專利名稱：一種蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法及專用微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及在一塊集成微流控芯片平臺(tái)上，采用在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)樣品的濃縮和分離的技術(shù)，特別提供了一種蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法及專用微流控芯片。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組的研究是后基因組時(shí)代的基本任務(wù)之一。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展在很大程度上依賴與分析手段的發(fā)展，而在某些實(shí)際樣品中，蛋白質(zhì)的濃度一般較低，解決這個(gè)問(wèn)題方法有幾種一是使用高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)，如激光誘導(dǎo)熒光法，質(zhì)譜法和安培法等；另一種是改進(jìn)檢測(cè)器的構(gòu)形，如用增加光程的Z形池等；第三中是增加樣品注入量的預(yù)濃縮法，主要包括電泳預(yù)濃縮和固相萃取等。電泳預(yù)濃縮是一種簡(jiǎn)易、有效和靈敏的方法，它包括場(chǎng)放大進(jìn)樣，等速電泳和等電聚焦等。但是在毛細(xì)管電泳中各種耦合方式的接口非常復(fù)雜，同時(shí)造成較大的死體積。而微流控芯片以其無(wú)死體積的交叉流路，同時(shí)以其快速，高效，為樣品的在線預(yù)濃縮和分離提供了較優(yōu)的平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法及專用微流控芯片。本發(fā)明以激光誘導(dǎo)熒光為檢測(cè)手段，在不降低分離效率的前提下，提高樣品的注入量，靈敏度得到很大的提高。
本發(fā)明具體提供了一種蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析用集成微流控芯片，其特征在于該集成微流控芯片將蛋白質(zhì)的在線預(yù)濃縮和濃縮后的電泳分離分析過(guò)程集成在一塊功能芯片上完成；該芯片由兩個(gè)基本單元構(gòu)成第一個(gè)基本單元為蛋白質(zhì)的在線電泳預(yù)濃縮，第二個(gè)單元為蛋白質(zhì)濃縮后的電泳分離分析。
本發(fā)明蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析用集成微流控芯片，其特征在于該芯片的進(jìn)樣通道為T字結(jié)構(gòu)，具體結(jié)構(gòu)形式如附圖1所示；整個(gè)在線電泳預(yù)濃縮分離分析過(guò)程用電極進(jìn)行自動(dòng)控制，其中不存在人為干擾。
本發(fā)明蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析用集成微流控芯片，其特征在于供蛋白質(zhì)分析用微流控芯片材料可以為石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物；內(nèi)表面是被修飾過(guò)的(1)對(duì)于石英、玻璃芯片選用靜態(tài)修飾、動(dòng)態(tài)修飾對(duì)芯片進(jìn)行預(yù)處理靜態(tài)修飾方法為通過(guò)偶聯(lián)劑將有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)鍵合在微流控芯片通道的表面，有機(jī)聚合物是聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羥乙烯纖維素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖，蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白。
動(dòng)態(tài)修飾方法為在緩沖液中加入以表面活性劑為主要成分的添加劑，所述表面活性劑是陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑及兩性表面活性劑。
(2)對(duì)于塑料芯片進(jìn)行表面修飾選用化學(xué)、物理兩大類方法物理方法是等離子體處理、光照射處理；化學(xué)方法是親水、疏水性處理的。
本發(fā)明蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析用集成微流控芯片，其特征在于對(duì)于石英、玻璃芯片，其內(nèi)表面采用靜態(tài)修飾，通過(guò)偶聯(lián)劑將有機(jī)聚合物鍵合在微流控芯片通道的表面；對(duì)于塑料芯片，其內(nèi)表面采用離子體處理方法進(jìn)行表面修飾。
本發(fā)明一種基于集成微流控芯片的蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法，其特征在于蛋白質(zhì)的在線電泳預(yù)濃縮方法包括場(chǎng)放大進(jìn)樣、樣品堆積、等速電泳；蛋白質(zhì)預(yù)濃縮后的電泳分離方法包括區(qū)帶電泳法、膠束電動(dòng)色譜法、毛細(xì)管篩分電泳法、毛細(xì)管等電聚焦。
本發(fā)明蛋白質(zhì)在線預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法，其特征在于蛋白質(zhì)的在線電泳預(yù)濃縮方法是等速電泳；蛋白質(zhì)預(yù)濃縮后的電泳分離方法是毛細(xì)管篩分電泳。
本發(fā)明蛋白質(zhì)在線預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法，其特征在于蛋白質(zhì)用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，濃縮分離后用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)。
本發(fā)明蛋白質(zhì)在線預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法，其特征在于用熒光染料對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所用熒光染料是共價(jià)標(biāo)記染料、非共價(jià)標(biāo)記染料蛋白質(zhì)共價(jià)標(biāo)記的熒光染料選自FITC系列、BODIPY系列、Cy系列、羅丹明系列和Alexa Fluor系列；蛋白質(zhì)非共價(jià)標(biāo)記的熒光染料選自Sypro系列、NanoOrange、Nile Red、MC 540。
本發(fā)明蛋白質(zhì)在線預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法，其特征在于用熒光染料對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所用熒光染料是共價(jià)標(biāo)記染料FITC系列。
本發(fā)明蛋白質(zhì)在線預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法，其特征在于用熒光染料對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所用熒光染料是非共價(jià)標(biāo)記的熒光染料Sypro系列。
本發(fā)明提供的集成微流控芯片平臺(tái)可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行在線電泳預(yù)濃縮，同時(shí)將濃縮后的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳快速分離。整個(gè)分析過(guò)程時(shí)間小于250秒，操作簡(jiǎn)便，靈敏度比常規(guī)的十字進(jìn)樣方法提高了約50倍。


圖1蛋白質(zhì)在線預(yù)濃縮-分離分析用集成微流控芯片結(jié)構(gòu)圖；圖2微流控芯片無(wú)膠篩分分離蛋白質(zhì)的電泳圖譜；圖3集成微流控芯片上等速電泳在線預(yù)濃縮-無(wú)膠篩分分離和十字進(jìn)樣無(wú)膠篩分分離蛋白質(zhì)的電泳比較圖譜；
圖4集成微流控芯片上等速電泳在線預(yù)濃縮-無(wú)膠篩分分離蛋白質(zhì)的重復(fù)性電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式(圖形說(shuō)明圖2微流控芯片無(wú)膠篩分分離蛋白質(zhì)的電泳圖譜；其中FITC為熒光素異硫氰酸酯，為碳酸酐酶，2為雞母雞卵白蛋白，3為牛血清白蛋白，4為伴清白蛋白。
圖1中濃縮檢測(cè)點(diǎn)在通道7與主通道相連接處附近的主通道內(nèi)；分離檢測(cè)點(diǎn)在通道8遠(yuǎn)離通道7的一側(cè)。)蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮-電泳分離分析集成微流控芯片按圖1所示，材料為石英、玻璃、不同的有機(jī)材料如PMMA、PDMS等。以等速電泳預(yù)濃縮-無(wú)膠篩分分離蛋白質(zhì)為例，等速電泳的前導(dǎo)離子可以是氯離子，磷酸根離子，硼酸根離子等陰離子，尾隨離子可以是甘氨酸根離子，醋酸根離子等陰離子；無(wú)膠篩分的篩分介質(zhì)為各種形式的高分子化合物，如聚乙二醇，甲基聚丙烯酰胺，葡聚糖，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺，瓊脂糖等。集成微流控芯片的通道內(nèi)充滿無(wú)膠篩分分離緩沖液，而在1通道內(nèi)充滿尾隨電解質(zhì)，在1和4通道之間形成一個(gè)不同電泳淌度電解質(zhì)的界面，蛋白質(zhì)樣品進(jìn)樣后進(jìn)行等速電泳濃縮，濃縮后實(shí)現(xiàn)無(wú)膠篩分分離。在分離通道內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離分析，需要進(jìn)行各種形式的表面修飾，以防止蛋白質(zhì)在通道內(nèi)壁的吸附。修飾過(guò)程可以是任何形式的物理或者化學(xué)修飾。對(duì)于石英和玻璃芯片修飾方法主要有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種修飾方法，靜態(tài)修飾通常是指將一些有機(jī)聚合物或者某些蛋白質(zhì)通過(guò)偶聯(lián)劑鍵合在通道的表面，有機(jī)聚合物主要有聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羥乙烯纖維素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖等；蛋白質(zhì)有牛血清白蛋白等。動(dòng)態(tài)修飾重要是指在緩沖液中加一些添加劑，主要是一些表面活性劑，包括陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑及兩性表面活性劑等。對(duì)于塑料芯片的表面修飾，主要是物理或者化學(xué)方法，物理方法有等離子體處理、光照射處理等，化學(xué)方法主要是根據(jù)材料的不同對(duì)通道表面進(jìn)行親水或者疏水性處理。
實(shí)施例1所用集成微流控芯片為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，以玻璃基片采用標(biāo)準(zhǔn)光刻、濕法腐蝕和鍵合制作，構(gòu)型如圖1所示，通道尺寸為80μm×20μm，通道用線性聚丙烯酰胺進(jìn)行修飾。蛋白質(zhì)常規(guī)的十字進(jìn)樣無(wú)膠篩分分離采用集成微流控芯片中十字交叉部分，運(yùn)行緩沖液是一定濃度的葡聚糖和磷酸緩沖液。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為分子量從31kD到78kD的4種蛋白質(zhì)，分別為碳酸酐酶(31kDa)，雞母雞卵白蛋白(43kDa)，牛血清白蛋白(66kDa)和伴清白蛋白(78kDa)。蛋白質(zhì)用十二烷基硫酸鈉和巰基乙醇混合100℃加熱變性6min。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，標(biāo)記蛋白質(zhì)的染料是熒光素異硫氰酸酯，激光波長(zhǎng)470nm。得到的微流控芯片無(wú)膠篩分分離蛋白質(zhì)電泳圖譜如圖2所示。
實(shí)施例2所用微流控芯片為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，以玻璃基片采用標(biāo)準(zhǔn)光刻、濕法腐蝕和鍵合制作，構(gòu)型如圖1所示，通道尺寸為80μm×20μm，通道用線性聚丙烯酰胺進(jìn)行修飾，同時(shí)為了消除通道大小對(duì)濃縮倍數(shù)的影響，十字進(jìn)樣分離與等速電泳-無(wú)膠篩分分離分別在同一塊微流控芯片上完成。運(yùn)行緩沖液是一定濃度的葡聚糖和硼酸緩沖液，其中硼酸根離子為等速電泳濃縮的前導(dǎo)離子，尾隨電解質(zhì)為一定濃度的甘氨酸溶液。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為分子量從31kDa到78kDa的4種蛋白質(zhì)，分別為碳酸酐酶(31kDa)，雞母雞卵白蛋白(43kDa)，牛血清白蛋白(66kDa)和伴清白蛋白(78kDa)。蛋白質(zhì)用十二烷基硫酸鈉和巰基乙醇混合100℃加熱變性6min。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，標(biāo)記蛋白質(zhì)的染料是熒光素異硫氰酸酯，激光波長(zhǎng)470nm，得到的微流控芯片等速電泳濃縮-無(wú)膠篩分分離和十字進(jìn)樣無(wú)膠篩分分離蛋白質(zhì)的電泳比較圖譜如圖3所示，通過(guò)計(jì)算峰面積，得到濃縮倍數(shù)約為50倍。
實(shí)施例3所用微流控芯片為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，以玻璃基片采用標(biāo)準(zhǔn)光刻、濕法腐蝕和鍵合制作，構(gòu)型如圖1所示，通道尺寸為80μm×20μm，通道用線性聚丙烯酰胺進(jìn)行修飾，運(yùn)行緩沖液是一定濃度的葡聚糖和硼酸緩沖液，其中硼酸根離子作為等速電泳濃縮的前導(dǎo)離子，尾隨電解質(zhì)為一定濃度的甘氨酸溶液。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為分子量從31kDa到78kDa的4種蛋白質(zhì)，分別為碳酸酐酶(31kDa)，雞母雞卵白蛋白(43kDa)，牛血清白蛋白(66kDa)和伴清白蛋白(78kDa)。蛋白質(zhì)用十二烷基硫酸鈉和巰基乙醇混合100℃加熱變性6min。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，標(biāo)記蛋白質(zhì)的染料是熒光素異硫氰酸酯，激光波長(zhǎng)470nm，重復(fù)運(yùn)行4次，遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＜2％，峰面積的RSD＜7％，得到的重復(fù)性譜圖如圖4所示。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析用集成微流控芯片，其特征在于該集成微流控芯片將蛋白質(zhì)的在線預(yù)濃縮和濃縮后的電泳分離分析過(guò)程集成在一塊功能芯片上完成；該芯片由兩個(gè)基本單元構(gòu)成第一個(gè)基本單元為蛋白質(zhì)的在線電泳預(yù)濃縮，第二個(gè)單元為蛋白質(zhì)濃縮后的電泳分離分析。
2.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析用集成微流控芯片，其特征在于該芯片的進(jìn)樣通道為T字結(jié)構(gòu)，整個(gè)在線電泳預(yù)濃縮分離分析過(guò)程用電極進(jìn)行自動(dòng)控制。
3.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)預(yù)濃縮分離分析用集成微流控芯片，其特征在于供蛋白質(zhì)分析用微流控芯片材料為石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物；(1)對(duì)于石英、玻璃芯片選用靜態(tài)修飾、動(dòng)態(tài)修飾對(duì)芯片進(jìn)行預(yù)處理靜態(tài)修飾方法為通過(guò)偶聯(lián)劑將有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)鍵合在微流控芯片通道的表面，有機(jī)聚合物是聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羥乙烯纖維素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖，蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白。動(dòng)態(tài)修飾方法為在緩沖液中加入以表面活性劑為主要成分的添加劑，所述表面活性劑是陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑及兩性表面活性劑。(2)對(duì)于塑料芯片進(jìn)行表面修飾選用化學(xué)、物理兩大類方法物理方法是等離子體處理、光照射處理；化學(xué)方法是親水、疏水性處理。
4.按照權(quán)利要求3所述蛋白質(zhì)預(yù)濃縮分離分析用集成微流控芯片，其特征在于供蛋白質(zhì)分析用微流控芯片材料為石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物；對(duì)于石英、玻璃芯片采用靜態(tài)修飾，通過(guò)偶聯(lián)劑將有機(jī)聚合物鍵合在微流控芯片通道的表面；對(duì)于塑料芯片采用離子體處理方法進(jìn)行表面修飾。
5.一種基于權(quán)利要求1所述集成微流控芯片的蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析方法，其特征在于蛋白質(zhì)的在線電泳預(yù)濃縮方法包括場(chǎng)放大進(jìn)樣、樣品堆積、等速電泳；蛋白質(zhì)預(yù)濃縮后的電泳分離方法包括區(qū)帶電泳法、膠束電動(dòng)色譜法、毛細(xì)管篩分電泳法、毛細(xì)管等電聚焦。
6.按照權(quán)利要求5所述蛋白質(zhì)在線預(yù)濃縮和濃縮后的電泳分離分析方法，其特征在于蛋白質(zhì)的在線電泳預(yù)濃縮方法是等速電泳；蛋白質(zhì)預(yù)濃縮后的電泳分離方法是毛細(xì)管篩分電泳。
7.按照權(quán)利要求5所述蛋白質(zhì)在線預(yù)濃縮和濃縮后的電泳分離分析方法，其特征在于蛋白質(zhì)用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，濃縮分離后用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)。
8.按照權(quán)利要求7所述蛋白質(zhì)濃縮與分離分析方法，其特征在于用熒光染料對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所用熒光染料是共價(jià)標(biāo)記染料、非共價(jià)標(biāo)記染料蛋白質(zhì)共價(jià)標(biāo)記的熒光染料選自FITC系列、BODIPY系列、Cy系列、羅丹明系列和Alexa Fluor系列；蛋白質(zhì)非共價(jià)標(biāo)記的熒光染料選自Sypro系列、NanoOrange、Nile Red、MC 540。
9.按照權(quán)利要求8所述蛋白質(zhì)濃縮與分離分析方法，其特征在于用熒光染料對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所用熒光染料是共價(jià)標(biāo)記染料FITC系列。
10.按照權(quán)利要求8所述蛋白質(zhì)濃縮與分離分析方法，其特征在于用熒光染料對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所用熒光染料是非共價(jià)標(biāo)記的熒光染料Sypro系列。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)在線電泳預(yù)濃縮和濃縮后電泳分離分析用集成微流控芯片，其特征在于該集成微流控芯片將蛋白質(zhì)的在線預(yù)濃縮和濃縮后的電泳分離分析過(guò)程集成在一塊功能芯片上完成；該芯片由兩個(gè)基本單元構(gòu)成第一個(gè)基本單元為蛋白質(zhì)的在線電泳預(yù)濃縮，第二個(gè)單元為蛋白質(zhì)濃縮后的電泳分離分析。該芯片的進(jìn)樣通道可以為T字型結(jié)構(gòu)，整個(gè)在線電泳預(yù)濃縮分離分析過(guò)程可以用電極進(jìn)行自動(dòng)控制。使用本發(fā)明提供的集成微流控芯片平臺(tái)，整個(gè)分析過(guò)程時(shí)間小于250秒，操作簡(jiǎn)便，在不降低分離效率的前提下，提高樣品的注入量，靈敏度得到很大的提高。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1779431SQ20041008756
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者林炳承, 黃淮青, 戴忠鵬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所