專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域中的一種檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
克侖特羅又稱(chēng)咳喘素，是一種β-興奮劑?？藗愄亓_進(jìn)入體內(nèi)后能夠改變養(yǎng)分的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉，特別是骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成，抑制脂肪的合成和積累，從而改善胴體品質(zhì)，使生長(zhǎng)速度加快，瘦肉相對(duì)增加，所以，稱(chēng)它為“瘦肉精”。在可食用動(dòng)物的飼養(yǎng)中國(guó)內(nèi)外均有非法使用該藥物提高經(jīng)濟(jì)效益的現(xiàn)象，然而長(zhǎng)期使用會(huì)使該藥物蓄積在可食用動(dòng)物的組織中，人食用該組織后，會(huì)產(chǎn)生骨骼肌震顫、心跳過(guò)速、頭痛等一系列不良反應(yīng)，嚴(yán)重的甚至危及生命。因此歐美各國(guó)均禁止在畜牧業(yè)生產(chǎn)上使用克侖特羅，我國(guó)也嚴(yán)禁將克侖特羅用于所有食用動(dòng)物中并將其列為獸藥殘留監(jiān)控的重點(diǎn)。我國(guó)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定克侖特羅為不得檢出藥物。
現(xiàn)已報(bào)道的克侖特羅殘留量分析方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法以及試紙條檢測(cè)法，其中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法已經(jīng)列為行業(yè)或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然可以進(jìn)行定量分析，但需要經(jīng)過(guò)繁瑣的樣品前處理過(guò)程，儀器設(shè)備昂貴，很難用于大量樣品的檢測(cè)；而試紙條檢測(cè)法的靈敏度達(dá)不到檢測(cè)要求。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被的二抗、克侖特羅特異性抗體和酶標(biāo)克侖特羅。
為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括A，B，C，D，E，F(xiàn)試劑液、G試劑液、H試劑液、I試劑液、J試劑液、K試劑液、L試劑液。
所述A，B，C，D，E，F(xiàn)試劑液為克侖特羅系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。
所述G試劑液為酶標(biāo)克侖特羅濃縮液。
所述H試劑液為克侖特羅抗體濃縮液。
所述I試劑液為磷酸鹽緩沖液。
所述J試劑液為四甲基聯(lián)苯胺。
所述K試劑液為檸檬酸緩沖液。
所述L試劑液為終止液。
其中，所述克侖特羅特異性抗體可為克侖特羅單克隆抗體或克侖特羅多克隆抗體；所述克侖特羅單克隆抗體或多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、豬源、兔源和豚鼠源抗體，所述克侖特羅單克隆抗體優(yōu)選為克侖特羅鼠單克隆抗體，所述克侖特羅多克隆抗體優(yōu)選為克侖特羅兔多克隆抗體。
以上抗體均可以用克侖特羅與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按常規(guī)方法制備。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、兔血清白蛋白(RSA)、甲狀腺球蛋白(TG)、或血蘭蛋白(KLH)等常用載體蛋白；所述克侖特羅與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過(guò)將克侖特羅和載體蛋白用戊二醛法、高碘酸鈉法或重氮法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
所述標(biāo)記酶可為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶。辣根過(guò)氧化物酶可通過(guò)戊二醛法、高碘酸鈉法或重氮法標(biāo)記于克侖特羅上。所述二抗可為抗鼠或抗兔抗抗體，優(yōu)選為羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
可作為固定所述二抗的載體的物質(zhì)很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等。
本發(fā)明的檢測(cè)原理為將二抗吸附于固相載體上，加入樣品和酶標(biāo)克侖特羅，再加入克侖特羅特異性抗體，待測(cè)樣品中殘留的克侖特羅和酶標(biāo)克侖特羅競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體，顯色后終止，測(cè)定樣品吸光值，該值與樣品中克侖特羅殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較即可得出克侖特羅的含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較可判斷樣品的濃度范圍。
本發(fā)明的檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物組織(豬、雞、牛、羊的肌肉組織及肝臟、腎臟尿等)、尿樣等樣品中克侖特羅的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，尿樣離心后可直接檢測(cè)，檢測(cè)快速，時(shí)間約為1.5小時(shí)；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中有1μg/L這一濃度點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了定性與定量一體化；最低檢測(cè)限達(dá)0.1μg/L，該試劑盒與其它β興奮劑交叉率很低，僅與沙丁胺醇有3.6％的交叉反應(yīng)，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，可在動(dòng)物性食品克侖特羅殘留檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、克侖特羅抗原及抗體的制備(1)克侖特羅抗原的合成以人血清白蛋白為載體，克侖特羅為半抗原，用重氮化法、戊二醛法、多元酸酐法或EDC法將克侖特羅偶聯(lián)在人血清白蛋白上，得到克侖特羅抗原。
(2)克侖特羅兔多克隆抗體的制備采用日本大耳兔作為免疫動(dòng)物，以步驟(1)中合成的抗原為免疫原，免疫劑量每次為2mg/mL免疫抗原，首次免疫用2mL完全福氏佐劑乳化，四周后加強(qiáng)免疫用2mL不完全福氏佐劑乳化。每次加強(qiáng)免疫間隔2周，共免疫5-10次，最后一次不加免疫佐劑直接肌肉注射，7天后采血檢測(cè)，測(cè)定血清抗體效價(jià)后，頸動(dòng)脈放血，提取血清，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。
(3)克侖特羅單克隆抗體制備采用BALB/C小鼠作為免疫動(dòng)物，以步驟(1)中合成的抗原為免疫原，劑量為50μg(0.1mL)加等體積完全福氏佐劑乳化，進(jìn)行首次皮下多點(diǎn)注射免疫。一月后，取同樣量免疫抗原加不完全福氏佐劑，乳化，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，再過(guò)一月后免疫抗原不加佐劑腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，之后5天采血，測(cè)定抗體效價(jià)。取脾細(xì)胞按4∶1比例與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合。采用有限稀釋或軟瓊脂平板法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1×106-5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。定期檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×105-106個(gè)/只，7-10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
(4)克侖特羅-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物的制備用用重氮化法、戊二醛法、多元酸酐法或EDC法將克侖特羅標(biāo)記于辣根過(guò)氧化物酶上，獲得克侖特羅-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，克侖特羅殘留檢測(cè)靈敏度(即50％抑制濃度)小于或等于1μg/kg。
(5)二抗的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠或兔IgG為免疫原進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗抗體。具體方法如下將經(jīng)硫酸銨沉淀法純化的兔或鼠免疫球蛋白用等量福氏完全佐劑乳化后，肌肉、皮下、皮內(nèi)多點(diǎn)免疫成年綿羊，免疫劑量為10mg蛋白/只，一月后，用半量的兔或鼠免疫球蛋白加入福氏不完全佐劑肌肉、皮下或皮內(nèi)注射綿羊，之后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次。瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶32以上時(shí)，采血，分離血清，用硫酸銨沉淀法粗提后，用免疫親和柱層析法提取羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，得到純化的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
實(shí)施例2、檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒1、檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒的結(jié)構(gòu)該試劑盒主要由盒體，酶標(biāo)板，A，B，C，D，E，F(xiàn)試劑液(克侖特羅系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液)、G試劑液(克侖特羅-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物濃縮液)、H試劑液(克侖特羅抗體濃縮液)、I試劑液(磷酸鹽緩沖液)；J試劑液(四甲基聯(lián)苯胺)；K試劑液(檸檬酸緩沖液)；L試劑液(終止液)；蓋板膜和托架組成。上述試劑液存放在試劑瓶中。托架內(nèi)裝有上述A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，J試劑瓶。托架，酶標(biāo)板、蓋板膜、I試劑瓶、K試劑瓶和L試劑瓶均安裝在盒體內(nèi)。酶標(biāo)板由塑料支架和各自分開(kāi)的帶孔的塑料條組成。
2、所用試劑的配制A，B，C，D，E，F(xiàn)試劑液為克侖特羅系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為0、0.1、0.3、1、3、9μg/L。
G試劑液為克侖特羅-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物濃縮液，含有5-500mg/L的克侖特羅-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物。
H試劑液為克侖特羅抗體濃縮液，含有蛋白濃度為5-500mg/L的克侖特羅鼠單克隆抗體或兔多克隆抗體。
I試劑液為0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液。
J試劑液為0.1-10mg/mL四甲基聯(lián)苯胺溶液。
K試劑液為0.1M pH5.0檸檬酸緩沖液。
L試劑液為終止液，1-2mol/L硫酸或鹽酸。
3、酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液(0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液)將羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG稀釋成0.1-5μg/ml，每孔加入100μl，4℃過(guò)夜，傾去包被緩沖液，用0.05％吐溫的0.05M pH7.2磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加5％脫脂牛奶0.05M磷酸鹽緩沖液250μl，室溫溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實(shí)施例3、樣品的前處理及檢測(cè)1、豬尿凍融后離心取上清，直接檢測(cè)。
2、豬肝
(1)提取稱(chēng)取絞碎組織1.0g，置于離心管中，加50mmol/L鹽酸5mL，振蕩1.5h，于10-15℃以5000r/min或更高的速度離心15min，上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中。加入1mol/L氫氧化鈉溶液300μL，混勻。振搖15min，加500mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH3.0)4mL，混勻，4℃放置1.5h或過(guò)夜。再以5000r/min或更高的速度10-15℃離心15min，取清亮的上清液備用。
(2)凈化C18固相萃取柱依次用無(wú)水甲醇3mL、50mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH3.0)2mL預(yù)洗。取全部備用液過(guò)柱，用50mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液2mL淋洗，擠干。用無(wú)水甲醇2mL洗脫，收集洗脫液，在50-60℃中用氮?dú)饣蚩諝獯蹈?。殘?jiān)盟?.0mL溶解(如有沉淀用5000r/min以上的速度離心)，上清作為供試試料。
3、檢測(cè)檢測(cè)前將試劑盒恢復(fù)室溫(18℃-30℃)，用試劑液H和I配成抗體溶液，分別在酶聯(lián)板微孔中加入20μl A，B，C，D，E，F(xiàn)試劑液和試樣溶液，然后每微孔中加入100μl抗體溶液，18℃-30℃孵育30min。用去離子水洗酶標(biāo)板3次，拍干。用試劑液G和I配成酶結(jié)合物溶液，然后每微孔中加入100μl酶結(jié)合物溶液，蓋上蓋板膜，18℃-30℃孵育30min。再用去離子水洗酶標(biāo)板3次，拍干，用J試劑液與K試劑液配制底物混合液(0.1％四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸緩沖液)，取100μl加入酶標(biāo)板小孔后混勻，避光顯色約15min，最后加入M終止液(2mol/L硫酸)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處A450值。按下 式計(jì)算百分吸光度值(B-為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光度值；B0-為0濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液平均吸光度值。)以標(biāo)準(zhǔn)溶液中克侖特羅濃度的對(duì)數(shù)為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出試樣溶液中克侖特羅濃度。
實(shí)施例4、試劑盒靈敏度、特異性、精密度和準(zhǔn)確度該試劑盒的二抗為羊抗兔IgG抗體，克侖特羅特異性抗體為克侖特羅兔多克隆抗體，酶標(biāo)克侖特羅為克侖特羅-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物。
1、靈敏度按常規(guī)方法進(jìn)行了試劑盒靈敏度試驗(yàn)，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍為0.1μg/L-9μg/L，其中包含1μg/L這一臨界濃度點(diǎn)；試劑盒的最低檢測(cè)限為0.1μg/L，在豬尿和豬肝等樣品中檢測(cè)限≤1.0μg/L(kg)。
2、特異性測(cè)定選擇與克侖特羅結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似的八種藥物，分別測(cè)定交叉反應(yīng)率。結(jié)果如表1所示，表明該試劑盒與其它β興奮劑交叉率很低，僅與沙丁胺醇有3.6％的交叉反應(yīng)，樣品的測(cè)定結(jié)果能代表克侖特羅殘留量。

表1.交叉反應(yīng)

3、準(zhǔn)確度、精密度測(cè)定分別在空白豬尿、豬肝中添加克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)液至終濃度為1.0μg/L和2.0μg/L。各濃度分別制備樣品5份，然后分別測(cè)定其含量，重復(fù)3次。結(jié)果表明在豬肝中，1μg/kg添加濃度的回收率為40％～110％；在豬尿中，1μg/L添加濃度的回收率為60％～120％；在空白添加添加豬肝和豬尿樣品中，批內(nèi)變異系數(shù)CV≤20％，批間變異系數(shù)CV≤25％。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被的二抗、克侖特羅特異性抗體和酶標(biāo)克侖特羅。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括A，B，C，D，E，F(xiàn)試劑液、G試劑液、H試劑液、I試劑液、J試劑液、K試劑液和L試劑液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述克侖特羅特異性抗體為克侖特羅單克隆抗體或克侖特羅多克隆抗體，它們是用克侖特羅與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述克侖特羅單克隆抗體或多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、豬源、兔源或豚鼠源抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述克侖特羅單克隆抗體為克侖特羅鼠單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述克侖特羅多克隆抗體為克侖特羅兔多克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述二抗為抗鼠或抗兔抗抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述二抗為羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被的二抗、克侖特羅特異性抗體和酶標(biāo)克侖特羅。本發(fā)明的檢測(cè)克侖特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，尿樣離心后可直接檢測(cè)，檢測(cè)快速，時(shí)間約為1.5小時(shí)；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中有1μg/L這一濃度點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了定性與定量一體化；最低檢測(cè)限達(dá)0.1μg/L，該試劑盒與其它β興奮劑交叉率很低，僅與沙丁胺醇有3.6％的交叉反應(yīng)，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，可在動(dòng)物性食品克侖特羅殘留檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/544GK1707266SQ20041004656
公開(kāi)日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2004年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月11日
發(fā)明者劉智宏, 郭文林, 葉妮, 黃齊頤, 郭筱華 申請(qǐng)人:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所