∶10000-12000。
在組裝本發(fā)明所述的試劑盒時(shí)，所述的單克隆抗體可將制備的抗體中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封，4℃保存，備用。每個(gè)試劑盒中100ul，使用時(shí)可用洗滌液或蒸餾水按1∶500稀釋。
本發(fā)明所述的煙草花葉病毒云南分離物三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(TAS-ELISA)檢測(cè)試劑盒中，所述的陽(yáng)性對(duì)照采用含煙草花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，離心力2000g下離心10min，取上清在冷凍干燥機(jī)制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
所述的陰性對(duì)照采用無病毒煙葉，同制備陽(yáng)性對(duì)照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
本發(fā)明所述的試劑盒中所述的酶標(biāo)抗體為羊抗鼠AP-IgG，分裝，4℃保存，備用。每個(gè)試劑盒中5ul，使用時(shí)可用洗滌液或蒸餾水按1∶1000稀釋，可由Sigma公司購(gòu)買。
其他主要材料及藥品可按溶液體積稱量分裝，常溫下保存。
所述的緩沖液包括包被緩沖液、病毒抽提緩沖液、封閉緩沖液、底物緩沖液，具體用量如下①包被緩沖液每個(gè)試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g
溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6；②PBST每個(gè)試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用NaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g溶解于1000ml雙蒸水中，加入0.5％tween20(吐溫-20)充分溶解；③病毒抽提緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；或PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 10.0gNa2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；用時(shí)加入1％脫脂奶粉(W/V)；④封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；或連接緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用BAS 2.0gPVP 10.0gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；⑤底物緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽(p-NPP)。
本發(fā)明所述的試劑盒可根據(jù)應(yīng)用單位的實(shí)際需求，可組裝成每個(gè)試劑盒檢測(cè)500個(gè)樣次的抗體及藥品試劑量，可備用適量的滴管，比如20個(gè)一次性滴管，本發(fā)明所述的試劑盒可采用常規(guī)檢測(cè)和快速檢測(cè)。
采用常規(guī)檢測(cè)時(shí)，所用的病毒抽提緩沖液為Na2SO31.3g，NaN30.2g，溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；所用的封閉緩沖液為PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解。
采用快速檢測(cè)時(shí)，所用病毒抽提緩沖液為PVP 10.0g，Na2SO31.3g，NaN30.2g，溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；用時(shí)加入1％脫脂奶粉(W∶V)；所用連接緩沖液為BAS2.0g，PVP10.0g，NaN30.2g，溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4。
本發(fā)明所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟先將煙草花葉病毒進(jìn)行分離提純得病毒提取液，然后采用病毒提取液進(jìn)行煙草花葉病毒多克隆抗體及單克隆抗體的制備，再對(duì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、多克隆抗體、單克隆抗體、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物進(jìn)行制備組裝而成。
具體地說，所述的試劑盒的制備方法，包括如下步驟
1.所述的煙草花葉病毒的分離提純先將含有煙草花葉病毒的病葉破碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1～3(克/毫升)，勻漿，過濾，濾液中加入濾液體積20～30％的氯仿，攪拌，收集上清液；然后在上清液中加入聚乙二醇(PEG)至濃度為4～8％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后靜置取沉淀，沉淀用0.01M磷酸鹽緩沖液懸浮，重復(fù)沉淀、懸浮處理1～3次，取上清液加入離心管離心，沉淀用含0.01M MgCl2的0.02M磷酸鉀鹽緩沖液(KPB)懸浮，離心，上清液即為病毒提純液，所得病毒濃度為20～30mg/ml。
2.TMV多克隆抗體的制備選用2公斤以上健康雄性家兔作為免疫動(dòng)物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
然后進(jìn)行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點(diǎn)1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得TMV云南分離物多克隆抗體。
3.TMV單克隆抗體的制備選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進(jìn)行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體。
4.試劑盒的組裝(1)陽(yáng)性對(duì)照采用含煙草花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，離心力2000g下離心10min，取上清在冷凍干燥機(jī)制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
(2)陰性對(duì)照采用無病毒煙葉，同制備陽(yáng)性對(duì)照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
(3)多克隆抗體將所得的多克隆抗血清中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封、冷貯(-70℃)、備用。在使用時(shí)可保存于4℃中，不宜反復(fù)凍融，有效期2年。每個(gè)試劑盒中100ul，使用時(shí)可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋。
(4)單克隆抗體將制備的抗體中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封，4℃保存，備用。每個(gè)試劑盒中100ul，使用時(shí)可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋。
(5)酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體為羊抗鼠AP-IgG，分裝，4℃保存，備用。每個(gè)試劑盒中5ul，使用時(shí)可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋。
(6)其他主要材料及藥品①包被緩沖液每個(gè)試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6。
②PBST每個(gè)試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g加水至1000ml，加入0.5％tween20(吐溫-20)充分溶解。
③病毒抽提緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；或PVP 10.0gNa2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；用時(shí)加入1％脫脂奶粉(W/V)。
④封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；或連接緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用BAS 2.0gPVP 10.0gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4。
⑤底物緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽(p-NPP)。
其中，所述的煙草花葉病毒分離提純的方法為1)病葉剪碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1，攪拌充分勻漿，過濾；2)濾液中加入濾液體積25～30％氯仿，攪拌5～20min，4℃下6000rpm離心5～20min，收集上清；3)上清液中加入PEG至濃度為6～8％，NaCl終濃度為0.1M，，溶解后4℃下放置4h～24h；4℃下離心力為10000g下離心10～30min；
4)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下懸??；5)懸浮液中加入PEG至濃度為4～8％，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置4h～24h；4℃下離心力為10000g下離心10～30min；6)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下懸??；7)在4℃、6000rpm離心轉(zhuǎn)速下5～20min，取上清液；8)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下33000rpm離心2～3h，沉淀用pH7.4～7.5，0.02M KPB(含0.01M MgCl2)懸浮，低速離心，取上清液即為病毒提純液。
本發(fā)明的研究人員在已有ELISA檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多年的研究，研制出TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，采用本發(fā)明所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.01～0.001ng/ml，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測(cè)靈敏度提高100～1000倍。而且采用本發(fā)明所述的方法制備的TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，試劑成本便宜，易于實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，僅2元人民幣/樣次，在性價(jià)比上具有明顯的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，對(duì)于研究、免疫和防治煙草病毒有很大幫助，可應(yīng)用于脫病毒種苗(薯)、種球、工廠化育苗檢測(cè)及種質(zhì)材料進(jìn)出口檢疫。


圖1多克隆抗體免疫注射程序圖2單抗體克隆制備流程具體實(shí)施方式
下面實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但所述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例的目的在于研究TMV云南分離物的TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒的常規(guī)檢測(cè)方法。
本發(fā)明的研究人員對(duì)試劑盒的常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行研究，總結(jié)出本發(fā)明所述的TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行煙草病毒檢測(cè)時(shí)的檢測(cè)方法，具體如下1.TMV多克隆抗體以1∶500倍用包被緩沖液稀釋，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，37℃下放置3h。
2.PBST洗板6次，快速3次，慢速3次，3min/次，拍干。
3.樣品加入5～10倍病毒抽提緩沖液研磨樣品，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，每個(gè)樣品加兩個(gè)孔，4℃下放置過夜。同時(shí)如法設(shè)置陽(yáng)性、陰性、空白對(duì)照。
4.同上洗板。
5.每孔加入150ul封閉緩沖液，37℃下放置30min。
6.拋棄孔中液體，拍干。
7.TMV單抗以1∶500倍用PBST稀釋，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，37℃下放置3h。
8.同上洗板。
9.酶標(biāo)抗體羊抗鼠AP-IgG以1∶10000倍用PBST稀釋，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，37℃下放置3h。
10.同上洗板。
11.用底物緩沖液溶解底物至1mg/ml，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，室溫25℃下至充分顯色，每孔加入50ul 1N NaOH終止顯色。肉眼或酶標(biāo)儀405nm讀數(shù)判別檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例的目的在于研究TMV云南分離物的TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒的快速檢測(cè)方法。
本發(fā)明的研究人員對(duì)試劑盒的快速檢測(cè)方法進(jìn)行研究，總結(jié)出本發(fā)明所述的TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行煙草病毒檢測(cè)時(shí)的檢測(cè)方法，具體如下陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、多克隆抗體、單克隆抗體、酶標(biāo)抗體同常規(guī)檢測(cè)方法制備、保存。
緩沖液略有改變①包被緩沖液每個(gè)試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6。
②PBST每個(gè)試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g加水至1000ml，加入0.5％tween20(吐溫-20)充分溶解。
③病毒抽提緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用PVP 10.0gNa2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；用時(shí)加入1％脫脂奶粉(W/V)。
④連接緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用BAS2.0gPVP10.0gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4。
⑤底物緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)
⑥底物硝基苯磷酸鹽(p-NPP)。
快速檢測(cè)流程為1.TMV多克隆抗體以1∶500倍用包被緩沖液稀釋，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，室溫(25℃)下放置2h。
2.PBST快速洗板6次，拍干。
3.樣品中加入5-10倍病毒抽提緩沖液研磨樣品，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，每個(gè)樣品加兩個(gè)孔，室溫(25℃)下放置2.5h。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性、陰性、空白對(duì)照。
4.PBST快速洗板6次，拍干。
5.TMV單抗以1∶500倍與羊抗鼠AP-IgG以1∶10000倍用連接緩沖液稀釋，混合放置10min，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，室溫25℃下放置2h。
6.PBST快速洗板8次，拍干。
7.用底物緩沖液溶解底物至1mg/ml，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，室溫(25℃)下至充分顯色，每孔加入50ul 1N NaOH終止顯色。肉眼或酶標(biāo)儀405nm讀數(shù)判別檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)例3本實(shí)驗(yàn)例驗(yàn)證陰陽(yáng)性判別、檢測(cè)靈敏度與準(zhǔn)確率比較。
應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果判別時(shí)，記錄酶標(biāo)儀在405nm波長(zhǎng)下酶標(biāo)板每孔的OD數(shù)值，首先進(jìn)行空白孔系統(tǒng)調(diào)零，若空白孔出現(xiàn)明顯的顏色反應(yīng)，或經(jīng)空白孔調(diào)零后，系統(tǒng)檢測(cè)出現(xiàn)大量的負(fù)值時(shí)，整個(gè)系統(tǒng)測(cè)定無效；每一樣品測(cè)定雙孔的OD值應(yīng)基本一致，若兩孔測(cè)定值差別較大(一般指同一樣品相同稀釋度兩孔的OD值超過其均值的0.5-1.5倍范圍)，該酶標(biāo)板測(cè)定無效。若陽(yáng)性對(duì)照OD值低于或接近陰性對(duì)照OD值時(shí)，測(cè)定也無效。待測(cè)樣品OD值與陰性對(duì)照OD值檢測(cè)之比大于等于2.1時(shí)，待測(cè)樣品為陽(yáng)性，否則為陰性。
肉眼判別檢測(cè)結(jié)果時(shí)，首先也是觀察空白孔、陰性孔、陽(yáng)性孔的顏色，若空白孔、陰性孔顏色較深或陽(yáng)性孔無顏色或顏色較淺時(shí)，則本塊酶標(biāo)板測(cè)定無效。目測(cè)待測(cè)樣品顏色反應(yīng)與陰性對(duì)照顏色反應(yīng)深淺對(duì)比，較深則為陽(yáng)性，較淺則為陰性。
本發(fā)明所述的TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.01-0.001ng/ml，與電鏡檢測(cè)結(jié)果比較準(zhǔn)確率相符，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測(cè)靈敏度提高1000倍。
實(shí)施例1本實(shí)施例所述的煙草花葉病毒云南分離物三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(TAS-ELISA)檢測(cè)試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的用液，盒體內(nèi)的用液包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物，及煙草花葉病毒多克隆抗體和煙草花葉病毒單克隆抗體，所述的煙草花葉病毒多克隆抗體和所述的煙草花葉病毒單克隆抗體由27.4mg/ml病毒濃度的煙草花葉病毒提取液作為免疫抗原，分別采用免疫家兔和免疫小鼠法制備而成。
所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟
1.煙草花葉病毒的分離提純?cè)谔镩g采集病株樣品，經(jīng)電子顯微鏡和標(biāo)準(zhǔn)抗體檢測(cè)含有大量TMV，且只含有該病毒，樣品采集后放入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。抽提緩沖液為0.02M PBS(pH7.4含0.1％巰基乙醇)。
提純方法1)病葉剪碎。
2)加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1(克/毫升)，電動(dòng)攪拌機(jī)充分勻漿，雙層紗布過濾。
3)濾液中加入濾液體積30％氯仿，攪拌10min，4℃6000rpm離心10min，收集上清。
4)上清中加入PEG至濃度為6％(克/毫升)，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置4h。
5)4℃下，離心力為10000g離心20min。
6)沉淀用0.01M PBS(pH7.4)懸浮。
7)懸浮液中加入至PEG濃度為4％，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置24h。
8)4℃下，離心力為10000g離心20min。
9)沉淀用0.01M PBS(pH7.4)懸浮。
10)離心6000rpm，4℃，10min。
11)上清液即為粗提純液。
12)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下33000rpm離心2h，沉淀用pH7.5，0.02M KPB(含0.01M MgCl2)懸浮，低速離心，上清液乳白色液體即為病毒提純液。
對(duì)所述的病毒提純液純度及含量采用電鏡負(fù)染法及紫外分光光度儀進(jìn)行檢測(cè)，在電鏡下觀察，可見其含大量的TMV病毒粒子，未見雜質(zhì)；提純樣品稀釋100倍液中A260＝0.741，A280＝0.5935，A260/A280＝1.25，病毒濃度＝A260/A0.1％260＝0.741/2.7×10＝27.44mg/ml；每克病葉得病毒0.274mg。
2.TMV多克隆抗體的制備選用2公斤以上健康雄性家兔作為免疫動(dòng)物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
然后進(jìn)行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點(diǎn)1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得TMV云南分離物多克隆抗體。
對(duì)所采集的TMV云南分離物多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)分析，將病毒提純液稀釋至0.01mg/ml，備用。將多克隆抗體倍比稀釋為1/10、1/20、1/40......1/20480，以間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。
結(jié)果，經(jīng)四次免疫家兔后采血，分離得到35ml抗血清，間接ELISA法測(cè)的效價(jià)為1∶10240。
將多克隆抗體稀釋至1mg/ml，備用。將病毒提純液稀釋為1mg/ml、0.1mg/ml0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml、0.000001mg/ml，以間接ELISA法測(cè)定抗體靈敏度。
結(jié)果，經(jīng)四次免疫家兔后采血，分離得到35ml抗血清，最低檢出濃度(檢測(cè)靈敏度)達(dá)0.01ng/ml。
3.TMV單克隆抗體的制備選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進(jìn)行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體。
對(duì)所得單克隆抗體進(jìn)行分析，篩選出一個(gè)TMV廣譜單克隆抗體細(xì)胞株，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)為1∶10000。
4.試劑盒的組裝(1)陽(yáng)性對(duì)照采用含煙草花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，2000g離心10min，取上清在冷凍干燥機(jī)制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
(2)陰性對(duì)照采用無病毒煙葉，同制備陽(yáng)性對(duì)照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
(3)多克隆抗體將所得的多克隆抗血清中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封、冷貯(-70℃)、備用。在使用時(shí)可保存于4℃中，不宜反復(fù)凍融，有效期2年。每個(gè)試劑盒中100ul，使用時(shí)可用PBST洗滌液或蒸餾水按1∶500稀釋。
(4)單克隆抗體將制備的抗體中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封，4℃保存，備用。每個(gè)試劑盒中100ul，使用時(shí)可用PBST洗滌液或蒸餾水按1∶500稀釋。
(5)酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體為羊抗鼠AP-IgG，由Sigma公司購(gòu)買。分裝，4℃保存，備用。每個(gè)試劑盒中5ul，使用時(shí)可用PBST洗滌液或蒸餾水按1∶1000稀釋。
(6)其他主要材料及藥品①包被緩沖液每個(gè)試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6。
②PBST每個(gè)試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g加水至1000ml，加入0.5％tween20(吐溫-20)充分溶解。
③病毒抽提緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；④封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；⑤底物緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽(p-NPP)。
本實(shí)施例所述的試劑盒可組裝成每個(gè)試劑盒檢測(cè)500個(gè)樣次的抗體及藥品試劑量，備用5個(gè)酶標(biāo)板，20個(gè)一次性滴管；可用于常規(guī)規(guī)程檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.001ng/ml，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測(cè)靈敏度提高1000倍。
實(shí)施例2其他同實(shí)施例1，不同的是，煙草花葉病毒的分離提純?cè)谔镩g采集病株樣品，經(jīng)電子顯微鏡和標(biāo)準(zhǔn)抗體檢測(cè)含有大量TMV，且只含有該病毒，樣品采集后放入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。抽提緩沖液為0.02M PBS(pH7.4含0.1％巰基乙醇)。
提純方法1)病葉剪碎。
2)加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶2，電動(dòng)攪拌機(jī)充分勻漿，雙層紗布過濾。
3)濾液中加入濾液體積20％氯仿，攪拌20min，4℃6000rpm離心15min，收集上清。
4)上清中加入PEG至濃度為8％，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置24h。
5)4℃下，離心力為10000g離心30min。
6)沉淀用0.01M PBS(pH7.5)懸浮。
7)懸浮液中加入至PEG濃度為5％，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置12h。
8)4℃下，離心力為10000g離心25min。
9)沉淀用0.01M PBS(pH7.5)懸浮。
10)離心6000rpm，4℃，5min。
11)上清液即為粗提純液。
12)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下33000rpm離心2.5h，沉淀用pH7.5，0.02M KPB(含0.01M MgCl2)懸浮，低速離心，上清液乳白色液體即為病毒提純液。
對(duì)所述的病毒提純液純度及含量采用電鏡負(fù)染法及紫外分光光度儀進(jìn)行檢測(cè)，病毒濃度為29.8mg/ml。
由此病毒提純液所得多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)分析，間接ELISA法測(cè)的效價(jià)為1∶11850，最低檢出濃度(檢測(cè)靈敏度)達(dá)0.001ng/ml。
所得單克隆抗體進(jìn)行分析，篩選出一個(gè)TMV廣譜單克隆抗體細(xì)胞株，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)為1∶12000。
該試劑盒的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.06ng/ml，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測(cè)靈敏度提高800倍。
實(shí)施例3其他同實(shí)施例1，不同的是，煙草花葉病毒的分離提純?cè)谔镩g采集病株樣品，經(jīng)電子顯微鏡和標(biāo)準(zhǔn)抗體檢測(cè)含有大量TMV，且只含有該病毒，樣品采集后放入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩３樘峋彌_液為0.02M PBS(pH7.4含0.1％巰基乙醇)。
提純方法1)病葉剪碎。
2)加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶3，電動(dòng)攪拌機(jī)充分勻漿，雙層紗布過濾。
3)濾液中加入濾液體積25％氯仿，攪拌5min，4℃6000rpm離心5min，收集上清。
4)上清中加入PEG至濃度為7％，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置12h。
5)4℃下，離心力為10000g離心10min。
6)沉淀用0.01M PBS(pH7.5)懸浮。
7)懸浮液中加入至PEG濃度為4％，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置8h。
8)4℃下，離心力為10000g離心15min。
9)沉淀用0.01M PBS(pH7.5)懸浮。
10)離心6000rpm，4℃，15min。
11)上清液即為粗提純液。
12)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下33000rpm離心3h，沉淀用pH7.5，0.02M KPB(含0.01M MgCl2)懸浮，低速離心，上清液乳白色液體即為病毒提純液。
對(duì)所述的病毒提純液純度及含量采用電鏡負(fù)染法及紫外分光光度儀進(jìn)行檢測(cè)，病毒濃度為21.3mg/ml。
由此病毒提純液所得多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)分析，間接ELISA法測(cè)的效價(jià)為1∶10950，最低檢出濃度(檢測(cè)靈敏度)達(dá)0.005ng/ml。
所得單克隆抗體進(jìn)行分析，篩選出一個(gè)TMV廣譜單克隆抗體細(xì)胞株，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)為1∶1150。
該試劑盒的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.01ng/ml，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測(cè)靈敏度提高100倍。
實(shí)施例4本實(shí)施例所述的試劑盒用于快速規(guī)程檢測(cè)，其中陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、多克隆抗體、單克隆抗體、酶標(biāo)抗體同常規(guī)檢測(cè)方法制備、保存，即同實(shí)施例1。
各用液具體為①包被緩沖液每個(gè)試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6。
②PBST每個(gè)試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g加水至1000ml，加入0.5％tween20(吐溫-20)充分溶解。
③病毒抽提緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用PVP 10.0gNa2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；用時(shí)加入1％脫脂奶粉(W/V)。
④連接緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用BAS 2.0gPVP 10.0gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4。
⑤底物緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽(p-NPP)。
本實(shí)施例的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.001ng/ml，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測(cè)靈敏度提高1000倍。
權(quán)利要求
1.煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的用液，盒體內(nèi)的用液包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物，其特征在于，盒體內(nèi)的用液還包括煙草花葉病毒多克隆抗體、煙草花葉病毒單克隆抗體，所述的煙草花葉病毒多克隆抗體和所述的煙草花葉病毒單克隆抗體由20～30mg/ml病毒濃度的煙草花葉病毒提取液作為免疫抗原，分別采用免疫家兔和免疫小鼠法制備而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的煙草花葉病毒提取液的制備方法為先將含有煙草花葉病毒的病葉破碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1～3(克/毫升)，勻漿，過濾，濾液中加入濾液體積20～30％的氯仿，攪拌，收集上清液；然后在上清液中加入聚乙二醇至濃度為4～8％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后靜置取沉淀，沉淀用0.01M磷酸鹽緩沖液懸浮，重復(fù)沉淀、懸浮處理1～3次，取上清液加入離心管離心，沉淀用含0.01M MgCl2的0.02M磷酸鉀鹽緩沖液懸浮，離心，上清液即為病毒提純液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的煙草花葉病毒提取液的制備方法為1)病葉剪碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1(克/毫升)，攪拌充分勻漿，過濾；2)濾液中加入濾液體積25～30％氯仿，攪拌5～20min，4℃下6000rpm離心5-20min，收集上清；3)上清液中加入PEG至濃度為6～8％(克/毫升)，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃下放置4h～24h；4℃下離心力為10000g下離心10～30min；4)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下懸??；5)懸浮液中加入PEG至濃度為4～8％(克/毫升)，NaCl終濃度為0.1M，，溶解后4℃放置4h～24h；4℃下離心力為10000g下離心10～30min；6)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下懸??；7)在4℃、6000rpm離心轉(zhuǎn)速下5～20min，取上清液；8)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下33000rpm離心2～3h，沉淀用pH7.4～7.5，含0.01M MgCl2的0.02M磷酸鉀鹽緩沖液懸浮，低速離心，取上清液即為病毒提純液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的抽提緩沖液為0.02M磷酸鹽緩沖液，pH為7.4～7.5，含0.1％巰基乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的煙草花葉病毒云南分離物多克隆抗體由20～30mg/ml病毒濃度的煙草花葉病毒提取液作為免疫抗原，采用免疫家兔制備而成，其制備方法為選用健康雄性家兔作為免疫動(dòng)物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存；然后進(jìn)行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點(diǎn)1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得TMV云南分離物多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的煙草花葉病毒單克隆抗體由20～30mg/ml病毒濃度的煙草花葉病毒提取液作為免疫抗原，采用克隆抗體法制備而成，其制備方法選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存；單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進(jìn)行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性對(duì)照采用含煙草花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，離心力2000g下離心10min，取上清在冷凍干燥機(jī)制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用；所述的陰性對(duì)照采用無病毒煙葉，同制備陽(yáng)性對(duì)照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草花葉病毒云南分離物三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的緩沖液包括包被緩沖液、病毒抽提緩沖液、PBST、封閉緩沖液、底物緩沖液，具體用量如下1)包被緩沖液每個(gè)試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6；2)PBST每個(gè)試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H20 2.9g或Na2HPO4.12H207.2gKCl0.2g溶解于1000ml雙蒸水中，加入0.5％ tween20充分混合；3)病毒抽提緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；或PVP 10.0gNa2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；用時(shí)加入1％脫脂奶粉(W/V)；4)封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；或連接緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用BAS 2.0gPVP 10.0gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；5)底物緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)6)底物硝基苯磷酸鹽。
9.制備權(quán)利要求1所述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于，包括如下步驟先將煙草花葉病毒進(jìn)行分離提純得病毒提取液，然后采用病毒提取液進(jìn)行煙草花葉病毒多克隆抗體及單克隆抗體的制備，再對(duì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、多克隆抗體、單克隆抗體、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物進(jìn)行制備組裝而成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9述的煙草花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1).所述的煙草花葉病毒的分離提純先將含有煙草花葉病毒的病葉破碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1～3，勻漿，過濾，濾液中加入濾液體積20～30％的氯仿，攪拌，收集上清液；然后在上清液中加入聚乙二醇和氯化鈉，PEG在溶液中的濃度為4～8％(克/毫升)，NaCl的終濃度為0.1mol/L，溶解后靜置取沉淀，沉淀用0.01M磷酸鹽緩沖液懸浮，重復(fù)沉淀、懸浮處理1～3次，取上清液加入離心管離心，沉淀用含0.01M MgCl2的0.02M磷酸鉀鹽緩沖液懸浮，離心，上清液即為病毒提純液，所得病毒濃度為20-30mg/ml；2).TMV多克隆抗體的制備選用2公斤以上健康雄性家兔作為免疫動(dòng)物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存；然后進(jìn)行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點(diǎn)1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得TMV云南分離物多克隆抗體；3).TMV單克隆抗體的制備選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存；單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進(jìn)行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體；4).試劑盒的組裝(1)陽(yáng)性對(duì)照采用含煙草花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，離心力2000g下離心10min，取上清在冷凍干燥機(jī)制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用；(2)陰性對(duì)照采用無病毒煙葉，同制備陽(yáng)性對(duì)照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時(shí)加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用；(3)多克隆抗體將所得的多克隆抗血清中加防腐劑0.1％疊氮化鈉，無菌分裝后，密封、-70℃冷貯、備用；每個(gè)試劑盒中100ul，使用時(shí)可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋；(4)單克隆抗體將制備的抗體中加防腐劑0.1％疊氮化鈉，無菌分裝后，密封，4℃保存，備用；每個(gè)試劑盒中100ul，使用時(shí)可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋；(5)酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體為羊抗鼠AP-IgG，分裝，4℃保存，備用；每個(gè)試劑盒中5ul，使用時(shí)可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋；(6)其他主要材料及藥品①包被緩沖液每個(gè)試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6；②PBST每個(gè)試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O7.2gKCl0.2g溶解于1000ml雙蒸水中，加入0.5％ tween20充分混合；③病毒抽提緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；或PVP 10.0gNa2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；用時(shí)加入1％脫脂奶粉(W/V)；④封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；或連接緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，1∶100使用BAS 2.0gPVP 10.0gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；⑤底物緩沖液每個(gè)試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草花葉病毒云南分離物TAS－ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的用液，盒體內(nèi)的用液包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物，盒體內(nèi)的用液還包括煙草花葉病毒云南分離物的多克隆抗體、煙草花葉病毒云南分離物的單克隆抗體，所述的煙草花葉病毒云南分離物多克隆抗體和所述的煙草花葉病毒云南分離物單克隆抗體由20～30mg/ml病毒濃度的煙草花葉病毒提取液作為免疫抗原，分別采用免疫注射法、單克隆抗體法制備而成；本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.01～0.001ng/ml，比間接ELISA和DAS－ELISA檢測(cè)靈敏度提高100～1000倍。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1611945SQ200410033669
公開日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2004年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日
發(fā)明者張仲凱, 丁銘, 汪繼玲, 李艷芳, 周雪平, 方琦 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 紅河卷煙廠, 浙江大學(xué)