專利名稱：一種酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬電化學(xué)和臨床化學(xué)分析領(lǐng)域，涉及一種酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法，具體涉及一種檢測(cè)過氧化物酶及其底物反應(yīng)系統(tǒng)的電化學(xué)方法背景技術(shù)1971年Engvall等建立了酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)技術(shù)，用于檢測(cè)生物標(biāo)本中的抗體或抗原。利用過氧化物酶(HRP)作為標(biāo)記物的ELISA的基本原理是，將HRP與抗體或抗原交聯(lián)，得到酶結(jié)合物，它與待測(cè)物中的抗原或抗體結(jié)合，分離并棄除游離的酶結(jié)合物后，加入HRP的底物，經(jīng)化學(xué)反應(yīng)，形成有色的產(chǎn)物，用酸中止反應(yīng)后，經(jīng)光度計(jì)在一定波長(zhǎng)下比色，根據(jù)吸光度的高低，與標(biāo)準(zhǔn)比較，計(jì)算待測(cè)物的量。上述技術(shù)后經(jīng)不斷改進(jìn)和完善，現(xiàn)在已成為一項(xiàng)廣泛應(yīng)用的光學(xué)免疫測(cè)定技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏、穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、低消耗、適于自動(dòng)化的酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法。具體涉及一種檢測(cè)過氧化物酶及其底物反應(yīng)系統(tǒng)的電化學(xué)方法。
已知技術(shù)酶標(biāo)記免疫原理，HRP作用于底物的反應(yīng)過程是，
式中H2O2可以是過氧化氫，也可以是過氧化氫尿素、sodiumperborate等；AH2則是一類供氫體的通式，如鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺、5-氨基水楊酸、鄰聯(lián)苯甲胺、ABTS等。
本發(fā)明利用磁性微球(珠)分離酶標(biāo)記免疫反應(yīng)結(jié)合物，在裸電極表面作用于酶的底物，測(cè)定電極表面電位或電流的改變，實(shí)現(xiàn)生物大分子物質(zhì)或半抗原的定性與定量分析。
本發(fā)明所述磁性微球(珠)為通用的磁珠試劑，所述底物為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，參比電極為Ag/AgCl電極；對(duì)電極為鉑電極；電化學(xué)分析儀為上海辰華儀器公司生產(chǎn)的CHI 830電化學(xué)分析儀，使用3電極系統(tǒng)。測(cè)量時(shí)，反應(yīng)液加在反應(yīng)池內(nèi)，參比電極和對(duì)電極插入液面下，分別連接至電化學(xué)分析儀，進(jìn)行檢測(cè)。
所述的反應(yīng)池即電解池，采用聚苯乙烯材質(zhì)制備，底部為矩形金片金電極1，經(jīng)導(dǎo)線聯(lián)至池外，是為工作電極2，反應(yīng)池底面粘固鐵片3，磁鐵4可在需要時(shí)吸附其上，而無須另行固定。
本發(fā)明電化學(xué)檢測(cè)法借助于磁性微珠將過氧化物酶(HRP)-過氧化氫(H2O2)-供氫體(H2A)反應(yīng)體系濃聚于裸電極表面進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。具有如下優(yōu)點(diǎn)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無需光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)；裸電極從理論上無使用壽命限制；檢測(cè)成本可明顯降低；適于檢測(cè)自動(dòng)化；結(jié)合微電子和微電極技術(shù)，有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1.電解池結(jié)構(gòu)示意圖，其中，1金電極，2工作電極，3鐵片，4磁鐵。
圖2.差分脈沖伏安法掃描圖其中，a、b、c、d為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)號(hào)。
圖3.循環(huán)伏安法掃描圖其中，a、b、c、d為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)號(hào)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 磁珠分離的ELISA在裸電極表面的電化學(xué)測(cè)定采用瑞士ROCHE公司的“Enzymum-TestCA 72-4”試劑盒(內(nèi)附標(biāo)準(zhǔn)品，由低到高共4瓶，標(biāo)號(hào)分別為a、b、c、d)和“Elecsys”試劑盒中通用的磁珠(包被有鏈霉親和素)試劑，和上?？迫A實(shí)業(yè)有限公司的肝炎標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒中底物(“SUBSTRATE A”和“SUBSTRATE B”，臨用前等量混合后應(yīng)用)。
電化學(xué)分析儀為上海辰華儀器公司生產(chǎn)的CHI 830電化學(xué)分析儀，使用3電極系統(tǒng)。
測(cè)量時(shí)，反應(yīng)液加在反應(yīng)池內(nèi)，參比電極和對(duì)電極插入液面下約2mm，分別連接至電化學(xué)分析儀。
參比電極為Ag/AgCl電極；對(duì)電極為鉑絲電極；電解池采用材質(zhì)為厚約1mm的聚苯乙烯，底部為約0.2mm厚的矩形金片，經(jīng)導(dǎo)線聯(lián)至池外，為工作電極，反應(yīng)池底下面粘固一鐵片，柱形磁鐵在需要時(shí)吸附其上，而無須另行固定。
取酶結(jié)合物工作液 0.700ml標(biāo)準(zhǔn)品 0.035ml磁珠懸液 0.100ml混勻，室溫下反應(yīng)60分鐘，其間混勻1-2次。
將試管置于磁性板上，使磁珠沉積，傾去上清液，并用吸水紙吸去管口殘余液滴，用含0.05％TWEEN 20的生理鹽水同法洗滌磁珠5次，后用生理鹽水懸浮。
用滴管將懸浮的磁珠移入電解池，將柱形磁鐵置于電解池下，使磁珠沉積，吸棄生理鹽水，加入底物應(yīng)用液0.500ml，立即將參比電極和對(duì)電極插入液面，開始掃描測(cè)定。
測(cè)試所用的標(biāo)準(zhǔn)品濃度是a.2.1U/ml；b.20.3U/ml；c.51.8U/ml；d.94.9U/ml。用差分脈沖伏安法和循環(huán)伏安法均可明確加以檢測(cè)和區(qū)分。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明方法能實(shí)現(xiàn)磁珠分離的ELISA在裸電極表面的電化學(xué)測(cè)定。
權(quán)利要求
1.一種酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是利用磁性微球(珠)分離酶標(biāo)記免疫反應(yīng)結(jié)合物，在裸電極表面作用于酶的底物，測(cè)定電極表面電位或電流的改變，實(shí)現(xiàn)生物大分子物質(zhì)或半抗原的定性與定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是所述的方法包括下述步驟，1)取酶結(jié)合物工作液，標(biāo)準(zhǔn)品，磁珠懸液置試管，混勻，室溫下反應(yīng)60分鐘，2)將試管置于磁性板上，使磁珠沉積，去上清，用含0.05％TWEEN20的生理鹽水洗滌磁珠，后用生理鹽水懸浮，3)將懸浮的磁珠移入電解池，將柱形磁鐵置于電解池下，使磁珠沉積，吸棄生理鹽水，加入底物應(yīng)用液，參比電極和對(duì)電極插入液面，分別連接至電化學(xué)分析儀，掃描測(cè)定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是所述的所述磁性微球(珠)為通用的磁珠試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是所述的底物為四甲基聯(lián)苯胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是所述的參比電極為Ag/AgCl電極；對(duì)電極為鉑電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是所述的電解池采用聚苯乙烯材質(zhì)制備，底部為矩形金片金電極，經(jīng)導(dǎo)線聯(lián)至池外，為工作電極，池底面粘固鐵片，磁鐵可吸附其上，無須另行固定。
全文摘要
本發(fā)明屬電化學(xué)和臨床化學(xué)分析領(lǐng)域，涉及一種酶標(biāo)記免疫電化學(xué)檢測(cè)方法，本發(fā)明利用磁性微球(珠)分離酶標(biāo)記免疫反應(yīng)結(jié)合物，在裸電極表面作用于酶的底物，測(cè)定電極表面電位或電流的改變，實(shí)現(xiàn)生物大分子物質(zhì)或半抗原的定性與定量分析。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無需光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)；裸電極從理論上無使用壽命限制；檢測(cè)成本可明顯降低；適于檢測(cè)自動(dòng)化；結(jié)合微電子和微電極技術(shù)，有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/544GK1588071SQ20041005380
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月16日
發(fā)明者于方治 申請(qǐng)人:上海市胸科醫(yī)院