專利名稱：確定NT－proBNP的分析夾心測試的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析夾心測試，特別是一種測試元件，尤其是一種利用夾心原理測定N-末端前腦鈉尿肽(NT-proBNP)的呈免疫層析測試條。
NT-proBNP是一種用于診斷和控制心力衰竭的非常有前途的標(biāo)志物。例如，在WO0045176中的1至4頁綜述了心力衰竭及NT-proBNP作為心臟病標(biāo)志物的重要性，給出了作為標(biāo)志物的實施例，WO0045176在此詳細的作為參考。此外，文獻US5786163、US6461828、US6117644、EP1151304、WO02083913以及申請日為2003年12月5日的EP專利申請?zhí)?30105910.0(Klemt等)均涉及NT-proBNP及其抗體和檢測方法。
目前，體外診斷市場中唯一可利用的NT-proBNP測試為Roche診斷公司的基于夾心反應(yīng)及電化學(xué)發(fā)光檢測原理的全自動ElecsysNT-proBNP檢測。該檢測被設(shè)計用于大規(guī)模中心實驗室，并且為了進行測試，除了須精確計量的液體試劑之外，還需要相對復(fù)雜的儀器來定量液體和檢測發(fā)光信號。目前市場上還沒有使用簡單的、僅通過顯色而無需采用評估儀器的快速檢測(如果需要的話)NT-proBNP的方法。
免疫可檢測物質(zhì)的快速檢測長期以來已知存在許多不同的參數(shù)，例如參見WO9706439、EP0291194、US5591645、US4861711、US5141850、US6506612、US5458852、US5073484。在這些文獻中的免疫檢測試劑(主要是標(biāo)記或未標(biāo)記的抗體或抗原)通常是以存在于載體上的干燥形式提供的，該載體允許樣品液體(特別是體液，例如血液、血清、血漿、尿、唾液等)轉(zhuǎn)移至或進入載體中。基于該目的，所述載體優(yōu)選具有毛細管的效果，例如具有毛細管通道的膜或塑料載體。業(yè)內(nèi)專家通常稱其為免疫層析測試條或測試裝置。
在患有急性呼吸窘迫癥的病人中，盡可能地快速進行NT-proBNP測定有利于排除或診斷心力衰竭作為呼吸窘迫癥的原因從而進行正確的治療。由于ElecsysNT-proBNP檢測僅能在中心實驗室中進行，從而很難在常規(guī)時間以外快速地測定NT-proBNP。因此，如果具有能在常規(guī)時間以外能在緊急病房中直接進行快速的檢測將對緊急病房十分有利。不過，這種快速檢測必須保證具有與中心實驗室的參考方法(ElecsysNT-proBNP)相同的參考范圍和截止值，從而保證不依賴于具體進行的檢測類型的結(jié)果的較好的可比性。
用于ElecsysNT-proBNP檢測的多克隆抗體(PAB)是NT-proBNP的一種非常特別的部分(“天然”NT-proBNP；參見Klemt等的申請日為2003年12月5日的EP專利申請?zhí)?30105910.0；根據(jù)該文獻，測試識別了包括1-21(AA 1-21)和39-50(AA 39-50)位氨基酸的NT-proBNP的表位)。然而，已經(jīng)證實，這些多克隆抗體不適用于采用顆粒標(biāo)記例如膠體金作為標(biāo)記物的NT-proBNP快速檢測，因為由于快速檢測的組分之間(例如載體物質(zhì)、基質(zhì)等)的物理化學(xué)相互作用，這類抗體在信號產(chǎn)生方面顯示出非常不理想的可變性。這導(dǎo)致在不同的批次間測試效果具有相當(dāng)大的波動性。
因此，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷。特別是，本發(fā)明的目的是提供一種測定NT-proBNP的快速測試，其能重復(fù)生產(chǎn)并與實驗方法存在良好的關(guān)聯(lián)。
該目標(biāo)由本發(fā)明的主題內(nèi)容實現(xiàn)了。
本發(fā)明涉及一種免疫測試，尤其是快速檢測的形式，例如如在專利的獨立權(quán)利要求中所表征的分析測試元件。在從屬權(quán)利要求中描述了優(yōu)選實施例。
用于在夾心方式中進行免疫測試的本發(fā)明的方案以及特別是與Elecsys參考方法十分相關(guān)的快速檢測采用了一種包括至少兩個抗NT-proBNP的抗體的特定抗體的組合，其中至少一個抗體為多克隆抗體(PAB)。根據(jù)本發(fā)明的另一夾心測試抗體可以是MAB或是多克隆抗體(PAB)。在這種聯(lián)系中，這些抗體(縮寫為AB)之一至少靶向包括38至50氨基酸的NT-proBNP表位部分(如下簡寫為AB(38-50)或MAB(38-50)或PAB(38-50))。至少有一個另外的抗體至少作用于包括1至37或43至76氨基酸(如下簡寫為AB(1-37)或AB(43-76)或MAB(1-37)或MAB(43-76)或PAB(1-37)或PAB(43-76))的NT-proBNP的表位部分。被抗體識別的表位可以稍微重疊，優(yōu)選重疊少于5個氨基酸，尤其優(yōu)選少于2個氨基酸。
一種抗體的組合優(yōu)選地包括至少一種抗NT-proBNP的多克隆抗體(PAB)和一種單克隆抗體(MAB)(也稱為PAB/MAB組合)。
本發(fā)明中采用的術(shù)語PAB(X-Y)表示一種多克隆抗體，其靶向包括X到Y(jié)位的氨基酸的NT-proBNP表位。MAB(X-Y)是一種相應(yīng)的單克隆抗體。AB(X-Y)一般表示一種靶向包括X到Y(jié)位氨基酸的NT-proBNP表位的抗體。
MABa.b.c(X-Y)為一種靶向包括X至Y位氨基酸的NT-proBNP表位的單克隆抗體，其來源于保藏的細胞系a.b.c.。
為了保證抗體一標(biāo)記綴合物的可重現(xiàn)的質(zhì)量，優(yōu)選MAB被固定于顆粒標(biāo)記物上，特別是金標(biāo)記物上。
其他合適的顆粒標(biāo)記物為例如彩色的乳膠、其他的金屬溶膠標(biāo)記物、聚合物標(biāo)記物或半導(dǎo)體納米微晶體(也稱為量子點)。MAB-標(biāo)記綴合物優(yōu)選地以可經(jīng)樣品液體作用而分離的方式存在于快速檢測裝置中，例如經(jīng)浸漬合適的載體介質(zhì)如羊毛狀覆蓋物、膜等的方式。不過，也可以將MAB-標(biāo)記的綴合物作為溶液添加至快速檢測裝置中。
優(yōu)選地，來源于免疫哺乳動物，尤其是綿羊、山羊或兔子的PAB優(yōu)選地作為生物素衍生物存在于快速檢測系統(tǒng)中，并且可以與抗生物素蛋白或鏈霉親和素檢測線相連。不過，也可以直接將PAB固定于快速檢測裝置中，例如以存在于合適的層析膜上的檢測線的形式。
根據(jù)本發(fā)明，也可以采用，雖然不是那么優(yōu)選，溶于溶液中的標(biāo)記的AB，特別是標(biāo)記的MAB，和第二抗體，特別是第二抗MAB或PAB用于快速檢測。一種可捕獲適當(dāng)標(biāo)記的AB的結(jié)合伙伴位于測試裝置的檢測區(qū)，從而可以將包括第一抗體、被分析物和第二抗體的夾心復(fù)合體結(jié)合至快速檢測系統(tǒng)的固相上。
如本發(fā)明中所采用的MAB無需必須識別在參考系統(tǒng)(Elecsys測試)中檢測出的表位(AA 1-21)從而保證與參考測試的良好地關(guān)聯(lián)權(quán)利要求1中提到的抗體組合，尤其是MAB/PAB組合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)和MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)與采用抗NT-proBNP的AA 1-21和AA 39-50表位的多克隆抗體(PAB(1-21)和PAB(39-50))的Elecsys參考系統(tǒng)關(guān)聯(lián)性很好。
采用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法，特別是參照WO0045176的實施例2的方法可以獲得、定性和鑒定多克隆抗體如PAB(1-21)和PAB(39-50)。
采用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法，特別是參照WO0045176的實施例3或申請日為2003年12月5日的EP專利申請?zhí)?30105910.0(Klemt等)中的方法可以獲得、定性和鑒定單克隆抗體如MAB(38-42)和MAB(44-50)。
通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法(同時也參照WO0045176的實施例2和Klemt等的申請日為2003年12月5日的EP專利申請?zhí)?30105910.0)，采用如金或其他標(biāo)記物、生物素等來標(biāo)記抗體。例如在EP-A0898170中詳細描述了采用金標(biāo)記的過程。
特別是可以根據(jù)Klemt等的申請日為2003年12月5日的EP專利申請?zhí)?30105910.0實施例3的記載來獲得優(yōu)選的單克隆抗體MAB17.3.1(13-16)、MAB 16.1.39(38-42)、MAB 18.29.23(64-67)和MAB18.4.34(27-31)。相應(yīng)的細胞系保藏于“Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSZM)”(保存編號和日期為MAB 17.3.1(13-16)為DSM ACC2591(2003/05/07)；MAB 16.1.39(38-42)為 DSM ACC2590(2003/05/07)；MAB 18.29.23(64-67)為DSMACC2593(2003/05/07)；和MAB 18.4.34(27-31)為DSM ACC2592(2003/05/07))。
與組合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)一樣，組合MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)與參考實驗有較好的相關(guān)性(也參見實施例2)。
此外，組合MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)被證實對于本發(fā)明的測試十分有效這種組合使函數(shù)曲線特別適合于特別合適的快速檢測系統(tǒng)(參見實施例3).與之相比較，組合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)顯示出較差的檢測靈敏度。
采用如下實施例和附圖進一步闡明本發(fā)明。


圖1顯示了呈免疫層析測試條形狀的本發(fā)明的快速檢測裝置的優(yōu)選圖2顯示了Elecsys濕潤測試形式的抗體組合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)與Elecsys參考方法PAB(1-21)/PAB(39-50)的相關(guān)性。
圖3顯示了Elecsys濕潤測試形式的抗體組合MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)與Elecsys參考方法PAB(1-21)/PAB(39-50)的相關(guān)性。
圖4顯示了采用不同抗體組合的根據(jù)實施例1所述的NT-proBNP測試條的函數(shù)曲線。
圖5顯示了采用抗體組合Au-MAB18.4.34(27-31)/Bi-PAB(39-50)的NT-proBNP測試條與ElecsysNT-proBNP測試試劑盒的相關(guān)性。
圖中的編號表示1.樣品加樣區(qū)2.紅血球分離區(qū)3.檢測區(qū)4.吸收區(qū)5.載體材料6.樣品加樣基質(zhì)(“生物素羊毛狀覆蓋物”和“金羊毛狀覆蓋物”)7.紅血球分離基質(zhì)8.檢測基質(zhì)9.線狀的固定區(qū)10.吸收基質(zhì)實施例1)用于測定全血中NT-proBNP的檢測裝置的制備(參考圖1)測試裝置(圖1)由其上裝有加樣區(qū)(1)、紅血球分離區(qū)(2)、檢測區(qū)(3)和吸收區(qū)(4)的載體材料(5)組成。部分與紅血球分離區(qū)(7)相重疊的樣品加樣基質(zhì)(6)位于樣品的加樣區(qū)(1)中。紅血球分離基質(zhì)(7)又稍稍與檢測基質(zhì)(8)(檢測區(qū))重疊，其中檢測基質(zhì)上覆蓋有呈線狀的(9)固定物質(zhì)。一種吸收基質(zhì)(10)稍稍與檢測基質(zhì)(8)重疊。與待檢測的被分析物形成復(fù)合體形式所需的所有試劑均置于樣品的加樣基質(zhì)中(6)。在本技術(shù)方案中，樣品加樣區(qū)由兩層疊放的羊毛狀覆蓋物組成，其中第一層(“金羊毛狀覆蓋物”)浸漬了抗NT-proBNP的金標(biāo)記的抗體(MAB 18.4.34(27-31))，第二層羊毛狀覆蓋物(“生物素羊毛狀覆蓋物”)中浸漬了抗NT-proBNP的生物素化抗體(PAB(39-50))。一由鏈霉親和素制成的線(9)位于檢測區(qū)中。
一層350μm厚的聚酯油(Pütz)作為載體層(5)。一層360μm厚的聚酯羊毛狀覆蓋物(Roche診斷公司)被用作樣品加樣基質(zhì)(6)的“金羊毛狀覆蓋物”或“生物素羊毛狀覆蓋物”。一層1.8mm厚的玻璃纖維羊毛狀覆蓋物(Roche診斷公司)被用作紅血球分離基質(zhì)(7)。一層140μm厚的硝酸纖維膜(Sartorius)被用作檢測基質(zhì)(8)。一層1.8mm厚的玻璃纖維羊毛狀覆蓋物(Roche診斷公司)被用作吸收基質(zhì)(10)。如圖1所示，單獨的組件(6、7、8、10)通過熱熔粘合的方式輕微重疊的粘合于載體層上(5)。
“金和生物素羊毛狀覆蓋物”的浸漬制劑為“金羊毛狀覆蓋物”100mM Hepes pH7.4，0.1％ Tween，20μg/ml生物素化的PAB(39-50)“生物素羊毛狀覆蓋物”100mM Hepes pH7.4，OD 4 MAB18.4.34(27-31)金絡(luò)合物2)Elecsys形式的表位/抗體組合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)和MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)與ElecsysNT-proBNP檢測試劑盒的相關(guān)性(參考圖2和3)在Elecsys2010(Roche診斷公司)上通過電化學(xué)發(fā)光免疫實驗來確定MAB/PAB組合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)和MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)與Elecsys檢測試劑盒(PAB(1-21)/PAB(30-50))的相關(guān)性。為了進行該實驗，將PAB(39-50)用作生物素化的捕獲劑，并且MABs的釕化F(ab’)2片段被用作檢測試劑。在每一實驗中將20μl的樣品或標(biāo)準(zhǔn)物與75μl的兩種抗體試劑在37℃下溫育9分鐘。隨后，加入35μl的覆蓋有鏈霉親和素的磁性聚苯乙烯顆粒，并在室溫下再溫育9分鐘。在Elecsys2010上常規(guī)檢測等量溫育溶液的電化學(xué)發(fā)光信號，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的方式將其轉(zhuǎn)化為濃度信號。
現(xiàn)在采用兩種MAB/PAB的改進測試方法和Elecsys試劑盒來檢測來源于患有心力衰竭的病人的臨床樣本。結(jié)果示于圖2和3中.兩種MAB/PAB的改進測試均獲得了與Elecsys試劑盒較好的相關(guān)性(r＝0.978和r＝0.957)。
3)采用兩種不同MAB/PAB組合的NT-proBNP測試條的函數(shù)曲線按照實施例1的方法制備NT-proBNP測試條。采用了如下用于試劑羊毛狀覆蓋物的浸漬制劑“生物素羊毛狀覆蓋物”100mM Hepes pH7.4，0.1％ Tween，20μg/ml生物素化的PAB(39-50)“金羊毛狀覆蓋物”100mM Hepes pH7.4，OD 4 MAB 18.4.34(27-31)或MAB 17.3.1(13-16)金絡(luò)合物向來源于健康捐贈者的肝素化的血液樣品中加入來源于患心力衰竭病人的含NT-proBNP的血清，并將其等分。取150μl的混合血樣加樣至測試條上，并利用CARDIAC Reader(Roche診斷公司)檢測。樣品檢測后的反應(yīng)時間為12分鐘。為了確定樣品的NT-proBNP濃度，從同一等分樣品離心獲得血漿并通過ElecsysNT-proBNP試劑盒(Roche診斷公司)進行檢測。通過這種方式獲得的兩種測試條改進系統(tǒng)MAB17.3.1(13-16)/PAB(39-50)和MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)的函數(shù)曲線示于圖4中。其中改進系統(tǒng)MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)具有相當(dāng)陡峭得多的標(biāo)準(zhǔn)曲線因此測試更靈敏。
4)采用AB組合Au-MAB18.4.34(27-31)/Bi-PAB(39-50)的NT-proBNP測試條與ElecsysNT-proBNP試劑盒的相關(guān)性將來源于患有心力衰竭的病人的含NT-proBNP的血清加入肝素化的來源于健康捐贈者的血液樣品中，并被等分。取150μl的這種混合血樣加樣至測試條上，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法利用CARDIAC Reader(Roche診斷公司)進行檢測。從相同樣品中離心獲得血漿，并采用ElecsysNT-proBNP試劑盒(Roche診斷公司)在Elecsys1010分析系統(tǒng)中進行檢測。采用這種方式制備了60份樣品并采用兩個系統(tǒng)檢測。圖5顯示了兩個系統(tǒng)的測量值。其相關(guān)性很好，r＝0.95.。
權(quán)利要求
1.用于測定NT-proBNP的免疫夾心測試，其特征在于采用至少兩種抗NT-proBNP的抗體，其中一種這類抗體為MAB，并且這些抗體中的一種至少靶向包括38至50位氨基酸的NT-proBNP的表位，并且這些抗體中的一種至少靶向包括1至37位或43至76位氨基酸的NT-proBNP表位的幾個部分，其中被抗體識別的表位可以稍微重疊。
2.如權(quán)利要求1所要求保護的免疫測試，其特征在于它采用如下抗體組合中的一種AB(39-50)與AB(1-21)或AB(13-16)或AB(22-38)或AB(27-31)或AB(51-76)或AB(64-67)；或AB(38-42)與AB(1-21)或AB(22-37)或AB(43-76)；或AB(44-50)與AB(1-21)或AB(22-43)或AB(51-76)。
3.如權(quán)利要求1或2所要求保護的免疫測試，其特征在于肽采用如下PAB/MAB組合中的一種PAB(39-50)與MAB(1-21)或MAB(13-16)或MAB(22-38)或MAB(27-31)或MAB(51-76)或MAB(64-67)；或PAB(38-42)與MAB(1-21)或MAB(22-37)或MAB(43-76)；或PAB(44-50)與MAB(1-21)或MAB(22-43)或MAB(51-76)。
4.如權(quán)利要求1所要求保護的免疫測試，其特征在于它優(yōu)選采用如下的抗體組合MAB 18.4.34(27-31)與PAB(39-50)或PAB(38-42)或PAB(44-50)或MAB 17.3.1(13-16)與PAB(39-50)或PAB(38-42)或PAB(44-50)。
5.如權(quán)利要求1所要求保護的免疫測試，其特征在于它優(yōu)選采用如下的抗體組合MAB 18.4.34(27-31)與MAB(38-42)；或MAB 18.9.8(27-31)與MAB(38-42)。
6.如權(quán)利要求5所要求保護的免疫測試，其特征在于MAB(38-42)為MAB 16.1.39(38-42)。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項所要求保護的免疫測試，其特征在于它是一種免疫快速檢測。
8.如權(quán)利要求7所要求保護的免疫快速檢測，其特征在于所述的抗體之一以抗體-金絡(luò)合物的形式存在。
9.如權(quán)利要求7所要求保護的免疫快速檢測，其特征在于所述的抗體之一以生物素化的抗體形式存在。
10.一種檢測NT-proBNP的方法，其特征在于應(yīng)用如權(quán)利要求1至9中任意一項所要求保護的免疫測試。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用特殊抗體組合的用于測定NT－proBNP的免疫快速測試。本發(fā)明中的快速測試可以有利地呈現(xiàn)為免疫層析測試條。
文檔編號G01N33/577GK1641352SQ200410095878
公開日2005年7月20日 申請日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者J·施平克, A·尼希特爾, V·克勒姆特, K·哈勒邁爾, M·格羅爾, A·博格亞, A·加魯塞爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司