專利名稱：免疫膠體金檢測出血性大腸桿菌o157的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種在醫(yī)學(xué)檢驗以及進出口食品衛(wèi)生檢驗中應(yīng)用的的免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)及快速檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，國際國內(nèi)食品安全惡性事件不斷發(fā)生，造成了十分巨大的經(jīng)濟損失。如英國僅禁止牛肉進口一項，每年就損失52億美元。同時我國國內(nèi)的食源性疾病也同樣非常突出，每年衛(wèi)生部都會接到食物中毒報告100-200起，涉及數(shù)干人發(fā)病，百余人死亡，除意外事故外，大部分均是致病微生物引起的。
腸出血性大腸桿菌O157:H7(以下簡稱O157:H7)是新近認識的一種人類出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征的腸道致病菌。1982年美國首次報告了由該菌引起的出血性結(jié)腸炎。另外，澳大利亞、歐洲、非洲的某些國家也有發(fā)生。1996年夏季由此菌造成的食物中毒使日本近萬人感染。因此，引起世界各國普遍關(guān)注。我國1988年由權(quán)太淑報道從江蘇腹瀉患者分離5株O157:H7。雖未發(fā)現(xiàn)感染暴發(fā)，但并不意味著沒有發(fā)生過，因國內(nèi)不斷有所謂原因不明的食物中毒發(fā)生，由于受條件所限沒能做進一步的鑒定。因而不能排除發(fā)生過O157:H7感染暴發(fā)的可能性。通常此菌存于牛等家畜腸道內(nèi)，污染食品可引起食物中毒和感染性腹瀉等疾病的散發(fā)和暴發(fā)流行。
隨著世界科學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展和人類物質(zhì)生活的不斷改善，人們普遍提高了對食品安全衛(wèi)生質(zhì)量的意識和要求，為此世界各國政府也相應(yīng)加強了對有關(guān)食品安全衛(wèi)生控制的關(guān)注，并制定了許多有關(guān)食品安全的強制性法律法規(guī)，以減少和杜絕在食品加工過程中可能存在或出現(xiàn)的危害因素；保證食品進入流通領(lǐng)域或到達消費者手中時，能將危害健康的風(fēng)險降低至最小程度。在食品生產(chǎn)企業(yè)中推行HACCP(危害分析和關(guān)鍵控制點)正是基于這一原則。
在現(xiàn)有技術(shù)中，病原菌的檢測主要是利用微生物學(xué)方法、生物化學(xué)方法、血清學(xué)方法和PCR方法。這些方法都有著這樣或那樣的一些限制1)由于需要培養(yǎng)，所需時間長；2)不能區(qū)別相近的致病菌；3)不能鑒定未知的致病菌；4)交叉反應(yīng)和其他假陽性；5)靈敏度較差。
無論是傳統(tǒng)的細菌檢測技術(shù)，還是PCR檢測技術(shù)，都需要一定的儀器設(shè)備和相關(guān)的技術(shù)支持才能進行。對于現(xiàn)在國內(nèi)國外對食品安全要求的不斷提高，以及基層普及的現(xiàn)狀，這些檢測方法有時就比較局限，無法做到即時即地。盡管目前國內(nèi)外已有不少針對致病微生物的快速檢測方法。其中包括一些自動的儀器和免疫試劑盒及利用分子生物學(xué)方法如核酸擴增技術(shù)、基因探針等，但上述這些方法有些屬于初步篩選，有些又必需配置比較昂貴的設(shè)備。這對不少基層單位來說目前尚難以承受。為此，需要開發(fā)一種快速簡便，易學(xué)易用的檢測技術(shù)。
免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，其發(fā)展十分迅速，在生物醫(yī)學(xué)各研領(lǐng)域，特別是在醫(yī)學(xué)檢驗中得到日益廣泛的應(yīng)用。膠體金已成為繼熒光素，放射同位素和酶之后，在免疫標(biāo)記技術(shù)中較為常用的一種非放射性標(biāo)記。
膠體金是由于氯金酸在還原劑如鞣酸，檸檬酸三鈉的作用下聚合形成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用形成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，它具有高電子密度，能與多種生物大分子結(jié)合的特點，免疫金標(biāo)記技術(shù)主要利用了金顆粒的這一特征，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處于顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或紫紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中由于膠體金檢測試劑盒與放免，酶標(biāo)試劑盒相比，具有操作使用安全(無放免物的污染)，簡便(簡單操作一步完成)，適用于單人份檢測(放免和酶標(biāo)試劑盒不適于單人份或少量樣品檢測)和快速(10分鐘左右即可有結(jié)果)等優(yōu)點，因此近幾年來金標(biāo)診斷試劑盒正日益流行，在某些項目上與已逐漸替代了放免、酶標(biāo)試劑盒，如早早孕試劑條(HCGTest Strip)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是建立一種簡易快速、自測式膠體金免疫層析法(GICA)用于檢測食品中所含的致病菌，目前以大腸桿菌O157為主要檢測對象。其主要工作原理是將一種高特異性高效價的抗O157抗體與膠體金顆粒交聯(lián)并以硝酸纖維素膜作為載體。在同一纖維膜上分為兩個區(qū)域段，A區(qū)是包被有抗體與膠體金顆粒交聯(lián)物的條帶，B區(qū)是放置已知陽性復(fù)合物的對照條帶，并將上述纖維膜放置于一雙層塑料模板中，在模板上方表面有一圓形加樣孔，及一長方形的視窗。當(dāng)操作者將檢樣的增菌液加入到模板加樣孔中，培養(yǎng)液即可通過在纖維膜上的滲透，逐漸向前延伸，當(dāng)增菌液向前延伸到測試(A)區(qū)時如其中有O157存在，則即被包被在此的抗體捕獲，并形成夾心法復(fù)合物并呈現(xiàn)紅色反應(yīng)條帶即可判為陽性反應(yīng)；然后抵達已知對照(B)區(qū)。被檢樣品增菌液中不論是否含有O157在通過對照區(qū)時，由于受潮即起反應(yīng)，會出現(xiàn)一條紅色條帶，如增菌液中不存在O157，則在此區(qū)域也無復(fù)合物形成。因此無條帶呈現(xiàn)。對此結(jié)果應(yīng)判為陰性反應(yīng)。
主要技術(shù)本試劑盒是以“測流式免疫色譜”形式設(shè)計制成的。其主要工作原理是將一種高特異性高效價的抗O157抗體與膠體金顆粒交聯(lián)并以硝酸纖維素膜作為載體。免疫金標(biāo)記技術(shù)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。
本發(fā)明的目的之一是提供了一種通用膠體金試劑盒組件，包括底板，上端吸水紙，噴有抗體的膜，膠體金墊，下端吸水紙。本發(fā)明的目的之二是提供一對針對大腸桿菌O157的不同抗原位點的特異性抗體，其中一個抗體被標(biāo)記膠體金。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)，將待測目的O157的抗體標(biāo)記膠體金，然后以此標(biāo)記了的抗體結(jié)合待測一樣本中的目的抗原O157，最終被固定在膜上檢測區(qū)的相應(yīng)的另一個抗體捕獲，形成一肉眼可見的檢測帶，可見檢測帶為樣本中有目的細菌，檢測帶上積聚的膠體金能為肉眼所見。
所述膠體金的制備是取四氯化金以檸檬酸三鈉還原它成為膠體金。
所述抗體的膠體金標(biāo)記和固相化是將膠體金標(biāo)記到抗體上，再以百德儀的氣壓噴頭噴到玻璃纖維素膜上。成為一膠體金墊，于37℃干燥待用。
分別將檢測目的蛋白相應(yīng)得另一個抗體以百德儀的噴頭噴到硝酸纖維素膜上形成檢測帶，同時將二抗也噴到硝酸纖維素膜上，形成對照線，以中性蛋白封閉，干燥。
上述檢測應(yīng)在加樣后15分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，如果超過20分鐘由于會造成顯色過度而形成誤判。
本發(fā)明使用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)建立診斷試劑盒，既能進行定性檢測同時又能做到快速準(zhǔn)確。運用本發(fā)明技術(shù)建立的試劑盒與同類試劑盒相比，操作簡單方便，省時省力，節(jié)約成本，在檢測靈敏度要求較低的樣本時，可根據(jù)試條有無顯色篩去陰性結(jié)果。該項目與現(xiàn)有技術(shù)相比，可快速準(zhǔn)確的檢測食品中的致病微生物O157。另外，它的主要優(yōu)點還有方便快速，同時又無需任何特殊的輔助儀器設(shè)備。自己開發(fā)的成本相對與國外同類產(chǎn)品要低三分之二左右，因此有著廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)和市場潛力。


圖1免疫膠體金檢測出血性大腸桿菌O157結(jié)果2免疫層析試驗原理示意圖參照圖1、圖2，此免疫層析試驗主要運用單克隆雙抗體夾心法。試驗所用試劑全部為干試劑，多個試劑被組合在一個約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條，試劑條上端(A)和下端(B)分別粘貼吸水材料，免疫金復(fù)合物干片粘貼在近下端(C)處，緊貼其上為硝酸纖維素膜條。硝酸纖維素膜條上有兩個反應(yīng)區(qū)域，測試區(qū)(T)包被有特異性O(shè)157抗體，參照區(qū)(R)包被有抗小鼠IgG抗體。
測定時將液體標(biāo)本滴入試紙條下端加樣孔中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經(jīng)C處時使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。若標(biāo)本中有待測沙門氏菌，其時可與免疫金復(fù)合物之抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)即被固相單克隆抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條-檢測線(T)。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠IgG抗體結(jié)合(免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG)，而顯出紅色質(zhì)控線條一對照線(R)。反之，陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。
具體實施例方式1、配對抗體的選擇配對抗體的選擇是選用目前市場上已有的商品化抗體，將所有相關(guān)抗體作配對實驗后，找到親和性和親合力最佳的一對抗體。
我們選取了大約有50個相關(guān)抗體，經(jīng)過反復(fù)實驗，主要是運用夾心法進行實驗，最后選定了一對效果最佳的抗體。實驗結(jié)果證明，該方案實施可避免樣品檢測中假陰性信號的出現(xiàn)，并且獲得結(jié)果最為穩(wěn)定。
2、膠體金的制備膠體金的制備是取四氯化金以檸檬酸三鈉還原它成為膠體金。
3、抗體的金標(biāo)以及固相化抗體的膠體金標(biāo)記和固相化是將膠體金標(biāo)記到抗體上，再以百德儀的氣壓噴頭噴到玻璃纖維素膜上，成為一膠體金墊，冷凍干燥待用。
抗體或二抗包被到硝酸纖維素膜上及其封閉4、抗體或二抗包被到硝酸纖維素膜上及其封閉分別將檢測目的蛋白相應(yīng)的另一個抗體以百德儀的噴頭，噴到硝酸纖維素膜上形成檢測帶即T帶，同時將抗鼠IgG二抗也噴到硝酸纖維素膜上，形成對照線，以中性蛋白封閉，干燥。
5、試劑盒的組裝試劑盒的組裝是將各成分(底板，上端吸水紙，噴有抗體的膜，膠體金墊，下端吸水紙)組裝，裁剪，包裝。
6、待檢樣品的處理食物標(biāo)本，將25g標(biāo)本磨碎，立即接種于225ml的mEC肉湯，31度恒溫搖床培養(yǎng)9h，建議使用增菌液為添加20mg/L新生霉素的EC改良肉湯。
7、檢測方法包括以下步驟用加樣器取前增菌液樣品150ul，加入檢測卡一端的加樣孔；5-15分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
8、解釋結(jié)果增菌后出現(xiàn)陰性結(jié)果，可判斷為陰性。
增菌液出現(xiàn)陽性結(jié)果，可進行病原菌鑒定。
權(quán)利要求
1.一種免疫膠體金標(biāo)記，檢測出血性大腸桿菌O157技術(shù)，其特征在于，將待測目的的O157的抗體標(biāo)記膠體金，然后以此標(biāo)記了的抗體去結(jié)合待測樣本中的目的抗原——出血性大腸桿菌O157，最終被固定在膜上檢測區(qū)的相應(yīng)抗體捕獲，形成一檢測帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)，其特征在于，所形成的檢測帶是一可見的檢測帶，可見檢測帶為樣本中有目的細菌使檢測帶上積聚的膠體金能為肉眼所見。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)，其特征在于，所述膠體金的制備是取四氯化金以檸檬酸三鈉還原它成為膠體金。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)，其特征在于，所述的膠體金標(biāo)記和固相化是將膠體金以百德儀的氣壓噴頭噴到玻璃纖維素上。成為一膠體金墊，冷凍干燥待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)，其特征在于，分別將檢測目的蛋白相應(yīng)得另一個抗體以百德儀的噴頭噴到硝酸纖維素膜上形成檢測帶，同時將二抗也噴到硝酸纖維素膜上，形成對照線，以中性蛋白封閉，干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述提供了一種通用膠體金試劑盒組件，包括底板，上端吸水紙，噴有抗體的膜，膠體金墊，下端吸水紙。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒組件中下端為加樣區(qū)，操作時將增菌液加入加樣孔中，然后觀察結(jié)果。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒組件中上端為反應(yīng)區(qū)，反應(yīng)時觀察結(jié)果，出現(xiàn)兩條反應(yīng)帶時說明反應(yīng)呈陽性；出現(xiàn)一條反應(yīng)帶時反應(yīng)為陰性；無反應(yīng)條帶出現(xiàn)時說明反應(yīng)無效。
全文摘要
本發(fā)明“免疫膠體金檢測出血性大腸桿菌O157”涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是運用一種免疫膠體金標(biāo)記檢測出血性大腸桿菌O157的方法。本試劑盒是以“測流式免疫色譜試驗”形式，利用抗原抗體夾心法設(shè)計制成的。該發(fā)明的技術(shù)方案是將待測目的O157的抗體標(biāo)記膠體金，然后以此標(biāo)記了的抗體結(jié)合待測一樣本中的目的抗原O157，最終被固定在膜上檢測區(qū)的相應(yīng)的另一個抗體捕獲，形成一肉眼可見的檢測帶，可見檢測帶為樣本中有目的細菌，檢測帶上積聚的膠體金能為肉眼所見。本發(fā)明將免疫膠體金技術(shù)運用到大腸桿菌O157快速檢測試劑盒中，在醫(yī)學(xué)及進出口食品衛(wèi)生等檢驗中既能進行定性檢測同時又能節(jié)省時間，節(jié)約了成本。
文檔編號G01N33/532GK1755364SQ20041006677
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者張慶華, 吳船, 王升年, 奚佳捷 申請人:上海生物芯片有限公司