專利名稱：定量分析規(guī)定尺寸和大于規(guī)定尺寸分析物的生物傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量分析規(guī)定尺寸或大于規(guī)定尺寸材料的生物傳感器及其制備方法。具體地，本發(fā)明涉及一種以期望的或隨機的方式分布在絕緣金屬基質(zhì)上的納米級結(jié)構(gòu)，這個納米級結(jié)構(gòu)有一個暴露的傳導(dǎo)區(qū)，傳導(dǎo)區(qū)有確定的直徑，還涉及用此納米級結(jié)構(gòu)定量分析生物材料的方法。
背景技術(shù)：
通常，金屬基質(zhì)可通過各種與眾所周知的半導(dǎo)體作用相關(guān)的技術(shù)在絕緣金屬基質(zhì)上形成具有微米級或更大面積的暴露傳導(dǎo)區(qū)。但是，由于常規(guī)技術(shù)的局限性，納米級的暴露傳導(dǎo)區(qū)的形成會遇到很多障礙。人們嘗試了很多方法來克服障礙。參見，例如，美國專利6,503,701、6,492,096、6,322,963、6,001,587和5,922,2146。
另一方面，單層的自裝配分子(在下文中指一種“單層SAM”)可以描述為這樣一種狀態(tài)，即一個含有巰基(-SH)或二硫鍵(-S-S)的有機化合物以單層的形式排列，這種排列是通過這種化合物的硫功能基團以共價鍵與金屬電極相連來實現(xiàn)的，金屬電極是由黃金或鉑金或類似物制得的。例如可通過如下步驟來形成單層SAM制備自裝配材料的水溶液，這種自裝配材料可溶于水或各種有機溶劑，然后將此溶液與金屬基質(zhì)相連(將金屬基質(zhì)浸于溶液中或?qū)⑷芤旱卧诮饘倩|(zhì)上)，反應(yīng)一段時間，清除沒反應(yīng)的試劑。這些單層SAM可用于修飾金屬表面，如將疏水表面變?yōu)橛H水表面，反之也可以。它們還可以充當生物材料和金屬材料的連接劑。雖然有很多專利試圖將SAM技術(shù)用于制作生物傳感器，但目前尚無用SAM技術(shù)制備的商業(yè)化生物傳感器的報道。
已報道的關(guān)于單層SAM的常規(guī)技術(shù)主要涉及以下幾個方面在傳導(dǎo)金屬材料如黃金或鉑金或類似物上形成單層SAM的方法，將生物材料諸如蛋白和DNA與制備的SAM末端的功能基團相連，對與SAM單層相連的材料的描述。這些技術(shù)都已公開在例如美國專利4,964,972、5,652,059、5,686,549、5,725,788、5,827,417、5,922,214、6,031,756、6,114,099、6,127,127、6,156,393、6,183,815、6,270,946、6,287,874、6,312,809、6,322,979、6,346,387、6,432,723、6,436,699、6,444,318、6,444,321、6,492,096和6,114,099上。
可應(yīng)用免疫反應(yīng)來定量分析蛋白，其中典型的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。在酶聯(lián)免疫吸附試驗中，與被分析蛋白特異性結(jié)合的一抗固定于底板上。然后將與一抗特異性結(jié)合的二抗固定于底板上。在二抗上連有一個標記物，此標記物有熒光或有放射性。因此，可以通過測定熒光信號或放射信號的強度來定量分析蛋白的濃度。
研究發(fā)現(xiàn)以上常規(guī)技術(shù)存在一些問題。典型地，常規(guī)技術(shù)需要有沖洗和清除步驟以去除非特異性吸附的酶或抗體，并需要單獨的裝置以檢測由標記物發(fā)出的熒光或放射信號。這些缺陷導(dǎo)致了需要大型設(shè)備、分析時間長(如需數(shù)小時)以及設(shè)備費用增加(如增加了數(shù)萬美元)等問題。這使得適用于小型醫(yī)院或非專業(yè)人員的便攜式分析儀的商業(yè)化受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通用的可以分析各種生物分子的分析儀界面，，以及利用該界面定量分析生物分子的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供一種用電化學法分析生物材料的系統(tǒng)，這個系統(tǒng)可用于生產(chǎn)便攜式小型化的分析儀。
本發(fā)明的又一目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點和存在的問題，如省去清洗或清除步驟，縮短分析時間和提高操作的便利性。
本發(fā)明提供了一種用于定量分析規(guī)定尺寸或大于規(guī)定尺寸材料的生物傳感器。這種生物傳感器包括了一個電極層，大量的第一種單層分子形成在電極層上，其中第一種單層分子的直徑要小于待分析的材料并具備電化學傳導(dǎo)性；第二種單層分子形成在電極層上除第一種單層分子以外的區(qū)域，其中第二種單層分子具備電化學絕緣性。第一種單層分子形成了一個暴露的傳導(dǎo)區(qū)，而第二種單層分子形成了一個絕緣區(qū)。這種生物傳感器還包括一個信號介質(zhì)，信號介質(zhì)的大小要能夠滿足擴散至由第一種單層分子形成的暴露傳導(dǎo)區(qū)的需要，其中信號介質(zhì)由一種能與待測材料特異性結(jié)合的材料和另一種能產(chǎn)生電化學信號的材料組成。
優(yōu)選地，由第一種單層分子形成的暴露傳導(dǎo)區(qū)有恒定的直徑或面積。而且，此暴露傳導(dǎo)區(qū)由納米級直徑的自裝配單層分子組成。在這里，納米級指0.1-10納米。第一種單層分子由包含巰基或二硫鍵的有機化合物組成，優(yōu)選地，第一種單層分子由選自3-巰基丙酸、半胱胺和胱胺中的任一種組成。第二種單層分子也包含了自裝配單層分子，由1-巰基癸烷系列化合物中的一種組成。電極層可以由黃金或白金組成。
本發(fā)明還提供了一種用于定量分析規(guī)定尺寸或大于規(guī)定尺寸材料的生物傳感器的制備方法。此方法包括以下步驟在電極基質(zhì)上形成第一種自裝配單層分子，其中自裝配單層分子有一個與一部分分子的末端相連的功能基團，此功能基團能與巨大分子特異性連接，而巨大分子能決定待檢測材料的尺寸。提供巨大分子，將巨大分子與功能基團連接，用第二種單層分子取代第一種單層分子，取代區(qū)不包括被巨大分子封閉的區(qū)域，其中第二種單層分子有電化學絕緣性，然后清除巨大分子。
根據(jù)本發(fā)明，我們可用簡化的工藝來定量分析蛋白，清除與待檢測材料非特異性連接的信號產(chǎn)生材料這一步驟不是必需的。本發(fā)明提供了一種通用的分析儀，此分析儀僅利用分子尺寸特點，因此在被檢材料上沒有限制。本發(fā)明可實現(xiàn)選擇性分析和獨立分析，分析時由其它材料造成的干擾被顯著降低。


下面對附圖的詳細描述將幫助我們進一步理解本發(fā)明的目的和優(yōu)點圖1根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，描述了混合自裝配單層分子的形成步驟；圖2根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，描述了將抗生物素蛋白與脫硫生物素連接來測定暴露傳導(dǎo)區(qū)的面積的步驟；圖3根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，顯示了通過取代自裝配單層分子來形成絕緣層的步驟；圖4根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，描述了運用生物素來清除抗生物素蛋白的步驟；圖5顯示了運用本發(fā)明所述的生物傳感器來定量分析糖化血紅蛋白(HbAlc)的工藝和原理。
本發(fā)明的最佳實施方式參考附圖，下面詳細描述本發(fā)明的實施方案。不同附圖中的相同數(shù)字用來代表類似的或相同的組分。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，圖1描述了混合自裝配單層分子的形成步驟。在本說明書中，自裝配單層分子指“單層SAM”或“SAM單層”。SAM單層由第一個巰基分子1和第二個巰基分子2的雜交分子組成。第一個巰基分子1能共價結(jié)合固定尺寸的蛋白分子，而此蛋白分子能確定暴露的傳導(dǎo)區(qū)的面積。第二個巰基分子2有一個短的碳鏈，能防止蛋白的非特異性吸附，同時還能維持足夠的電化學傳導(dǎo)性。如圖1a所示，制備含有不同化學性質(zhì)的自裝配分子的溶液，將金屬基質(zhì)3(也稱之為“電極層”)浸入溶液。任選地，溶液可以滴在金屬基質(zhì)3上。反應(yīng)一段時間后，如圖1b所示，巰基分子的硫原子會與如金屬基質(zhì)的金原子共價結(jié)合，從而形成混合SAM單分子層5。
盡管很多材料都可以用于制造金屬基質(zhì)3，只要其能夠形成SAM單分子層，但對本發(fā)明的電化學生物傳感界面而言，用黃金或白金更好，因為它們具備良好的電化學性質(zhì)。選用黃金更好一些，因為黃金的成本相對較低，處理過程簡單，對塑料材料有很好的支持性，并且傳導(dǎo)性高。
根據(jù)本發(fā)明，絕大多數(shù)含有巰基(-SH)或二硫鍵(-S-S)的有機化合物都可以用作形成混合SAM的分子。優(yōu)選地，化合物的碳鏈長度要短，這樣能夠進行電化學氧化，從而減少還原反應(yīng)的發(fā)生。例如，具備以上特性的材料包括了3-巰基丙酸、半胱胺、胱胺和類似物，半胱胺或胱胺是尤其優(yōu)選地，它們的碳鏈只有兩個碳原子。
本發(fā)明的特征之一是第一個巰基分子1能特異性的與一個巨大分子共價結(jié)合，此巨大分子有固定的尺寸，并能決定暴露傳導(dǎo)區(qū)的面積。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，第一個巰基分子1可以由第二個巰基分子2人工的共價結(jié)合分子4(在下文中指“功能基團”或“脫硫-生物素”)來生成，而分子4能特異性結(jié)合固定尺寸的巨大分子。優(yōu)選地，將商品化的或預(yù)制成的分子4經(jīng)純化后，與第二個巰基分子2混合以制備如上所述的第一個巰基分子1。巨大分子用于確定暴露傳導(dǎo)區(qū)的面積，且與其特異性鍵合的材料4可選自大量的連接對，只要選取的連接對能夠反向連接。例如，反向連接對包括酶-抗體，抗生物素蛋白-生物素，或類似物。任何能以材料的靜電力或吸引力的方式控制的連接對都可以使用。特定的，其中抗生物素蛋白-生物素有高的鍵能并可以反向連接。因此，抗生物素蛋白-生物素的例子將在下面參照圖2進行闡述。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，圖2顯示了將抗生素蛋白與脫硫生物素連接以測定暴露傳導(dǎo)區(qū)的面積的步驟。如圖2a所示，巨大分子6被導(dǎo)入圖1b中的電極層5，然后將巨大分子6與特殊功能基團4連接，功能基團4存在于SAM單層5的表面。巨大分子6可以溶液的形式導(dǎo)入到并在室溫下保持一段時間，直至連接過程完成。如上所述，酶-抗體，抗生物素蛋白-生物素，或類似物都可作為材料4或6。本實施方案將以抗生物素蛋白-生物素作為連接對來描述，抗生物素蛋白-生物素可以反向連接。
抗生物素蛋白是一種有四個連接位點的蛋白，能以高鍵能與生物素特異性連接。但是，能對反向連接進行控制是本發(fā)明要求的特性之一，當用生物素做特殊功能基團4時，不容易反向控制抗生物素蛋白與生物素的連接。因此，在本實施方案中，鍵能較低的脫硫-生物素是更好的選擇。脫硫-生物素是將生物素脫去一個硫原子得到的，因此它與抗生物素蛋白的特異性連接與生物素的方式是一樣的，但是它連接的鍵能要稍弱于生物素。因此，脫硫-生物素與抗生物素蛋白的特異性連接能通過競爭性反應(yīng)來反向控制，這是利用了生物素和脫硫-生物素的鍵能不同。根據(jù)以上描述的過程，制備了由SAM單層組成的混合界面7和巨大分子，如圖2b所示?；旌辖缑?用下面所述的方式被取代，參見圖3。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，圖3描述了通過取代SAM單層來形成絕緣區(qū)的步驟。絕緣區(qū)9用于絕緣除暴露的傳導(dǎo)區(qū)以外的區(qū)域，暴露的傳導(dǎo)區(qū)用圖2的方式進行了封閉，因此能夠選擇性的檢測信號，這取決于待檢材料的尺寸。圖3所示的過程可以通過取代反應(yīng)的方式來進行。如前所述，取代反應(yīng)可通過滴取代分子溶液的方式進行，并保持一段時間直至反應(yīng)完成。在取代反應(yīng)中，一種新的自裝配分子8取代了混合界面7上除被巨大分子封閉的區(qū)域以外的區(qū)域的分子。完成反應(yīng)后，清除未反應(yīng)的分子和被取代的分子。優(yōu)選地，用做絕緣自裝配分子8的材料為那些有足夠長度碳鏈可以阻止電流的分子。1-巰基癸烷系列化合物是更好的選擇，它有長達十個碳原子的碳鏈。從而，根據(jù)如圖3所示的工藝可以制備得到中間界面10。如圖4，巨大分子6將根據(jù)如下所述從中間界面10中去除。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，圖4描述了應(yīng)用生物素來去除抗生物素蛋白的步驟。圖3所示的中間界面10是完全絕緣的，沒有任何允許電流通過的暴露傳導(dǎo)區(qū)。因此，必須要有暴露傳導(dǎo)區(qū)，以使本發(fā)明能包括一個電化學生物傳感器界面。為了形成暴露傳導(dǎo)區(qū)，可以應(yīng)用競爭性反應(yīng)。即通過脫硫-生物素4與生物素11競爭性結(jié)合抗生物素蛋白6，將抗生物素蛋白6(巨大分子)從中間界面10中分離出來，這樣就可以在抗生物素蛋白6被清除的位置形成暴露傳導(dǎo)區(qū)。
類似的，競爭性反應(yīng)可以通過如下方式來進行將生物素溶液11與中間界面10接觸，反應(yīng)一段時間。因為生物素11與抗生物素蛋白6結(jié)合的鍵能要高于脫硫-生物素4與抗生物素蛋白6結(jié)合的鍵能，所以當生物素溶液11與中間界面10接觸時，抗生物素蛋白6會被從中間界面10中清除。這樣就可以制得如圖4b所示的混合SAM界面12?；旌蟂AM界面12包括了一個暴露傳導(dǎo)區(qū)13，這是本發(fā)明的一個重要特征。暴露傳導(dǎo)區(qū)13的寬度由巨大分子6如抗生物素蛋白來決定，這在本發(fā)明已闡明。
圖5描述了用本發(fā)明所述的生物傳感器來定量分析糖化血紅蛋白(HbAlc)的工藝和原理。為了能應(yīng)用混合SAM界面12來定量分析待測材料，還需要另外兩種材料和界面12配合使用。其中一個是材料15(也稱之為“連接材料”)，它能與待測材料特異性結(jié)合。另一種是材料16(也稱之為“信號或電子傳遞材料”)，它能產(chǎn)生電化學或光信號。為闡述本發(fā)明，下面將描述對HbAlc 17的分析。
已知，HbAlc 17能與硼酸衍生物(可做連接材料15)連接。但是，已知的硼酸衍生物都不能產(chǎn)生本發(fā)明中需要的信號。因此，將一種電子傳遞介質(zhì)16與硼酸衍生物15合成，以制得硼酸化合物14(也稱之為“混合信號介質(zhì)”)，硼酸化合物14能產(chǎn)生本發(fā)明所需要的電化學信號。這個合成工藝為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，這里不作闡述。為能在本發(fā)明中應(yīng)用，混合信號介質(zhì)14需要具備幾個特性。例如，混合信號介質(zhì)14的尺寸必須足夠小，以便能輕松的擴散到暴露傳導(dǎo)區(qū)；要能與待測材料有效結(jié)合；要能充當電化學氧化和還原反應(yīng)的介質(zhì)。
圖5a顯示的是沒有結(jié)合任何待測材料的混合SAM界面12。如上所述，混合信號介質(zhì)14有足夠小的尺寸，能擴散到界面12上的暴露傳導(dǎo)區(qū)13，能夠向電極3如黃金電極導(dǎo)入或?qū)С鲭娮?。因此，當待測材料沒存在于界面12上時，產(chǎn)生的信號強度要高于待測材料存在于界面12上的情況。
圖5b顯示的是待測材料如HbAlc17存在時的混合SAM界面12。在這種情況下，混合信號介質(zhì)14中的連接材料15與HbAlc17相連，混合信號介質(zhì)14就不能像在單分子狀態(tài)下那樣自由的擴散。同時，因為待測材料HbAlc17的尺寸大于暴露傳導(dǎo)區(qū)13，它不能到達電極基質(zhì)3，也就不能在其中傳遞電子。因此，當待測材料存在于界面12上時，產(chǎn)生的信號強度要弱于待測材料沒存在于界面12上的情況。因此，應(yīng)用混合SAM界面12和本發(fā)明所述的分析原理可以實現(xiàn)對待測材料的定量分析。
工業(yè)適用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明，對蛋白的定量分析可用簡化的工藝來進行，清除與待檢測材料非特異性連接的信號產(chǎn)生材料這一步驟不是必需的。本發(fā)明提供了一種通用的分析儀，此分析儀僅利用分子尺寸特點，因此在被檢材料上沒有限制。本發(fā)明可實現(xiàn)選擇性分析和隔離分析，分析時由其他材料造成的干擾被顯著降低。
這些具體的實施方案僅用于闡述本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護范圍由附上的權(quán)利要求書來限定?？梢岳斫獗绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明的范圍和精神的情況下改變或修飾本發(fā)明的實施方案。
權(quán)利要求
1.一種定量分析規(guī)定尺寸或大于規(guī)定尺寸材料的生物傳感器，它包括a)電極層；b)大量的在電極層上形成的第一種單層分子，，其具有小于待分析材料的直徑以及具有電化學傳導(dǎo)性；和c)在除形成第一種單層分子的區(qū)域以外的電極基質(zhì)上形成的第二種單層分子，，其具有電化學絕緣性。
2.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中第一種單層分子形成了一個暴露傳導(dǎo)區(qū)，第二種單層分子形成了一個絕緣區(qū)。
3.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中第一種單層分子有恒定的直徑或面積。
4.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中由第一種單層分子形成的暴露傳導(dǎo)區(qū)有納米級直徑。
5.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其進一步包括一個由兩種材料組成形成的信號介質(zhì)第一種材料能特異性的與待測材料結(jié)合，第二種材料能產(chǎn)生電化學信號；信號介質(zhì)能擴散至由第一種單層分子形成的暴露傳導(dǎo)區(qū)。
6.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中第一種和第二種單層分子包括了自裝配單層分子。
7.如權(quán)利要求6所述的生物傳感器，其中第一種單層分子由包含巰基或二硫鍵的有機化合物組成。
8.如權(quán)利要求6所述的生物傳感器，其中第二種單層分子由包含巰基或二硫鍵的有機化合物組成。
9.如權(quán)利要求7所述的生物傳感器，其中第一種單層分子由能夠形成自裝配單層分子的化合物組成，自裝配單層分子具有能使電化學電流通過的長度。
10.如權(quán)利要求9所述的生物傳感器，其中第一種單層分子由選自3-巰基丙酸、半胱胺和胱胺中的任一種組成。
11.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中第二種單層分子由能夠形成自裝配單層分子的化合物組成，自裝配單層分子具有能使之具備電化學絕緣性的長度。
12.如權(quán)利要求11所述的生物傳感器，其中第二種單層分子由1-巰基癸烷系列化合物形成。
13.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中電極基質(zhì)由黃金或白金形成。
14.一種制備用于定量分析生物材料的生物傳感器的方法，該方法包括步驟a)在電極基質(zhì)上形成具有電化學傳導(dǎo)性的第一種自裝配單層分子，，所述具有功能基團的自裝配單層分子與其自裝配單層分子一部分的末端相連使得功能基團能與巨大分子特異性連接，而巨大分子能通過生物傳感器測定待檢測材料的尺寸；b)提供巨大分子并將巨大分子與功能基團連接；c)用第二種自裝配單層分子部分取代除被巨大分子封閉的區(qū)域之外的第一種自裝配單層分子，第二種自裝配單層分子有電化學絕緣性；以及d)清除巨大分子。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中第一種自裝配單層分子由包含巰基或二硫鍵的有機化合物形成，且功能基團共價結(jié)合部分第一種自裝配單層分子的末端。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中第一種自裝配單層分子由一種能夠形成自裝配單層分子的化合物形成，自裝配單層分子具有能使電化學電流通過的長度。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中巨大分子包括抗生物素蛋白，且功能基團包括脫硫-生物素。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中清除步驟包括將抗生物素蛋白與生物素溶液接觸這一步。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中第二種單層分子由能夠形成自裝配單層分子的化合物組成，自裝配單層分子具有能使之具備電化學絕緣性的長度。
20.如權(quán)利要求14所述的方法，它在取代和清除步驟之間還包括一個清洗步驟。
21.一種定量分析生物材料的生物傳感器，它包括a)電極基質(zhì)；b)大量的在電極基質(zhì)上形成的暴露傳導(dǎo)區(qū)，其直徑要小于待分析的材料的直徑；c)在電極基質(zhì)的除形成暴露傳導(dǎo)區(qū)以外的區(qū)域上形成的絕緣區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量分析生物材料的生物傳感器及其制備方法。該生物傳感器有一個納米級的暴露傳導(dǎo)區(qū)，此暴露傳導(dǎo)區(qū)以期望的或隨機的方式分布在絕緣金屬基質(zhì)上。本發(fā)明中，對蛋白的定量分析可用簡化的工藝來進行，清除與待檢測材料非特異性連接的信號產(chǎn)生材料這一步驟不是必需的。本發(fā)明所述的分析儀僅利用分子尺寸特點，因此可在分析生物材料中得到廣泛應(yīng)用。本發(fā)明可實現(xiàn)選擇性分析和獨立分析，分析時由其它材料造成的干擾被顯著降低。
文檔編號G01N27/26GK1791794SQ200480013975
公開日2006年6月21日 申請日期2004年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月23日
發(fā)明者張帝榮, 姜丞柱 申請人:奧麥迪可斯株式會社