專利名稱：高效液相色譜法測定竹紅菌甲素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種色譜檢測方法，具體涉及一種高效液相色譜法測定竹紅菌甲素含量的方法。
背景技術(shù)：
竹紅菌素(Hypocrellin)是我國首次發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床的新型光療藥物。臨床證明它對某些皮膚頑癥有明顯的光敏治療作用，其中包括用于治療肥厚性瘢痕、皮膚淀粉樣苔蘚、牛皮蘚，白癜瘋等皮膚病。經(jīng)過十多年來對竹紅菌素的結(jié)構(gòu)、光化學(xué)、光物理、光生物、藥理學(xué)等各方面的廣泛系統(tǒng)的研究，研究工作者發(fā)現(xiàn)與其它類型的光敏劑相比，竹紅菌素作為一種新型的光敏劑，具有易純化、化學(xué)修飾性好、三重態(tài)量子產(chǎn)率高、單重態(tài)氧量子產(chǎn)率高、光毒性高、從正常組織排出速度快等優(yōu)點(diǎn)，因此被公認(rèn)為是一種極有應(yīng)用前景的光療藥物。竹紅菌素又具有抗癌活性，對實(shí)體肉瘤和體外癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用。竹紅菌素中最主要的光敏成分為竹紅菌甲素(HA)。它屬于羥基苝醌類衍生物(圖1)。有關(guān)它的定量分析研究目前還很少。目前竹紅菌甲素含量的測定主要運(yùn)用分光光度計(jì)測量其紫外吸收值，容易受雜質(zhì)干擾，誤差較大。
竹紅菌藥物正越來越得到廣泛運(yùn)用，竹紅菌甲素的科學(xué)研究也越來越廣泛深入。這一切都對竹紅菌甲素定量檢測方法的準(zhǔn)確性和簡便性提出了更高的要求，目前所用的分光光度計(jì)定量方法已經(jīng)不能滿足科學(xué)發(fā)展的需要。特別是，竹紅菌甲素一般都由天然產(chǎn)物中提取，而天然提取產(chǎn)物中一般都含有大量的雜質(zhì)存在。如果選用一般的紫外或示差折光檢測器，則這些雜質(zhì)常常存在于竹紅菌甲素色譜峰周圍，甚至與竹紅菌甲素的色譜峰相疊加，影響了竹紅菌甲素定量的準(zhǔn)確性。在大量的實(shí)驗(yàn)比較后，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用竹紅菌甲素的熒光發(fā)射性質(zhì)，如果選用熒光檢測器，則可以解決這一難題。竹紅菌甲素在激發(fā)光為410nm時(shí)，于610nm處發(fā)射較強(qiáng)的熒光，而大部分雜質(zhì)都不具備這一發(fā)光的特性。因此，選用熒光檢測器，并將檢測波長定在此處，則大部分雜質(zhì)都被濾過而不出現(xiàn)在色譜峰中，對竹紅菌甲素的色譜測定不造成影響，而保證了竹紅菌甲素定量的準(zhǔn)確性。
目前之所以沒有竹紅菌甲素色譜方面的研究成果，是因?yàn)橐业竭m合竹紅菌甲素的色譜分析方法相當(dāng)困難。所做的大量實(shí)驗(yàn)表明，竹紅菌甲素在一般的C18，C8，以及離子交換色譜柱上，均呈現(xiàn)拖尾達(dá)數(shù)分鐘的扁平色譜峰，改變流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，pH值，緩沖鹽濃度等均無法使之優(yōu)化；竹紅菌甲素色譜峰不僅峰形差，而且理論塔板數(shù)很低，在對竹紅菌提取液的分析中，達(dá)不到可行的分離效果和回收率。發(fā)明人推斷這種現(xiàn)象可能是竹紅菌甲素分子中的羥基、羰基、以及甲氧基等基團(tuán)與色譜柱中的硅羥基的作用引起。

發(fā)明內(nèi)容
竹紅菌甲素作為新型的光療藥物正廣泛用于臨床及科學(xué)研究。為了提高竹紅菌甲素定量的準(zhǔn)確性和簡便性，避免雜質(zhì)干擾，適應(yīng)臨床藥物及科學(xué)研究的需要，本實(shí)驗(yàn)首次將反相高效液相色譜法用于竹紅菌提取物中竹紅菌甲素含量進(jìn)行測定。針對分光光度計(jì)方法的缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種快速簡便，選擇性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確并且容易操作的測定竹紅菌甲素濃度的方法。
結(jié)合目前色譜柱技術(shù)對硅羥基活性的研究成果，發(fā)明人選用不同的已知硅羥基活性的色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硅羥基活性越高，色譜峰越扁平，拖尾越嚴(yán)重，證實(shí)了發(fā)明人的推斷。因而，發(fā)明人選用運(yùn)用雙封端保證很低硅羥基活性的Zorbax Extend C18柱，獲得良好的峰形，竹紅菌甲素色譜峰的理論塔板數(shù)達(dá)到4000以上。
經(jīng)過大量比較實(shí)驗(yàn)，最后選用能去掉大量雜質(zhì)影響的熒光檢測法。熒光檢測器除了選擇性好的優(yōu)點(diǎn)外，又具有靈敏度高的特點(diǎn)，因而本發(fā)明的檢測最小量達(dá)到納克級，對竹紅菌甲素產(chǎn)業(yè)化后的質(zhì)量控制具有實(shí)際意義。
所以，本發(fā)明目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種高效液相色譜法測定竹紅菌甲素含量的方法，包括以下步驟a.色譜柱選用Zorbax Extend-C18 column(4.6mm ID×150mm，5μm)；b.以甲醇和水作為色譜流動(dòng)相；c.所用條件為柱溫30℃，流速1ml/min；熒光檢測器激發(fā)波長410nm；發(fā)射檢測波長610nm。
在選擇適合的流動(dòng)相方面，發(fā)明人也做了大量的實(shí)驗(yàn)摸索。為了研究流動(dòng)相pH值對保留時(shí)間的影響，在甲醇與水的流動(dòng)相體系中將水的pH值用乙酸和三乙胺分別調(diào)到pH＝3.5、4.2、5.0、7.5、8.2。與未加酸堿調(diào)節(jié)的流動(dòng)相比較發(fā)現(xiàn)，隨著pH值逐漸降低，保留時(shí)間略有增加，但伴隨著峰形展寬；而堿性pH值使保留時(shí)間略有減小但樣品組分間分離度降低?？偟貋碚f，pH值改變對樣品分離的影響不大。從分子結(jié)構(gòu)角度來看，竹紅菌甲素分子中含有羥基、羰基等基團(tuán)，但羥基中的H已和旁邊羰基的O原子形成氫鍵，而這樣的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)使流動(dòng)相的酸堿度對其影響不大。因而發(fā)明人選用甲醇與水作為流動(dòng)相系統(tǒng)。而在甲醇與水作為流動(dòng)相的系統(tǒng)中，隨著甲醇比例的增大，竹紅菌甲素保留時(shí)間迅速減小?？紤]到分析時(shí)間、分離度及峰形等綜合因素，最后選擇甲醇/水＝83/17(體積比)，柱溫30℃。
本發(fā)明技術(shù)進(jìn)步在于測定準(zhǔn)確，方法簡單，靈敏度高，方法專一。
1.線性試驗(yàn)及檢測限試驗(yàn)表明，在一定濃度下，竹紅菌甲素的回歸方程的相關(guān)系數(shù)γ＝0.9999，線性范圍內(nèi)線性關(guān)系很好，易于定量準(zhǔn)確。檢出限(S/N＝3)為1.2ng，最小可測的量達(dá)到納克級，靈敏度高。
2.精密度試驗(yàn)測出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3％左右，表明方法的重復(fù)性很好。
3.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程約半小時(shí)，也就是說，在半小時(shí)內(nèi)，運(yùn)用本方法即能成功將竹紅菌甲素與其他雜質(zhì)分開，并準(zhǔn)確測量出其含量。


圖1、圖2分別為竹紅菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品、竹紅菌提取液樣品的液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取采自云南浦江縣的竹紅菌樣品，干燥粉碎，準(zhǔn)確稱取約1g，加入甲醇250ml，稱重，于避光條件下70℃水浴中回流50min。冷卻后加甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻后過濾。續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣，對其中的竹紅菌甲素含量進(jìn)行分析，得到其中的竹紅菌甲素含量分別為28.0mg/g。
實(shí)施例2取采自云南寧蒗縣的竹紅菌樣品，干燥粉碎，準(zhǔn)確稱取約1g，加入甲醇250ml，稱重，于避光條件下70℃水浴中回流50min。冷卻后加甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻后過濾。續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣，對其中的竹紅菌甲素含量進(jìn)行分析，得到其中的竹紅菌甲素含量分別為27.2mg/g。
工作原理和工作過程流動(dòng)相甲醇和水載著竹紅菌甲素等被測物質(zhì)進(jìn)入色譜柱，ZorbaxExtend-C18色譜柱將竹紅菌甲素與其他雜質(zhì)分開，使它們依次到達(dá)熒光檢測器被檢測識(shí)別，檢測器給出不同成分的響應(yīng)值，分別對應(yīng)其進(jìn)樣量的多少。
權(quán)利要求
1.一種高效液相色譜法測定竹紅菌甲素含量的方法，包括以下步驟a.色譜柱選用Zorbax Extend-C18 column；b.以甲醇和水的體積比為83∶17作為色譜流動(dòng)相；c.所用條件為柱溫30℃，流速1ml/min；熒光檢測器激發(fā)波長410nm；發(fā)射檢測波長610nm；進(jìn)樣體積為10μl。
2.按照權(quán)利要求1所述的高效液相色譜法測定竹紅菌甲素含量的方法，其特征在于作為色譜流動(dòng)相的甲醇/水的體積比為83/17。
全文摘要
高效液相色譜法測定竹紅菌甲素含量的方法，包括以下步驟a.色譜柱選用Zorbax Extend－C18 column；b.以甲醇和水的體積比為83∶17作為色譜流動(dòng)相；c.所用條件為柱溫30℃，流速1ml/min；熒光檢測器激發(fā)波長410nm；發(fā)射檢測波長610nm；進(jìn)樣體積為10μl。優(yōu)化方案中，作為色譜流動(dòng)相的甲醇/水的體積比為83/17。本發(fā)明以大量實(shí)驗(yàn)和理論分析，找到了適合竹紅菌甲素的色譜分析方法，填補(bǔ)了竹紅菌甲素色譜方面的研究空白。
文檔編號G01N30/00GK1648656SQ20041006598
公開日2005年8月3日 申請日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者周家宏, 顧曉天, 馮玉英, 魏少華 申請人:南京師范大學(xué)