專利名稱：一種檢測氯霉素的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測分析技術領域中的一種檢測氯霉素的試劑盒。
背景技術：
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是應用廣泛的抗菌素，在畜禽疾病控制和治療中起到了重要作用。但由于氯霉素存在嚴重的副作用，能抑制骨髓細胞內(nèi)線粒體的蛋白質(zhì)合成，造成骨髓細胞和肝細胞的毒性，從而引起人的再生性障礙性貧血，粒細胞缺乏癥，新生兒、早產(chǎn)兒灰嬰綜合癥等疾病，歐美等發(fā)達國家已相繼禁止或嚴格禁止使用。2002年12月中國農(nóng)業(yè)部公告第235號文規(guī)定，氯霉素及其鹽、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品動物的所有可食組織中不得檢出。但由于氯霉素價格便宜且為廣譜抗生素，違法使用仍很普遍。因此加強對動物性食品中氯霉素的殘留檢測是非常必要的。
目前，常用于氯霉素殘留檢測的方法主要有微生物法和儀器分析法。微生物檢測法雖然經(jīng)濟、操作簡便，但在樣本中有其他微生物抑制劑存在時，其靈敏度和特異性受到限制；高效液相色譜分析法、氣譜、氣質(zhì)聯(lián)機法等單純的儀器分析方法，雖然靈敏度高，但樣本前處理及測定操作煩瑣，費用高，不適宜于大量樣本篩查，可以作為殘留的確證分析。免疫化學法，尤其是酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)其靈敏度比微生物法高，樣品前處理又比儀器分析法簡單，，特別適于現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測氯霉素的試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測氯霉素的試劑盒，包括酶標氯霉素特異性抗體及包被的載體蛋白與氯霉素偶聯(lián)物。
其中，所述酶標氯霉素特異性抗體可為酶標氯霉素單克隆抗體或酶標氯霉素多克隆抗體，所述氯霉素單克隆抗體或多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源和豚鼠源抗體，所述氯霉素單克隆抗體優(yōu)選為氯霉素鼠單克隆抗體，所述氯霉素多克隆抗體優(yōu)選為氯霉素兔多克隆抗體。以上抗體均可用氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按常規(guī)方法制備。所述氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將氯霉素和載體蛋白用混合酸酐法或活化酯法進行偶聯(lián)得到。所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血蘭蛋白(KLH)等常用載體蛋白。所述標記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸法交聯(lián)在抗體上。
可作為固定氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物的載體的物質(zhì)很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等。
為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括氯霉素標準溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液和濃縮復溶液。
所述濃縮洗滌液為含有0.8-1.2％吐溫的磷酸鹽緩沖液；所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述濃縮復溶液為含有0.8-1.2％吐溫的檸檬酸鹽緩沖液。
本發(fā)明的檢測原理為將氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物作為包被原吸附于固相載體上，加入樣品和酶標氯霉素特異性抗體，待測樣品中殘留的氯霉素和固相載體上包被的氯霉素與載體蛋白偶聯(lián)物競爭特異性抗體，顯色后終止，測定樣品吸光值，該值與樣品中氯霉素殘留量呈負相關，與標準曲線比較即可得出氯霉素的含量。
本發(fā)明的檢測氯霉素的試劑盒主要采用直接競爭ELISA方法定性或定量檢測動物組織(豬、雞、牛、羊的肌肉組織及肝臟、魚蝦等)、尿樣、血清血漿、飼料、蜂蜜、牛奶等樣品中氯霉素的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品；該試劑盒采用高特異性的氯霉素單克隆抗體或多克隆抗體，主要試劑均以工作液形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，可在動物性食品氯霉素殘留檢測中發(fā)揮重要作用。


圖1為檢測氯霉素的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖具體實施方式
實施例1、抗原及抗體的制備(1)抗原的合成將氯霉素和牛血清白蛋白(BSA)采用活化酯法進行偶聯(lián)得到免疫原。
將氯霉素和卵清蛋白(OVA)采用活化酯法進行偶聯(lián)得到包被原。
(2)氯霉素鼠單克隆抗體制備動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以氯霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為80-100μg/只，首免時將抗原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞。
細胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5-10∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
細胞凍存和復蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成1-5×106個/ml的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射雜交瘤細胞5-106個/只，7-10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
(3)氯霉素兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以氯霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg·b.w.，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7-10d后采血，測定血清效價，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
實施例2、檢測氯霉素的試劑盒(1)檢測氯霉素的試劑盒的結(jié)構(gòu)試劑盒的結(jié)構(gòu)如圖1所示，主要由盒體1、鋁膜真空包裝96孔/40孔酶標板2、6瓶氯霉素系列濃度標準品3、終止液4、酶標記物工作液5、底物顯色液A液6、底物顯色液B液7、濃縮洗滌液8、濃縮復溶液9和泡沫托架10，泡沫托架10上制有凹孔，上述試劑瓶3-9安放在泡沫托架的凹孔內(nèi)，泡沫托架10及酶標板2安放在盒體內(nèi)。其中酶標板2由塑料支架和可拆分的塑料條組成。
(2)所用試劑的配制a.氯霉素標準溶液∶氯霉素系列標準溶液6瓶，0、0.01、0.25、2.5、5.0、10.0ng/ml，1-3ml/瓶。
b.包被緩沖液pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
c.封閉液3-10％小牛血清。
d.濃縮洗滌液含0.8-1.2％吐溫的磷酸鹽緩沖液(0.01M pH7.4)，為正常使用濃度的15-25倍，30-50ml/瓶，1瓶。
e.酶標記物工作液酶標氯霉素抗體工作液，使用蛋白濃度為0.5-5.0μg/L的酶標氯霉素抗體，5-8ml/瓶，1瓶。
f.底物顯色液A液過氧化氫或過氧化脲，5-8ml/瓶，1瓶。
g.底物顯色液B液鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，5-8ml/瓶，1瓶。
h.終止液1-2mol/L硫酸或鹽酸，5-8ml/瓶，1瓶。
i.濃縮復溶液含0.8-1.2％吐溫的檸檬酸鹽緩沖液，為正常使用濃度的5-10倍，30-50ml/瓶，1瓶。
(3)酶標板的制備用氯霉素與卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶標板，其制備方法如下用包被緩沖液將氯霉素與卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實施例3、樣品的前處理(1)動物組織 稱取5g勻漿后的樣品，加入20ml乙酸乙酯，渦動，3000g離心5分鐘，取有機相于雞心瓶中。再向樣品中加入20ml乙酸乙酯重復提取一次，3000g離心，取上清，將兩次上清合并于雞心瓶中。50℃減壓蒸干，加入4.5ml蒸餾水溶解，加正己烷，混勻，靜置，棄上層有機相。加入0.5ml濃縮復溶液，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(2)尿樣 取1ml尿液，加入0.5ml 100mM醋酸鈉緩沖液，pH4.8，加入8μlβ-葡萄糖醛酸酶，37℃孵育3h，恢復至室溫后加入2ml乙酸乙酯混合，3000g離心10分鐘，取出1ml上層液體用氮氣吹干，用濃縮復溶液稀釋樣品，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(3)血清血漿 取1ml血清血漿，加入2ml乙酸乙酯，混合振蕩，3000g離心10分鐘，取1ml上層液用氮氣吹干，用復溶液稀釋樣品，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(4)飼料 取5g飼料加入20ml乙酸乙酯，混合，振蕩，3000g離心10分鐘。取1ml上層液用氮氣吹干。用1ml異辛烷+氯仿(40+60)溶解殘留物。用濃縮復溶液稀釋樣品，3000g離心10分鐘，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(5)蜂蜜 取1g蜂蜜，加入4ml蒸餾水，再加4ml乙酸乙酯，混合，振蕩，3000g離心10分鐘。取2ml上層液用氮氣吹干，用濃縮復溶液稀釋樣品，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(6)牛奶 將奶樣6000g離心10分鐘，吸除上層的脂肪，取0.5ml去除脂肪奶用復溶液稀釋，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
實施例4、檢測雞肝樣品中殘留的氯霉素(1)樣品前處理稱取5g勻漿后的樣品，加入20ml乙酸乙酯，渦動，靜置20分鐘，3000g離心5分鐘，取有機相于雞心瓶中。再向樣品中加入20ml乙酸乙酯重復提取一次，3000g離心10分鐘，取上清，將兩次上清合并于雞心瓶中。50℃減壓蒸干，加入4.5ml蒸餾水溶解，加正己烷5ml，混勻，靜置，棄上層有機相。加入0.5ml濃縮復溶液，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(2)樣品溶液的檢測向氯霉素與卵清蛋白偶聯(lián)物包被的96孔酶標板微孔中加系列標準溶液或樣品溶液(各2孔)50μl，然后加入酶標氯霉素鼠單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應1h。倒出孔中液體，每孔加入250μl濃縮洗滌液(含1.2％吐溫的磷酸鹽緩沖液(0.01M pH7.4))，1分鐘后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次。每孔加入底物顯色液A液(過氧化氫)50μl，再加B液(鄰苯二胺)50μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色5-10min。每孔加入終止液(1mol/L硫酸)50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值(OD值)。
本實施例所用的試劑均按照實施例2中的試劑配制方法進行配制。
所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標準(0標準)的吸光度值(B0)再乘以100，即百分吸光度值。
公式中B為標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標準溶液的平均吸光度值。以氯霉素濃度(μg/L)的自然對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖，相對應每一個樣品的濃度(μg/L)可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。整個檢測過程只需1.5小時就可以完成。
實施例5、試劑盒靈敏度、特異性、精密度、準確度和保存期試驗(1)試劑盒靈敏度試驗50％抑制濃度(既IC50，指0標準溶液的吸光度值的50％處所對應的藥物濃度)常作為評價競爭ELISA試劑盒靈敏度的指標。分別測定20次標準曲線的50％抑制濃度，確定該試劑盒標準曲線IC50應在1.5-4.0μg/L的范圍之內(nèi)。分別測定20份雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚蝦、血清血漿、尿樣、蜂蜜、牛奶和飼料的空白樣品及20份氯霉素0標準品。結(jié)果判定該試劑盒對氯霉素0標準品最低檢測限為0.05μg/L。對肌肉、肝臟、魚蝦、血清血漿、尿樣、蜂蜜和飼料的最低檢測限均小于0.1μg/L；對牛奶樣品的最低檢測限為0.15μg/L。
(2)試劑盒特異性試驗選擇與氯霉素類似結(jié)構(gòu)和類似功能的4種氯霉素類藥物測定交叉反應率。通過各種藥物的標準曲線分別得到其50％抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它藥物的交叉反應率。交叉反應率愈小，表明試劑盒的特異性愈高。

表1.試劑盒的特異性

試劑盒特異性試驗結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明該試劑盒對氯霉素和琥珀氯霉素的交叉反應率高(注琥珀氯霉素進入體內(nèi)經(jīng)酶消解成為氯霉素發(fā)揮藥理作用，所以在動物源食品中均以氯霉素形式存在)，可保證對動物源食品及飼料中氯霉素殘留檢測結(jié)果的可靠性。
(3)試劑盒精密度試驗標準可重復性從三批酶聯(lián)板中，每板各抽出20個微孔，測定同一濃度標準溶液的吸光度值(OD值)，重復測定10次，計算變異系數(shù)。變異系數(shù)范圍在3.5-9.7％。
樣品可重復性取不同濃度的氯霉素標樣，添加到樣品中，分別取三個不同批次的試劑盒各三個，每個濃度重復5次。分別計算板內(nèi)，批內(nèi)，批間變異系數(shù)。動物肌肉、動物肝臟、魚蝦、血清血漿、尿樣、牛奶和蜂蜜的變異系數(shù)均低于20.0％，飼料的變異系數(shù)均低于15.0％。
(4)試劑盒的準確度取4個濃度的氯霉素標樣，對樣品進行添加回收試驗，每個濃度設4個平行，分別計算回收率。動物肝臟、動物肌肉、魚蝦、血清血漿、尿樣、蜂蜜、牛奶和飼料的添加回收率均在60.0-120.0％范圍內(nèi)。
(5)試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、氯霉素添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結(jié)果表明該試劑盒各項指標完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測氯霉素的試劑盒，包括酶標氯霉素特異性抗體及包被的氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括氯霉素標準溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液和濃縮復溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述酶標氯霉素特異性抗體為酶標氯霉素單克隆抗體或酶標氯霉素多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、血蘭蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為含有0.8％-1.2％吐溫的磷酸鹽緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮復溶液為含0.8％-1.2％吐溫的檸檬酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測氯霉素的試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測氯霉素的試劑盒，包括酶標氯霉素特異性抗體及包被的氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物。本發(fā)明的檢測氯霉素的試劑盒能同時快速檢測大批樣品；主要試劑均以工作液形式提供，使用方便；具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，可在動物性食品氯霉素殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/544GK1690708SQ20041003725
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者沈建忠, 丁雙陽, 魏書林, 史為民, 張素霞, 江海洋, 劉金鳳 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學