專利名稱：二氧化碳含量測(cè)定方法及二氧化碳診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定二氧化碳(碳酸氫根)含量的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血液內(nèi)二氧化碳的含量對(duì)人體內(nèi)酸堿平衡的調(diào)節(jié)起著重要的作用。血液pH的恒定是維持生命活動(dòng)必不可少的條件，血漿中的多種緩沖系統(tǒng)中以碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)最為重要，直接影響血液的pH。
血液內(nèi)二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸堿平衡紊亂。單純代謝性酸或堿中毒時(shí)，血液碳酸氫根[HCO3-]下降或升高，總二氧化碳也隨之下降或升高。而單純呼吸性酸或堿中毒時(shí)，血液碳酸氫根升高或下降。
總二氧化碳和碳酸氫根的測(cè)定方法較可分為直接測(cè)定和間接推算兩類。直接測(cè)定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Conway微量擴(kuò)散法、流動(dòng)注射氣體擴(kuò)散法等。間接推算是利用血?dú)夥治鰞x測(cè)得的PH與PCO2，根據(jù)H-H方程的變換形式HCO3-(m mol/L)＝0.03×PCO2(mm Hg)×antilog(PH-p ka)或HCO3-(m mol/L)＝0.225×PCO2(k Pa)×antilog(PH-p Ka)計(jì)算獲得。
式中PH為37℃時(shí)測(cè)得值，p ka在37℃為6.10。
目前，以間接推算法應(yīng)用較普遍，由血液分析儀的微處理計(jì)算機(jī)并與血?dú)夥治鼋Y(jié)果一起報(bào)告，準(zhǔn)確性基本可以符合臨床要求。
直接測(cè)定法以滴定法應(yīng)用最廣泛，但由于受多種因素影響，測(cè)定誤差較大。
酶法測(cè)定適合自動(dòng)化分析，結(jié)果可靠，應(yīng)當(dāng)是很有前途的測(cè)定方法，但目前尚有待深入研究。
檢索中國(guó)專利發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?6190276.0、申請(qǐng)日為1996.02.06的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種用來(lái)導(dǎo)出病人血液中氣體含量的非侵入性的系統(tǒng)和方法。該系統(tǒng)相應(yīng)于體積測(cè)量呼氣中的二氧化碳濃度。然后處理該數(shù)據(jù)導(dǎo)出動(dòng)脈血中二氧化碳?xì)怏w水平。若數(shù)據(jù)為時(shí)間域，處理可將時(shí)間域數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成體積域。該方法也經(jīng)迭代評(píng)估了多個(gè)變量的顯著性，所得的關(guān)系可供快速和準(zhǔn)確地對(duì)健康人和患肺病病人進(jìn)行血中氣體含量的測(cè)定。近年來(lái)，申請(qǐng)?zhí)枮?2282386.7、申請(qǐng)日為2002.10.29的實(shí)用新型專利公開了一種醫(yī)用的血液碳酸氫根測(cè)定儀，主要由操作面板、進(jìn)樣檢測(cè)機(jī)構(gòu)、定滴加液機(jī)構(gòu)、攪拌機(jī)構(gòu)和以單片機(jī)為主控元件的電器控制部分組成。
以上專利均與酶法測(cè)定無(wú)關(guān)，這從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明，國(guó)內(nèi)此方面的實(shí)驗(yàn)研究十分缺乏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的二氧化碳(碳酸氫根)含量的測(cè)定方法。同時(shí)本發(fā)明還給出實(shí)現(xiàn)該方法的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行二氧化碳(碳酸氫根)含量測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測(cè)定二氧化碳(碳酸氫根)含量的步驟如下1)、將樣品與主要由磷酸烯醇式丙酮酸、氧化型輔酶、甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根甘油醛-3-磷酸+磷酸根+氧化型輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶還原型輔酶+甘油酸-1，3-雙磷酸2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，測(cè)算出二氧化碳(碳酸氫根)含量的大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，測(cè)算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測(cè)定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
本發(fā)明直接應(yīng)用二氧化碳(碳酸氫根)和磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用后產(chǎn)生草酰乙酸，再通過偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，氧化NAD(P)H成為NAD(P)+，從而得以測(cè)定NAD(P)H在340nm處吸光度下降的幅度，通過測(cè)量340nm處吸光度下降的幅度，可以測(cè)算二氧化碳(碳酸氫根)的含量大小。
用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 0.5--20mmol/l氧化型輔酶 0.2--10mmol/1甘油醛-3-磷酸 0.2--10mmol/l
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1000--20000U/l甘油醛-3-磷酸脫氫酶 1000--20000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源磷酸根污染試劑I緩沖液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 0.5--20mmol/l氧化型輔酶0.2--10mmol/l甘油醛-3-磷酸 0.2--10mmol/l甘油醛-3-磷酸脫氫酶 1000--20000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑II緩沖液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1000--20000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，磷酸烯醇式丙酮酸、氧化型輔酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源磷酸根污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 0.5--20mmol/l
氧化型輔酶0.2--10mmol/l甘油醛-3-磷酸 0.2--10mmol/l穩(wěn)定劑10--50mmol/l試劑II緩沖液40--200mmol/l甘油醛-3-磷酸脫氫酶 1000--20000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑III緩沖液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1000--20000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，磷酸烯醇式丙酮酸、氧化型輔酶、甘油醛-3-磷酸、等可以放在試劑II或試劑III中。試劑II其中的成分，甘油醛-3-磷酸脫氫酶也可以放在試劑I或試劑III中。試劑III其中的成分，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶也可以放在試劑I或試劑II中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上氧化型輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒較為理想緩沖液80--120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l氧化型輔酶1--5mmol/l甘油醛-3-磷酸 1--6mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000--10000U/l甘油醛-3-磷酸脫氫酶 6000--10000U/l穩(wěn)定劑20--50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡(jiǎn)便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測(cè)試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測(cè)試成本低廉。因此可以保證具有較高的測(cè)試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源磷酸根的污染，消除內(nèi)、外源磷酸根的作用發(fā)生在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間段的前半部分，在后半段時(shí)間受污染的內(nèi)、外源磷酸根已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時(shí)間測(cè)試二氧化碳(碳酸氫根)含量所需要的磷酸根都是產(chǎn)生于二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1mmol/l氧化型輔酶1mmol/l甘油醛-3-磷酸 1mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000U/l甘油醛-3-磷酸脫氫酶 6000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根甘油醛-3-磷酸+磷酸根+氧化型輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶還原型輔酶+甘油酸-1，3-雙磷酸將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的幅度，從而測(cè)算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
本實(shí)施例應(yīng)用二氧化碳(碳酸氫根)和磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用后產(chǎn)生磷酸根，再通過偶聯(lián)甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，和甘油醛-3-磷酸一起將氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度的上升幅度，通過測(cè)量340nm處吸光度的上升幅度，可以測(cè)算二氧化碳(碳酸氫根)的含量大小。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 6mmol/l氧化型輔酶3mmol/l甘油醛-3-磷酸 3mmol/l甘油醛-3-磷酸脫氫酶 8000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II緩沖液100mmo l/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶8000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)測(cè)定二氧化碳(碳酸氫根)含量時(shí)，溫度控制在30，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
具體測(cè)定步驟為二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根甘油醛-3-磷酸+磷酸根+氧化型輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶還原型輔酶+甘油酸-1，3-雙磷酸將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的幅度，從而測(cè)算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 10mmol/l氧化型輔酶5mmol/l甘油醛-3-磷酸 6mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液120mmol/l甘油醛-3-磷酸脫氫酶 10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑III緩沖液120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間20分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
具體測(cè)定步驟為二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根甘油醛-3-磷酸+磷酸根+氧化型輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶還原型輔酶+甘油酸-1，3-雙磷酸將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的幅度，從而測(cè)算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在20分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l氧化型輔酶2mmol/l甘油醛-3-磷酸 4mmol/l甘油醛-3-磷酸脫氫酶 10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II緩沖液100mmo l/l磷酸烯醇式丙酮酸 5mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根甘油醛-3-磷酸+磷酸根+氧化型輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶還原型輔酶+甘油酸-1，3-雙磷酸將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的幅度，從而測(cè)算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種二氧化碳含量測(cè)定方法，包括以下步驟1)、將樣品與主要由磷酸烯醇式丙酮酸、氧化型輔酶、甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根甘油醛-3-磷酸+磷酸根+氧化型輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶還原型輔酶+甘油酸-1，3-雙磷酸2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，測(cè)算出二氧化碳(碳酸氫根)含量的大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述二氧化碳含量測(cè)定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速(程)度，測(cè)算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述二氧化碳含量測(cè)定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述二氧化碳含量測(cè)定方法，其特征在于被測(cè)二氧化碳樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種二氧化碳診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40——200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸0.5——20mmol/l氧化型輔酶 0.2——10mmol/l甘油醛-3-磷酸 0.2——10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000——20000U/l甘油醛-3-磷酸脫氫酶 1000——20000U/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述二氧化碳診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述二氧化碳診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述二氧化碳診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述二氧化碳診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADPH、NADH或thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定二氧化碳(碳酸氫根)含量的方法，同時(shí)還涉及二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、磷酸烯醇式丙酮酸、氧化型輔酶、甘油醛－3－磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛－3－磷酸脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)吸光度變化的情況(速度)，從而測(cè)算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N21/33GK1763537SQ20041006505
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月20日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:王爾中