專利名稱：飲用水生物處理的ttc－脫氫酶活性測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)境監(jiān)測方法，特別是一種對飲用水生物處理中的生物活性進行測定的方法。
背景技術(shù)：
水中有機污染物的生物降解過程的本質(zhì)是酶促反應過程，有機物在微生物酶的催化下進行氧化分解，在微生物生理代謝方面，物質(zhì)代謝和能量代謝密切相關(guān)。細胞中能量代謝的關(guān)鍵一環(huán)，是細胞中有機物氧化分解的各代謝之路所產(chǎn)生的氫(H+/e)通過呼吸鏈而產(chǎn)生能量。脫氫酶是呼吸鏈的主干酶系，其輔酶口(NAD+-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)或輔酶口(NADP+-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)是重要的遞氫體，它們可以把基質(zhì)氧化脫下的氫(H+/e)傳如呼吸鏈脂質(zhì)分子態(tài)氧。氫(H+/e)在呼吸鏈傳遞過程中，釋放出能量用于生物合成和維持細胞的生命活動。氫(H+/e)之所以能夠通過呼吸鏈最終與受氫體氧結(jié)合成水，其動力在于氧化呼吸鏈各組成部分的氧化還原電位不同。細胞中有機物脫氫是生物氧化分解的關(guān)鍵步驟，分子氧是生物氧化的最終受氫體，經(jīng)過氧化傳遞給最終受氫體的氫(H+/e)越多，說明脫氫酶活性越高。所以，脫氫酶水平的高低直接關(guān)系到有機污染物的生物降解速度以及水處理工藝的運行效果。
目前，國內(nèi)外常以脫氫酶高溫萃取法來測定污水生物處理中的生物活性，該法采用高溫(90℃)萃取樣品顯色液，再進行比色分析。由于萃取時溶劑蒸發(fā)，極易破塞而溢，從而導致測定結(jié)果不穩(wěn)定，使得這一生化分析技術(shù)在實際應用方面受到限制。而且，由于技術(shù)上的原因，該方法主要應用于廢水生物處理方面，在飲用水生物處理方面尚未見應用脫氫酶活性的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測結(jié)果穩(wěn)定的飲用水生物處理的生物活性檢測方法，它包括如下操作步驟a.樣品的采集與制備取待處理水樣10～15g放入含有50～100mL無菌水的三角瓶中，加蓋無菌棉塞，扎緊后置于振蕩器上振蕩60min，振蕩頻率240次/min，所得生物膜混合液便可作為TTC-DHA活性測定的樣品；b.樣品濃縮將a步驟待測樣品轉(zhuǎn)移到100mL離心管內(nèi)，以4000r/min的速度離心10min，靜止后，棄去上清液，將沉淀物用10mL蒸餾水洗入25mL比色管中，再依次加入7.5mL Tris-HCl緩沖液，pH＝8.4；2.5mL體積濃度0.36％的Na2SO3溶液；2.5mL體積濃度0.4％的TIC溶液和2.5mL蒸餾水，混合均勻后，立即從上述混合液中吸取5mL注入具塞試管中，并加入0.5mL甲醛溶液，作為對照樣品；c.樣品培養(yǎng)將25mL比色管連同樣品對照管一起置36～38℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～4h；d.終止酶反應分別向25ml比色管和對照管中加入2.0mL甲醛溶液，混合均勻，并將25ml比色管內(nèi)的溶液分裝于4個具塞試管中，再連同樣品對照管一道離心5min，棄去上清液；e.比色分析向上述試管中各加入5.0mL丙酮，并將試管底部沉淀物攪拌混合均勻，于36～38℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱中保持10min，然后于4000r/min條件下離心5min，取上清液，在1cm比色皿的485nm處進行比色，記錄吸光值，然后根據(jù)通常方法即可檢測出樣品的TTC-脫氫酶活性。本發(fā)明的TTC-脫氫酶活性法，解決了檢測尺度和低基質(zhì)濃度條件下的生物活性檢測問題。該方法采用科學的樣品采集手段，以氧化還原性有機染料2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyl Tetrazoliumchloride，簡稱TTC)為人工受氫體，它在細胞呼吸過程中接受氫(H+/e)以后，其還原產(chǎn)物TF呈現(xiàn)紅色，該反應在微生物細胞內(nèi)進行，TF不溶于水，因此可采用有機溶劑將其萃取出來，用分光光度法于485nm處測定其光密度，進而根據(jù)標準曲線計算TF生成量，即TTC-脫氫酶活性(Dehydrogenase Activity，簡稱TTC-DHA)。本發(fā)明的方法用于檢測飲用水的生物活性，它的檢測結(jié)果穩(wěn)定，具有極高的實用價值，利于推廣應用。
具體實施例方式本發(fā)明的測定方法包括如下操作步驟a.樣品的采集與制備用采樣器取樣10～20g，分別裝在無菌平皿中。稱取10～15g樣品放入含有50～100mL無菌水的三角瓶中，加蓋無菌棉塞，扎緊后置于振蕩器上振蕩60min，振蕩頻率240次/min，所得生物膜混合液便可作為TTC-DHA活性測定的樣品；b.樣品濃縮將a步驟經(jīng)振蕩脫膜后所得到的生物絮體懸液轉(zhuǎn)移到100mL離心管內(nèi)，以4000r/min的速度離心10min，靜止后，棄去上清液，將沉淀物用10mL蒸餾水洗入25mL比色管中，再依次加入7.5mL Tris-HCl緩沖液(pH＝8.4)，2.5mL體積濃度0.36％的Na2SO3溶液，2.5mL體積濃度0.4％的TTC溶液和2.5mL蒸餾水，混合均勻，并立即從上述混合液中吸取5mL于具塞試管中，加入0.5mL甲醛溶液，以終止酶反應，作為樣品對照；c.樣品培養(yǎng)將25mL比色管連同樣品對照管一起置37±1℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-4h，以便樣品中微生物細胞內(nèi)進行生化反應，還原TIC生成紅色Triph-enyl Formazone，即TF；d.終止酶反應分別向25ml比色管和對照管中加入2.0mL甲醛溶液，混合均勻，并將25ml比色管內(nèi)的溶液以5.5mL為1份分裝于4個具塞試管中，再連同樣品對照管一道離心5min，棄去上清液；e.比色分析向上述試管中各加入5.0mL丙酮，并將試管底部沉淀物攪拌混合均勻，于36～38℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱中保持10min，然后將萃取完畢的試管于4000r/min條件下離心5min，取上清液，取上清液于485nm處(1cm比色皿)進行比色，記錄吸光值，然后根據(jù)樣品顯色液與樣品對照萃取液的吸光值之差，查標準曲線，進而計算出檢測樣品的TTC-脫氫酶活性.測定結(jié)果以每立方厘米生物樣品每小時還原TTC所生成的TF微克數(shù)(ugTF/cm3·h-1)表示。
本發(fā)明權(quán)利要求所提到的具體參數(shù)，如時間、溫度等，在實際使用過程中，各具體參數(shù)的控制不可能絕對與本發(fā)明所述參數(shù)一致，所以只要按照本發(fā)明的方法實現(xiàn)了本發(fā)明的目的，就應在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)；另外，如所取水樣的量以及使用培養(yǎng)基的量，并不一定是在實際使用過程中的絕對數(shù)值，所以，只要是它們之間的比例，即應在本發(fā)明的保護范圍，而不限于本發(fā)明所述的具體數(shù)值。
權(quán)利要求
1.一種飲用水生物處理的TTC-脫氫酶活性測定方法，其特征在于它包括如下操作步驟a.樣品的采集與制備取待處理水樣10～15g放入含有50～100mL無菌水的三角瓶中，加蓋無菌棉塞，扎緊后置于振蕩器上振蕩60min，振蕩頻率240次/min，所得生物膜混合液便可作為TTC-DHA活性測定的樣品；b.樣品濃縮將a步驟待測樣品轉(zhuǎn)移到100mL離心管內(nèi)，以4000r/min的速度離心10min，靜止后，棄去上清液，將沉淀物用10mL蒸餾水洗入25mL比色管中，再依次加入7.5mL Tris-HCl緩沖液，pH＝8.4；2.5mL體積濃度0.36％的Na2SO3溶液；2.5mL體積濃度0.4％的TTC溶液和2.5mL蒸餾水，混合均勻后，立即從上述混合液中吸取5mL注入具塞試管中，并加入0.5mL甲醛溶液，作為對照樣品；c.樣品培養(yǎng)將25mL比色管連同樣品對照管一起置36～38℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～4h；d.終止酶反應分別向25ml比色管和對照管中加入2.0mL甲醛溶液，混合均勻，并將25ml比色管內(nèi)的溶液分裝于4個具塞試管中，再連同樣品對照管一道離心5min，棄去上清液；e.比色分析向上述試管中各加入5.0mL丙酮，并將試管底部沉淀物攪拌混合均勻，于36～38℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱中保持10min，然后于4000r/min條件下離心5min，取上清液，在1cm比色皿的485nm處進行比色，記錄吸光值，然后根據(jù)通常方法即可檢測出樣品的TTC一脫氫酶活性。
全文摘要
飲用水生物處理的TTC－脫氫酶活性測定方法，它涉及一種環(huán)境監(jiān)測方法，特別是一種對飲用水生物處理中的生物活性進行測定的方法。目前，測定污水生物處理中的生物活性方法，由于萃取時溶劑蒸發(fā)，極易破塞而溢，從而導致測定結(jié)果不穩(wěn)定，使得這一生化分析技術(shù)在實際應用方面受到限制。本發(fā)明方法包括如下操作步驟a.樣品的采集與制備，b.樣品濃縮，c.樣品培養(yǎng)，d.終止酶反應，e.比色分析。本發(fā)明的方法解決了檢測尺度和低基質(zhì)濃度條件下的生物活性檢測問題，它的檢測結(jié)果穩(wěn)定，具有極高的實用價值，利于推廣應用。
文檔編號G01N1/28GK1598578SQ200410043738
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者馬放, 韓健, 任南琪, 楊基先 申請人:哈爾濱工業(yè)大學