專利名稱：電化學(xué)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測芯片的制備和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)芯片的電化學(xué)檢測技術(shù)，該新型的電化學(xué)PCR檢測芯片和檢測方法可用于生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中多種核酸的并行定量擴增檢測。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)的發(fā)展，基因組的研究逐漸深入，從基因水平上認識生命的差異、疾病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律、以及藥物與生命體的相互作用將成為可能。核酸序列信息的高通量檢測和分析技術(shù)將成為醫(yī)學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域的核心技術(shù)之一。人們需要發(fā)展高通量、準(zhǔn)確、低成本基因信息的檢測方法。近來，基因芯片技術(shù)越來越受到人們的重視。但是，目前基因芯片技術(shù)在臨床監(jiān)測和診斷應(yīng)用中尚存在瓶頸問題，嚴重影響其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)臨床中的實際應(yīng)用。1)首先是定量檢測問題。目前的基因芯片技術(shù)，基因的PCR擴增過程與檢測過程是分開進行的，這樣不能準(zhǔn)確定量地檢測基因的原始模板量。2)檢測對象需要進行多步處理，并且要進行熒光標(biāo)記。檢測過程操作復(fù)雜，影響檢測的可靠性。另外熒光檢測需要較好的光學(xué)檢測系統(tǒng)支持，在臨床應(yīng)用中成本較高。
因此，發(fā)展一種能夠?qū)崟r定量檢測的基因芯片技術(shù)對芯片的臨床應(yīng)用會是一個巨大的推動，以電化學(xué)檢測和PCR擴增相結(jié)合的技術(shù)是本芯片技術(shù)定量的關(guān)鍵，這必為生物芯片在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種可以實時定量檢測的電化學(xué)定量PCR檢測芯片的制備和檢測方法，可以實現(xiàn)多個核酸片段的定量檢測。
技術(shù)方案本發(fā)明提出了一種利用電化學(xué)方法定量檢測PCR過程的生物芯片技術(shù)，它是一種核酸的定量檢測技術(shù)。該技術(shù)的具體實施方案為(a)在固體載體的表面上制備一組電極微陣列，(b)在電極微陣列的電極上固定核酸捕獲的分子探針，(c)在固定有核酸捕獲的分子探針的電極區(qū)域制備一個能夠裝載液體的全封閉的微小腔體，腔體內(nèi)可進行生化反應(yīng)，腔體上有液體的注入口，(d)在固體載體的電極上接有連接電線，可與電化學(xué)檢測裝置相連接來對電極施加電壓或電流，以及電信號的采集，電化學(xué)檢測裝置是指在電極表面發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)時能夠檢測其電流和電壓等變化的儀器，如恒電位儀。
所述的核酸捕獲的分子探針直接固定在電極的表面，或通過某種手臂分子“NH2，HS”的作用與電極表面結(jié)合。
所述的電化學(xué)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測芯片的檢測方法為a、把核酸、酶、脫氧核糖核苷酸、電化學(xué)活性物質(zhì)等反應(yīng)組分加入上述的電化學(xué)定量PCR芯片的全封閉的微小腔體中；b、將芯片置于一個可以進行溫度控制的大腔體中，進行PCR擴增反應(yīng)c、通過恒電位儀來檢測電極表面的捕獲DNA探針分子上因為發(fā)生反應(yīng)面產(chǎn)生的電流電壓的變化；d、PCR每循環(huán)一次或數(shù)次，就檢測一次電流電壓的變化通過檢測不同電極上PCR循環(huán)過程中的電流電壓的變化規(guī)律對多個基因進行PCR定量檢測。
PCR的反應(yīng)組分中電化學(xué)活性物質(zhì)為染料試劑、金屬粒子等具有電化學(xué)指示作用的物質(zhì)。
PCR反應(yīng)和檢測儀器是包括溫控系統(tǒng)、電信號檢測系統(tǒng)和芯片的引入和取出部件。該芯片檢測的對象可以是DNA、RNA、反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA)或是其他的核酸片斷。
技術(shù)效果本發(fā)明提出的電化學(xué)實時定量檢測PCR芯片技術(shù)具有以下特點1、該芯片最大的特點就是能夠進行核酸的定量檢測，是電化學(xué)技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的核酸定量的新技術(shù)。
2、載體表面可以制備多個電極，在每個電極上制備特異性的核酸捕獲分子探針，而且芯片上可以進行多重的PCR，從而實現(xiàn)多個位點并行檢測，該體系檢測不會存在相互污染問題。
3、該定量檢測芯片是利用電化學(xué)方法對PCR擴增的過程進行檢測，不需要任何的熒光標(biāo)記，降低了檢測成本，同時也避免了熒光檢測過程中選擇染料時受其激發(fā)波長范圍的影響等問題。
4、電化學(xué)方法檢測靈敏度高，可以對低拷貝的基因進行準(zhǔn)確檢測，操作簡便，成本低。
本實時定量擴增的芯片技術(shù)，對生物芯片在生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)臨床的定量檢測方面的應(yīng)用開拓了廣闊的前景。


以下將結(jié)合附圖對本技術(shù)作進一步說明。
圖1、檢測芯片基底橫切面結(jié)構(gòu)示意圖，圖2、檢測芯片縱切面結(jié)構(gòu)示意圖，圖3、檢測芯片工作示意圖，圖4固定了探針的電極工作示意圖，圖5以50mv/s的速度掃描時檢測到的不同樣品循環(huán)伏安信號曲線，圖6電化學(xué)定量PCR的電信號隨著循環(huán)數(shù)變化的曲線。
以上的圖中有第一工作電極1、第二工作電極2、參比電極3、第三工作電極4、第四工作電極5、對電極6、固體載體7、溶液池8、對電極電連接線9、參比電極電連接線10、工作電極電連接線11、溶液池蓋12、電化學(xué)檢測儀13、溫度控制裝置14、電化學(xué)定量檢測芯片15、固定了探針的工作電極16、工作電極上的探針結(jié)合了擴增產(chǎn)物17、工作電極上的雜交產(chǎn)物結(jié)合了電活性物質(zhì)18、擴增過程中不同循環(huán)時檢測的樣品的電化學(xué)信號曲線19、20、21。
具體實施例方式
該電化學(xué)定量PCR檢測芯片是由一個可以進行PCR擴增的帶有全封閉腔體的固體載體組成的。首先是在固體載體的表面制備電極微陣列，在電極區(qū)域有一定的空間用于液體存儲和反應(yīng)，然后再制備用于對該固體載體進行全封閉的微小腔體，該腔體上有用于加樣的小孔。固體載體是由金屬、玻璃、硅片、塑料、陶瓷等能夠制備電極并且可以對其進行溫度控制的材料組成；載體表面的電極上固定待檢基因的捕獲分子探針，該分子探針可以直接固定在電極上，也可以通過某種手臂分子(NH2，HS等)的作用與電極表面特異性的結(jié)合。
還有一個能夠容納該電化學(xué)定量PCR檢測芯片的溫度控制裝置，該裝置能夠使固體載體表面上電極區(qū)域的液體進行PCR反應(yīng)。
該電化學(xué)定量PCR檢測芯片還有一組電極連接線。該連接線與電化學(xué)檢測裝置相連接來對電極施加電壓或電流，以及電信號的采集；該連接線的制備不影響固體載體的全封閉。該電化學(xué)檢測裝置的特點是能夠同時進行多個電極信號的采集分析。
該芯片檢測過程是將待檢基因連同PCR反應(yīng)體系和電化學(xué)檢測活性物質(zhì)一起加入到芯片上的電極區(qū)域，封閉該芯片并且放入到溫度控制裝置里進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)的同時通過電化學(xué)檢測裝置進行相關(guān)的電壓、電流等的供應(yīng)和電信號的采集。PCR過程中，產(chǎn)生的待檢基因片斷就會不斷的與捕獲探針形成雙鏈DNA，通過檢測電化學(xué)活性物質(zhì)上的電化學(xué)信號隨著PCR進程的變化規(guī)律，就可以檢測特檢基因的擴增情況。PCR每循環(huán)一次或數(shù)次，就采集一次電化學(xué)信號；通過檢測不同電極上PCR循環(huán)過程中的電化學(xué)信號的變化規(guī)律來檢測多個基因的PCR定量檢測。PCR的反應(yīng)組分中電化學(xué)活性物質(zhì)為染料試劑、金屬粒子等具有電化學(xué)指示作用的物質(zhì)。
實例1電化學(xué)與PCR結(jié)合檢測p16基因的甲基化狀態(tài)1、電極及其探針的制備在金電極上固定特異性的可以檢測甲基化狀態(tài)的探針。首先進行電極預(yù)處理，金電極經(jīng)Piranha溶液、丙酮、無水乙醇依次浸泡0.5min，然后用0.05μm Al2O3磨墊拋光，超聲波清洗約1min，氮氣干燥。將金電極浸入含有100μg/ml HS2ssDNA的TE緩沖液中，于4℃放置12h，得到單鏈DNA修飾電極(HS2ssDNA/Au電極)。
2、PCR擴增待檢樣品DNA提取以后，將電化學(xué)指示劑加入其中，進行普通的PCR擴增。
3、擴增產(chǎn)物的檢測擴增產(chǎn)物與電極上的探針結(jié)合后，在電化學(xué)指示劑的作用下，用電化學(xué)儀在80mV的作用下進行檢測。每一個PCR循環(huán)，檢測一次，從面可以對相應(yīng)的樣品中被檢DNA原始模板量的情況進行定量檢測。(試驗結(jié)果見圖5)實施2母體血漿中胎兒DNA的電化學(xué)PCR芯片檢測1、設(shè)計了幾組擴增檢測胎兒特異(Y染色體上特異的區(qū)段)的基因探針和引物序列，用普通的電泳法檢測篩選出了最佳的引物探針組合進行電化學(xué)實時檢測。
2、電極及胎兒DNA特異性的探針的制作固定方法同上3、樣品處理及PCR擴增首先從血漿樣品中提取純化出DNA，然后在合適的溫度循環(huán)下(94℃，30s-50℃，30s-72℃，30s)進行擴增，在每個PCR循環(huán)后用電化學(xué)儀采集相關(guān)的信號，并且進行處理，結(jié)果顯示胎兒DNA的隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加而逐漸增加。(如圖6，a為陰性對照b、c、d、e為不同的樣品)
權(quán)利要求
1.一種電化學(xué)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測芯片的制備方法，其特征是制備的方法為(a)在固體載體的表面上制備一組電極微陣列，(b)在電極微陣列的電極上固定核酸捕獲的分子探針，(c)在固定有核酸捕獲的分子探針的電極區(qū)域制備一個能夠裝載液體的全封閉的微小腔體，腔體內(nèi)可進行生化反應(yīng)，腔體上有液體的注入口，(d)在固體載體的電極上接有連接電線，可與電化學(xué)檢測裝置相連接來對電極施加電壓或電流，以及電信號的采集，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測芯片的制備方法，其特征在于所述的核酸捕獲的分子探針直接固定在電極的表面，或通過某種手臂分子“NH2，HS”的作用與電極表面結(jié)合。
3.一種如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測芯片的檢測方法，其特征是檢測方法為a、把核酸、酶、脫氧核糖核苷酸、電化學(xué)活性物質(zhì)等反應(yīng)組分加入上述的電化學(xué)定量PCR芯片的全封閉的微小腔體中；b、將芯片置于一個可以進行溫度控制的大腔體中，進行PCR擴增反應(yīng)；c、通過恒電位儀來檢測電極表面的捕獲DNA探針分子上因為發(fā)生反應(yīng)面產(chǎn)生的電流電壓的變化；d、PCR每循環(huán)一次或數(shù)次，就檢測一次電流電壓的變化；通過檢測不同電極上PCR循環(huán)過程中的電流電壓的變化規(guī)律對多個基因進行PCR定量檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的電化學(xué)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測芯片的檢測方法，其特征是PCR的反應(yīng)組分中電化學(xué)活性物質(zhì)為染料試劑、金屬粒子等具有電化學(xué)指示作用的物質(zhì)。
全文摘要
電化學(xué)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測芯片的制備方法涉及一種核酸定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片的電化學(xué)檢測技術(shù)，其制備的方法為在固體載體的表面上制備一組電極微陣列；在電極微陣列的電極上固定核酸捕獲的分子探針；在固定有核酸捕獲的分子探針的電極區(qū)域制備一個能夠裝載液體的全封閉的微小腔體；在固體載體的電極上接有連接電線，檢測方法為；把核酸、酶、脫氧核糖核苷酸、電化學(xué)活性物質(zhì)等反應(yīng)組分加入微小腔體中；將芯片置于一個可以進行溫度控制的大腔體中；通過恒電位儀來檢測電極表面的捕獲DNA探針分子上因為發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的電流電壓的變化；通過檢測不同電極上PGR循環(huán)過程中的電流電壓的變化規(guī)律對多個基因進行PCR定量檢測。
文檔編號G01N27/26GK1605861SQ20041006571
公開日2005年4月13日 申請日期2004年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月15日
發(fā)明者陸祖宏, 葛芹玉, 劉全俊, 白云飛 申請人:東南大學(xué)