專利名稱：焦磷酸檢測傳感器、核酸的檢測方法以及堿基種類的判斷方法
技術領域：
本發(fā)明涉及簡便而且高敏感度地檢測試樣中焦磷酸的傳感器，以及使用這種傳感器的核酸檢測方法以及堿基種類的判斷方法。
背景技術：
已知焦磷酸與細胞內的酶反應有著很深的關聯。比如在合成蛋白質的過程中，氨基酸經由氨?；佘账嵝纬砂滨RNA的反應中生成焦磷酸。而在比如植物等中觀察到的淀粉合成的過程中，葡萄糖-1-磷酸與ATP反應生成ADP-葡萄糖時，就生成焦磷酸。除此以外，在各種酶反應中涉及到焦磷酸也是已知的。因此，定量檢測焦磷酸的技術，在解析細胞狀態(tài)或者上述酶反應時是很重要的技術。
現有的焦磷酸的測量方法，已知有Grindley等的化學方法(參照G.B.Grindley和C.A.Nichel，Anal.Biochem.第33卷，p.114(1970))。但是，由于在此方法中要使用濃硫酸，非常危險。
在特開昭61-12300號公報中公開了不用濃硫酸等危險藥品，而利用酶測定焦磷酸的三種方法，下面說明這些方法。
第一種方法是在磷酸烯醇丙酮酸和腺苷一磷酸存在下，用丙酮酸正磷酸鹽二激酶作用于焦磷酸的方法。由于通過此反應生成丙酮酸，可通過測定丙酮酸的量算出焦磷酸的量。而測定丙酮酸的量，提出了兩種方法。其一是利用乳酸脫氫酶的催化作用，在用NADH還原丙酮酸時，比色定量NADH的減少的方法。另一個是用丙酮酸氧化酶作用于生成的丙酮酸，把生成的過氧化氫導入到色素進行比色定量的方法。
第二種方法是在胞苷二磷甘油存在下，讓甘油-3-磷酸酯胞苷轉移酶作用于焦磷酸的方法。通過此反應生成甘油三磷酸。從而，通過測定甘油三磷酸的生成量可算出焦磷酸的量。對于測定甘油三磷酸，提出了兩種方法。一種是利用甘油-3-磷酸脫氫酶的催化作用，用NAD(P)氧化甘油三磷酸時，對NAD(P)H的增加進行比色定量的方法。另一個是讓甘油-3-磷酸酯氧化酶作用于生成的甘油三磷酸，把生成的過氧化氫導入到色素，對此進行比色定量的方法。
第三種方法是在胞苷二磷酸核糖醇存在下，讓焦磷酸與核糖醇-5-磷酸酯胞苷轉移酶相作用的方法。由于通過此反應生成D-核糖醇-5-磷酸，測定其生成量就能夠測定焦磷酸的量。D-核糖醇-5-磷酸的測定方法，提出過在NAD(或NADP)存在下，與核糖醇-5-磷酸脫氫酶作用，對NADH(或NADPH)的增加進行比色定量的方法。
此外，在特開2002-369698號公報中公開了一種方法，在此方法中，通過焦磷酸酶使焦磷酸加水分解成磷酸，然后由嘌呤核苷酸磷酸化酶使肌苷或黃苷與磷酸反應，生成次黃嘌呤，再通過黃嘌呤氧化酶將其氧化為黃嘌呤，再氧化生成尿酸，將此通過黃嘌呤氧化酶進行的氧化過程中生成的過氧化氫，利用過氧化酶使發(fā)色劑發(fā)色。
另外，核酸的延伸反應也是涉及到焦磷酸的一種重要的生體反應。
近年來，涉及基因信息的技術得到廣泛的開發(fā)。在醫(yī)療領域中，通過對疾病相關基因的解析，使得能夠在分子水平上治療疾病。而通過基因診斷，使得能夠根據不同的患者個人進行特定的治療。在制藥領域中，使用基因信息使特定的抗體或激素等蛋白質分子作為藥品加以利用。在農業(yè)和食品等領域，也制造出了許多利用基因信息的制品。
在這些基因信息中，基因的多態(tài)性是特別重要的。正如我們每個人有各式各樣的面部和體型，各個人的基因信息有相當一部分是不同的。在這些不同遺傳信息中，堿基序列的變化以人口1％以上的頻率存在，這稱為基因的多態(tài)性。這樣的基因多態(tài)性不僅表現在各個人的臉面上，也成為各種基因疾病的原因，據說與體質、藥物的應答性、藥物的副作用等都有關，現在，研究者們正在快速研究基因的多態(tài)性和疾病等的關聯。
在此基因的多態(tài)性當中，近年來特別引人注目的是SNP(單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism))。SNP指的是在基因信息的堿基序列中只有一個堿基不同的基因多態(tài)性。據說人的染色體DNA內的SNP有2～3百萬之多，很容易利用基因的多態(tài)性作為標志，期望在臨床上得到應用。現在，作為SNP的相關技術，在研究染色體中SNP的確定位置以及SNP與疾病的關聯性等的同時，判別SNP部位的堿基的SNP分類定型技術也在進行開發(fā)當中。
SNP分類定型技術有利用雜交的技術、利用限制酶的技術、利用連接酶的技術等各種技術。在這些技術中，最簡便的技術是利用引物延伸(primer extension)反應的技術。在這種技術中，通過判斷是否發(fā)生引物延伸反應，來進行SNP的分類定型。
在利用引物延伸反應的SNP分類定型技術的檢測中，除了使用熒光色素檢測實際DNA擴增產物的方法，以及使用固定探針的方法以外，也想出了由DNA聚合酶檢測核酸合成副產物焦磷酸的方法。在此方法中，為了檢測延伸反應進行的差別，使用了將伴隨著引物延伸反應的進行生成的焦磷酸轉變?yōu)锳TP，之后利用熒光素酶反應測定焦磷酸的方法(參照J.Immunological Method，156，55～60，1992)。
但是，在通過上述方法測定焦磷酸的方法中，在引物延伸反應中使用dATP的情況下，dATP成為與ATP相同的熒光素酶反應基質。因此，不能正確地判別SNP部位的堿基種類。從而，就有了有必要用特殊的dATP類似物(作為DNA聚合酶的基質發(fā)生作用、而不作為熒光素酶反應基質)來代替dATP的課題。
另外，在其它的焦磷酸測定技術中，也存在需要多種酶和試劑等、增加成本、工序復雜等缺點。在這些方法中，由于上述的原因致使難以實現作為套件和小型傳感器的裝置，這也成為一個課題。
并且，由于這些方法幾乎都是光學檢測法，測定裝置龐大也成為問題。

發(fā)明內容
為了解決如上所述的課題，本發(fā)明的目的是提供一種能夠簡便而且高敏感度地檢測焦磷酸，并且結構簡單的焦磷酸檢測傳感器，以及使用此傳感器檢測核酸的方法和判別鹽基種類的方法。
為了實現此目的，本發(fā)明是一種用來檢測試樣液體中焦磷酸的焦磷酸檢測傳感器，該傳感器具備容納上述試樣液體的試樣液體容納部、含有H+-焦磷酸酶的H+難透過性膜、用來固定上述H+難透過性膜的固定層、測定伴隨著上述固定層中氫離子濃度變化發(fā)生的電化學變化的測定機構，上述H+-焦磷酸酶使上述液體試樣中的焦磷酸水解，伴隨著此反應引起固定層的氫離子濃度的變化。在這樣的結構中，由于通過H+-焦磷酸酶引起氫離子濃度變化的固定層還具有固定H+難透過性膜的功能，可使焦磷酸檢測傳感器的結構很簡單。
作為上述焦磷酸檢測傳感器的一個形態(tài)，其結構是上述固定層在其上面或內部固定H+難透過性膜。
作為上述焦磷酸檢測傳感器的一個形態(tài)，其結構是上述H+難透過性膜是一個膜小胞，上述固定層將上述H+難透過性膜固定在其內部。
作為上述焦磷酸檢測傳感器的一個形態(tài)，其結構是其上述測定機構具備與上述固定層相連接的氫離子敏感電極，和在容納上述液體試樣的狀態(tài)下與上述液體試樣接觸的參比電極。而上述測定機構的結構優(yōu)選為，能夠測定上述氫離子敏感電極與上述參比電極的電位差變化。
作為上述焦磷酸檢測傳感器的一個形態(tài)，上述固定層由高分子凝膠或自組織單分子膜(下面稱SAM膜)構成。高分子凝膠通過其持水力固定上述H+難透過性膜。
作為上述焦磷酸檢測傳感器的一個形態(tài)，其結構具備上述固定層含有根據氫離子濃度的變化能發(fā)生氧化還原反應的材料，上述測定機構具備與上述固定層接觸的可極化電極，和在容納上述液體試樣的狀態(tài)下與上述液體試樣接觸的參比電極。而上述測定機構的結構優(yōu)選為能夠測定上述可極化電極與上述參比電極之間的電流變化。
作為上述焦磷酸檢測傳感器的一個形態(tài)，其結構是，上述固定層由含有根據氫離子濃度的變化能發(fā)生氧化還原反應的介質的高分子凝膠或自組織單分子膜所構成，在其上面固定有上述H+難透過性膜。
作為上述焦磷酸檢測傳感器的一個形態(tài)，其結構是上述固定層由根據氫離子濃度的變化能發(fā)生氧化還原反應的電解聚合材料構成。
另外，本發(fā)明是使用上述焦磷酸檢測傳感器檢測具有特定堿基序列的核酸的方法，該方法包括(a)配制含有試樣、引物(具有堿基序列，該堿基序列含有與上述核酸互補結合的互補結合區(qū))和核苷酸的液體試樣的工序；(b)在上述液體試樣與上述引物發(fā)生延伸反應的條件下發(fā)生上述延伸反應時，生成焦磷酸的工序；(c)在上述焦磷酸檢測傳感器的上述液體試樣容納部，使上述液體試樣處于容納狀態(tài)的工序；(d)由上述焦磷酸檢測傳感器的上述測定機構，測定伴隨著上述固定層的氫離子濃度變化所發(fā)生的電化學變化的工序；(e)基于工序(d)的測定結果檢測上述延伸反應的工序；以及(f)基于工序(e)的檢測結果檢測上述核酸的工序。
另外，本發(fā)明是使用上述焦磷酸檢測傳感器判別核酸的堿基序列中堿基種類的方法，包括(a)配制含有核酸、引物(具有堿基序列，該堿基序列含有與上述核酸互補結合的互補結合區(qū))和核苷酸的液體試樣的工序；(b)在上述液體試樣與上述引物發(fā)生延伸反應的條件下發(fā)生上述延伸反應時，生成焦磷酸的工序；(c)在上述焦磷酸檢測傳感器的上述液體試樣容納部，使上述液體試樣處于容納狀態(tài)的工序；(d)由上述焦磷酸檢測傳感器的測定機構測定伴隨著上述固定層氫離子濃度變化發(fā)生的電化學變化的工序；(e)基于工序(d)的測定結果檢測上述延伸反應的工序；以及(f)基于工序(e)的檢測結果判別上述核酸的堿基序列中堿基種類的工序。
下面參照附圖詳細說明具體實施方式
，由此本發(fā)明的的上述目的、其它目的、特征以及優(yōu)點將更加明了。


圖1是表示處于植物液胞膜內部狀態(tài)的H+-焦磷酸酶的示意圖；圖2是示意性地表示第一個實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖；圖3是示意性地表示第二個實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖；圖4是示意性地表示第三個實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖；圖5是示意性地表示第四個實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖；圖6是示意性地表示第五個實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖；圖7是示意性地表示焦磷酸檢測傳感器結構1的斷面圖；圖8是示意性地表示焦磷酸檢測傳感器結構2的斷面圖；圖9是示意性地表示焦磷酸檢測傳感器結構3的斷面圖；
圖10是示意性地表示焦磷酸檢測傳感器結構4的斷面圖；圖11是表示以檢測為目的的DNA和DNA探針中SNP部位一致時反應體系的圖；圖12是表示以檢測為目的的DNA和DNA探針中SNP部位不一致時反應體系的圖；圖13A是表示與λDNA的特定堿基序列完全雜交得到的兩種引物C和引物D的圖；圖13B是表示PCR(聚合酶鏈式反應)反應液G和H組成表的圖；圖13C是表示進行PCR反應的反應溫度條件的流程圖；圖14A是表示野生型λDNA、變異型λDNA和分類定型引物的圖；圖14B是表示PCR反應液I和J組成表的圖；圖14C是表示進行PCR反應的反應溫度條件的流程圖。
具體實施例方式
下面參照

本發(fā)明的實施方式。
首先用圖1說明本發(fā)明的反應原理。在本發(fā)明中，為了定性或定量檢測焦磷酸，使用了H+-焦磷酸酶。圖1是表示處于植物液胞膜內部狀態(tài)的H+-焦磷酸酶的示意圖。如圖1所示，H+-焦磷酸酶11通常是植物等的液胞膜13內存在的膜蛋白質，具有伴隨著由一個分子焦磷酸10生成兩個分子磷酸12的水解反應，從不能或難以通過氫離子的液胞膜13的外側(表面13a一側)向液胞膜13的內側(里面13b一側)輸送氫離子的性能。因此，通過H+-焦磷酸酶的酶反應，使液胞膜13內部的氫離子濃度增大，液胞膜13外部的氫離子濃度減小。
各個實施方式中的焦磷酸檢測傳感器中，利用H+-焦磷酸酶的上述性能和作為膜蛋白質的形態(tài)來進行焦磷酸的檢測。即，在持有H+-焦磷酸酶的膜上分離一部分區(qū)域，通過測定至少是任何一邊的氫離子濃度的變化，可檢測H+-焦磷酸酶促進了水解的焦磷酸的量。如此，各個實施方式中的焦磷酸檢測傳感器中，通過檢測與H+-焦磷酸酶的作用直接相關的氫離子的濃度變化，進行焦磷酸的檢測，因此能夠進行簡便而且高敏感度的檢測。而為了進行上述檢測，將氫離子輸送源的區(qū)域和氫離子輸送目的地的區(qū)域進行分離就成為必要的條件，由于H+-焦磷酸酶是膜蛋白質，能夠將其形態(tài)利用于區(qū)域分離。這有助于簡化焦磷酸檢測傳感器的結構。
在使用各個實施方式的焦磷酸檢測傳感器的檢測工序中，使含有焦磷酸的液體試樣，與從植物細胞中離析的液胞膜13等的處于H+難透過性膜的內部狀態(tài)的H+-焦磷酸酶接觸。
之后，測定H+難透過性膜內側或H+難透過性膜外側的氫離子濃度的變化。由此測定液體試樣中有無焦磷酸或焦磷酸的量，進行焦磷酸的定性或定量檢測。
(實施方式1)本實施方式涉及焦磷酸檢測傳感器。圖2是示意性地表示本實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖。焦磷酸檢測傳感器31具備絕緣基板22、固定在絕緣基板22上的由持液部件25形成的持液部分32和測定機構。持液部分32由在基板22上形成的固定層51、固定在上述固定層51上面的H+難透過性膜21、和沒有構成這些區(qū)域的液體試樣容納部33所構成。測定機構具備配置在基板22的上面與固定層51接觸的氫離子敏感電極23，和配置成在試樣液體容納部33中充滿試樣液體26的狀態(tài)下與試樣液體26接觸的參比電極27。
H+難透過性膜21具有H+-焦磷酸酶11。H+難透過性膜21在H+-焦磷酸酶11以外的部分由難以透過氫離子的膜構成，比如可以利用天然的液胞膜或人工的脂質雙層膜等。在H+難透過性膜21中，使H+-焦磷酸酶11的焦磷酸水解的活性部位，在液體試樣容納部33一側露出。
固定層51由能夠充分透過氫離子并保持水分的材料所制造。而固定層51由在其上面能夠固定H+難透過性膜的材料所形成。固定層51可由利用其持水力能將H+難透過性膜21固定在其上面的凝膠，或由利用交聯反應將H+難透過性膜21固定在其上面的SAM膜所形成。作為這樣的材料，可以使用瓊脂糖凝膠等的高分子凝膠、含有球殼狀碳分子形狀化合物的材料等。
作為氫離子敏感電極23，只要具有通常的pH值傳感器功能即可，可以利用玻璃電極、ISFET電極(ion sensitive FET(離子敏感場效應晶體管)，在口部使用離子敏感膜的離子敏感FET)、LAPS(Light-Addressable Potentiometric Sensor光尋址電位傳感器)等。
參比電極27可以利用標準氫電極、銀/氯化銀電極和飽和甘汞電極等。
絕緣基板22和持液部件25，只要是由不影響焦磷酸水解反應的材料制造即可，能夠由玻璃、硅、塑料等制造。
下面說明使用焦磷酸檢測傳感器31檢測液體試樣26中含有的焦磷酸的方法及其原理。首先，在液體試樣容納部33中裝滿液體試樣26。液體試樣26中含有焦磷酸時，由于H+-焦磷酸酶11的活性，使焦磷酸水解為磷酸，伴隨著這個過程固定層51內的氫離子濃度上升。通過使用氫離子敏感電極23測定此氫離子濃度的升高，就能夠檢測測定液26中的焦磷酸濃度。具體來說，通過測定氫離子敏感電極23與參比電極27之間電位差的變化，測定出固定層51內氫離子濃度的變化，基于此測定的結果，檢測出測定液26中焦磷酸的濃度。
另外，H+難透過性膜21也可以包括，水解焦磷酸的活性部位向固定層51一側(內部)露出的H+-焦磷酸酶。但是，使用H+難透過性膜21(H+難透過性膜含有，水解焦磷酸的活性部位向內部露出的H+-焦磷酸酶)時，固定層51的焦磷酸濃度優(yōu)選低于液體試樣26的焦磷酸濃度，在固定層51中最優(yōu)選不含有焦磷酸。由此，減少或終止了從固定層51向液體試樣26輸送氫離子，使從液體試樣26向固定層51的氫離子輸送變成優(yōu)勢，固定層51的氫離子濃度的變化大體上就限定在由液體試樣26中所含焦磷酸造成的變化。從而，就能夠正確地估計出在液體試樣26中所含的焦磷酸的量。
由于焦磷酸檢測傳感器31的結構沒有用H+難透過性膜21覆蓋與固定層51的液體試樣容納部33的整個界面，在液體試樣26和固定層51之間的氫離子能夠從H+難透過性膜沒有覆蓋的界面部分移動，氫離子從應該保持平衡的這個部分進行擴散，但由于擴散造成的氫離子的移動比由于H+-焦磷酸酶11的活性造成的氫離子的移動要慢，由氫離子敏感電極23測定的氫離子濃度變化大致就是由H+-焦磷酸酶11的活性造成的氫離子濃度的變化。
(第二實施方式)本實施方式涉及焦磷酸檢測傳感器。圖3是示意性地表示本實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖。本實施方式的焦磷酸檢測傳感器34與第一實施方式的焦磷酸檢測傳感器31的不同之處只是在絕緣基板22上面的整個區(qū)域形成固定層51，在固定層51和液體試樣容納部33的整個區(qū)域都配置有H+難透過性膜21。其它結構與第一實施方式的焦磷酸檢測傳感器31相同，省略說明。
(第三實施方式)本實施方式涉及焦磷酸檢測傳感器。圖4是示意性地表示本實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖。與第一實施方式不同之處在于，由膜小胞71形成H+難透過性膜，以及作為H+難透過性膜的膜小胞71的固定位置。下面只說明與第一實施方式的不同之處。
膜小胞71具有H+-焦磷酸酶11，固定在固定層51內。固定層51由能夠通過，比如凝膠持水力，將膜小胞71固定在內部的材料構成。作為膜小胞71，可以使用從細胞中離析的液胞調制的材料。另外，作為膜小胞71，也可以使用在人工制造的脂質雙層膜或LB膜等不能通過氫離子或者難以通過氫離子的膜內，使內部存在離析或精制的H+-焦磷酸酶的重新構筑的結構。
膜小胞71的膜也可以含有H+-焦磷酸酶以外的蛋白質。但是，這些蛋白質優(yōu)選是不與焦磷酸反應，或者反應性很低的蛋白質。這是由于焦磷酸與膜小胞71中存在的H+-焦磷酸酶以外的蛋白質反應時，使與H+-焦磷酸酶反應的焦磷酸的量減少，與此同時，使氫離子的輸送量減少。另外，膜小胞71的膜中含有不與焦磷酸發(fā)生反應，而通過與焦磷酸以外的物質反應來輸送氫離子的蛋白質時，優(yōu)選在液體試樣26中要幾乎不含有與這種蛋白質發(fā)生反應的物質。具體說比如，膜小胞71的膜中含有幾乎不與焦磷酸發(fā)生反應，而通過與ATP的反應來輸送氫離子的蛋白質ATP酶時，液體試樣26中優(yōu)選幾乎不含有ATP。
下面說明使用焦磷酸檢測傳感器35檢測液體試樣26中所含焦磷酸的方法及其原理。首先液體試樣容納部33中裝滿液體試樣26。液體試樣26中含有焦磷酸時，焦磷酸向固定層51擴散。之后，擴散到固定層51中的焦磷酸，由于H+-焦磷酸酶11的活性水解為磷酸，與此同時，膜小胞71的內部液體24的氫離子濃度上升，H+-焦磷酸酶11的周邊的氫離子濃度降低。當在氫離子敏感電極23的很近處存在有H+-焦磷酸酶時，氫離子敏感電極23就測定出氫離子濃度的降低，就能夠測定出液體試樣26中的焦磷酸濃度。
(第四實施方式)本實施方式涉及焦磷酸檢測傳感器。圖5是示意性地表示本實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖。焦磷酸檢測傳感器36與第二實施方式的不同之處只是固定層的結構和測定電極的結構。下面說明這些不同點。
測定電極由絕緣基板22上形成的可極化電極81構成。可極化電極81可由金、鉑、碳等通常的可用于電化學測定的電極構成?？蓸O化電極81，可以利用結構非常簡單的電極。這有助于焦磷酸檢測傳感器整體結構的簡單化。并且，本實施方式中，作為參比電極27，除了標準氫電極、銀/氯化銀電極、飽和甘汞電極以外，也可以利用金、鉑、碳等電極，這樣有助于焦磷酸檢測傳感器整體結構的進一步簡單化。
可極化電極81的表面，形成含有介質82的固定層83。作為固定層83，可以利用比如一端具有硫醇基的直鏈碳的SAM膜(self-assembled monolayer，自組織單分子膜)。但是，作為形成固定層83的材料，只要能夠固定H+難透過性膜21就不限于此，也可以使用通過其持水力來固定H+難透過性膜21的凝膠。作為介質82，可以使用氫離子敏感性的氧化體。在如此形成的固定層83上固定含有H+-焦磷酸酶的H+難透過性膜21。利用上述SAM膜形成固定層83時，可通過硫醇基團的交聯反應將H+難透過性膜21固定在固定層83上。H+難透過性膜21是脂質膜時，固定層83與脂質膜的疏水部分相對著，由脂質膜的親水部分形成膜表面。H+-焦磷酸酶11被固定在由固定層83和脂質膜的疏水部分形成的膜的內部，而此時，H+-焦磷酸酶11的水解焦磷酸的活性部位就暴露在H+難透過性膜21的外部。
下面說明使用焦磷酸檢測傳感器36檢測液體試樣26中所含焦磷酸的方法及其原理。首先，液體試樣容納部33中裝滿液體試樣26。液體試樣26中含有焦磷酸時，由于H+-焦磷酸酶11的活性使焦磷酸水解為磷酸，伴隨著此過程，固定層83內的氫離子濃度上升。此時，在氫離子敏感性介質82的氧化體的存在下，通過氧化還原反應生成介質82的還原體。通過在可極化電極81上施加比介質82的氧化還原電位高得多的電位，可測定出與介質82的還原物質濃度相應的電流，由此就能夠檢測出液體試樣26中焦磷酸的濃度。
(第五實施方式)本實施方式涉及焦磷酸檢測傳感器。圖6是示意性地表示本實施方式的焦磷酸檢測傳感器結構的斷面圖。本實施方式的焦磷酸檢測傳感器37與第四實施方式的不同之處在于由膜小胞71形成H+難透過性膜、作為膜小胞71的H+難透過性膜的固定位置，固定層的結構。下面說明這些與第四實施方式的不同點。
膜小胞71含有H+-焦磷酸酶11，被固定在固定層91內。固定層91由電解聚合膜構成。由電解聚合膜固定膜小胞的方法是，例如，可以通過混合聚合前的單體和膜小胞，再施加預定的電壓來形成。作為制造電解聚合膜的電解聚合材料，可以選擇具有電化學活性的物質，比如可以使用聚苯胺、聚鄰苯二胺、聚N-甲基苯胺、聚吡咯、聚N-甲基吡咯、聚噻吩等。
下面說明使用焦磷酸檢測傳感器37檢測液體試樣26中所含焦磷酸的方法及其原理。首先，液體試樣容納部33中裝滿液體試樣26。液體試樣26中含有焦磷酸時，焦磷酸向固定層91擴散，由于H+-焦磷酸酶11的活性使焦磷酸水解為磷酸。伴隨著焦磷酸的水解，內部液體24的氫離子濃度上升，H+-焦磷酸酶11周邊的氫離子濃度減少。由于此氫離子濃度的變化，作為固定層91的電解聚合膜發(fā)生氧化還原反應，通過可極化電極81測定其電子移動，就能夠測定出液體試樣26中焦磷酸的濃度。
本發(fā)明涉及的焦磷酸檢測傳感器中，正如從使用圖1所說明的反應原理中所看到的，在含有H+-焦磷酸酶的H+難透過性膜與測定電極(氫離子敏感電極23、可極化電極81)之間，氫離子或氫離子敏感性介質的氧化體必須以離子狀態(tài)存在。作為這樣的情況，也可以使用自由水溶液(bulk aqueous solution)。但是，為了使H+難透過性膜與測定電極之間存在有自由的水溶液，如在特開平6-90736號公報中所顯示，必須經過非常復雜的工序來制造傳感器。特別是，在如此制造的傳感器中，一旦制造完畢，就只能保存在水溶液中，例如焦磷酸檢測傳感器作為DNA檢測傳感器使用時，其操作方法和保存方法都極為特殊，再考慮到制造方法的復雜性，其不適合例如在任意形式的臨床檢查等當中使用。另外，在第一～第五實施方式的焦磷酸檢測傳感器中，上述氫離子或氫離子敏感性介質的氧化體，在以離子狀態(tài)存在時，都由固定層構成。這樣的固定層可由比如SAM膜或電解聚合膜形成，能夠以比較簡單的方法制造傳感器。而在以高分子凝膠作為固定層的傳感器中，由于能夠在保持水分子的狀態(tài)下保存，操作和保存都極為方便。即使是用其它材料形成固定層的情況，與使用自由水溶液的上述情況相比較，操作和保存也都極為方便。從而，可構成適用于例如任意形式的臨床檢查等。特別是，通過盡可能地減少固定層的厚度，可提高氫離子濃度的變化率，提高敏感度。
下面表示使用H+-焦磷酸酶的焦磷酸檢測傳感器的另外結構的例子。
<焦磷酸檢測傳感器結構例1>
圖7是示意性地表示焦磷酸檢測傳感器的一個結構例的斷面圖。與第一實施方式的不同之處在于用內部液體24充滿氫離子敏感電極23的周圍這一點，和在絕緣基板22上固定H+難透過性膜21使之覆蓋住氫離子敏感電極23這一點。下面只說明與第一實施方式不同之處。
至于H+難透過性膜21的固定方法，只要H+難透過性膜21覆蓋整個氫離子敏感電極23的表面，任何方法都可以，例如可以使用利用脂質體轉錄在SAM膜上的方法以及LB法。在被H+難透過性膜21分離的溶液保持部分32內區(qū)域中包含了氫離子敏感電極23的區(qū)域內，充滿了內部液體24。
下面說明使用焦磷酸檢測傳感器38檢測液體試樣26中所含焦磷酸的方法及其原理。首先，液體試樣容納部33中裝滿液體試樣26。液體試樣26中含有焦磷酸時，由于H+-焦磷酸酶11的活性，使焦磷酸水解為磷酸，伴隨著此過程，內部液體24中的氫離子濃度上升。通過使用氫離子敏感電極23測定此上升的情況，就能夠檢測液體試樣26中焦磷酸的濃度。
對于內部液體24沒有特別的限制，但在H+難透過性膜21中，含有焦磷酸活性部位暴露到氫離子敏感電極23一側(內側)區(qū)域中的'-焦磷酸酶時，內部液體24的焦磷酸濃度優(yōu)選低于試樣液體26的焦磷酸濃度，最優(yōu)選內部液體24中不含焦磷酸。由此，就減少或終止了從內部液體24向試樣液體26的氫離子輸送，使從試樣液體26向內部液體24的氫離子輸送成為優(yōu)勢，使內部液體24的氫離子濃度的變化，大致被限定在由試樣液體26中所含的焦磷酸所造成的濃度變化。從而，就能夠正確地估計液體試樣26所含的焦磷酸的量。
<焦磷酸檢測傳感器結構例2>
圖8是示意性地表示焦磷酸檢測傳感器的一個結構例的斷面圖。只在H+難透過性膜21的固定方法上與上述結構例1不同。下面只說明與結構例1的不同之處。
本結構例的焦磷酸檢測傳感器39，其H+難透過性膜21通過鏈狀的碳化物31被固定在絕緣基板22上。
<焦磷酸檢測傳感器結構例3>
圖9是示意性地表示焦磷酸檢測傳感器的一個結構例的斷面圖。與上述結構例1的不同之處只是H+難透過性膜21的固定方法。下面只說明與結構例1的不同之處。
本結構例的焦磷酸檢測傳感器40，其H+難透過性膜21的兩端被固定在持液部件25上。
<焦磷酸檢測傳感器結構例4>
圖10是示意性地表示焦磷酸檢測傳感器一個結構例的斷面圖。本結構例的焦磷酸檢測傳感器41中，H+難透過性膜21被固定在絕緣基板22上形成的貫通孔上。H+難透過性膜21的內側具備氫離子敏感電極23，外側具備參比電極27。氫離子敏感電極23和參比電極27也可以在絕緣基板22上形成。內部液體24和液體試樣26能夠分別接觸氫離子敏感電極23和參比電極27，而且都與H+難透過性膜21接觸。H+-焦磷酸酶的方向性與第一實施方式相同。H+難透過性膜21固定在貫通孔上的方法，可以根據例如運用Langmuir-Blodgette法的公知方法進行(參照吉岡書店，岡田泰伸編《新パツチクランプ實驗技術法》，p.214)。而在絕緣基板22上形成貫通孔或穴，以及在絕緣基板22上形成電極的方法，可通過例如，在硅基板上進行刻蝕的方法進行(參照特開2004-12215號公報)。
試樣液體26中焦磷酸的檢測方法及其原理與結構例1相同，省略說明。
(第六實施方式)
第六實施方式是使用本發(fā)明涉及的焦磷酸檢測傳感器檢測具有特定序列的DNA的方法。
本實施方式中，首先，向含具有與目的DNA的序列互補序列的DNA探針、DNA聚合酶、脫氧核苷酸的反應體系中，供給試樣。在此，所謂“反應體系”指的是如下所說明的實施一系列核酸延伸反應和此類反應的場所。在“反應體系”中存在著實施一系列反應所必需的成分。“反應體系”通常能夠以在適當的溶劑(比如Tris-HCl緩沖液、通常在核酸延伸反應或核酸擴增反應中能夠使用的任一緩沖液(包括市售的配套的緩沖液))中溶解上述成分形成的溶液的形式提供。DNA聚合酶可以是市售的，或者是可由專業(yè)人員配制的任意DNA聚合酶。優(yōu)選使用Taq聚合酶，但并不限于此。脫氧核苷酸可以是各種脫氧核苷三磷酸(也稱dNTP包括脫氧胞嘧啶三磷酸、脫氧鳥嘌呤三磷酸、脫氧腺嘌呤三磷酸以及脫氧胸苷三磷酸)，通常是可作為DNA合成的直接初級粒子使用的物質。由此使DNA探針伸長，在此伴隨著DNA探針的延伸反應生成焦磷酸。使用化學反應式1來說明此反應。
當此DNA探針與目的DNA進行雜交時，由于在反應體系中存在的DNA聚合酶，從反應體系中取出一個脫氧核苷酸(化學反應式1中的dNTP)進行伸長，生成一個焦磷酸分子。
DNA(n)+dNTP<＝>DNA(n+1)+PPi化學反應式1中，注腳n+1表示n個堿基的DNA探針延長為n+1個堿基。使用如上所述各個實施方式中的焦磷酸檢測傳感器檢測如此生成的焦磷酸，就能夠檢測出液體試樣中的具有特定序列的DNA。
具體說來，經過如上所述的(c)在上述任一焦磷酸檢測傳感器的液體試樣容納部33，使液體試樣處于容納狀態(tài)的工序；(d)由焦磷酸檢測傳感器的測定機構對固定層的氫離子濃度變化進行電化學測定的工序；(e)基于工序(d)的測定結果檢測DNA延伸反應的工序；以及(f)基于工序(e)的檢測結果檢測上述DNA的工序等各個工序，就能夠檢測具有特定序列的DNA。
在本實施方式中使用的DNA探針，設計成具有檢測目的的DNA序列的互補序列。此DNA探針，當與作為檢測目的的DNA序列雜交時，作為該DNA探針延長時的引物起作用。從而，DNA探針的長度要足夠使其起著作為延伸反應的引物的作用。比如，可以是最少10個堿基，最少12個堿基，最少15個堿基，最少20個堿基和最少30個堿基的長度?？紤]到能夠充分進行雜交和引物延長，而且容易調制，優(yōu)選20～25個堿基的長度。本發(fā)明中使用的DNA探針，只要能夠與檢測目的的DNA進行特異性雜交，并且起著使該DNA探針延長的引物的作用，可以是任意長度。
由于DNA探針與液體試樣中的目的DNA進行特異性雜交，而且起著引物的作用，在已知被檢測序列時，可以設計與此序列完全互補的序列，即，具有與序列中的堿基正確對應的序列(A-T或C-G對)。液體試樣中不存在具有目的特定序列的DNA時，當然不會發(fā)生與DNA探針的雜交。因此，由于使用了本反應體系，無論要檢測的序列是已知還是未知，都能夠檢測與此DNA探針完全互補的序列的存在與否。
雜交和延伸反應，可在進行DNA的雜交、由DNA聚合酶作用通過引物和脫氧核苷酸的延伸反應的任意條件下實施。DNA探針與目的DNA的雜交，例如，可以根據Sambrook等人在(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，第1～3卷，Cold Spring HarborLaboratory等實驗說明書中所述的方法進行，本方法是本領域技術人員公知的。
反應體系中所含的DNA探針、聚合酶和脫氧核苷酸的量可以由專業(yè)人員適當地決定。
另外，如化學反應式1中所示，由于脫氧核苷酸一次延長就生成一個焦磷酸，如果具有目的特定序列的DNA和DNA探針兩者的長度(堿基)是已知的，就能夠定量地檢測出具有目的特定序列的DNA。
并且，通過將化學反應式1的反應置換為PCR等核酸擴增反應，能夠使試樣中具有目的特定序列的DNA的量迅速增加。PCR擴增的方法，在該領域中是眾所周知的(PCR TechnologyPrinciples andApplications for DNA Amplification，HA Erlich編，Freeman Press，NewYork，NY(1992)；PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Innis，Gelfland，Snisky和White編，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Mattila等(1991)Nucleic Asids Res.194967；Eckert，K.A.和Kunkel，T.A.(1991)PCR Methods and Applications 117；PCR，McPherson，Quirkes和Taylor，IRL Press，Oxford)。通過使用PCR等核酸擴增反應，就能夠檢測出極微量的DNA。
(第七實施方式)本發(fā)明的第七實施方式是使用本發(fā)明涉及的焦磷酸檢測傳感器判別測定體系的DNA堿基種類的方法，更具體說是對SNP進行高速分類定型的方法。
用圖11和圖12來說明第七實施方式。圖11表示，把檢測作為目的的DNA和DNA探針中SNP部位一致時的反應體系；圖12表示，把檢測作為目的的DNA和DNA探針中SNP部位不一致時的反應體系。圖11和圖12中，1表示DNA探針、2表示具有目的特定序列的DNA、3a表示一致的SNP部位、3b表示不一致的SNP部位、4表示DNA聚合酶、5表示dNTP。
本實施方式中，首先向含有具有與目的DNA的序列互補的序列，而且3’終端是SNP部位的DNA探針1、DNA聚合酶4和脫氧核苷酸5的反應體系中供給試樣。由此使DNA探針伸長，此時伴隨著此DNA探針1的延伸反應，在這里生成焦磷酸。
本實施方式中使用的DNA探針1，可以設計成與目的序列互補，而且3’終端是SNP部位。本實施方式中，DNA探針1除了3’終端是SNP部位以外，可以設計成與上述第六實施方式相同。本實施方式中使用的DNA聚合酶4和脫氧核苷酸5，都可以與上述第六實施方式相同。本實施方式中的雜交和延長條件，也可以與上述第六實施方式相同。而本實施方式中的DNA探針，只要是能夠對在SNP部位的堿基種類進行分類定型即可，并不限于如上所設計的探針。
液體試樣中的目的DNA2和DNA探針1的堿基序列，當包括SNP部位完全互補時，該DNA探針1與目的DNA2就會雜交，而且作為該探針1進行進一步延長的引物起作用。此時，如圖11中所示，由于反應體系中存在的DNA聚合酶，DNA探針上伸長1個脫氧核苷酸5，生成1個焦磷酸。另一方面，液體試樣中目的DNA2和DNA探針1的堿基序列，在SNP部位不互補時(即使比如在其它部位是互補的)，DNA探針1能夠與目的DNA進行雜交，但由于DNA探針1的3’終端不匹配，不能作為該探針1進行延長的引物起作用。此時，如圖12中所示，即使在反應體系中存在有DNA聚合酶4和必要的脫氧核苷酸5，也不能發(fā)生化學反應式1的反應，不能生成焦磷酸。
由此，通過使用上述各實施方式中的焦磷酸檢測傳感器，檢測液體試樣中DNA延伸反應以后的焦磷酸，就能夠對試樣中具有目的特定序列的DNA2和DNA探針1，作出包括SNP部位完全一致的判斷。如果在SNP部位使用最多4種探針1，就能夠對試樣中具有特定序列的DNA2的SNP，針對4種堿基進行分類定型。
不用說，已知SNP部位的堿基種類時，其分類定型就沒有必要用4種探針。
使用上述各實施方式的焦磷酸檢測傳感器，檢測DNA延伸反應以后液體試樣中的焦磷酸，從而給SNP進行分類定型的方法，更具體說，包括(c)在上述各種焦磷酸檢測傳感器的液體試樣容納部33裝滿含有焦磷酸的上述液體試樣的工序；(d)由焦磷酸檢測傳感器的測定機構對固定層的氫離子濃度變化進行電化學測量的工序；(e)基于工序(d)中的測定結果檢測出DNA的上述延伸反應的工序；以及(f)基于工序(e)中的檢測結果判別DNA堿基序列中的SNP部位的堿基種類。
本發(fā)明中使用的所謂“液體試樣”指的是可以含有焦磷酸的各種液體試樣。在第六和第七實施方式中，是可含有通過延伸反應可生成焦磷酸的DNA的液體試樣。特別是涉及DNA檢測的方法(第六或第七實施方式)中，“液體試樣”可以來自含有目的DNA的任意被分析物。目的DNA與疾病相關時，這樣的被分析物可以是罹患疾病的細胞、組織、器官或血液。當然，本發(fā)明的方法并不限定于臨床用途，在所有的領域中都能夠應用，因此，這樣的被分析物可以是發(fā)現或確認有目的DNA存在的細胞、組織、器官或血液。DNA可以使用苯酚萃取法以及乙醇沉淀法等常用的方法從這些被分析物中取得。DNA的純度對反應的效率會產生影響，DNA的精制程序也是本領域的技術人員公知的。
正如以上所說明的，按照本發(fā)明，提供了能夠以高的敏感度、高速、且定量地測定焦磷酸的焦磷酸檢測傳感器，以及使用這種傳感器的擴散檢測方法和堿基種類的判別方法。
另外，按照本發(fā)明，能夠通過測量伴隨著DNA延伸反應所生成的焦磷酸，即使沒有對試樣中的目的DNA進行標識，也能夠定量地測定有無目的核酸。特別是，能夠以高的敏感度而且高速地測定目的SNP的分類定型。
(實施例1)本實施例制造涉及第四實施方式的焦磷酸檢測傳感器。
首先，按照Shizuo Yoshida等的方法(Masayoshi Maeshima andShizuo Yoshida.(1989)，J.Biol.Chem.264(33)，20068～20073)，在由來自綠豆的液胞膜13構成的膜小胞溶解于Tris/Mes緩沖液(濃度5mM，pH值7.0)、山梨糖醇(濃度0.25M)、DTT(濃度2mM)組成的溶液中，作為由含有H+-焦磷酸酶的液胞膜13構成的膜小胞懸浮液。
另外，將金電極(可極化電極81)浸入1mM正辛硫醇/乙醇溶液中，在室溫下放置4h，在金電極表面上形成辛硫醇的SAM膜(固定層83)。然后，將辛硫醇修飾的電極浸入10mM的硫堇水溶液中，在室溫下靜置1h，將硫堇(介質82)固定在SAM膜之間。
在如此制造的硫堇/辛硫醇修飾電極上，通過滴下含有H+-焦磷酸酶的膜小胞懸浮液，在固定層83的表面固定H+-焦磷酸酶，構成H+-焦磷酸酶電極。為使各個焦磷酸鈉的最終濃度為20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，將焦磷酸鈉溶液與H+-焦磷酸酶接觸，開始了由H+-焦磷酸酶進行的焦磷酸的加水分解反應。
得到的結果是，試樣液體中焦磷酸鈉的濃度與，使用銀/氯化銀電極作為參比電極27，施加200mV電位時金電極指示的電流值，幾乎呈直線的關系。由此可知，按照本方法能夠測定焦磷酸的量。
(實施例2)本實施例制造涉及第一實施方式的焦磷酸檢測傳感器。
首先，按照Masasuke Yoshida等的方法(MasaH.Sato，MasahikoKasahara，Noriyuki Ishii，Haruo Homareda，Hideo Matsui and MassasukeYoshida.(1994)J.Biol.Chem.269(9)，6725～6728)，從南瓜籽進行液胞膜H+-焦磷酸酶的精制。
另一方面，將0.1g聚乙烯醇縮丁醛樹脂和1g己二胺溶解于二氯甲烷，在室溫下攪拌溶液30min，滴在ISFET的柵電極(氫離子敏感電極)上，然后浸入5％的戊二醛中，在室溫下放置24h。如此在ISFET電極上形成固定層51。然后，將形成了固定層51的ISFET電極(修飾ISFET電極)浸入5mg/mL的H+-焦磷酸酶溶液中，在4℃下靜置24h，將H+-焦磷酸酶固定在ISFET柵電極上。對于這些H+-焦磷酸酶固定ISFET電極，為使各個焦磷酸鈉最終濃度為20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，添加磷酸鈉溶液，開始了由H+-焦磷酸酶進行的焦磷酸的加水分解反應。
得到的結果是，試樣液體中焦磷酸鈉的濃度與，使用銀/氯化銀電極作為參比電極27、在固定了H+-焦磷酸酶的ISFET電極的源-漏間施加4.0V的電壓、保持源-漏間的電流為400μA時的柵電壓值，幾乎呈直線的關系。由此可知，按照本方法能夠測定焦磷酸的量。
(實施例3)本實施例制造第五實施方式的焦磷酸檢測傳感器。
首先，與上述實施例2一樣，精制來自南瓜籽的液胞膜H+-焦磷酸酶。
然后，將50mg/mL的上述液胞膜H+-焦磷酸酶、0.1M的吡咯、1M的氯化鉀混合，得到電解聚合用混合液。將作為可極化電極81的鉑電極和作為參比電極27的銀/氯化銀電極浸入此電解聚合用混合液中，在鉑電極上施加+1V的恒電壓6min，通過電解聚合得到H+-焦磷酸酶固定化聚吡咯膜修飾電極。對于如此得到的H+-焦磷酸酶固定化聚吡咯膜修飾電極，為使各個濃度為20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，添加焦磷酸鈉溶液，開始了由H+-焦磷酸酶進行的加水分解反應。
得到的結果是，焦磷酸鈉的濃度與，使用銀/氯化銀電極作為參比電極27、施加300mV電位時H+-焦磷酸酶固定化聚吡咯膜修飾電極顯示的電流，幾乎呈直線的關系。由此可知，按照本方法能夠測定焦磷酸的量。
(實施例4)在本實施例中，進行試樣中λDNA(λDNA的全堿基序列參照GenBan數據庫的Accession No.V00636、J02459、M17233、X00906)的檢測。
首先，準備以10ng/μL的濃度將λDNA(寶酒造(株)制造)溶解在蒸餾水中的液體試樣26A，以及只由蒸餾水組成的液體試樣26B。另外，再準備如圖13A中所示的，與λDNA的特定堿基序列完全雜交得到的兩種引物C(序列號1)和引物D(序列號2)分別溶解于蒸餾水得到的引物溶液E和F(各自都是20μM)。
在上述液體試樣26A和26B中分別添加TaKaRa La Taq(5U/μL，寶酒造(株)制造)、TaKaRa La Taq的專用緩沖液2×GC緩沖液I(寶酒造(株)制造)、dNTP混合物(各濃度2.5mM，寶酒造(株)制造)，同時添加引物溶液E和F，配制出組成如圖13B所示的PCR反應液G和H。
然后，分別對PCR反應液G和H，在圖13C所示的反應溫度條件下進行PCR反應。
PCR反應結束之后，用上述實施例1中所述的H+-焦磷酸酶電極，用與實施例1相同的銀/氯化銀電極作為參比電極，對PCR反應液G和H分別測定施加200mV電位時的電流，此時，PCR反應液G的電流值明顯地大于PCR反應液H的電流值。即，可知在PCR反應液G中進行了引物的延伸反應。從而可知，按照本方法能夠檢測目的核酸。
(實施例5)在本實施例中，討論將λDNA的堿基序列中的某個堿基人為地置換為其它的堿基制作成變異λDNA時，能不能判斷出通常的λDNA和變異的λDNA。
首先，用λDNA(寶酒造(株)制造)(序列號3)制造變異型λDNA(序列號4)。變異型λDNA是用本領域技術人員公知的方法將λDNA(下面將通常的λDNA記為野生型λDNA)的兩根λDNA序列中存在的GC堿基對(圖中的區(qū)域R1)人為地置換為AT堿基對(圖中的區(qū)域R2)。
然后，分別將野生型λDNA和變異型λDNA溶解于蒸餾水，使得最終濃度為10ng/μL，成為野生型λDNA液和變異型λDNA液。
然后，為了判斷上述堿基的不同，準備如圖14A所示的分類定型引物(序列號5)。接著，將分類定型引物溶解于蒸餾水使其最終濃度為20μM，調制出分類定型引物溶液。
在圖14A中所示的分類定型引物與野生型λDNA的下段中記述的單鏈λDNA完全雜交。但是，此分類定型引物，其終端3’的G與變異λDNA的下段中記述的單鏈λDNA不能雜交。因此，在使用這樣的分類定型引物進行引物的延伸反應時，在野生型λDNA的情況下能夠進行良好的反應，但在變異型λDNA的情況下就不怎么進行反應。
此外，再準備上述實施例4中使用的引物溶液F。
然后，對野生型λDNA液和變異型λDNA液，分別使用TaKaRaTaq(5U/μL，寶酒造(株)制造)、TaKaRa Taq專用的10×PCR緩沖液(寶酒造(株)制造)、dNTP混合物(各濃度2.5mM，寶酒造(株)制造)以及分類定型引物溶液和引物溶液F，調制出如圖14B中所示組成的PCR反應液I和J。
然后，在PCR反應液I和J中，分別在如圖14C中所示的反應溫度條件下進行PCR反應。
PCR反應結束后，將各PCR反應液導入固定H+-焦磷酸酶的修飾的ISFET電極中。修飾的ISFET電極與在上述實施例2中使用的是同樣的。
使用此修飾ISFET電極，與實施例2同樣用銀/氯化銀電極作為參比電極，在H+-焦磷酸酶固定的ISFET電極的源-漏之間施加4.0V的電壓，測定保持源-漏間電流值400μA時的柵電壓，其結果，PCR反應液I的電壓值明顯大于PCR反應液J的電壓值。即，可知在PCR反應液I中進行了引物延伸反應。這可以認為是在反應液J中沒有發(fā)生延伸反應，但在含有變異型λDNA的延伸反應液I中，由dATP引起了一個堿基的延伸反應，結果，生成的焦磷酸與修飾ISFET電極上的H+-焦磷酸酶反應，將氫離子輸送到修飾ISFET電極處。
由此可知按照本實施例能夠辨別出DNA特定堿基序列中一個堿基對的不同。這就是說，本實施例表明本發(fā)明的方法對于判斷SNP部位的堿基種類、由突變產生的一個堿基對的變異等、判別特定堿基序列都非常有效。
通過上面的說明，本領域的技術人員可以明了對本發(fā)明的許多改良或其它的實施方式。因此，上面的說明都只是作為例子進行的解釋，目的是向本領域技術人員顯示出本發(fā)明的具體實施方式
。只要不偏離本發(fā)明的精神，可對其結構和/或功能的細節(jié)進行實質性的變更。
產業(yè)上的可利用性本發(fā)明涉及的焦磷酸檢測傳感器，可用來判別比如SNP部位的堿基種類，因此可用于基于SNP分類定型進行給藥的特制醫(yī)療。而涉及本發(fā)明的焦磷酸檢測傳感器，可用于DNA堿基序列中突變的解析，能夠將相關解析的結果用于藥物研發(fā)和臨床。
特別是，本發(fā)明涉及的焦磷酸檢測傳感器可用于檢測具有特定堿基序列的核酸，而核酸的檢測，在遺傳病的診斷、檢查被細菌或病毒等污染的食品，以及檢查對人體的感染等方面都是有用的。
序列號1的<223>引物序列號2的<223>引物序列號3的<223>雙鏈DNA序列號4的<223>雙鏈DNA序列號5的<223>引物序列表<110>松下電器產業(yè)株式會社<120>焦磷酸檢測傳感器、核酸的檢測方法以及堿基種類的判斷方法<130>04P540WO<150>JP2003-190121<151>2003-07-02<160>5<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1gatgagttcg tgtccgtaca actgg 25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gaatcacggt atccggctgc gctga 25<210>3<211>24<212>DNA<213>λ噬菌體<220>
<223>雙鏈DNA<400>3
gatgagttcg tgtccgtaca actg24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221)突變<222>24<223>雙鏈DNA<400>4gatgagttcg tgtccgtaca acta24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gatgagttcg tgtccgtaca actg2權利要求
1.一種檢測試樣液體中的焦磷酸的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于，具備容納所述試樣液體的試樣液體容納部；具有H+-焦磷酸酶的H+難透過性膜；固定所述H+難透過性膜的固定層；測定伴隨著所述固定層中的氫離子濃度變化的電化學變化的測定機構，所述H+-焦磷酸酶被配置成使所述液體試樣中的焦磷酸水解，并伴隨著此反應引起固定層的氫離子濃度的變化。
2.如權利要求1所述的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于所述固定層將H+難透過性膜固定在其上面或內部。
3.如權利要求1所述的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于所述H+難透過性膜是一種膜小胞，所述固定層將所述H+難透過性膜固定在其內部。
4.如權利要求1所述的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于所述測定機構具有，與所述固定層接觸的氫離子敏感電極，和配置成在容納所述液體試樣的狀態(tài)下與所述液體試樣接觸的參比電極。
5.如權利要求4所述的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于所述測定機構測定所述氫離子敏感電極與所述參比電極之間的電位差的變化。
6.如權利要求4所述的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于所述固定層由高分子凝膠或自組織單分子膜構成。
7.如權利要求1所述的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于所述固定層含有因氫離子濃度的變化發(fā)生氧化還原反應的材料；所述測定機構具有，與所述固定層接觸的可極化電極，和配置成在容納所述液體試樣的狀態(tài)下與所述液體試樣接觸的參比電極。
8.如權利要求7所述的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于所述測定機構測定所述可極化電極與所述參比電極之間的電流的變化。
9.如權利要求7所述的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于所述固定層由含有因氫離子濃度的變化發(fā)生氧化還原反應的介質的高分子凝膠或自組織單分子膜構成，所述H+難透過性膜就固定在其上面。
10.如權利要求7所述的焦磷酸檢測傳感器，其特征在于所述固定層由因氫離子濃度的變化發(fā)生氧化還原反應的電解聚合材料構成。
11.使用如權利要求1所述的焦磷酸檢測傳感器檢測具有特定堿基序列的核酸的檢測方法，該方法包括如下工序(a)調制含有試樣、具有包括與所述核酸互補結合的互補結合區(qū)的堿基序列的引物、和核苷酸的液體試樣的工序；(b)把所述液體試樣置于發(fā)生所述引物的延伸反應的條件下，發(fā)生所述延伸反應時生成焦磷酸的工序；(c)在所述焦磷酸檢測傳感器的所述液體試樣容納部使所述液體試樣處于被容納狀態(tài)的工序；(d)由所述焦磷酸檢測傳感器的所述測定機構，測定伴隨著所述固定層的氫離子濃度變化所發(fā)生的電化學變化的工序；(e)基于工序(d)的測定結果檢測所述延伸反應的工序；以及(f)基于工序(e)的檢測結果檢測所述核酸的工序。
12.使用如權利要求1所述的焦磷酸檢測傳感器判別核酸的堿基序列中的堿基種類的方法，該方法包括如下工序(a)調制含有核酸、具有包括與所述核酸互補結合的互補結合區(qū)的堿基序列的引物和、核苷酸的液體試樣的工序；(b)把所述液體試樣置于發(fā)生所述引物的延伸反應的條件下，發(fā)生所述延伸反應時生成焦磷酸的工序；(c)在所述焦磷酸檢測傳感器的所述液體試樣容納部使所述液體試樣處于被容納狀態(tài)的工序；(d)由所述焦磷酸檢測傳感器的所述測定機構，測定伴隨著所述固定層的氫離子濃度變化所發(fā)生的電化學變化的工序；(e)基于工序(d)的測定結果檢測所述延伸反應的工序；以及(f)基于工序(e)的檢測結果判別所述核酸的堿基序列中的堿基種類的工序。
全文摘要
本發(fā)明是一種檢測液體試樣中焦磷酸的焦磷酸檢測傳感器，該傳感器的結構具備容納所述試樣液體的試樣液體容納部、具有H
文檔編號G01N27/403GK1705878SQ20048000134
公開日2005年12月7日 申請日期2004年7月2日 優(yōu)先權日2003年7月2日
發(fā)明者行政哲男, 夜久英信, 岡弘章, 池田信, 中南貴裕 申請人:松下電器產業(yè)株式會社