專利名稱：用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種樣品處理制劑，尤指一種用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑。
背景技術(shù)：
隨著全球生物安全戰(zhàn)略的廣泛實施，有關(guān)病原生物的快速診斷需求日益增強，同時快速診斷所要面對的檢測對象也更加復雜，包括人、動植物樣品、食品，甚至是“白色粉末”等。固相膜免疫分析試驗(Membrane-based immunoassay)，尤其是免疫層析技術(shù)由于具有簡便、快速、高效、廉價，而且適用于大規(guī)?，F(xiàn)場應用等特點，近年來在病原檢測方面獲得了長足的發(fā)展，各種新的生物標記材料以及光學、電子檢測系統(tǒng)研究也不斷取得進展并得到迅速應用。然而，有關(guān)檢測對象樣品處理技術(shù)在固相膜免疫分析研究中并未得到同步發(fā)展，使得固相膜免疫分析技術(shù)在大顆粒抗原和復雜樣本檢測中面臨困難。
固相膜免疫分析試驗是以膜為固相載體的免疫快速診斷技術(shù)，該項技術(shù)以多孔性的微孔濾膜為固相載體，含水介質(zhì)作為流動相通過膜孔的毛細管作用誘導反應物向固定在膜表面的結(jié)合對象傳遞，從而將未結(jié)合的反應物與液-固界面上形成的復合物分離開來，因此，固相膜免疫分析技術(shù)完成要依賴流動相作為載體運輸檢測對象。受固相膜孔徑等因素的限制，攜帶樣本的流動相的表面張力以及其中的顆粒成分大小將會直接影響檢測結(jié)果。但是，目前國內(nèi)外有關(guān)免疫分析的研究主要集中在提高檢測系統(tǒng)的敏感性上，而作為載體流動相應用于免疫層析系統(tǒng)的樣本制劑僅限于檢測標本液體(如尿樣)、普通緩沖液(溶解的固體對象如PBS緩沖液、生理鹽水等)或在普通緩沖液中添加作為封閉液使用的Tween20、牛血清白蛋白(BSA)緩沖液等。
而在固相膜免疫分析技術(shù)應用于傳染病檢測時，其檢測對象主要可分為抗原和抗體兩大類。對于抗體檢測，固相膜免疫分析檢測對象特征相對同定；而對于抗原檢測，免疫層析面臨的檢測對象則要復雜得多，少數(shù)可以是可溶性的病原微生物分泌蛋白分子，如細菌毒素，多數(shù)則是病毒、細菌、寄生蟲等顆粒性抗原對象，其大小從納米、微米到毫米級不等。由于免疫層析方法主要借助毛細作用，讓樣品在條狀纖維制成的膜上泳動，其中的待測物與膜上一定區(qū)域的配體結(jié)合，通過酶促顯色反應或者其它標記物檢測，以便短時間得到直觀的結(jié)果。因此，顆粒性抗原的體積大小不僅會影響檢測對象在膜上地流動，而且其空間結(jié)構(gòu)不可避免地會限制其與捕捉抗體地充分結(jié)合，因而會降低待測樣本的檢測靈敏度。而要提高檢測靈敏度則需要通過有效的化學制劑將其從顆粒上最大限度地解離、溶解并且不影響其與相應抗體的后續(xù)結(jié)合，而目前作為載體流動相應用于免疫層析系統(tǒng)的樣本制劑無法滿足這一要求。
另外，如果檢測對象是復雜樣本中的病原微生物，如食品、組織樣本、土壤或白色粉末等，如何從復雜樣本中將顆粒性的待測抗原分離檢測而不受或最大限度減少樣本物質(zhì)的影響是個非常棘手的問題，目前作為載體流動相應用于免疫層析系統(tǒng)的樣本制劑卻無法滿足上述要求，這也是當前固相膜免疫分析方法應用于病原微生物顆粒性抗原如細菌檢測的難點所在，嚴重限制了其在直接檢測病原微生物方面的應用。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種可提高固相膜免疫分析方法檢測復雜樣品的能力及其檢測敏感性、并可擴大檢測復雜樣本顆粒性抗原的應用范圍、原料來源容易、配制方法簡便的用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑。
為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑，該制劑包括基礎(chǔ)緩沖液和Nonidet P40，其中，該基礎(chǔ)緩沖液的PH值在5.5-10之間，Nonidet P40的體積比含量在0.05％-3.5％之間。
進一步，所述制劑還包括封閉劑。
進一步，所述制劑還包括防腐劑。
進一步，所述防腐劑可為疊氮鈉或硫汞撒或慶大霉素。
進一步，所述基礎(chǔ)緩沖液為生物化學緩沖液或鹽溶液。
由于本發(fā)明的樣品處理制劑中包括有非離子表面活性劑NonidetP40，因此可有效解離奶粉、動物組織、土壤等復雜樣品中的顆粒性抗原成分，使之在經(jīng)過簡單的離心或過濾方法處理后適合于固相膜免疫分析，從而提高固相膜免疫分析方法檢測復雜樣品的能力并擴大檢測復雜樣本顆粒性抗原的應用范圍；另外，優(yōu)化了溶液中的非離子表面活性劑Nonidet P40的濃度、樣品液的PH值后，應用于顆粒性抗原的固相膜免疫分析方法，與現(xiàn)有常見流動相相比較，同等條件下能夠提高細菌樣本檢測敏感性10倍以上，而且具有較低的檢測背景，使樣品在膜上流動時無明顯阻滯現(xiàn)象出現(xiàn)。另外，該樣品制劑原料來源容易，配制方法簡便，一個普通的技術(shù)人員在無特殊設(shè)備的條件下就可以完成配制工作。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明。
本發(fā)明用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑，其配方如下實施例1以PBS緩沖液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為8.0，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 3.5％(v/v)上述樣本處理制劑用于處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的奶粉(每毫升樣本制劑加入約50mg奶粉)，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，樣本上清液用檢測鼠疫菌的膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)分別檢測。結(jié)果顯示，與用不同量的通用的Tween20溶液處理相比較，經(jīng)本實施例的樣品處理制劑作用后，對于膠體金試驗檢測敏感性可提高5-10倍，對于上轉(zhuǎn)磷光標記的免疫測定則可提高靈敏度10倍以上。用于已建立的炭疽桿菌UCP免疫層析方法檢測芽孢也可獲得類似的比較結(jié)果。
實施例2以PBS緩沖鹽溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為7.5，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 1.0％(v/v)NaN3(疊氮鈉)0.05％(w/v)將上述樣本處理制劑處理鼠疫耶爾森氏菌，與通用的用同濃度的Tween20(v/v)、SDS(w/v)、去氧膽酸鹽(w/v)、Triton X-100(v/v)溶液來處理作比較，混勻5-10分鐘后，用以檢測鼠疫菌的UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)檢測。比較結(jié)果顯示對于上轉(zhuǎn)磷光標記的免疫測定，用本實施例的樣品制劑，具有更高的陽性檢測值，可提高檢測靈敏度最低10倍以上。而且，在溶液基質(zhì)中加入重量含量為0.05％的NaN3，還可起到防腐的作用，使配制好的溶液不會變質(zhì)。
實施例3以PBS緩沖鹽溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為5.5，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 0.5％(v/v)
NaN3(疊氮鈉)0.05％(w/v)BSA 1.0％(w/v)上述樣本處理制劑可用于現(xiàn)有的免疫層析方法或免疫滲濾試驗，檢測處理如土壤、奶粉、肉骨粉、動物組織、肉湯、血液等待檢樣品。加入該樣品處理制劑混勻5-10分鐘后，靜置或短暫離心或粗濾處理，以現(xiàn)有固相膜免疫分析試驗檢測條插入，或取上清液或濾過物加樣適量，觀察檢測結(jié)果。檢測對象可依據(jù)試驗目的不同而有所區(qū)別，可以是細菌、病毒、寄生蟲或其它有意義的檢測配體成分；用該制劑進行免疫層析或免疫滲濾檢驗，可提高靈敏度10倍以上。而且，在溶液基質(zhì)中加入0.05％的NaN3，還可起到防腐的作用，使配制好的溶液不會變質(zhì)，并且加入封閉劑1.0％的BSA更可增強試劑的封閉性，提高檢測靈敏度。
實施例4以PBS緩沖液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為8.5，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 0.05％(v/v)Tween20 1.5％(v/v)將上述樣本處理制劑用于處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的淀粉(每毫升樣本制劑加入約50mg奶粉)，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，將樣本上清液以檢測鼠疫菌的膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)分別檢測。結(jié)果顯示，與用不同量的通用的Tween20溶液處理相比較，經(jīng)該樣品處理制劑作用后，膠體金試驗檢測敏感性可提高5-10倍，對于上轉(zhuǎn)磷光標記的免疫測定則可提高靈敏度10倍以上。以Tween20代替BSA同樣可增強試劑的封閉性，提高檢測靈敏度。
實施例5以TBS緩沖溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為10，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 0.5％(v/v)NaN3(疊氮鈉)0.05％(w/v)BSA 1.0％(w/v)將上述樣本處理制劑處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的奶粉，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，分別以膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)檢測條插入樣本上清液檢測，檢測結(jié)果表明，與用同濃度的通用的Tween20溶液處理相比較，對于膠體金試驗檢測敏感性可提高5-10倍，對于上轉(zhuǎn)磷光標記的免疫測定則可提高靈敏度10倍以上。對以面粉、土壤和肉末模擬添加鼠疫菌進行處理可獲得同樣的結(jié)果。并且，配制好的溶液不會變質(zhì)，還可增強試劑的封閉性，提高檢測靈敏度。
實施例6
以Hepes緩沖溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為10，配制含以下成分的溶液Nonidet P40 0.5％(v/v)硫汞撒0.05％(w/v)TritonX-100 1.0％(w/v)將上述樣本處理制劑處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的奶粉，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，分別以膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)檢測條插入樣本上清液檢測，檢測結(jié)果表明，與用同濃度的通用的Tween20溶液處理相比較，對于膠體金試驗檢測敏感性可提高5-10倍，對于上轉(zhuǎn)磷光標記的免疫測定則可提高靈敏度10倍以上。對以面粉、土壤和肉末模擬添加鼠疫菌進行處理可獲得同樣的結(jié)果。并且，加入防腐劑硫汞撒使配制好的溶液不會變質(zhì)，而1.0％的TritonX-100還可增強試劑的封閉性，提高檢測靈敏度。
實施例7以Hepes緩沖溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為10，配制含以下成分的溶液Nonidet P40 0.5％(v/v)慶大霉素0.05％(w/v)TritonX-100 1.0％(w/v)將上述樣本處理制劑處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的奶粉，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，分別以膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)檢測條插入樣本上清液檢測，檢測結(jié)果表明，與用同濃度的通用的Tween20溶液處理相比較，對于膠體金試驗檢測敏感性可提高5-10倍，對于上轉(zhuǎn)磷光標記的免疫測定則可提高靈敏度10倍以上。對以面粉、土壤和肉末模擬添加鼠疫菌進行處理可獲得同樣的結(jié)果。并且，加入防腐劑硫汞撒同樣使配制好的溶液不會變質(zhì)，而1.0％的TritonX-100還可增強試劑的封閉性，提高檢測靈敏度。
另外，本發(fā)明樣本處理制劑中的基質(zhì)緩沖液為生物化學中常用的緩沖液或鹽溶液，可選自Tris緩沖液、Hepes緩沖液、磷酸鹽緩沖液、鹽酸鹽溶液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽溶液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液等其中的一種或幾種的混合液；封閉劑可選自牛血清白蛋白(BSA)、Tween20、Triton X-100或PVA(15Kda)、PVP(33KDA)、PEG(20KDA)、Brij、凝膠、脫脂牛奶、、免疫球蛋白(IgG)、酪蛋白(Casein)等。
權(quán)利要求
1.一種用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑，其特征在于該制劑包括基礎(chǔ)緩沖液和Nonidet P40，其中，該基礎(chǔ)緩沖液的PH值在5.5-10之間，Nonidet P40的體積比含量在0.05％-3.5％之間。
2.如權(quán)利要求1所述的用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑，其特征在于所述制劑還包括封閉劑。
3.如權(quán)利要求2所述的用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑，其特征在于所述制劑還包括防腐劑。
4.如權(quán)利要求3所述的用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑，其特征在于所述防腐劑可為疊氮鈉或硫汞撒或慶大霉素。
5.如權(quán)利要求4所述的用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑，其特征在于所述基礎(chǔ)緩沖液為生物化學緩沖液或鹽溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于固相膜免疫分析方法流動相的樣本處理制劑，該制劑包括基礎(chǔ)緩沖液和Nonidet P40，其中，該基礎(chǔ)緩沖液的pH值在5.5－10之間，Nonidet P40的體積比含量在0.05％－3.5％之間。由于本發(fā)明的樣品處理制劑中包括有非離子表面活性劑Nonidet P40，因此可有效解離奶粉、動物組織、土壤等復雜樣品中的顆粒性抗原成分，使之在經(jīng)過簡單的離心或過濾方法處理后適合于固相膜免疫分析，從而提高固相膜免疫分析方法檢測復雜樣品的能力并擴大檢測復雜樣本顆粒性抗原的應用范圍；并且，優(yōu)化Nonidet P40的濃度、樣品液的pH值后，能夠提高細菌樣本檢測敏感性10倍以上。
文檔編號G01N1/28GK1619307SQ200410091168
公開日2005年5月25日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者胡孔新, 王寶麟, 王大寧, 王靜, 姚李四, 李偉, 陳維娜 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院