專利名稱：多基因轉(zhuǎn)錄活性測定系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用發(fā)射不同顏色光的熒光素酶而多重測定活細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄活性的基因構(gòu)建體、含有該構(gòu)建體的表達(dá)載體、含有該構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞、使用該哺乳動物細(xì)胞的藥物篩選方法和用于多重測定不同啟動子轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)。
本發(fā)明還涉及用于通過使用發(fā)射紅色、橙色或藍(lán)色光的熒光素酶測定活細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)的基因和多肽。
背景技術(shù)：
在生命科學(xué)領(lǐng)域，細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活性通常被測定并用于評估給予細(xì)胞的外來因素、分析細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或個體蛋白質(zhì)組的表達(dá)?；蜣D(zhuǎn)錄活性通過Western印跡法等直接測定，或用熒光素酶基因或發(fā)光酶基因作為報告基因間接測定。具體而言，常規(guī)使用螢火蟲發(fā)光酶基因基于發(fā)光強(qiáng)度對轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行定量。熒光蛋白幾乎在其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的同時不需要輔因子而表現(xiàn)出熒光活性。熒光蛋白已用作監(jiān)控蛋白，例如通過使用其細(xì)胞內(nèi)熒光活性作為指標(biāo)來定位蛋白質(zhì)。但其難以定量，不可用作基因表達(dá)的報告基因。
分析蛋白質(zhì)基因表達(dá)的量、時間動態(tài)變化很重要，但基因的轉(zhuǎn)錄活性主要在傳統(tǒng)報告基因技術(shù)中進(jìn)行分析。然而近來，已經(jīng)可以從市場上購得通過向細(xì)胞中導(dǎo)入兩個基因構(gòu)建體來測定兩種轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)(雙重分析系統(tǒng)，Promega)，即將轉(zhuǎn)錄活性區(qū)A插入螢火蟲發(fā)光酶基因，將轉(zhuǎn)錄活性區(qū)B插入海腎發(fā)光酶基因。然而該方法是通過分別加入不同的發(fā)光底物來測定轉(zhuǎn)錄活性的一種系統(tǒng)，兩種活性不能同時測定，并且只能測定兩種轉(zhuǎn)錄活性。此外，因為使用螢火蟲熒光素酶，其波長隨pH改變，所以難于精確測定。
細(xì)胞內(nèi)來回傳遞多種信號，有必要建立定量測定多種轉(zhuǎn)錄活性的技術(shù)。例如，在人生物鐘中，提供24小時節(jié)律的Per基因受Clock和BMAL基因產(chǎn)物的控制。因此要精確評價生物鐘，必須測定多種、至少3種轉(zhuǎn)錄活性。到目前為止，單個基因的轉(zhuǎn)錄活性已經(jīng)利用螢火蟲熒光素酶報告基因測定，但一次只能觀察一個基因轉(zhuǎn)錄的動態(tài)變化，生物鐘相關(guān)基因表達(dá)的相互作用還不清楚。
由于致癌基因活化引起的細(xì)胞異常生長或由于抑癌基因失活引起的控制消除而造成的細(xì)胞異常生長，發(fā)生癌變過程。因此，為評價癌變因素和癌變過程的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，需要測定致癌基因、抑癌基因和有絲分裂標(biāo)志基因的基因轉(zhuǎn)錄活性。然而，常規(guī)方法中，一次只能觀察一個基因轉(zhuǎn)錄的動態(tài)變化，一次不能評估蘭個基因的轉(zhuǎn)錄活性，因而參與癌變的三個基因的相互作用還沒有充分了解。
抑制或促進(jìn)基因表達(dá)的物質(zhì)與稱作基因產(chǎn)物上游啟動子區(qū)的基因序列上特定序列相結(jié)合引起基因轉(zhuǎn)錄。E盒和cAMP結(jié)合位點是這些序列的代表。通過將一定長度的啟動子區(qū)插入到報告基因上游可以測定基因轉(zhuǎn)錄活性。此外，隨后合成被認(rèn)為有效的特定序列，并插入報告基因上游，以檢測特定序列的作用。為檢測特定序列的轉(zhuǎn)錄控制作用，有必要同時評價原始啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性和可標(biāo)準(zhǔn)化組合作用的轉(zhuǎn)錄活性。然而常規(guī)方法中只能觀察一個基因的轉(zhuǎn)錄動態(tài)變化，無法充分評價控制轉(zhuǎn)錄活性的特定序列。
熒光素酶用作直接觀察細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄活性的工具，并已經(jīng)用作基因表達(dá)的檢測監(jiān)控蛋白。有很多種熒光素酶，但還沒有基于其多樣性測定轉(zhuǎn)錄活性的報告基因。如果使用發(fā)射不同顏色光的熒光素酶基因作為報告基因，并且將不同轉(zhuǎn)錄活性區(qū)插入哺乳動物細(xì)胞中，就可以測定多種轉(zhuǎn)錄活性。來自鐵路蠕蟲的發(fā)紅光的熒光素酶有最長的發(fā)光波長，與來自螢火蟲和叩頭蟲的熒光素酶相比容易鑒別，并由于發(fā)紅光而可以高度穿透細(xì)胞。然而，鐵路蠕蟲發(fā)紅和綠光的熒光素酶的表達(dá)只在大腸桿菌(Escherichia coli)中成功實現(xiàn)(US2002/0119542-A1)，還沒有作為哺乳動物細(xì)胞包括人類細(xì)胞中系統(tǒng)的成功實例。
也有實例通過修飾其基因結(jié)構(gòu)使得鐵路蠕蟲的熒光素酶基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)(WO 2003/016839)。
來自大場雌光螢(Rhagophthalmus ohba)的熒光素酶作為熒光素酶也是已知的。
只在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶表達(dá)(Ohmiya，YSumiya，M.Viviani，VR.And Ohba N.；Comparative aspects of a luciferase molecule fromthe Japanese luminous beetle Rhagophthalmus ohba.Sci.Rept.Yokosuka City Mus..47，31-38，2000)。基于這個序列，構(gòu)建了來自大場雌光螢的發(fā)橙光的熒光素酶并已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達(dá)(Viviani，VR.，Uchida，A.，Suenaga，N.，Ryufuku M.and Ohmiya Y.Thr-226 is a key-residue for bioluminescence spectra determination in beetle luciferases.Biochem.Biophys.Res.Commun.，280，1286-1291，2001)。另外，來自腰鞭毛蟲和海腎的發(fā)藍(lán)光的熒光素酶作為熒光素酶也是已知的。
本發(fā)明的目的是構(gòu)建和優(yōu)化可同時或在同一階段測定或定量細(xì)胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄活性的報告基因，并利用該報告基因組進(jìn)一步開發(fā)多種基因轉(zhuǎn)錄活性測定系統(tǒng)，以及利用它們進(jìn)行生命科學(xué)中的細(xì)胞功能分析、疾病治療/檢查以及新藥開發(fā)。
本發(fā)明的另一個目的是構(gòu)建一種基因構(gòu)建體，從而使鐵路蠕蟲的發(fā)紅或綠光的熒光素酶在哺乳動物細(xì)胞或動物中穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄并穩(wěn)定翻譯。
本發(fā)明的另一個目的是構(gòu)建一種基因構(gòu)建體，從而使大場雌光螢的發(fā)橙或綠光的熒光素酶在哺乳動物細(xì)胞或動物中穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄并穩(wěn)定翻譯。
這樣可以穩(wěn)定測定和顯示哺乳動物細(xì)胞或動物中基因轉(zhuǎn)錄活性的變化。


圖1表示測定多種基因轉(zhuǎn)錄活性的略圖以及與常規(guī)方法的區(qū)別。
圖2表示一種哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)和Hela細(xì)胞中的發(fā)光活性。
圖3表示培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光譜。
圖4表示培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的細(xì)胞內(nèi)壽命。
圖5表示培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的同步發(fā)光譜和用于顏色識別(color identification)的濾光片特性(透光率)。
圖6表示發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)曲線和發(fā)光活性測定時間。
圖7表示發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的豐度比和發(fā)光活性(使用圖5中的濾光片)。
圖8表示實際多種轉(zhuǎn)錄活性測定的結(jié)果，即通過來自發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的光同時測定兩種轉(zhuǎn)錄活性，通過來自發(fā)藍(lán)光的熒光素酶的光測定標(biāo)準(zhǔn)基因的轉(zhuǎn)錄活性，并標(biāo)準(zhǔn)化兩種轉(zhuǎn)錄活性。
圖9表示培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的發(fā)紅光的熒光素酶、發(fā)綠光的熒光素酶和發(fā)藍(lán)光的熒光素酶的同步發(fā)光譜，以及用于顏色識別的濾光片特性(透光率)。
圖10所示結(jié)果表明由發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶表示的轉(zhuǎn)錄活性由連續(xù)監(jiān)測兩種轉(zhuǎn)錄活性而獲得。
圖11表示通過初步篩選對很多樣品全部進(jìn)行分析的實例。
圖12表示通過二次篩選評價單個事件的實例。
圖13示出本發(fā)明中鐵路蠕蟲的發(fā)紅光熒光素酶基因突變體的DNA序列(SEQ IDNO7)與鐵路蠕蟲的野生型發(fā)紅光熒光素酶基因的DNA序列(SEQ ID NO3)的同源性。
圖14示出最大發(fā)光波長為630nm的鐵路蠕蟲的發(fā)紅光熒光素酶基因突變體的DNA序列(SEQ ID NO7)與最大發(fā)光波長為622nm的WO 2003/016839的鐵路蠕蟲的發(fā)紅光熒光素酶基因突變體的DNA序列(SEQ ID NO6)的同源性。
圖15示出野生型鐵路蠕蟲的發(fā)紅光熒光素酶與突變型鐵路蠕蟲的發(fā)紅光熒光素酶的發(fā)光活性的區(qū)別。
圖16示出導(dǎo)入并在哺乳動物細(xì)胞(小鼠NIH3T3細(xì)胞，粗線)中產(chǎn)生的突變體(SEQ ID NO7)和昆蟲家蠶細(xì)胞(細(xì)線)中產(chǎn)生的鐵路蠕蟲野生型(SEQ ID NO3)的發(fā)光譜。
圖17示出大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶突變體的DNA序列(SEQ ID NO10)與其野生型序列(SEQ ID NO8)的同源性。
圖18示出大場雌光螢的發(fā)綠光熒光素酶的野生型與突變型和大場雌光螢的發(fā)橙光熒光素酶的野生型與突變型的發(fā)光活性的區(qū)別。
圖19示出用一種底物螢火蟲熒光素檢測三種基因表達(dá)的方法。在本具體實施方式
的方法中，通過用紅、橙和綠色光而傳達(dá)三種轉(zhuǎn)錄活性并識別對應(yīng)顏色來進(jìn)行測定。
圖20示出大場雌光螢發(fā)綠光和橙光、鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶的混合物的發(fā)光譜和一組分光濾光片(split filter)的透射曲線。
圖21示出兩種顏色熒光素酶((A)發(fā)綠-紅光、(B)發(fā)綠-橙光和(C)發(fā)橙-紅光的熒光素酶的組合)的豐度比和發(fā)光活性(使用圖22所示的濾光片時)。
圖22示出三種顏色熒光素酶((A)當(dāng)發(fā)紅光的熒光素酶是1時發(fā)綠-橙光的熒光素酶；(B)當(dāng)發(fā)橙光的熒光素酶是1時發(fā)綠-紅光的熒光素酶；和(C)當(dāng)發(fā)綠光的熒光素酶是1時發(fā)橙-紅光的熒光素酶)的豐度比和發(fā)光活性(使用圖20所示的濾光片時)。

發(fā)明內(nèi)容
作為解決上述主題的深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人構(gòu)建了一種報告基因構(gòu)建體，它可以基于發(fā)射不同顏色光(包括紅、橙、綠和藍(lán))的熒光素酶或多種發(fā)光底物，分別對來自2種或更多種、優(yōu)選3種或更多種、更優(yōu)選4種或更多種熒光素酶(發(fā)紅、橙、綠和藍(lán)光)的光進(jìn)行定量。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選同時或在同一階段可以測定2種或更多種、優(yōu)選3種或更多種、更優(yōu)選4種或更多種基因活性，因為來自每種熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度對應(yīng)每個啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，即每個啟動子原始連接的基因的活性。因為發(fā)光波長不會由于測定條件(pH等)而變化，所以也可以進(jìn)行精確測定。例如在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過構(gòu)建鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶和大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶和發(fā)橙光的熒光素酶的報告基因構(gòu)建體，并同時使用海腎、海洋介形類甲殼動物、發(fā)光腰鞭毛蟲、叩頭蟲、水母發(fā)光蛋白等的熒光素酶報告基因，從而構(gòu)建一種簡單并高度定量測定多種基因轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)。
此外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(1)改變cDNA序列使其他轉(zhuǎn)錄因子無法結(jié)合和(2)將cDNA序列中昆蟲的密碼子偏向性(密碼子使用頻率偏向性)轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯游锏拿艽a子偏向性并因為很多限制酶位點限制cDNA的應(yīng)用而進(jìn)一步減少cDNA序列中的限制酶位點，從而使在哺乳動物細(xì)胞中很少表達(dá)或根本不表達(dá)的熒光素酶易于在哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明提供以下多肽、基因、基因構(gòu)建體、哺乳動物細(xì)胞、藥物篩選方法和使用哺乳動物細(xì)胞測定多種啟動子轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)。
1.在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的、編碼選自鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶與大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶和發(fā)橙光的熒光素酶的至少一種熒光素酶的DNA，其特征在于(1)該DNA沒有哺乳動物細(xì)胞中其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列并具有哺乳動物的密碼子偏向性。
2.根據(jù)上述1的DNA，其特征在于哺乳動物是人類，DNA具有選自SEQ IDNOs7、10、11和16的至少一種核苷酸序列。
3.使編碼鐵路蠕蟲或大場雌光螢熒光素酶的DNA在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的方法，其特征在于具有1)改變cDNA序列使其他轉(zhuǎn)錄因子不結(jié)合的步驟；2)將cDNA序列中昆蟲的密碼子偏向性改成哺乳動物的密碼子偏向性的步驟；和任選地3)由于使用時應(yīng)用受限而改變具有很多限制酶位點的cDNA序列的步驟。
4.根據(jù)上述3的方法，其特征在于不改變熒光素酶的氨基酸序列。
5.多肽，其是最大發(fā)光波長為630nm的熒光素酶，由以下任意一個表示(1)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的多肽；和(2)具有SEQ ID NO4序列中一個或多個氨基酸替換、增加或缺失的多肽。
6.根據(jù)上述5的多肽，表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中。
7.基因構(gòu)建體，引入要在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的一個或兩個或更多個熒光素酶基因，所述熒光素酶發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件且最大發(fā)光波長為535-635nm。
8.根據(jù)上述7的基因構(gòu)建體，通過將最大發(fā)光波長為460-520nm的一個或兩個或更多個熒光素酶基因和發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件且最大發(fā)光波長為535-635nm的一個或兩個或更多個熒光素酶基因一起引入，從而引入可穩(wěn)定表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中的3個或更多個熒光素酶基因。
9.根據(jù)上述7的基因構(gòu)建體，其中上述熒光素酶基因是編碼選自鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶與大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶和發(fā)橙光的熒光素酶的至少一種熒光素酶的基因。
10.根據(jù)上述7的基因構(gòu)建體，含有促進(jìn)翻譯效率的元件和/或穩(wěn)定mRNA的元件。
11.基因構(gòu)建體，能夠通過引入發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件的一個或兩個或更多個熒光素酶基因和根據(jù)需要的受不同啟動子控制的發(fā)光波長不同且基本上不依賴于測定條件的熒光素酶基因，分別測定從兩種或更多種熒光素酶發(fā)射的每種光。
12.表達(dá)載體，包含根據(jù)上述7-11中任意一項的基因構(gòu)建體。
13.哺乳動物細(xì)胞，轉(zhuǎn)化有根據(jù)上述7-11中任意一項的基因構(gòu)建體或者根據(jù)上述12的表達(dá)載體。
14.哺乳動物細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)地整合可在哺乳動物細(xì)胞中受不同啟動子控制的、發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件的兩種或更多種熒光素酶的基因。
15.根據(jù)上述13或14的哺乳動物細(xì)胞，其中兩種或更多種上述熒光素酶的最大發(fā)光波長為535-635nm且可用一種底物發(fā)光。
16.根據(jù)上述15的哺乳動物細(xì)胞，含有鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶基因，還含有受不同啟動子控制且選自鐵路蠕蟲發(fā)綠光的熒光素酶基因、大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶基因、大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶基因、以及發(fā)藍(lán)光的熒光素酶基因的至少兩種或更多種。
17.根據(jù)上述14的哺乳動物細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)地整合可在哺乳動物細(xì)胞中受不同啟動子控制的、發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件的三種或更多種熒光素酶的基因。
18.根據(jù)上述14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的三個或更多個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受毒性評價啟動子控制，剩余的一個或多個熒光素酶基因受待評價啟動子控制。
19.根據(jù)上述14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的三個或更多個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受假啟動子控制，剩余的一個或多個熒光素酶基因受待評價啟動子控制。
20.根據(jù)上述14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的四個或更多個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受毒性評價啟動子控制，第三個熒光素酶基因受外來因素感受蛋白的啟動子控制，剩余的一個或多個熒光素酶基因受待評價啟動子控制。
21.根據(jù)上述14的哺乳動物細(xì)胞，其中具有受不同啟動子控制的四個或更多個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受假啟動子控制，第三個熒光素酶基因受外來因素感受蛋白的啟動子控制，剩余的一個或多個熒光素酶基因受待評價啟動子控制。
22.根據(jù)上述14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的兩個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受毒性評價啟動子控制。
23.根據(jù)上述14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的兩個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受假啟動子控制。
24.一種藥物篩選方法，包括在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中、在藥物候選化合物的存在下培養(yǎng)根據(jù)上述18-21中任意一項的哺乳動物細(xì)胞的步驟，存在或缺少候選化合物的條件下對上述熒光素酶進(jìn)行定量的步驟，和評價候選化合物對與至少一種熒光素酶相連的待評價啟動子的作用的步驟。
25.一種系統(tǒng)，通過改變根據(jù)上述13-23中任意一項的哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境而多重測定改變培養(yǎng)環(huán)境前后與每個熒光素酶連接的各啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，并評價兩種或多種熒光素酶的表達(dá)量，所述兩種或多種熒光素酶發(fā)射發(fā)光波長不依賴于測定條件的不同光。
26.根據(jù)上述23的系統(tǒng)，用于同時測定兩種或多種熒光素酶的表達(dá)量。
27.根據(jù)上述23的系統(tǒng)，能測定三種或多種熒光素酶的表達(dá)量。
下面將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
本發(fā)明的兩種或更多種熒光素酶需要發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件(例如pH)，因為重要的是測定兩種或更多種熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度并計算其相對比值。
本文所用的“發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件”表示即使pH、溫度、濃度或其他條件改變，最大發(fā)光波長的變化為3nm或更小，優(yōu)選為2nm或更小，更優(yōu)選為1nm或更小，特別優(yōu)選為0.5nm或更小。當(dāng)用濾光片分光來測定多種熒光素酶的表達(dá)量時，如果最大發(fā)光波長的變化量在此范圍內(nèi)，這是優(yōu)選的，因為熒光素酶的相對比值幾乎不變。
本文所用的“發(fā)射不同光的兩種或更多熒光素酶”表示可以用濾光片(濾色片、帶通濾光片等)測定各種光的發(fā)光強(qiáng)度比值。例如，對于鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶、發(fā)綠光的熒光素酶和大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶、發(fā)綠光的熒光素酶，可以通過用濾光片濾除綠光來測定各種光的發(fā)光強(qiáng)度比值。為了能測定各種光的發(fā)光強(qiáng)度比值，優(yōu)選最大發(fā)光波長相互分開通常20nm或更多，優(yōu)選30nm或更多，更優(yōu)選40nm或更多，特別優(yōu)選50nm或更多。
用于本發(fā)明的優(yōu)選熒光素酶包括鐵路蠕蟲的發(fā)綠到紅光(包括其突變體，最大發(fā)光波長535-635nm，例如540-630nm)的熒光素酶、叩頭蟲的發(fā)橙到綠光(包括其突變體，最大發(fā)光波長530-600nm)的熒光素酶和大場雌光螢的發(fā)橙到綠光(包括其突變體，最大發(fā)光波長550-590nm)的熒光素酶等等。例如，對于鐵路蠕蟲的熒光素酶，已知最大發(fā)光波長為622nm的發(fā)紅光的熒光素酶和最大發(fā)光波長為545nm的發(fā)綠光的熒光素酶(US 2002/0119542)，但本發(fā)明人已經(jīng)鑒定，除了這兩種以外，還存在很多發(fā)光在540-635nm的熒光素酶。這些熒光素酶都可以使用。例如，本發(fā)明人已經(jīng)證實鐵路蠕蟲的最大發(fā)光波長為622nm(表達(dá)于昆蟲或大腸桿菌中)的發(fā)紅光的熒光素酶表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中時，最大發(fā)光波長遷移到630nm。鐵路蠕蟲的最大發(fā)光波長為630nm的發(fā)紅光的這種熒光素酶由本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)。
當(dāng)使用多種熒光素酶利用濾光片分別測定每種發(fā)射光時，需要最大發(fā)光波長相互分開20nm或更多，優(yōu)選30nm或更多，更優(yōu)選40nm或更多，特別優(yōu)選50nm。通過使最大發(fā)光波長分開到這種程度，可以通過使用位于最大發(fā)光波長之間的濾光片、測量濾光片前后每種光的透光率并轉(zhuǎn)換而同時對各種光的發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行定量。
例如，圖20中熒光素酶的最大發(fā)光波長是發(fā)紅光(630nm)、橙光(580nm)、和綠光(550nm)，它們可以充分分開。
具體而言，當(dāng)使用來自具有最大發(fā)光波長分開一定程度的多種熒光素酶的鐵路蠕蟲和大場雌光螢的熒光素酶時，可以使用一種發(fā)光底物(例如螢火蟲熒光素可用于鐵路蠕蟲、大場雌光螢和叩頭蟲的熒光素酶)同時對共表達(dá)的多種熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行定量，并精確測定啟動子的表達(dá)量比值。因為這些熒光素酶發(fā)光波長不依賴于測定條件(例如pH)，還可以進(jìn)一步組合使用海腎熒光素酶、腰鞭毛蟲的多種熒光素酶(包括全序列或發(fā)光結(jié)構(gòu)域如結(jié)構(gòu)域1、2和3；JP-2002-335961；Li L.，Hong R.，Hasting JW.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94，8954)和海洋介形類甲殼動物熒光素酶。當(dāng)使用來自鐵路蠕蟲、大場雌光螢和叩頭蟲的熒光素酶時，可以使用螢火蟲熒光素，因此可以減少背景。優(yōu)選腰鞭毛蟲熒光素酶與熒光素的組合，因為其背景低。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過使用鐵路蠕蟲、大場雌光螢的熒光素酶(例如鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶、大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶)，可以用一種熒光素對至少3個啟動子的表達(dá)量進(jìn)行定量(VR.Viviani，A.Uchida，N.Suenaga.M.Ryufuku & Y. OhmiyaThr-226 is a key-residue for bioluminescencespectra determination in beetle luciferases(2001)Biochem.Biophys.Res.Communi.280，1286-1291)。也可以通過組合發(fā)藍(lán)光的熒光素酶(海腎、腰鞭毛蟲或海洋介形類甲殼動物的每種熒光素酶)對四種或更多種進(jìn)行定量。通過成功設(shè)置濾光片，可以分析540-635nm(發(fā)綠到紅光)、優(yōu)選540-630nm的多種表達(dá)。此外，可以再加一種底物不同的發(fā)藍(lán)光的熒光素酶。因此，至于熒光素酶的同時測定，當(dāng)使用相同熒光素時可以同時對三種或更多種進(jìn)行定量，當(dāng)使用不同熒光素時可以同時對四種或更多種進(jìn)行定量。
常規(guī)上，已知海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶是可在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的熒光素酶。然而，螢火蟲熒光素酶所發(fā)出的光的顏色隨細(xì)胞裂解液的pH不同從綠光變成黃光。因此比較兩種或更多種熒光素酶的表達(dá)量時，具有缺乏準(zhǔn)確度的缺陷。需要自海腎熒光素酶發(fā)出的藍(lán)光，是因為其發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件，但在與螢火蟲熒光素酶組合的測定系統(tǒng)中，必須分開進(jìn)行使用螢火蟲熒光素的和使用海腎熒光素的兩種定量。因此其缺陷是缺乏簡單性和準(zhǔn)確性。
與海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶相比，本發(fā)明人更關(guān)注來自鐵路蠕蟲的熒光素酶，并試圖在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)這種蛋白，但使用常用表達(dá)系統(tǒng)無法在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)鐵路蠕蟲的熒光素酶。這被認(rèn)為是除了海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶外為何沒有其他熒光素酶在哺乳動物細(xì)胞中、特別是在人類細(xì)胞中表達(dá)的原因。
根據(jù)本發(fā)明人迄今為止的發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，影響鐵路蠕蟲熒光素酶、大場雌光螢熒光素酶和海洋介形類甲殼動物熒光素酶的實際應(yīng)用的是鐵路蠕蟲熒光素酶基因、大場雌光螢熒光素酶基因和海洋介形類甲殼動物熒光素酶基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定翻譯。在用于本發(fā)明實施例的技術(shù)中，已經(jīng)證明通過使轉(zhuǎn)錄的mRNA穩(wěn)定和增加一定量的翻譯頻率，實際應(yīng)用成為可能。也就是說，在這種情況下，通過插入球蛋白內(nèi)含子以延長mRNA壽命并插入Kozak序列以增加翻譯頻率，從而首次使來自鐵路蠕蟲的熒光素酶基因可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。
在本發(fā)明優(yōu)選的其他實施方案中的其他技術(shù)包括，例如，將cDNA序列從昆蟲的密碼子偏向性(密碼子使用頻率偏向性)轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯游锏拿艽a子偏向性以增加mRNA拷貝數(shù)，改變cDNA序列使其他轉(zhuǎn)錄因子無法結(jié)合，改變具有很多限制酶位點的cDNA序列，因為這種序列的應(yīng)用受到限制。這些技術(shù)用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)鐵路蠕蟲熒光素酶和大場雌光螢熒光素酶。具體而言，轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯游锏拿艽a子偏向性(密碼子使用頻率偏向性)和改變cDNA序列使其他轉(zhuǎn)錄因子無法結(jié)合更有用。
通過依次考慮以下1)到4)的步驟，可對cDNA序列進(jìn)行改變1)盡可能不改變熒光素酶的氨基酸序列(優(yōu)選完全不改變)；2)隨后，改變cDNA序列使其他轉(zhuǎn)錄因子無法結(jié)合；3)此外，將cDNA序列中昆蟲的密碼子偏向性轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯游锏拿艽a子偏向性；和4)根據(jù)需要，改變cDNA序列以減少限制酶位點。
以上描述了鐵路蠕蟲熒光素酶和大場雌光螢熒光素酶的表達(dá)，但來自其他生物如叩頭蟲的熒光素酶被認(rèn)為可用相似的方法表達(dá)。
本文所用的“熒光素酶”包括一組發(fā)光酶，如催化熒光素光化學(xué)反應(yīng)的熒光素酶，也包括諸如水母發(fā)光蛋白的那些。通過改變催化作用(氧化熒光素以轉(zhuǎn)化發(fā)光物質(zhì)的作用)較弱的熒光素酶結(jié)構(gòu)而獲得的具有發(fā)光作用的蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明的熒光素酶范圍內(nèi)，前提是其發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件(例如pH)。
至于熒光素酶，需要組合使用相同發(fā)光底物發(fā)射光的兩個或更多種熒光素酶。對于發(fā)光波長基本上不隨測定條件改變且使用相同底物發(fā)光的優(yōu)選熒光素酶，優(yōu)選列舉鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和鐵路蠕蟲發(fā)綠光的熒光素酶或鐵路蠕蟲的發(fā)光波長為約540-635nm、優(yōu)選約540-630nm的其他熒光素酶，還有大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶和大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶。除此之外，來自叩頭蟲的熒光素酶(約530-600nm)也是具體實例。具體而言，鐵路蠕蟲發(fā)紅/綠光的熒光素酶和大場雌光螢發(fā)橙/綠光的熒光素酶可方便地用于多重定量啟動子轉(zhuǎn)錄活性，因為當(dāng)熒光素酶的量相同時發(fā)光強(qiáng)度也幾乎相同。
本發(fā)明中，哺乳動物包括人、牛、馬、綿羊、猴、豬、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔和狗，優(yōu)選的是人。
優(yōu)選的是，至少兩種熒光素酶基因用相同底物發(fā)射不同顏色的光并且其細(xì)胞內(nèi)壽命相似。從這一角度說，優(yōu)選鐵路蠕蟲的發(fā)紅/綠光的熒光素酶和大場雌光螢的發(fā)橙/綠光的熒光素酶。具體而言，優(yōu)選鐵路蠕蟲的發(fā)紅光的熒光素酶和大場雌光螢的發(fā)橙/綠光的熒光素酶。
此外，為了用簡單裝置量化每種發(fā)光顏色，優(yōu)選能用濾光片分離至少一種、優(yōu)選至少兩種用于本發(fā)明的發(fā)光波長不隨測定條件(例如pH)變化的熒光素酶和用于標(biāo)準(zhǔn)化上述熒光素酶的其他熒光素酶所發(fā)出光的不同顏色。例如，如圖5所示，優(yōu)選來自鐵路蠕蟲的發(fā)紅/綠光的熒光素酶，因為它們可以容易地用濾光片分開。此外，特別優(yōu)選鐵路蠕蟲發(fā)紅/綠光的熒光素酶與海腎或腰鞭毛蟲熒光素酶(最大發(fā)光波長474-480nm)的組合，因為發(fā)射光可以容易地用圖10所示的兩個濾光片分開。鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和大場雌光螢發(fā)橙/綠光的熒光素酶發(fā)出的光可用兩個濾光片相互分開(圖19)。
上文已經(jīng)了解到鐵路蠕蟲熒光素酶在大腸桿菌中表達(dá)，還了解到尚未在哺乳動物細(xì)胞中、尤其是人類細(xì)胞中表達(dá)。事實上，即使試圖在人類細(xì)胞中表達(dá)熒光素酶(發(fā)紅光、發(fā)綠光)時，如圖2和實施例1所示，單獨使用作為代表性的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)啟動子的SV40或CMV啟動子也不能誘導(dǎo)其表達(dá)。就大場雌光螢的熒光素酶而言，公知序列表達(dá)水平太低而不具有實用性，但與野生型熒光素酶相比，本發(fā)明的突變體表達(dá)水平是其44倍(綠光)和57倍(橙光)，具有顯著的實用性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，野生型的表達(dá)量不足，因為特定顏色的熒光素酶的表達(dá)量利用濾光片在發(fā)光譜方面進(jìn)行評價。
鐵路蠕蟲熒光素酶(發(fā)紅光、發(fā)綠光)的基因序列公開于US 2002/0119542-A1中。US 2002/0119542-A1中發(fā)紅光的熒光素酶基因(有錯誤)示于SEQ ID NO5中。鐵路蠕蟲熒光素酶的正確的核苷酸序列示于SEQ ID NO1(發(fā)綠光的熒光素酶基因)和SEQ ID NO3(發(fā)紅光的熒光素酶基因)中，正確的氨基酸序列示于SEQ ID NO2(發(fā)綠光的熒光素酶基因)和SEQ ID NO4(發(fā)紅光的熒光素酶基因)中。
可以使用完整的野生型或突變型熒光素酶基因作為本發(fā)明的熒光素酶基因，也可以使用能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與熒光素酶基因雜交的DNA和編碼在熒光素酶中替換、添加、缺失或插入一個或更多個氨基酸并具有熒光素酶活性之多肽的DNA作為熒光素酶基因。
在一個優(yōu)選實施方案中，通過驗證多種表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對于在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶重要的是向基因構(gòu)建體中引入促進(jìn)翻譯效率的元件和/或穩(wěn)定mRNA的元件。至于促進(jìn)翻譯效率的元件，Kozak序列(Ko)等是具體實例。至于穩(wěn)定mRNA的元件，β-珠蛋白內(nèi)含子II等是具體實例。為了在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶，具體而言，優(yōu)選(珠蛋白內(nèi)含子II)一(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)的部分結(jié)構(gòu)。還已經(jīng)證實對于在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶，優(yōu)選將cDNA序列中昆蟲的密碼子偏向性(密碼子使用頻率偏向性)轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯游锏拿艽a子偏向性并改變cDNA序列使其他轉(zhuǎn)錄因子無法結(jié)合。
在一個優(yōu)選實施方案中本發(fā)明的基因構(gòu)建體可包含熒光素酶基因、啟動子、基因上游促進(jìn)翻譯效率的元件和/或穩(wěn)定mRNA的元件，還可包含增強(qiáng)子、IRES、SV40pA、藥物抗性基因(Neor等)等。
本發(fā)明的優(yōu)選基因構(gòu)建體的實例如下所示。
(1)(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(SV40 poly A序列)
(2)(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)本發(fā)明的基因構(gòu)建體可直接導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，但優(yōu)選整合到載體(例如包括質(zhì)粒和病毒載體)上導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞。當(dāng)在基因構(gòu)建體中可表達(dá)地整合多個熒光素酶時，可將一個基因構(gòu)建體或表達(dá)載體導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞中，而當(dāng)一個基因構(gòu)建體中整合一個熒光素酶時，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，可將多個基因構(gòu)建體或表達(dá)載體同時或依次導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中。
作為需要通過本發(fā)明的系統(tǒng)同時測定的基因組合，-時鐘基因(Per基因、Clock基因、BMAL基因等)-癌基因(致癌基因、抑癌基因、有絲分裂標(biāo)志基因等)-疾病相關(guān)基因(病理相關(guān)基因、生死敏感的細(xì)胞凋亡基因、激素基因等)-恒定表達(dá)基因(肌動蛋白基因、GAPDH(磷酸甘油醛脫氫酶)基因、猴源SV40病毒基因等)等基因是具體實例。
本發(fā)明中可以進(jìn)行以下應(yīng)用。
(1)初步篩選假定大規(guī)模分析很多樣品的條件下，同時獲得3種或更多信息很重要。很明顯可以想到多種組合?？紤]到藥物發(fā)現(xiàn)，需要評價藥物作用的陽性點和陰性毒性點。此外，兩個轉(zhuǎn)錄水平基因的變化反映細(xì)胞本身的狀態(tài)，因而優(yōu)選使用指示細(xì)胞狀態(tài)的恒定表達(dá)啟動子作為對照。因此，在藥物發(fā)現(xiàn)篩選中，以下組合是具體實例。
在表1和2中，僅舉例說明發(fā)紅/藍(lán)/綠光的熒光素酶。無需多言，也可以使用其他熒光素酶包括發(fā)橙光的熒光素酶或其組合。具體而言，特別優(yōu)選鐵路蠕蟲和大場雌光螢的發(fā)紅/橙/綠光的熒光素酶，因為它們可用螢火蟲熒光素同時測定。
可以任意選擇多種顏色的熒光素酶。
表1藥物發(fā)現(xiàn)篩選

在這種情況下，毒性評價和恒定表達(dá)啟動子是經(jīng)受藥物評價的啟動子的對照，因此也可用于構(gòu)建在一個載體中。已經(jīng)導(dǎo)入了這種載體的細(xì)胞自身是用于篩選的基礎(chǔ)細(xì)胞。
表2尋找目標(biāo)啟動子序列

在這種情況下，假啟動子和恒定表達(dá)啟動子是經(jīng)受篩選的啟動子的對照，因此也可用于(非必需的)構(gòu)建在一個載體中。已經(jīng)導(dǎo)入了這種載體的細(xì)胞自身是用于篩選的基礎(chǔ)細(xì)胞。
用一種底物，發(fā)紅/橙/綠光的組合可完成表1和2中所示的篩選。也就是說，發(fā)藍(lán)光的熒光素酶可用發(fā)橙光的熒光素酶代替。在此情況下，可用一種底物進(jìn)行測定，且測定方法更簡單。為測定發(fā)藍(lán)光的熒光素酶，需要裂解細(xì)胞，但螢火蟲熒光素可以濃度梯度滲透到活細(xì)胞中并發(fā)光，因而可以在活細(xì)胞中測定三種發(fā)射光。因此該方法的特征在于無需裂解細(xì)胞即可進(jìn)行篩選。
與此同時，發(fā)紅/橙/綠/藍(lán)光的組合具有優(yōu)勢，可以同時評價外來因素如環(huán)境破壞因素，并可以在受外來因素影響的細(xì)胞中測定多種基因轉(zhuǎn)錄活性的變化。例如，包括監(jiān)測直接感受外來因素的受體的表達(dá)。
表3

在這種情況下，可以評價感受外來因素的蛋白質(zhì)、因此而受影響的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞自身的安全性，同時通過用恒定表達(dá)啟動子的蛋白對照使它們標(biāo)準(zhǔn)化，還可以準(zhǔn)確評價外來因素給予細(xì)胞的信息。因而，也可用于(非必需的)構(gòu)建在一個載體中。已經(jīng)導(dǎo)入了這種載體的細(xì)胞自身是用于篩選的基礎(chǔ)細(xì)胞。
初步篩選的實施例示于圖11。
(2)二次篩選假定評價所關(guān)注藥物作用和啟動子信號的條件下，同時獲得3種或更多信息很重要。在藥物發(fā)現(xiàn)中，經(jīng)常假設(shè)藥物的多種作用。了解指示細(xì)胞狀態(tài)改變的基因、藥物的一過性作用(例如毒性、沖擊應(yīng)答(shock response)等)和實際作用也很重要。例如，如表3和4所示，可以舉例說明時鐘相關(guān)的藥物作用評價系統(tǒng)。
表3時鐘相關(guān)的藥物作用評價系統(tǒng)

表4時鐘相關(guān)的藥物作用評價系統(tǒng)

具體而言，如上所述，可以用一種底物測定活細(xì)胞中的三種發(fā)射光。因此，該方法特征在于可在不裂解細(xì)胞的情況下根據(jù)時間軸評價藥物作用。
對相同細(xì)胞進(jìn)行一系列操作，因而可以評價藥物對多種操作的組合(歷史)的作用。
二次篩選的實施例示于圖12。
如上所述，通過優(yōu)選地同時評價2個或更多個、特別是3個或更多個或者4個或更多個啟動子的表達(dá)量，當(dāng)評價了一個啟動子的作用時，可以標(biāo)準(zhǔn)化活性、毒性等或者標(biāo)準(zhǔn)化假信息。
此外，當(dāng)要闡明哺乳動物中多種基因表達(dá)復(fù)雜相關(guān)的現(xiàn)象時，本發(fā)明的系統(tǒng)極其有用。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，提供了使用鐵路蠕蟲的發(fā)紅光的熒光素酶基因、發(fā)綠光的熒光素酶基因、大場雌光螢的發(fā)綠光的熒光素酶基因、發(fā)橙光的熒光素酶基因、和發(fā)藍(lán)光的熒光素酶基因同時對三種或四種基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行定量的方法/系統(tǒng)。通過使用這種系統(tǒng)，可以同時測定細(xì)胞中的多種轉(zhuǎn)錄活性。可以將它們用于病理學(xué)治療/檢查和新藥開發(fā)。
此時，進(jìn)行顏色識別，通過使用專用于發(fā)紅、綠、橙和藍(lán)光的濾光片測定發(fā)光活性，可同時測定細(xì)胞中的多種轉(zhuǎn)錄活性?？梢酝瑫r得到細(xì)胞變化的大量信息，這些信息常規(guī)上難以從一種轉(zhuǎn)錄活性的變化信息中獲得，并可用于治療多種疾病和新藥開發(fā)。
本發(fā)明中，根據(jù)權(quán)利要求14的具有位于不同啟動子(1)或(2)控制下的兩個熒光素酶基因的哺乳動物細(xì)胞可以用作中間細(xì)胞，通過進(jìn)一步將一個或多個熒光素酶基因位于待分析啟動子控制下的基因構(gòu)建體導(dǎo)入這些哺乳動物細(xì)胞來產(chǎn)生用于藥物篩選的哺乳動物細(xì)胞，所述的(1)中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制而第二個熒光素酶基因受毒性評價啟動子控制，所述的(2)中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制而第二個熒光素酶基因受假啟動子控制。
具體實施例方式
下面將參照以下實施例，對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但無需多言，本發(fā)明不限于這些實施例。
實施例1鐵路蠕蟲發(fā)綠光的熒光素酶基因和發(fā)紅光的熒光素酶基因(SEQ ID NO1、3)在大腸桿菌中得到了表達(dá)，但單獨使用代表性的哺乳動物表達(dá)啟動子SV40或CMV啟動子不能在哺乳動物細(xì)胞中誘導(dǎo)它們的表達(dá)。因而，將其中插入穩(wěn)定基因表達(dá)的Kozak序列和β-珠蛋白內(nèi)含子II、并進(jìn)一步選擇雞β-肌動蛋白啟動子和CMV增強(qiáng)子的構(gòu)建體連接到發(fā)紅或綠光的熒光素酶基因上以構(gòu)建一種基因構(gòu)建體，并測定酶活性(圖2)。將這種基因構(gòu)建體與熒光素酶基因插入到SV40啟動子、CMV啟動子或CAG啟動子下游的基因構(gòu)建體進(jìn)行比較。用Lipofectamine使培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞NIH3T3轉(zhuǎn)染各基因，24小時后測定細(xì)胞中的發(fā)光活性(圖2)。為了測定發(fā)光活性，分別用發(fā)光底物混合溶液(由Toyo B-Net Co.，Ltd提供)和AB-2000(由ATTO Corporation提供)作為底物和發(fā)光測定裝置。向50μL細(xì)胞提取液中加入50μL PicaGene。結(jié)果，在導(dǎo)入(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(SV40 poly A序列)基因的細(xì)胞中獲得最高活性。在導(dǎo)入(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)取代(SV40 poly A序列)而插入的構(gòu)建體的細(xì)胞中獲得次最高活性。然而，只有SV40啟動子或CMV啟動子幾乎得不到活性。但是基于由(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)基因得到的活性，由(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)基因得到的活性約為500/1，而由(CMV啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(SV40 poly A序列)基因得到的活性約為10/1。因此，證實了為穩(wěn)定表達(dá)鐵路蠕蟲發(fā)綠光的熒光素酶基因并測定基因的轉(zhuǎn)錄活性，優(yōu)選在不直接影響轉(zhuǎn)錄活性的酶基因上游區(qū)域插入(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)。這被認(rèn)為歸因于Kozak序列促進(jìn)翻譯效率，而β-珠蛋白內(nèi)含子II穩(wěn)定mRNA。已經(jīng)證明，包括熒光素酶基因的效率促進(jìn)和轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定是實際應(yīng)用的關(guān)鍵。
實施例2對表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中的鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶基因和發(fā)綠光的熒光素酶基因的發(fā)光譜進(jìn)行分析。向15μL細(xì)胞提取液中加入15μL PicaGene，其中細(xì)胞中已經(jīng)導(dǎo)入表現(xiàn)出最高活性的(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(SV40 poly A序列)基因，并用由ATTO Corporation提供的弱發(fā)光譜測量裝置測定發(fā)光譜。圖3示出單獨表達(dá)光譜時的發(fā)光譜，在發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶中觀察到最大發(fā)光波長分別是630和550nm。這些光譜不受pH和溶液環(huán)境的影響，并完全不改變。
實施例3對表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中的鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶基因和發(fā)綠光的熒光素酶基因的細(xì)胞壽命進(jìn)行評價。使用導(dǎo)入了(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅光、發(fā)綠光的熒光素酶)-(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)基因的細(xì)胞。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法用要在細(xì)胞中表達(dá)的上述熒光素酶基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時將培養(yǎng)基更換為含100μM蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺的培養(yǎng)基，并培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘。隨后用與實施例1中相同的方法隨時間測定發(fā)光活性。結(jié)果，對于發(fā)紅和綠光的熒光素酶，其活性都以相似的時程降低，且每種酶在細(xì)胞中的半衰期都是約3.5小時(圖4)。
實施例4鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶基因和發(fā)綠光的熒光素酶基因、(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(SV40 poly A序列)基因共表達(dá)于培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞NIH3T3中。用與實施例2中相同的方法，測定通過裂解共表達(dá)細(xì)胞而獲得的細(xì)胞提取液中鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶基因和發(fā)綠光的熒光素酶基因的發(fā)光譜。圖5示出共表達(dá)細(xì)胞的發(fā)光譜。由于發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光而觀察到兩個峰。這是同時測定兩個基因轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)果。當(dāng)通過利用光電倍增管的發(fā)光測定儀測定這些發(fā)光活性時，觀察到鐵路蠕蟲的發(fā)紅光和發(fā)綠光的兩種熒光素酶基因發(fā)光活性的總和。因而，為了僅測定發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光活性，屏蔽發(fā)紅光的熒光素酶的發(fā)光。從發(fā)光譜評價，選擇使用圖5中用點線表示的光波長的屏蔽濾光片。通過使用這種濾光片，可以檢測到8％發(fā)綠光的熒光素酶活性和76％發(fā)紅光的熒光素酶活性，通過轉(zhuǎn)換可以評價發(fā)紅和綠光的熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度及其豐度。
實施例5向50μL含發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的細(xì)胞提取液中加入50μLPicaGene，使用ATTO Corporation提供的皿型發(fā)光測定儀AB2500以一分鐘間隔測定發(fā)光活性，得到如圖6所示的發(fā)光反應(yīng)曲線。反應(yīng)開始后5分鐘內(nèi)活性不穩(wěn)定，但6分鐘以后活性都穩(wěn)定。因而，當(dāng)測量已經(jīng)共表達(dá)了發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的細(xì)胞中的發(fā)光活性時，在發(fā)光反應(yīng)穩(wěn)定的時間區(qū)間上測量活性。測量方法如下1)不用濾光片(Hoya Corporation提供的R54型濾色片)而測量發(fā)光強(qiáng)度(發(fā)紅光和發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光活性)；2)將實施例4中測定的濾光片(Hoya Corporation提供的R54型濾色片)插入發(fā)光測定儀，測量發(fā)光強(qiáng)度而得到發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光活性；和3)通過轉(zhuǎn)換濾光片(Hoya Corporation提供的R54型濾色片)的透光率計算發(fā)紅光的熒光素酶的發(fā)光活性。
實施例6在模式實驗中驗證不同豐度比的發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶是否可以用實施例5中的方法來進(jìn)行定量。圖7中，對于發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的豐度比已經(jīng)改變的樣品，1)測量總發(fā)光強(qiáng)度；2)只測量發(fā)綠光的熒光素酶，和3)確定發(fā)紅光和發(fā)綠光的熒光素酶的量。結(jié)果表明，發(fā)光活性隨豐度比成線性關(guān)系變化。這表示借助插入濾色片(Hoya Corporation提供的R54型濾色片)的發(fā)光測定儀，可以確定細(xì)胞中表達(dá)量不同的發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶的量。
實施例7為驗證本系統(tǒng)的可用性，測量兩個時鐘基因的基因轉(zhuǎn)錄活性，并同時用表現(xiàn)恒定基因轉(zhuǎn)錄活性的啟動子作為第三個基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。具體地，用(E54)、小鼠Per啟動子中連接E盒3、4、5的元件-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅光的熒光素酶)-(SV40 poly A序列)基因和小鼠BMAL1啟動子中的REV-ERV/ROR元件1、2(RORE)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)綠光的熒光素酶)-(SV40poly A序列)基因、和用于標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)藍(lán)光的熒光素酶載體(phRL-TK，Promega)，與人BMAL1、人CLOCK和小鼠ROR-4表達(dá)載體一起共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。24小時后裂解細(xì)胞并用光度計分析細(xì)胞中熒光素酶的發(fā)光波長。作為結(jié)果，檢測這兩種熒光素酶的發(fā)光波長，表現(xiàn)出與單獨表達(dá)每個熒光素酶時相同的發(fā)光譜。因而，測量發(fā)紅光和發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光活性。通過用發(fā)藍(lán)光的熒光素酶的活性值進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化這些活性值而得到的轉(zhuǎn)錄活性表示于圖8。在獨立實驗中，已經(jīng)知道，當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)BMAL1和CLOCK蛋白時，連接E盒3、4、5的元件(E54)啟動子被激活而(RORα)啟動子失活，然而當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)小鼠ROR-4時，(RORα)啟動子被高度激活。本實驗中同時定量測量的發(fā)紅光和發(fā)綠光的熒光素酶的活性表現(xiàn)出(E54)啟動子和(RORα)啟動子的轉(zhuǎn)錄活性差異。
實施例8鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶基因和發(fā)綠光的熒光素酶基因、(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(SV40 poly A序列)基因和發(fā)藍(lán)光的熒光素酶載體(phRL-TK，Promega)共表達(dá)于培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞NIH3T3中。裂解共表達(dá)細(xì)胞，用與實施例2中相同的方法測量細(xì)胞提取液中鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶和海腎發(fā)藍(lán)光的熒光素酶的發(fā)光譜。圖9示出共表達(dá)細(xì)胞的發(fā)光譜。觀察到發(fā)紅光、發(fā)綠光和發(fā)藍(lán)光的熒光素酶發(fā)出的三個峰，峰高度反映相應(yīng)啟動子活性的強(qiáng)度。通過使用具有可識別發(fā)光顏色的濾光片的發(fā)光強(qiáng)度測定裝置轉(zhuǎn)換成紅、綠或藍(lán)光的發(fā)光強(qiáng)度，可以評價三個基因的轉(zhuǎn)錄活性。
實施例9通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法用鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶基因和發(fā)綠光的熒光素酶基因、(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)-(發(fā)紅/綠光的熒光素酶)-(SV40 poly A序列)基因共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。培養(yǎng)16小時后，將培養(yǎng)基換成含100nM地塞米松的培養(yǎng)基，并培養(yǎng)細(xì)胞2小時。隨后，將培養(yǎng)基換成含100μM螢火蟲熒光素的培養(yǎng)基，使用ATTO Corporation提供的皿型發(fā)光測定儀AB2500連續(xù)測量發(fā)紅光和發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光活性。圖10表示連續(xù)測量轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)果。如果使用可識別發(fā)光顏色的連續(xù)發(fā)光強(qiáng)度測定裝置，可以連續(xù)測量兩種轉(zhuǎn)錄活性。
實施例10為了在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，設(shè)計發(fā)紅光的熒光素酶基因序列時謹(jǐn)記以下內(nèi)容。通過(1)改變34個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(48個DNA序列)(表4)；(2)改變279個DNA序列使密碼子使用頻率接近哺乳動物的使用頻率(表5)；和(3)改變15個常見的限制酶位點(45個DNA序列中有4個與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點中的那些相同)(表6)，設(shè)計SEQ ID NO7的序列并人工構(gòu)建一種構(gòu)建體(SEQ ID NO7)。該序列與鐵路蠕蟲野生型發(fā)紅光的熒光素酶基因(SEQ ID NO3)有77.5％的同源性，與WO 2003/016839中描述的發(fā)紅光的熒光素酶突變體有82.8％的同源性(圖13和14)。
表4

表5

表6

實施例11制備野生型或突變型熒光素酶基因插入到三種啟動子(CMV、SV40或CAG{CAG(CMV增強(qiáng)子)-(雞β-肌動蛋白啟動子)-(β-珠蛋白內(nèi)含子II)-(Kozak序列)})下游的載體(野生型CMV-Red、CAG-Red，突變型CMV-REDm、CAG-REDm)。同時，制備其中稱作C端過氧物酶體轉(zhuǎn)移序列的SKL序列已被刪除的載體(野生型SV40-Red(-SKL)，突變型SV40-REDm(-SKL)、CAG-REDm)。
使用Lipofectamine將每個基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，24小時后測量細(xì)胞中的發(fā)光活性(圖15)。為了測定發(fā)光活性，分別用發(fā)光底物混合溶液(由Toyo B-Net Co.，Ltd提供)和AB2500(由ATTO Corporation提供)作為底物和發(fā)光測定裝置。向50μL細(xì)胞提取液中加入50μL PicaGene而得到樣品。含CMV-Red或SV40-Red(-SKL)的樣品顯示約1000 RLU的值，而含CMV-REDm或SV40-REDm(-SKL)的樣品顯示值為2×107-4×107RLU。如圖15所示，含CAG-Red的樣品中觀察到高活性，但在含突變體的樣品中活性增加約兩倍。SKL序列被認(rèn)為參與活性增加，但含SKL的樣品活性僅增加百分之幾。從這些結(jié)果來看，已經(jīng)表明，CAG和REDm可用作分析哺乳動物基因表達(dá)的報告基因。通過實施例10的方法，可以在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)來自鐵路蠕蟲的熒光素酶。因此，通過相似的方法，修改了來自鐵路蠕蟲的發(fā)綠光的熒光素酶基因序列(SEQ ID NO16)。在修改序列中，野生型中16個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點被修改，并與野生型有76％同源性。
實施例12對表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中的來自鐵路蠕蟲的發(fā)紅光的熒光素酶基因的發(fā)光譜進(jìn)行分析。向15μL轉(zhuǎn)染有活性最高的CMV-REDm基因的細(xì)胞(來自小鼠的NIH3T3，來自大鼠的Rat-1，來自人的A543細(xì)胞)提取液中加入15μL PicaGene，并用由ATTOCorporation提供的弱發(fā)光譜測量裝置測定發(fā)光譜。作為參照，也測量轉(zhuǎn)染有SEQ IDNO3所述基因的家蠶昆蟲細(xì)胞提取液的發(fā)光譜。圖16表示表達(dá)于小鼠NIH3T3細(xì)胞(粗線)和家蠶昆蟲細(xì)胞(細(xì)線)的發(fā)光譜。小鼠NIH3T3細(xì)胞中的最大發(fā)光波長是630nm，家蠶昆蟲細(xì)胞中的最大發(fā)光波長是622nm。這些發(fā)光譜不受pH和溶液環(huán)境的影響，并且總是表現(xiàn)為相同的發(fā)光譜。源于大鼠的Rat-1細(xì)胞和源于人的A543細(xì)胞中的最大發(fā)光波長也是630nm。
實施例13為在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，謹(jǐn)記以下內(nèi)容，在野生型大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶(基因序列和氨基酸序列分別表示在SEQ ID NO8和12中)和野生型大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶(基因序列和氨基酸序列分別表示在SEQ ID NO9和13中)序列中，人工構(gòu)建基因構(gòu)建體。
(1)改變15個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(20個DNA序列)(表7)
(2)改變322個DNA序列使密碼子使用頻率接近哺乳動物的密碼子偏向性(表8)。
(3)改變30個常見的限制酶位點(49個DNA序列中有2個與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點中的那些相同)(表9)。
表8和9中，RoLWT代表野生型大場雌光螢熒光素酶，RoLM代表突變型大場雌光螢熒光素酶。
所得突變型大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶基因的基因序列及其氨基酸序列分別表示在SEQ ID NO10和14中，所得突變型大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶基因的基因序列及其氨基酸序列分別表示在SEQ ID NO11和15中。
突變型大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶基因序列(SEQ ID NO10)與野生型大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶基因序列(SEQ ID NO8)的同源性是76.0％(圖17)。
表7

表8

表9

實施例14制備野生型或突變型熒光素酶基因(來自大場雌光螢的發(fā)橙或綠光的熒光素酶)插入到三種啟動子SV40下游的載體(野生型SV40-RoL(綠)和SV40-RoL(橙)，突變型SV40-RoL(綠)m和SV40-RoL(橙)m)。用Lipofectamine Plus將每個基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞，24小時后測量細(xì)胞中的發(fā)光活性。分別用發(fā)光底物混合溶液(由Toyo B-Net Co.，Ltd提供)和LB9506(由Berthold提供)作為底物和發(fā)光測定裝置。向50μL細(xì)胞提取液中加入50μL PicaGene而得到樣品。結(jié)果，含野生型SV40-RoL(綠)和SV40-RoL(橙)的樣品的顯示值分別為約1×106和4×105RLU，而含突變型SV40-RoL(綠)m和SV40-RoL(橙)m的樣品的顯示值分別為約5×108和8×107RLU。比較野生型與突變型，當(dāng)野生型的值是1時，突變的綠和橙色熒光素酶中活性值分別增加約44倍和約57倍。這些結(jié)果表明突變體可用作分析哺乳動物基因表達(dá)的報告基因。
實施例15用一種底物同時測量哺乳動物細(xì)胞中三種基因的轉(zhuǎn)錄活性的方法示意圖示于圖19。在培養(yǎng)的細(xì)胞中共表達(dá)啟動子序列插入到鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶基因、大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶基因和大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶基因上游的三個基因載體。細(xì)胞處理一段時間之后裂解共表達(dá)細(xì)胞。隨后，通過用濾色片分開細(xì)胞提取液中鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶、大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶和大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶的發(fā)光活性，測量三種轉(zhuǎn)錄活性。因而，向獨立表達(dá)鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶、大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶和大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶的15μL細(xì)胞提取液中加入15μL PicaGene。然后用由ATTO Corporation提供的弱發(fā)光譜測量裝置測定發(fā)光譜(圖20)。作為發(fā)光譜的分析結(jié)果，證實了通過選擇Hoya Co.，Ltd.提供的用于分開綠和橙色光的O-54型濾色片和選擇Hoya Co.，Ltd.提供的用于分開橙和紅色光的R-60型濾色片，可以將顏色分開。測量過程如下。(1)不用濾光片而測量發(fā)光強(qiáng)度(發(fā)紅光、橙光和發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光活性)。(2)將O-54型濾色片插入發(fā)光測定儀，測量發(fā)光強(qiáng)度而得到發(fā)綠光的熒光素酶的發(fā)光活性。(3)將R-60型濾色片插入發(fā)光測定儀，測量發(fā)光強(qiáng)度而得到發(fā)綠光和橙光的熒光素酶的發(fā)光活性。(4)通過轉(zhuǎn)換濾光片的透光率計算發(fā)紅光的熒光素酶的發(fā)光活性。此外，校正三種顏色熒光素酶的活性。如此就可以評價發(fā)紅光、綠光和橙光的熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度和豐度。
實施例16在模式實驗中考查豐度比不同的發(fā)紅光、橙光和綠光的熒光素酶組成不同的兩種酶是否可以用實施例15中的方法來定量。圖21中，對于發(fā)紅光和綠光的熒光素酶(A)、發(fā)綠光和橙光的熒光素酶(B)、和發(fā)橙光和紅光的熒光素酶(C)，可通過以下操作獲得具有不同豐度比的樣品的發(fā)光活性(1)測量總發(fā)光強(qiáng)度，(2)用濾光片組并轉(zhuǎn)換。結(jié)果表明發(fā)光活性隨豐度比成線性關(guān)系變化。這說明利用插入濾光片的發(fā)光測定儀，可以對哺乳動物細(xì)胞中發(fā)紅光、橙光和綠光的熒光素酶的不同表達(dá)量進(jìn)行定量。
實施例17在模式實驗中考查組成不同的兩種酶是否可以用實施例15中的方法，通過使豐度比不同的發(fā)紅光、橙光和綠光的熒光素酶中一種發(fā)光酶的量恒定來進(jìn)行定量。圖22中，對于發(fā)橙光和綠光的熒光素酶使發(fā)紅光的熒光素酶恒定(A)、對于發(fā)綠光和紅光的熒光素酶使發(fā)橙光的熒光素酶恒定(B)、對于發(fā)橙光和紅光的熒光素酶使發(fā)綠光的熒光素酶恒定(C)，通過以下操作獲得具有不同豐度比的樣品的發(fā)光活性(1)測量總發(fā)光強(qiáng)度，(2)用濾光片組并轉(zhuǎn)換。結(jié)果表明發(fā)光活性隨豐度比成線性關(guān)系變化。這說明利用插入濾光片的發(fā)光測定儀，可以對哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的發(fā)紅光、橙光和綠光的熒光素酶的不同表達(dá)量進(jìn)行定量。因此，證實了用一種底物可以對三種熒光素酶進(jìn)行定量，并可以測量三種基因的轉(zhuǎn)錄活性量。
序列表<110>獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所<120>多基因轉(zhuǎn)錄活性測定系統(tǒng)<130>P04-31<150>JP2003-127629<151>2003-05-06<150>JP2003-407564<151>2003-12-05<160>65<170>Patentln version 3.1<210>1<211>1638<212>DNA<213>野生型Phrixothrix發(fā)綠光的熒光素酶<400>1atggaagaag aaaacattag gcatggagag cgtcctcgtg atatagtcca tcctggctcg 60gcaggacaac aattatacca atcattgtat aaatttgcat cttttcctga agcaataatc120gatgctcata caaatgaagt aatatcatat gctcaaatat ttgaaaccag ctgccgctta180gctgttagta tagaacaata tggcttgaat gaaaacaatg ttgtgggtgt atgcagtgaa240aacaatataa acttttttaa tcctgtcctt gctgctttat acttaggaat accagtagca300acatcaaatg atatgtacac agatggagag ttaactggtc atttgaatat atcaaaacca360actatcatgt ttagttcaaa gaaagcactc ccgcttattc tgagagtaca gcaaaatcta420agtttcatta aaaaagtcgt agttatcgat agcatgtacg acattaatgg cgttgaatgc480gtatctacct ttgttgcacg ttatactgac cacacctttg atccattgtc atttacacca540aaagattttg atccccttga aaaaatcgca ttaattatgt catcatctgg aacaactgga600ttgcctaagg gtgtagtact gagccataga agtctaacta taagattcgt tcatagcagg660gatcccattt atggcactcg tacggttcca caaacatcaa ttctttcctt agtaccgttc720catcatgcct ttggaatgtt tactacatta tcttactttg tagtaggact taaggttgta780atgttgaaga aatttgaggg cgcacttttc ttaaaaacca tacagaatta caaaatcccc840
actattgtag tggcccctcc agttatggtg tttttggcta aaagcccatt agtcgatcaa900tacgatttat cgagcttaac ggaagttgct actggaggag ctcctttagg aaaagatgtc960gcagaagcag tagcaaagag gttgaaatta cctggaatca tacaaggata tggattaact 1020gaaacttgct gcgctgtaat gattacccct cataatgctg tgaaaacagg ttcaactgga 1080agacccttgc catacattaa agctaaagtt ttagataacg ctactgggaa ggcgctagga 1140ccaggagaaa gaggcgaaat atgctttaaa agtgaaatga ttatgaaagg atattacaac 1200aatccggaag caactattga tactattgac aaagatggtt ggcttcattc tggagatatt 1260ggatattacg acgaagatgg aaatttcttt atagttgatc gattgaaaga acttattaaa 1320tacaagggat atcaggttgc gcctgctgaa ctggaaaatc tgcttttaca acatccaagt 1380attgctgatg cgggtgttac tggagttccg gacgaatttg ctggacaatt acctgctgct 1440tgtgttgtgt tagaatctgg caagacgctg actgaaaagg aagttcaaga ttttattgca 1500gcacaagtca ctccaacaaa gcatcttcga ggcggtgtcg tatttgtaga cagtattccg 1560aaaggcccta ctggaaaact catcagaaag gagctccgag aaatatttgc ccagcgagca 1620ccaaaatcaa aattataa 1638<210>2<211>545<212>PRT<213>野生型Phrixothrix發(fā)綠光的熒光素酶<400>2Met Glu Glu Glu Asn Ile Arg His Gly Glu Arg Pro Arg Asp Ile Val1 5 10 15His Pro Gly Ser Ala Gly Gln Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Tyr Lys Phe20 25 30Ala Ser Phe Pro Glu Ala Ile Ile Asp Ala His Thr Asn Glu Val Ile35 40 45Ser Tyr Ala Gln Ile Phe Glu Thr Ser Cys Arg Leu Ala Val Ser Ile50 55 60
Glu Gln Tyr Gly Leu Asn Glu Asn Asn Val Val Gly Val Cys Ser Glu65 70 75 80Asn Asn Ile Asn Phe Phe Asn Pro Val Leu Ala Ala Leu Tyr Leu Gly85 90 95Ile Pro Val Ala Thr Ser Asn Asp Met Tyr Thr Asp Gly Glu Leu Thr100 105 110Gly His Leu Asn Ile Ser Lys Pro Thr Ile Met Phe Ser Ser Lys Lys115 120 125Ala Leu Pro Leu Ile Leu Arg Val Gln Gln Asn Leu Ser Phe Ile Lys130 135 140Lys Val Val Val Ile Asp Ser Met Tyr Asp Ile Asn Gly Val Glu Cys145 150 155 160Val Ser Thr Phe Val Ala Arg Tyr Thr Asp His Thr Phe Asp Pro Leu165 170 175Ser Phe Thr Pro Lys Asp Phe Asp Pro Leu Glu Lys Ile Ala Leu Ile180 185 190Met Ser Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Leu Ser195 200 205His Arg Ser Leu Thr Ile Arg Phe Val His Ser Arg Asp Pro Ile Tyr210 215 220Gly Thr Arg Thr Val Pro Gln Thr Ser Ile Leu Ser Leu Val Pro Phe225 230 235 240His His Ala Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Ser Tyr Phe Val Val Gly245 250 255Leu Lys Val Val Met Leu Lys Lys Phe Glu Gly Ala Leu Phe Leu Lys
260 265 270Thr Ile Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Thr Ile Val Val Ala Pro Pro Val275 280 285Met Val Phe Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Gln Tyr Asp Leu Ser290 295 300Ser Leu Thr Glu Val Ala Thr Gly Gly Ala Pro Leu Gly Lys Asp Val305 310 315 320Ala Glu Ala Val Ala Lys Arg Leu Lys Leu Pro Gly Ile Ile Gln Gly325 330 335Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Cys Ala Val Met Ile Thr Pro His Asn340 345 350Ala Val Lys Thr Gly Ser Thr Gly Arg Pro Leu Pro Tyr Ile Lys Ala355 360 365Lys Val Leu Asp Asn Ala Thr Gly Lys Ala Leu Gly Pro Gly Glu Arg370 375 380Gly Glu Ile Cys Phe Lys Ser Glu Met Ile Met Lys Gly Tyr Tyr Asn385 390 395 400Asn Pro Glu Ala Thr Ile Asp Thr Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His405 410 415Ser Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Asp Gly Asn Phe Phe Ile Val420 425 430Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro435 440 445Ala Glu Leu Glu Asn Leu Leu Leu Gln His Pro Ser Ile Ala Asp Ala450 455 460
Gly Val Thr Gly Val Pro Asp Glu Phe Ala Gly Gln Leu Pro Ala Ala465 470 475 480Cys Val Val Leu Glu Ser Gly Lys Thr Leu Thr Glu Lys Glu Val Gln485 490 495Asp Phe Ile Ala Ala Gln Val Thr Pro Thr Lys His Leu Arg Gly Gly500 505 510Val Val Phe Val Asp Ser Ile Pro Lys Gly Pro Thr Gly Lys Leu Ile515 520 525Arg Lys Glu Leu Arg Glu Ile Phe Ala Gln Arg Ala Pro Lys Ser Lys530 535 540Leu545<210>3<211>1641<212>DNA<213>野生型Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>3atggaagaag aaaacattgt gaatggagat cgtcctcgtg atctagtttt tcctggcaca 60gcaggactac aattatatca atcattatat aaatattcat atattactga cggaataatc120gatgcccata ccaatgaagt aatatcatat gctcaaatat ttgaaaccag ctgccgcttg180gcagttagtc tagaaaaata tggcttggat cataacaatg ttgtggcaat atgcagtgaa240aacaacatac acttttttgg ccctttaatt gctgctttat accaaggaat accaatggca300acatcaaatg atatgtacac agaaagggag atgattggcc atttgaatat atcgaaacca360tgccttatgt tttgttcaaa gaaatcactc ccatttattc tgaaagtaca aaaacatcta420gatttcctta aaaaagtcat agtcattgat agtatgtacg atatcaatgg cgttgaatgc480gtatttagct ttgtttcacg ttatactgat cacgcctttg atccagtgaa atttaaccca540aaagagtttg atcccttgga aagaaccgca ttaattatga catcatctgg aacaactgga600ttgcctaaag gggtagtaat aagccataga agtataacta taagattcgt ccatagcagt660
gatcccatct atggtactcg tattgctcca gatacatcaa ttcttgctat agcaccgttc 720catcatgcct ttggactgtt tactgcacta gcttactttc cagtaggact taagattgta 780atggtgaaga aatttgaggg cgaattcttc ttaaaaacca tacaaaatta caaaatcgct 840tctattgtag ttcctcctcc aattatggta tatttggcta aaagtccatt agtcgatgaa 900tacaatttat cgagcttaac ggaaattgct tgtggagggt ctcctttagg aagagatatc 960gcagataaag tagcaaagag attgaaagta catggaatcc tacaaggata tggattaacc 1020gaaacctgca gcgctctaat acttagcccc aatgatcgag aacttaaaaa aggtgcaatt 1080ggaacgccta tgccatatgt tcaagttaaa gttatagata tcaatactgg gaaggcgcta 1140ggaccaagag aaaaaggcga aatatgcttc aaaagtcaaa tgcttatgaa aggatatcac 1200aacaatccgc aagcaactcg tgatgctctt gacaaagatg gttggcttca tactggggat 1260cttggatatt acgacgaaga cagatttatc tatgtagttg atcgattgaa agaacttatt 1320aaatataaag gatatcaggt tgcgcctgct gaactggaaa atctgctttt acaacatcca 1380aatatttctg atgcgggtgt tattggaatt ccggacgaat ttgctggtca attaccttcc 1440gcgtgtgttg tgttagagcc tggtaagaca atgaccgaaa aggaagttca ggattatatt 1500gcagagctag tcactacaac taaacatctt cgaggcggtg tcgtatttat agatagtatt 1560ccaaaaggcc caacaggaaa actcatgaga aacgaactcc gtgcaatatt tgcccgggaa 1620caggcaaaat caaaattata a1641<210>4<211>546<212>PRT<213>野生型Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>4Met Glu Glu Glu Asn Ile Val Asn Gly Asp Arg Pro Arg Asp Leu Val1 5 10 15Phe Pro Gly Thr Ala Gly Leu Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Tyr Lys Tyr20 25 30
Ser Tyr Ile Thr Asp Gly Ile Ile Asp Ala His Thr Asn Glu Val Ile35 40 45Ser Tyr Ala Gln Ile Phe Glu Thr Ser Cys Arg Leu Ala Val Ser Leu50 55 60Glu Lys Tyr Gly Leu Asp His Asn Asn Val Val Ala Ile Cys Ser Glu65 70 75 80Asn Asn Ile His Phe Phe Gly Pro Leu Ile Ala Ala Leu Tyr Gln Gly85 90 95Ile Pro Met Ala Thr Ser Asn Asp Met Tyr Thr Glu Arg Glu Met Ile100 105 110Gly His Leu Asn Ile Ser Lys Pro Cys Leu Met Phe Cys Ser Lys Lys115 120 125Ser Leu Pro Phe Ile Leu Lys Val Gln Lys His Leu Asp Phe Leu Lys130 135 140Lys Val Ile Val Ile Asp Ser Met Tyr Asp Ile Asn Gly Val Glu Cys145 150 155 160Val Phe Ser Phe Val Ser Arg Tyr Thr Asp His Ala Phe Asp Pro Val165 170 175Lys Phe Asn Pro Lys Glu Phe Asp Pro Leu Glu Arg Thr Ala Leu Ile180 185 190Met Thr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Ile Ser195 200 205His Arg Ser Ile Thr Ile Arg Phe Val His Ser Ser Asp Pro Ile Tyr210 215 220Gly Thr Arg Ile Ala Pro Asp Thr Ser Ile Leu Ala Ile Ala Pro Phe225 230 235 240
His His Ala Phe Gly Leu Phe Thr Ala Leu Ala Tyr Phe Pro Val Gly245 250 255Leu Lys Ile Val Met Val Lys Lys Phe Glu Gly Glu Phe Phe Leu Lys260 265 270Thr Ile Gln Asn Tyr Lys Ile Ala Ser Ile Val Val Pro Pro Pro Ile275 280 285Met Val Tyr Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Glu Tyr Asn Leu Ser290 295 300Ser Leu Thr Glu Ile Ala Cys Gly Gly Ser Pro Leu Gly Arg Asp Ile305 310 315 320Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg Leu Lys Val His Gly Ile Leu Gln Gly325 330 335Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Ser Ala Leu Ile Leu Ser Pro Asn Asp340 345 350Arg Glu Leu Lys Lys Gly Ala Ile Gly Thr Pro Met Pro Tyr Val Gln355 360 365Val Lys Val Ile Asp Ile Asn Thr Gly Lys Ala Leu Gly Pro Arg Glu370 375 380Lys Gly Glu Ile Cys Phe Lys Ser Gln Met Leu Met Lys Gly Tyr His385 390 395 400Asn Asn Pro Gln Ala Thr Arg Asp Ala Leu Asp Lys Asp Gly Trp Leu405 410 415His Thr Gly Asp Leu Gly Tyr Tyr Asp Glu Asp Arg Phe Ile Tyr Val420 425 430Val Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala435 440 445
Pro Ala Glu Leu Glu Asn Leu Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Ser Asp450 455 460Ala Gly Val Ile Gly Ile Pro Asp Glu Phe Ala Gly Gln Leu Pro Ser465 470 475 480Ala Cys Val Val Leu Glu Pro Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Val485 490 495Gln Asp Tyr Ile Ala Glu Leu Val Thr Thr Thr Lys His Leu Arg Gly500 505 510Gly Val Val Phe Ile Asp Ser Ile Pro Lys Gly Pro Thr Gly Lys Leu515 520 525Met Arg Asn Glu Leu Arg Ala Ile Phe Ala Arg Glu Gln Ala Lys Ser530 535 540Lys Leu545<210>5<211>1760<212>DNA<213>US2002-0119542-A1中的Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>5gtgacagttt agttcagtag aagatttttt tgagatcaaa atggaagaag aaaacgttgt60gaatggagat cgtcctcgtg atctagtttt tcctggcaca gcaggactac aattatatca 120atcattatat aaatattcat atattactga cggaataatc gatgcccata ccaatgaagt 180aatatcatat gctcaaatat ttgaaaccag ctgccgcttg gcagttagtc tagaaaaata 240tggcttggat cataacaatg ttgtggcaat atgcagtgaa aacaacatac acttttttgg 300ccctttaatt gctgctttat accaaggaat accaatggca acatcaaatg atatgtacac 360agaaagggag atgattggcc atttgaatat atcgaaacca tgccttatgt tttgttcaaa 420gaaatcactc ccatttattc tgaaagtaca aaaacatcta gatttcctta aaagagtcat 480
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<400>6atggaagaag aaaacgtggt gaatggagat cggcctaggg atctggtgtt tcccggcaca60gcaggactcc agctgtacca gtcactgtat aagtattcat acatcactga cgggataatc 120gacgcccata ccaacgaggt catctcatat gctcagatct ttgaaacctc ctgccggctg 180gcagtgtcac tggagaagta tggcctggat cacaacaatg tggtggccat ctgttctgaa 240aacaacatac actttttcgg ccccctgatt gctgccctgt accaaggcat cccaatggca 300acatcaaacg acatgtacac agagagggag atgataggcc atctgaacat ctccaagcca 360tgcctgatgt tctgttcaaa gaaatcactg cccttcattc tgaaggtgca gaagcacctg 420gactttctga aaaaagtcat agtcattgat tccatgtacg atatcaatgg cgtggagtgc 480gtcttctcct ttgtctcgag gtacactgat cacgccttcg acccagtgaa gttcaacccc 540aaagagttcg accccctcga aagaaccgcc ctgattatga catcatctgg gacaactgga 600ctgcctaagg gggtcgtgat ctcccacaga tctataacta tcagattcgt ccattcttcc 660gatcccatct acggcaccag gattgcccca gacacatcaa ttctggctat cgcacccttc 720catcacgcct ttggactgtt tactgcactg gcttacttcc ctgtcggact gaagattgtc 780atggtgaaga aatttgaggg cgagttcttt ctgaaaacca tacaaaatta caagatcgct 840tctattgtcg tgcctcctcc tattatggtc tatctggcta agtcccccct ggtcgatgaa 900tacaatttat cttctctgac cgaaatcgca tgcggaggct ctcctctggg gagagacatc 960gcagataaag tcgccaagag actgaaagtg catggaatcc tccagggata tgggctgacc 1020gagacctgtt ccgctctgat actgtctccc aacgatcggg aactgaaaaa gggggcaatc 1080ggaaccccta tgccatacgt gcaagtgaaa gtgatcgaca tcaataccgg gaaggccctg 1140ggaccaagag agaaaggcga gatctgcttc aagtctcaga tgctgatgaa ggggtatcac 1200aacaatcctc aggccactag ggatgctctg gacaaggatg ggtggctgca cactggggac 1260ctgggatatt acgacgaaga cagatttatc tatgtcgtgg acaggctgaa agagctgatc 1320aagtataaag ggtatcaggt cgcccctgct gagttggaaa acctgctgtt gcagcacccc 1380aatatctctg atgccggcgt gattggaatt ccggacgaat ttgctggtca attaccttcc 1440gcctgtgtgg tgctggagcc tggcaagaca atgaccgaga aagaagtgca ggactacatt 1500
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His His Ala Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Ser Tyr Phe Ile Val Gly245 250 255Leu Arg Val Val Leu Leu Lys Arg Phe Glu Glu Lys Phe Phe Leu Ser260 265 270Thr Ile Glu Lys Tyr Arg Ile Pro Thr Ile Val Leu Ala Pro Pro Val275 280 285Met Val Phe Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Gln Tyr Asp Leu Ser290 295 300Ser Ile Arg Glu Val Ala Thr Gly Gly Ala Pro Val Gly Thr Glu Val305 310 315 320Ala Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Lys Ile Gly Gly Ile Leu Gln Gly325 330 335Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Cys Ala Val Leu Ile Thr Pro His Asp340 345 350Asp Val Lys Thr Gly Ser Thr Gly Arg Val Ala Pro Tyr Val Gln Ala355 360 365Lys Ile Val Asp Leu Thr Thr Gly Lys Ser Leu Gly Pro Asn Lys Arg370 375 380Gly Glu Leu Cys Phe Lys Ser Glu Ile Ile Met Lys Gly Tyr Phe Asn385 390 395 400Asn Lys Gln Ala Thr Glu Glu Ala Ile Asp Lys Glu Gly Trp Leu His405 410 415Ser Gly Asp Val Gly Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly His Phe Phe Val Val420 425 430Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro
435 440 445Ala Glu Leu Glu Trp Leu Leu Leu Gln His Pro Ser Ile Lys Asp Ala450 455 460Gly Val Thr Gly Val Pro Asp Glu Ala Ale Gly Glu Leu Pro Gly Ala465 470 475 480Cys Ile Val Leu Gln Glu Gly Lys Ser Leu Thr Glu Gln Glu Ile Ile485 490 495Asp Tyr Ile Ala Glu Arg Val Ser Pro Thr Lys Arg Ile Arg Gly Gly500 505 510Val Val Phe Val Asp Asp Ile Pro Lys Gly Ala Thr Gly Lys Leu Val515 520 525Arg Ser Glu Leu Arg Lys Leu Leu Ala Gln Lys Lys Ser Lys Leu530 535 540<210>16<211>1638<212>DNA<213>突變型Phrixothrix發(fā)綠光的熒光素酶<400>16atggaagaag agaacatcag gcacggcgag cgccctcggg acatcgtcca ccctggctcc60gccggccagc agctgtacca gtccctgtac aagttcgcct ccttccctga ggccatcatc 120gacgcccaca ccaacgaggt gatctcctac gcccagattt tcgaaaccag ctgccgcctg 180gccgtgagca tcgagcagta cggcctgaac gagaacaacg tggtgggcgt ctgtagcgag 240aacaacatca acttcttcaa ccctgtgctg gccgccctgt acctcggcat cccagtggcc 300acctccaacg atatgtacac cgatggcgag ctgaccggcc acctgaacat ctccaagcca 360accatcatgt tcagctccaa gaaggccctg cccctgatcc tgagagtgca gcagaacctg 420agcttcatca agaaggtggt ggtgatcgac agcatgtacg acatcaacgg cgtggagtgc 480gtgtctacct tcgttgcccg gtacaccgac cacaccttcg acccactgtc cttcacccca 540
aaggacttcg accccctgga gaagatcgcc ctgatcatgt catcctccgg caccaccggc 600ctgcctaagg gcgtggtgct gagccacaga agcctgacca tcagattcgt ccacagcagg 660gaccccatct acggcacccg caccgtgccc cagacctcca tcctgtccct ggtgccattt 720caccacgcct tcggcatgtt caccaccctg tcctacttcg tggtgggcct gaaggtggtg 780atgctgaaga agttcgaggg cgccctcttc ctgaagacca tccagaacta caagatccct 840acaatcgtgg tggcccctcc agtgatggtg ttcctggcta agagcccact ggtggatcag 900tacgatctgt ccagcctcac cgaggtggct accggcggcg ctcctctggg caaggatgtg 960gccgaggctg tggccaagag attgaagctg cctggcatca tccagggcta cggcctgacc 1020gagacctgct gcgctgtgat gatcacccct cacaacgctg tgaagaccgg ctccaccggc 1080agacccctgc catacatcaa ggctaaggtg ctggataacg ctaccggcaa agccctggga 1140ccaggcgaga gaggcgagat ttgcttcaag agcgagatga tcatgaaggg ctactacaac 1200aaccctgagg ccaccatcga caccatcgac aaggatggct ggctgcactc tggcgacatc 1260ggctactacg acgaggatgg caacttcttc atcgtggatc ggctgaaaga gctgatcaag 1320tacaagggct accaggtggc ccctgctgag ctggagaact tgcttctgca gcacccaagc 1380atcgctgatg ccggcgtgac cggcgtgccc gacgagttcg ctggccagct gcctgctgct 1440tgtgtcgtgc tggagtctgg caagacattg accgagaagg aggtgcaaga tttcatcgcc 1500gcccaggtga ccccaactaa gcacctgcgg ggcggcgtgg tgttcgtgga cagcatccct 1560aaaggcccta ccggcaagct gatcagaaag gagctgcggg agattttcgc ccagagagcc 1620ccaaagtcca agctgtaa1638<210>17<211>75<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>17cagcaggact acaattatat caatcattat ataaatattc ttatattact gacggaataa60tcgatgccca tacca 75<210>18
<211>71<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>18gcaggactac aattatatca atcattatat aaatactcgt atattactga cggaataatc60gatgcccata c 71<210>19<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>19caatgaagta atatcatatg ctcaaatatt tgaaacaagt tgccgcttgg cagttagtct60agaaaaatat ggcttgg 77<210>20<211>75<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>20aatatttgaa accagctgcc gcttggcagt tagtctagag aaatatggct tggatcataa60caatgttgtg gcaat 75<210>21<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>21gaaaacaaca tacacttttt tggcccttta attgctgccc tataccaagg aataccaatg60gcaacatcaa atgatat 77<210>22<211>73<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>22acttttttgg ccctttaatt gctgctttat accaagggat accaatggca acatcaaatg60
atatgtacac aga 73<210>23<211>71<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>23catcaaatga tatgtacaca gaaagggaga tgatcggcca tttgaatata tcgaaaccat60gccttatgtt t 71<210>24<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>24tttattctga aagtacaaaa acatctagat tttctcaaaa aagtcatagt cattgatagt60atgtacgata tcaatgg 77<210>25<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>25atgtacgata tcaatggcgt tgaatgcgta tttagttttg tttcacgtta tactgatcac60gcctttgatc cagtgaa 77<210>26<211>75<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>26atatcaatgg cgttgaatgc gtatttagct ttgtttcacg gtatactgat cacgcctttg60atccagtgaa attta 75<210>27<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶
<400>27gtatttagct ttgtttcacg ttatactgat cacgcgttcg atccagtgaa atttaaccca60aaagagtttg atccctt 77<210>28<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>28tttaacccaa aagagtttga tcccttggaa agaaccgcgc taattatgac atcatctgga60acaactggat tgcctaa 77<210>29<211>81<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>29gaaccgcatt aattatgaca tcatctggaa caactggcct gcctaaaggg gtagtaataa60gccatagaag tataactata a 81<210>30<211>73<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>30ctggattgcc taaaggggta gtaataagcc ataggagtat aactataaga ttcgtccata60gcagtgatcc cat 73<210>31<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>31aagaaatttg agggcgaatt cttcttaaaa accatccaaa attacaaaat cgcttctatt60gtagttcctc ctccaat 77
<210>32<211>71<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>32agggcgaatt cttcttaaaa accatacaaa actacaaaat cgcttctatt gtagttcctc60ctccaattat g 71<210>33<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>33gttcctcctc caattatggt atatttggct aaaagtcctc tagtcgatga atacaattta60tcgagcttaa cggaaat 77<210>34<211>73<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>34tttggctaaa agtccattag tcgatgaata caatctgtcg agcttaacgg aaattgcttg60tggagggtct cct 73<210>35<211>73<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>35ggaaattgct tgtggagggt ctcctttagg aagagacatc gcagataaag tagcaaagag60attgaaagta cat 73<210>36<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>36gggtctcctt taggaagaga tatcgcagat aaagtagcca agagattgaa agtacatgga60
atcctacaag gatatgg 77<210>37<211>73<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>37ggatatggat taaccgaaac ctgcagcgct ctaatactga gccccaatga tcgagaactt60aaaaaaggtg caa 73<210>38<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>38ccgaaacctg cagcgctcta atacttagcc ccaacgatag agaacttaaa aaaggtgcaa60ttggaacgcc tatgcca 77<210>39<211>81<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>39ctaatactta gccccaatga tcgagaactt aaaaagggtg caattggaac gcctatgcca60tatgttcaag ttaaagttat a 81<210>40<211>73<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>40tgggaaggcg ctaggaccaa gagaaaaagg cgagatttgc ttcaaaagtc aaatgcttat60gaaaggatat cac 73<210>41<211>77<212>DNA
<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>41aaaaggcgaa atatgcttca aaagtcaaat gcttatgaag ggctatcaca acaatccgca60agcaactcgt gatgctc 77<210>42<211>75<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>42tccgcaagca actcgtgatg ctcttgacaa agatgggtgg cttcatactg gggatcttgg60atattacgac gaaga 75<210>43<211>73<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>43gacagattta tctatgtagt tgatcgattg aaagagctta ttaaatataa aggatatcag60gttgcgcctg ctg 73<210>44<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>44atttatctat gtagttgatc gattgaaaga actcatcaaa tataaaggat atcaggttgc60gcctgctgaa ctggaaa 77<210>45<211>75<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>45cgcctgctga actggaaaat ctgcttttac aacacccaaa tatttctgat gcgggtgtta60ttggaattcc ggacg 75
<210>46<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>46ctgaactgga aaatctgctt ttacaacatc ctaatatttc tgatgcgggt gttattggaa60ttccggacga atttgct 77<210>47<211>75<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>47ttacaacatc caaatatttc tgatgcgggt gtcattggaa ttccggacga atttgctggt60caattacctt ccgcg 75<210>48<211>77<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>48tgcgggtgtt attggaattc cggacgaatt tgctggtcag ttaccttccg cgtgtgttgt60gttagagcct ggtaaga 77<210>49<211>73<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>49aactaaacat cttcgaggcg gtgtcgtatt tatcgacagt attccaaaag gcccaacagg60aaaactcatg aga 73<210>50<211>48<212>DNA<213>Phrixothrix發(fā)紅光的熒光素酶<400>50
gaactccgtg caatatttgc ccgggaacag gcaaaatcaa aactataa 48<210>51<211>77<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>51cccagggacc ccctggacct gggcaccgcc ggcattcagc tctacagagc cctgaccaac60ttctccttcc tgaggga 77<210>52<211>77<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>52cctgggcacc gccggcatcc agctgtacag ggccctgacc aacttctcct tcctgaggga60ggccctgatc gacgccc 77<210>53<211>79<212>DNA<213>人場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>53gtggtgtctt acgccgacat cctggagaac agctgtagac tggctaagtg ctacgagaac60tacggcctgc gccagaaca 79<210>54<211>79<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>54gcgccagaac agcgtgatct ccgtgtgcag cgagaatagc accatcttct tctaccccgt60gatcgccgcc ctgtacatg 79<210>55<211>81<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶
<400>55tcaagaaggt ggtgctgctg gacagcaagg aggatatggg cgaggcccag tgcctgagca60acttcatggc ccggtactcc g 81<210>56<211>81<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>56tcaagccaag ggacttcgac gccaaggagc aggtggccct tattatgtcc tcctctggca60ccaccggcct gccaaagggc g 81<210>57<211>75<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>57atcgagaagt acagaatccc aacaatcgtg ctggcccctc ctgtgatggt gttcctggcc60aagagccccc tggtg 75<210>58<211>79<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>58atcccaacaa tcgtgctggc cccccccgtg atggtgttcc tggctaagag ccccctggtg60gaccagtacg acctgtcca 79<210>59<211>75<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>59gagaggtggc caccggcggc gcccctgtgg gcaccgaggt tgccgtggcc gtggccaagc60ggctgaagat cggcg 75
<210>60<211>75<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>60gccatcgaca aggagggctg gctgcactcc ggcgacgtgg gatactacga cgacgatggc60cacttcttcg tggtg 75<210>61<211>73<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>61ctccggcgac gtgggctact acgacgacga tggacatttc ttcgtggtgg accggctgaa60ggagctgatc aag 73<210>62<211>81<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>62cgacgatggc cacttcttcg tggtggaccg gctgaaagag ctgatcaagt acaagggcta60ccaggtggcc cccgccgagc t 81<210>63<211>71<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>63agtggctgct gctccagcac ccatccatca aggatgccgg cgtgaccggc gtgcccgacg60aggccgccgg c 71<210>64<211>75<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>64ccgagcagga gatcatcgac tacatcgccg agcgagtgtc tcccaccaag cgcatccggg60
gcggcgtcgt cttcg 75<210>65<211>71<212>DNA<213>大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶<400>65gagcgggtgt cccccaccaa gcgcatccgg ggcggagtcg tcttcgtgga cgacatcccc60aagggcgcca c 7權(quán)利要求
1.在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的、編碼選自鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶與大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶和發(fā)橙光的熒光素酶的至少一種熒光素酶的DNA，其特征在于(1)該DNA沒有哺乳動物細(xì)胞中其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列并具有哺乳動物的密碼子偏向性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其特征在于哺乳動物是人類，DNA具有選自SEQ IDNOs7、10、11和16的至少一種核苷酸序列。
3.使編碼鐵路蠕蟲或大場雌光螢熒光素酶的DNA在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的方法，其特征在于具有1)改變cDNA序列使其他轉(zhuǎn)錄因子不結(jié)合的步驟；2)將cDNA序列中昆蟲的密碼子偏向性改成哺乳動物的密碼子偏向性的步驟；和任選地3)由于使用時應(yīng)用受限而改變具有很多限制酶位點的cDNA序列的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于不改變熒光素酶的氨基酸序列。
5.多肽，其是最大發(fā)光波長為630nm的熒光素酶，由以下任意一個表示(1)具有SEQ ID NO4氨基酸序列的多肽；和(2)具有SEQ ID NO4序列中一個或多個氨基酸替換、增加或缺失的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中。
7.基因構(gòu)建體，引入要在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的一個或兩個或更多個熒光素酶基因，所述熒光素酶發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件且最大發(fā)光波長為535-635nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的基因構(gòu)建體，通過將最大發(fā)光波長為460-520nm的一個或兩個或更多個熒光素酶基因和發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件且最大發(fā)光波長為535-635nm的一個或兩個或更多個熒光素酶基因一起引入，從而引入可穩(wěn)定表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中的3個或更多個熒光素酶基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的基因構(gòu)建體，其中上述熒光素酶基因是編碼選自鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶和發(fā)綠光的熒光素酶與大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶和發(fā)橙光的熒光素酶的至少一種熒光素酶的基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的基因構(gòu)建體，含有促進(jìn)翻譯效率的元件和/或穩(wěn)定mRNA的元件。
11.基因構(gòu)建體，能夠通過引入發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件的一個或兩個或更多個熒光素酶基因和根據(jù)需要的受不同啟動子控制的發(fā)光波長不同且基本上不依賴于測定條件的熒光素酶基因，分別測定從兩種或更多種熒光素酶發(fā)射的每種光。
12.表達(dá)載體，包含根據(jù)權(quán)利要求7-11中任意一項的基因構(gòu)建體。
13.哺乳動物細(xì)胞，轉(zhuǎn)化有根據(jù)權(quán)利要求7-11中任意一項的基因構(gòu)建體或者根據(jù)權(quán)利要求12的表達(dá)載體。
14.哺乳動物細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)地整合可在哺乳動物細(xì)胞中受不同啟動子控制的、發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件的兩種或更多種熒光素酶的基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的哺乳動物細(xì)胞，其中兩種或更多種上述熒光素酶的最大發(fā)光波長為535-635nm且可用一種底物發(fā)光。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的哺乳動物細(xì)胞，含有鐵路蠕蟲發(fā)紅光的熒光素酶基因，還含有受不同啟動子控制且選自鐵路蠕蟲發(fā)綠光的熒光素酶基因、大場雌光螢發(fā)綠光的熒光素酶基因、大場雌光螢發(fā)橙光的熒光素酶基因、以及發(fā)藍(lán)光的熒光素酶基因的至少兩種或更多種。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的哺乳動物細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)地整合可在哺乳動物細(xì)胞中受不同啟動子控制的、發(fā)光波長基本上不依賴于測定條件的三種或更多種熒光素酶的基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的三個或更多個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受毒性評價啟動子控制，剩余的一個或多個熒光素酶基因受待評價啟動子控制。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的三個或更多個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受假啟動子控制，剩余的一個或多個熒光素酶基因受待評價啟動子控制。
20.根據(jù)權(quán)利要求14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的四個或更多個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受毒性評價啟動子控制，第三個熒光素酶基因受外來因素感受蛋白的啟動子控制，剩余的一個或多個熒光素酶基因受待評價啟動子控制。
21.根據(jù)權(quán)利要求14的哺乳動物細(xì)胞，其中具有受不同啟動子控制的四個或更多個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受假啟動子控制，第三個熒光素酶基因受外來因素感受蛋白的啟動子控制，剩余的一個或多個熒光素酶基因受待評價啟動子控制。
22.根據(jù)權(quán)利要求14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的兩個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受毒性評價啟動子控制。
23.根據(jù)權(quán)利要求14的哺乳動物細(xì)胞，具有受不同啟動子控制的兩個熒光素酶基因，其中第一個熒光素酶基因受恒定表達(dá)啟動子控制，第二個熒光素酶基因受假啟動子控制。
24.一種藥物篩選方法，包括在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中、在藥物候選化合物的存在下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求18-21中任意一項的哺乳動物細(xì)胞的步驟，存在或缺少候選化合物的條件下對上述熒光素酶進(jìn)行定量的步驟，和評價候選化合物對與至少一種熒光素酶相連的待評價啟動子的作用的步驟。
25.一種系統(tǒng)，通過改變根據(jù)權(quán)利要求13-23中任意一項的哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境而多重測定改變培養(yǎng)環(huán)境前后與每個熒光素酶連接的各啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，并評價兩種或多種熒光素酶的表達(dá)量，所述兩種或多種熒光素酶發(fā)射發(fā)光波長不依賴于測定條件的不同光。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的系統(tǒng)，用于同時測定兩種或多種熒光素酶的表達(dá)量。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的系統(tǒng)，能測定三種或多種熒光素酶的表達(dá)量。
全文摘要
以實現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)的方式導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的一種基因構(gòu)建體，其含有可以用單一發(fā)光底物發(fā)射不同顏色光的至少兩種光蛋白基因的任意一個；一種利用導(dǎo)入上述基因構(gòu)建體所獲得的哺乳動物細(xì)胞分析光蛋白表達(dá)量來多重測定與每個光蛋白連接的各啟動子轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)等等。
文檔編號G01N33/50GK1784496SQ20048001207
公開日2006年6月7日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月6日
發(fā)明者近江谷克裕, 中島芳浩 申請人:獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所