專利名稱：混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凝血因子(blood coagulation factors)。
具體而言，本發(fā)明涉及用于測量凝血因子的活化混合物。
背景技術(shù)：
血液凝固的過程與一系列被認(rèn)為是血液凝固蛋白的蛋白質(zhì)相關(guān)，所述蛋白以級聯(lián)方式實(shí)現(xiàn)血塊的形成。血友病是人類以及其它哺乳動(dòng)物的一種疾病，其中編碼凝血因子的基因含有突變，因此該基因所編碼的蛋白質(zhì)不能在級聯(lián)過程中正常行使功能。
A型血友病是血友病中最常見的形式，所述A型血友病是一種由凝血因子VIII活性缺乏引起的X-連鎖隱性出血性疾病?；颊弑憩F(xiàn)出多種表型，如關(guān)節(jié)內(nèi)及肌肉內(nèi)出血，容易淤青以及傷口的長時(shí)間出血。所述疾病是由因子VIII基因的異型(heterogeneous)突變引起的，所述的VIII基因位于Xq28。盡管因子VIII具有突變的異型性，攜帶者檢測以及產(chǎn)前診斷仍然可以通過所選突變(特別是倒位突變)的直接檢測以及連鎖分析的間接檢測來實(shí)施。多種來自人血漿或重組技術(shù)的制劑可以替代因子VIII。盡管在大多數(shù)病例中替代療法是有效的，10％到15％的治療者仍然會出現(xiàn)降低所述療法有效性的中和抗體。A型血友病常規(guī)治療方法的核心是輸注足以恢復(fù)因子VIII的活性到達(dá)治療水平所需的劑量的因子VIII。由于因子VIII的半衰期是8-12個(gè)小時(shí)，在一定環(huán)境中可能需要每天注射兩次。
血友病B是一種遺傳性疾病，其特征為編碼血液凝固蛋白，因子IX(F.IX)的基因發(fā)生突變。在High等人撰寫的下述文章中以綜述形式報(bào)道了F.IX(1995，“Factor IX”InMolecular Basis ofThrombosis and Hemostasis，High and Roberts，eds.，MarcelDekker，Inc.)1936年，Patek和Stetson(J.Clin.Invest.15，531-542)報(bào)道了可以通過替代一種血漿因子來治療血友病。自此之后，需要一種可以支持臨床診斷的所述因子(現(xiàn)被命名為因子VIII)的檢測方法，以用于監(jiān)控治療及用于治療因子VIII制劑的質(zhì)量控制。
以此為目的，發(fā)展了多種體外檢測方法。例如下述文獻(xiàn)中報(bào)道的眾所周知的一階段(one-stage)檢測法Langdell et al.(1953)J.Lab.Clin.Med.41，637-647，Hardisty and Macpherson(1962)Thromb.Diath.Haemorrh 7，215-229.以及Biggs等人報(bào)道的二階段檢測法(Biggs et al.(1955)Br.J.Haematol.1，20-34)。自此以后，盡管發(fā)展了其它類型的檢測方法，比如，呈色檢測方法(Seghatchian and Miller-Anderson，(1978)Med.La b.Sci.35，347-354)或熒光檢測方法(Mitchell et al.(1981)Thromb.Res.21，573-584)，傳統(tǒng)的檢測系統(tǒng)仍然在使用。
一階段檢測法以其快捷性、簡便性以及便于自動(dòng)化的特性在所有用于檢測凝血因子(比如因子VIII)的檢測方法中是最常用的(Barrowcliffe et al.，(1981)Haemostasis 11，96-101)。下述文獻(xiàn)中描述了此檢測方法的原理Over(1984)ScandinavianJournal of Haematology Supplementum No.41，3313-24。該檢測方法建立在如下基礎(chǔ)上，即含有因子VIII的樣品能夠修正缺乏因子VIII的血漿的凝固能力。在添加經(jīng)過稀釋的含有因子VIII的樣品后，凝固時(shí)間縮短了，并且一旦選定稀釋度使得所添加VIII因子的量是限速的，則凝固時(shí)間的縮短和所添加的因子VIII的量成函數(shù)關(guān)系。在高濃度的因子VIII下，其它因子變成限速的，但是在低濃度時(shí)凝固時(shí)間接近最大凝固時(shí)間。然而，在此高低極限之中，當(dāng)劑量反應(yīng)曲線為線性時(shí)凝固時(shí)間通常是有一定范圍的。通過對比未知樣品與具有已知活性樣品(即標(biāo)準(zhǔn)品)的劑量反應(yīng)曲線，可以測定待測樣品中因子VIII的含量。
Over(1984)Scandinavian Journal of HaematologySupplementum No.41，3313-24描述了如下一階段檢測法的步驟完成實(shí)驗(yàn)的步驟包括，用吸液管依次吸入一定體積的缺乏因子VIII的基質(zhì)血漿，稀釋后的待測樣品，磷脂懸浮物以及激活劑(最后兩者可以以混合試劑添加)，然后將混合物在37℃下培養(yǎng)。通過添加鈣離子開始凝固反應(yīng)，并從此時(shí)開始記錄時(shí)間直到反應(yīng)結(jié)束。
為了克服與一階段檢測法可重復(fù)性相關(guān)的問題，現(xiàn)已報(bào)道了該一階段檢測法的多種改進(jìn)方法。Geiger et al.(1955)Proc.V.Congr.Europ.Soc.Haemat.Freiburg i.B.，S.413。Springer，Berlin在該系統(tǒng)中加入了正常的血清。Waller(1959)Scand.J.Clin.Lab.Invest.11，194試圖通過玻璃器皿的細(xì)致標(biāo)準(zhǔn)化以及在再次鈣化之前對血漿混合物進(jìn)行6分鐘的預(yù)培養(yǎng)來改進(jìn)所述的一階段檢測法。Egeberg(1961)Scand.J.Clin.Lab.Invest.13，140發(fā)現(xiàn)除了臨用前對血友病基質(zhì)血漿進(jìn)行有力的攪拌以外，Waller(1959)描述的措施同樣可以提高可重復(fù)性。Hardisty & Macpherson(1962)Thromb.Diath.Haemorrh 7，215-229描述了進(jìn)一步改進(jìn)，其中將血漿和最佳量的高嶺土在再次鈣化前立即培養(yǎng)。
本發(fā)明涉及一階段檢測法的改進(jìn)，所述的改進(jìn)用于測定樣品中凝血因子的量。
發(fā)明概述本發(fā)明部分地建立在如下令人吃驚的發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，即可以使用一種單一的活化混合物代替已有的一階段檢測法(one stage assay)中使用的具體組分。
優(yōu)越地，此處所述的改進(jìn)的一階段檢測法操作起來更快速、更容易并且可能更加容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
第一方面，本發(fā)明涉及一種活化混合物，該活化混合物包括缺乏因子的基質(zhì)血漿(substrate plasma)，激活劑以及磷脂。
第二方面，本發(fā)明涉及制備活化混合物的方法，該方法包括將缺乏因子的基質(zhì)血漿，激活劑以及磷脂混合在一起的步驟。
第三方面，本發(fā)明涉及確定待測樣品中凝血因子的量的檢測方法，該檢測方法包括將活化混合物添加到該待測樣品中。
測定凝血因子可以用于多種用途-比如用于血友病的診斷或監(jiān)控治療(例如檢測出血過多的特定原因)，攜帶者的檢測，手術(shù)過程中，以及作為治療濃縮物的質(zhì)量控制的一部分。
第四方面，本發(fā)明涉及用于確定待測樣品凝血因子的量的試劑盒，所述的試劑盒中包括第一個(gè)容器，該容器中含有活化混合物。
第五方面，本發(fā)明涉及活化混合物在檢測方法中的應(yīng)用，所述的檢測方法是用于測定樣品中凝血因子的含量。
優(yōu)選地，所述的激活劑為二氧化硅微粒。
優(yōu)選地，所述的磷脂為合成磷脂。
優(yōu)選地，所述的激活劑及磷脂作為單一的試劑提供。更優(yōu)選地，所述的單一試劑為APTT試劑。
優(yōu)選地，所述的缺乏因子的基質(zhì)血漿為化學(xué)去除的或者免疫去除的。
優(yōu)選地，所述的活化混合物在4℃和/或22℃穩(wěn)定至少5個(gè)小時(shí)。
優(yōu)選地，所述的激活劑及所述的磷脂作為單一的試劑提供。更優(yōu)選地，所述的單一試劑為APTT試劑。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明第三方面的檢測方法包括步驟(a)提供待測樣品；(b)提供根據(jù)權(quán)利要求1到7的任一權(quán)利要求的活化混合物；(c)將所述的待測樣品及所述的活化混合物添加在一起；(d)添加鈣試劑；(e)測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)；以及(f)確定待測樣品中凝血因子的量。
優(yōu)選地，在步驟(a)，(b)和(d)中描述的每一種檢測組分為預(yù)熱的。更優(yōu)選地，在步驟(a)，(b)和(d)中描述的每一種檢測組分預(yù)熱至大約37℃。
優(yōu)選地，使用凝固儀(coagulometer)測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
優(yōu)選地，使用現(xiàn)場實(shí)時(shí)設(shè)備(point of care device)和/或病人身邊護(hù)理設(shè)備(near patient care device)測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
優(yōu)選地，所述的試劑盒包括附加的容器，該容器含有鈣試劑。
優(yōu)選地，所述的試劑盒包括附加的容器，該容器含有一種或多種凝血因子。
優(yōu)選地，所述的試劑盒包括現(xiàn)場實(shí)時(shí)設(shè)備或病人身邊護(hù)理設(shè)備。
優(yōu)選地，所述的活化混合物為預(yù)熱的。更優(yōu)選地，所述的活化混合物預(yù)熱至大約37℃。
在所附的權(quán)利要求書及下面的描述和討論中提出本發(fā)明其它方面的內(nèi)容。這些方面的內(nèi)容在獨(dú)立的節(jié)標(biāo)題下提出。然而，可以理解，每一節(jié)標(biāo)題中的教導(dǎo)并不僅限于其特定的節(jié)標(biāo)題。
優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明具有許多優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)在接下來的描述中將會顯現(xiàn)出來。
通過例子可以說明，本發(fā)明是優(yōu)越的，因?yàn)樗峁┝艘环N比已有方法操作起來更快速的測定樣品中凝血因子含量的檢測方法。
通過另一個(gè)例子可以說明，本發(fā)明是優(yōu)越的，因?yàn)樗峁┝艘环N比已有方法包含更少步驟的檢測方法，因此所述的檢測方法操作起來更簡便。
通過又一個(gè)例子可以說明，本發(fā)明是優(yōu)越的，因?yàn)樗峁┝艘环N可能更易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的檢測方法。
通過又一個(gè)例子可以說明，本發(fā)明是優(yōu)越的，因?yàn)樵谒龅臋z測方法中使用的試劑可以特定制作，特定制作的目的是用來評估感興趣的凝血因子。
附圖的說明

圖1概述了已有的一階段檢測法以及根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的一階段檢測法。
圖2用于說明所述的活化混合物在4℃5小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性的曲線圖。
圖3用來說明所述的活化混合物在22℃5小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性的曲線圖。
圖4用來說明添加到缺乏FVIII的血漿中的FVIII的劑量反應(yīng)的曲線圖。該曲線圖示出了凝固時(shí)間(秒)(縱軸)以及加入到(spiked)VIII缺乏血漿中的FVIII的濃度(橫軸)。
發(fā)明詳述活化混合物如此處所述，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)可以使用一種活化混合物代替已有的一階段檢測法中使用的具體組分(即缺乏因子的基質(zhì)血漿(factor-deficient substrate plasma)，激活劑，磷脂或者缺乏因子的基質(zhì)血漿與激活劑/磷脂)。
本發(fā)明上下文中用到的“活化混合物(activation mixture)”指的是與待測樣品接觸前混合在一起的缺乏因子的基質(zhì)血漿、激活劑以及磷脂。因此，在其用于含有待測樣品的反應(yīng)之前(比如某種凝血因子檢測方法中)，該活化混合物被制備好。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種活化混合物，該活化混合物包括缺乏因子的基質(zhì)血漿，激活劑及磷脂。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種活化混合物，該活化混合物包括缺乏因子的基質(zhì)血漿、激活劑及磷脂或者基本上由缺乏因子的基質(zhì)血漿、激活劑及磷脂組成。
代表性地，所述活化混合物的制備方法，包括將基本上相等體積的缺乏因子的基質(zhì)血漿，激活劑，和磷脂混合到一起后形成單一的試劑。
優(yōu)選地，所述的活化混合物在用于本發(fā)明的檢測方法之前被預(yù)熱。更優(yōu)選地，該活化混合物預(yù)熱至大約37℃。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的活化混合物在用于本發(fā)明的檢測方法之前在約37℃下預(yù)培養(yǎng)10分鐘。
兩種組分可以作為單一的試劑提供，該單一的試劑添加到第三種組分中后形成所述的活化混合物。
優(yōu)選地，激活劑和磷脂作為單一的試劑提供，接著該單一的試劑與基本上相同體積的缺乏因子的基質(zhì)血漿相混合。
商業(yè)上可獲得的激活劑與磷脂的混合物通常指的是APTT試劑，下述文獻(xiàn)中詳盡地描述了所述的APTT試劑Poller and Thomson(1972)J.Clin，Pathol.25，1038-1044例如，APTT試劑可以從多種商業(yè)來源中獲得，包括但又不僅限于，bioMérieux，法國；Sigma Diagnostics，美國；Helena HaemostasisSystems Ltd，英國；Instrumentation Laboratory，美國。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的APTT試劑是InstrumentationLaboratory APTT-SP(液態(tài))(Catalogue number 20006300)，該APTT試劑包括二氧化硅激活劑和磷脂混合物。
優(yōu)選地，所述的活化混合物在4℃和/或22℃下至少穩(wěn)定存在5個(gè)小時(shí)。
優(yōu)越地，所述的穩(wěn)定性同樣可以在檢測方法中避免時(shí)間漂移(temporal drift)。
凝血因子如此處所用到的，術(shù)語“凝血因子(blood coagulation factor)”指的是任意一種血液凝結(jié)/血液凝固因子，所述的血液凝結(jié)/血液凝固因子涉及或者與防止損傷或損害位點(diǎn)處(例如，傷口處)的血液流失相關(guān)。
血液凝固涉及到一種半固態(tài)塊狀物質(zhì)的形成，即血凝塊，該血凝塊可以堵塞傷口。所述的血凝塊由血小板聚集物及網(wǎng)狀纖維蛋白分子組成，該網(wǎng)狀纖維蛋白分子包括許多血漿蛋白，至少一種組織蛋白，磷脂膜表面，鈣離子以及血小板。在一些綜述性的文章中詳細(xì)地描述了血液凝固的機(jī)制以及其中涉及到的組分，所述的綜述性文章包括Cell 53(1988)505-518；Biochem.30(1991)10363-10379；Methodsof Enzymatic Analysis，Vol.V，chapter 3，3rd ed.，AcademicPress，New York(1983)。
血液凝固過程中涉及到的蛋白通常被稱為是因子。
凝血因子包括因子II，因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XI，因子XII及因子XIII。以因子的數(shù)字編號述及該因子可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員標(biāo)識相應(yīng)的蛋白。
優(yōu)選地，本發(fā)明上下文中的凝血因子指的是因子VIII，因子IX，或因子XI中的任意一種。最優(yōu)選地，所述的凝血因子為因子VIII。
因此，在本發(fā)明的很優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的凝血因子為因子VIII。
缺乏因子的基質(zhì)血漿本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，所使用的缺乏因子的基質(zhì)血漿所缺乏的因子和正在被檢測的凝血因子相同。因此，例如，如果被檢測的凝血因子是因子VIII，因子IX或因子XI，相應(yīng)地，應(yīng)分別使用缺乏因子VIII的基質(zhì)血漿，缺乏因子IX的基質(zhì)血漿，或缺乏因子XI的基質(zhì)血漿。
本發(fā)明所述的檢測方法中用到的缺乏因子的基質(zhì)血漿可以從多處機(jī)構(gòu)中獲得。
在制備所述的血漿時(shí)可以包括如下措施當(dāng)使用冰凍干燥時(shí)，使其成為無細(xì)胞狀態(tài)(兩次離心)的措施，用于快速冷凍該血漿以及用緩沖溶液穩(wěn)定該血漿的措施(Godfrey et al.(1975)Thromb.Diath.Haemorrh.34，879-882)。
所述的基質(zhì)血漿可以從嚴(yán)重血友病患者中獲得-比如A型血友病患者。然而，由于嚴(yán)重血友病患者的預(yù)防性治療變得更強(qiáng)(intense)，因此獲得不包含凝血因子的血漿就變得更加困難。此外，HCV感染率同樣也會產(chǎn)生問題。
基質(zhì)血漿的一個(gè)可供選擇的來源是從商業(yè)機(jī)構(gòu)中購買，比如如下文獻(xiàn)中描述的機(jī)構(gòu)Barrowcliffe et al.(1981)Haemostasis 11，96-101。
另外一個(gè)可能是使用人工缺乏凝血因子的血漿，所述的人工缺乏凝血因子的血漿可以通過將正常血漿中的凝血因子選擇性的去除來獲得。這可以通過物理的，化學(xué)的或者免疫學(xué)的處理來完成。
適宜地，基質(zhì)血漿中殘留的凝血因子的凝血活性應(yīng)當(dāng)盡可能的低，通常小于其正常凝血活性的1％。
同樣地，應(yīng)當(dāng)不存在所述的凝血因子的抗體，而保持其它的凝固因子(clotting factor)的濃度足以達(dá)到不限速的目的。在無凝血因子以及高凝血因子濃度時(shí)，相應(yīng)的凝固時(shí)間應(yīng)當(dāng)有很大的差別，并且凝固時(shí)間通常在寬的凝血因子濃度區(qū)間上暗示出較大斜率的線性關(guān)系(適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)換后)。
優(yōu)選地，使用人工缺失凝血因子的血漿-比如人工缺失因子VIII的血漿(Biomerieux/Organon Teknika Corp，USA)。該血漿通過化學(xué)方法去除，并具有正常的vWF水平。
激活劑代表性地，所使用的激活劑為因子XII的激活劑。現(xiàn)已知道的因子VII的激活劑多種多樣，其中包括可溶的以及不可溶的。
因子XII是蛋白酶因子XIIa的循環(huán)前體，所述的蛋白酶因子XIIa能夠激活因子XI。因子XI是因子XIa的循環(huán)前體，其將因子IX轉(zhuǎn)變成因子IXa。因子IXa和因子VIII共同參與激活固有凝固通路中的因子X。
通常地，激活劑普遍具有凈負(fù)電荷，所述的凈負(fù)電荷可以附著在高嶺土，硅藻土，玻璃，鞣花酸以及二氧化硅微粒等表面上，亦或是附著在高分子量組分上(如硫酸葡聚糖(dextransulfate))。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，此處所描述的激活劑并不是唯一的，可以使用其它的激活劑。
代表性地，在所述的一階段檢測法中使用高嶺土，鞣花酸或二氧化硅微粒。當(dāng)使用具有光視(photooptical)凝固檢測裝置的凝固儀記錄凝固時(shí)間時(shí)，鞣花酸及二氧化硅微?？梢宰鳛榧せ顒┯?；在其他的凝固儀中，高嶺土是使用最廣泛的激活劑(Barrowcliffe et al.，1981)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，激活劑為二氧化硅微粒。
激活劑同樣可以包含因子IXa。因子IXa是一種絲氨酸蛋白酶，它在固有凝固通路中激活因子X并將因子IX轉(zhuǎn)變成因子IXa。
應(yīng)當(dāng)選擇適當(dāng)?shù)募せ顒舛?，從而使在選用最佳激活時(shí)間后，凝固時(shí)間盡可能的短。
磷脂通常地，對于體外檢測，磷脂的最好來源為血小板本身，該血小板是以富血小板血漿的形式從嚴(yán)重血友病患者中獲得的(Nilsson etal.(1957)Acta.Med.Scand.159，35-57(1957))。然而，對于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來說這并不是實(shí)用方法，因此不得不使用其它的試劑。
帶負(fù)電荷的磷脂(比如磷脂酰絲氨酸)和不帶電荷的磷脂(比如磷脂酰膽堿)的混合物可以作為合適的試劑(Zwaal & Hemker(1982)Haemostasis 11，12-39)。
如下述文獻(xiàn)中描述的，可以使用不同來源(比如牛，兔子或人腦)的磷脂提取物Bell and Alton(1954)Nature 174，880-881；Hjortet al.(1955)J.Lab.Clin.Med.46，89-97；and Barrowcliffe etal.(1982)Homeostasis 11，96-101)。
磷脂可以是基本上純化的磷脂。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的是合成磷脂，例如，基本上純化的合成磷脂。
優(yōu)越地，使用可使凝固時(shí)間最短的磷脂濃度，以保證在測試系統(tǒng)中磷脂濃度微弱的變化(此變化是由待測樣品中磷脂含量不同引起的)對凝固時(shí)間的影響最小。低于和高于此最佳濃度都會導(dǎo)致凝固時(shí)間變長。
鈣試劑為了起始級聯(lián)凝固反應(yīng)中凝血因子依賴型的部分，必須加入一定量的鈣離子以克服混合物中的檸檬酸鹽(為基質(zhì)血漿的抗凝固劑)，并獲得自由鈣的最佳濃度。
可以使用任意化學(xué)來源的鈣陽離子。例如，鈣陽離子(Ca++)源可以為CaCl2，Ca(NO2)2，CaSO4或者可以使用其它的含有無機(jī)陽離子鈣的化合物。
優(yōu)選地，鈣陽離子源為CaCl2。
代表性地，在相當(dāng)于基質(zhì)血漿的體積中使用25到33mM鈣試劑。然而，技術(shù)人員可以通過確立最短凝固時(shí)間來決定鈣試劑的最佳濃度(Lenahan & Philips(1966)Clin.Chem.12，269-273)。
優(yōu)選地，所述的鈣試劑在用于根據(jù)本發(fā)明的檢測方法前被預(yù)熱。更優(yōu)選地，所述的鈣試劑預(yù)熱至大約37℃。
檢測方法在另一方面，本發(fā)明涉及一種測定待測樣品中凝血因子量的檢測方法。
根據(jù)本發(fā)明此方面所述的檢測方法包括添加活化混合物的步驟，所述的活化混合物包括缺乏因子的基質(zhì)血漿，激活劑和磷脂。
優(yōu)越地，此處所述的檢測方法比已有的方法操作起來更快捷。之所以這樣說有如下兩方面的原因。首先，此處所描述的檢測方法比已有的一階段檢測法少一個(gè)步驟，已有的一階段檢測法需要將缺乏凝血因子的血漿添加到激活劑及磷脂或者它們的混合物中。如此處所描述的，在用于檢測之前，所述的缺乏因子的血漿，激活劑及磷脂是作為單一的混合物提供的。其次，省略了在約37℃培養(yǎng)10分鐘這一步。取而代之的，將活化混合物預(yù)熱至所需的溫度從而使得它可以與其它檢測組分直接混合。
優(yōu)越地，此處所描述的檢測方法比已有的方法操作起來更簡便。這是因?yàn)楸景l(fā)明的檢測方法包含更少的步驟，如上文所述。
優(yōu)越地，此處所描述的檢測方法可能比已有的方法更易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。這是因?yàn)楸景l(fā)明的檢測方法包含更少的步驟以及不需要在約37℃培養(yǎng)10分鐘這一步驟。因此，可以將此處所描述的檢測方法中的組分直接添加到檢測混合物中，并測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的檢測方法包括步驟(a)提供待測樣品；(b)提供根據(jù)本發(fā)明的活化混合物；(c)將所述的待測樣品和所述的活化混合物添加到一起；(d)添加鈣試劑；以及(f)測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
在使用本發(fā)明的檢測方法時(shí)，可以使用不同的蛋白濃度，不同的培養(yǎng)時(shí)間，不同的試劑濃度，以及不同的溫度。特定檢測參數(shù)的選擇受其來源，類型以及待測樣品的尺寸，待測樣品中凝血因子的預(yù)期水平，以及期望靈敏度的影響?？紤]這些情況后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然可以對檢測參數(shù)進(jìn)行選擇。
用來稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的介質(zhì)通常包含一種緩沖試劑，該緩沖試劑不含鈣離子，比如但又不僅限于，巴比妥，乙酸巴比妥(barbital-acetate)，咪唑或Tris。
將所述的緩沖試劑調(diào)至生理pH值，并補(bǔ)充鹽水用以提供生理離子強(qiáng)度。
如果用于檢測的材料中蛋白濃度有差別的話(比如針對血漿的濃縮物)，可能需要在緩沖液中添加額外的蛋白以掩蔽上述差別?；蛘?，可以在缺乏凝血因子的血漿中預(yù)先對濃縮物進(jìn)行首次稀釋(預(yù)稀釋)來模擬正常的血漿樣品。
對于凝血因子的激活以及凝固步驟，均普遍采用約37℃的反應(yīng)溫度。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，所述的溫度可以不同于37℃，因?yàn)樵诘陀?7℃的溫度下，例如，30，31，32，33，34，35，或36℃，或在稍微高于37℃的溫度下，例如，38，39或40℃，凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)可能會受到影響。所述的影響可能導(dǎo)致凝固時(shí)間變長或縮短。
然而，不管反應(yīng)溫度是高于37℃還是低于37℃，都希望在檢測全過程中保持恒定的溫度。這是因?yàn)闄z測過程中溫度的微小變化可能會影響到凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
在本發(fā)明的檢測方法中常用到多種設(shè)備(比如試管和反應(yīng)試管)。
這種設(shè)備可以由塑料或者玻璃制成。所述設(shè)備的組成幾乎沒有影響，這是因?yàn)樵摍z測系統(tǒng)的接觸活性通過添加活化混合物來標(biāo)準(zhǔn)化。
優(yōu)選地，為了用于機(jī)器(比如半自動(dòng)或者全自動(dòng)的機(jī)器(例如凝固儀))，該設(shè)備應(yīng)該是光學(xué)規(guī)則的(optically regular)(Zacharski& Resenstein(1978)Am.J.Clin.Pathol.70，280-286)。
在進(jìn)行此處所描述的檢測方法時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，應(yīng)當(dāng)選擇合適的稀釋度以便經(jīng)過適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化后可以得到直線，盡管許多點(diǎn)通常是來自3種不同稀釋度的最小值。通常地，在一定范圍的稀釋度內(nèi)，將劑量(凝血因子濃度)和反應(yīng)(凝固時(shí)間)都轉(zhuǎn)換成對數(shù)，或者只將劑量轉(zhuǎn)換成對數(shù)，都能夠得到一條直線。
通常地，添加試劑的順序并不重要。然而，考慮到穩(wěn)定性的原因，最好不要以凝血因子待測樣品(比如經(jīng)過稀釋的凝血因子待測樣品)開始，而是應(yīng)當(dāng)以活化混合物開始，接著是凝血因子待測樣品，最后將鈣試劑添加到活化混合物/待測樣品中。
待測樣品此處所使用的術(shù)語“待測樣品”有其本身的涵義。
待測樣品可以是任意物理實(shí)體，該樣品中的凝血因子的量是根據(jù)本發(fā)明測定的。
所述的樣品可以是哺乳動(dòng)物或者可以來源于哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，所述的待測樣品是動(dòng)物或人，或者來源于動(dòng)物或人。最優(yōu)選地，所述的待測樣品是人或者來源于人。
所述的樣品可以是或者可以來源于在哺乳動(dòng)物或者非哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中編碼凝血因子的正常的或者修飾后的人類基因的表達(dá)。
所述的樣品可以是或者可以來源于生物材料，包括重組生物材料。
所述的待測樣品可以是或者可以來源于血液或其組分，例如，血漿(比如靜脈血漿或者毛細(xì)血管血漿)。
優(yōu)選地，所述的待測樣品在用于根據(jù)本發(fā)明的檢測方法之前為預(yù)熱的。更優(yōu)選地，該待測樣品預(yù)熱至大約37℃。
可以根據(jù)如下文獻(xiàn)中描述的方法準(zhǔn)備血液Langdell et al.(1953)J.Lab.Clin.Med.41，637-647。簡言之，可以通過靜脈穿刺(比如肘前或頸前靜脈穿刺)獲得血液，并將其立即與抗凝固劑(比如檸檬酸鈉或草酸鈉)相混合。
適當(dāng)?shù)?，血漿樣品在檢測之前應(yīng)置于融化的冰中保存，通常在取出血液樣品后1小時(shí)之內(nèi)。
可以根據(jù)如下文獻(xiàn)中所述的方法準(zhǔn)備靜脈血漿Hardisty andMacpherson(1962)Thromb.Diath.Haemorrh 7，215-229。簡言之，將取自肘前靜脈的9體積的血液添加到1體積3.1％的檸檬酸三鈉中，在大約2000g下離心至少15分鐘以獲得血小板貧乏血漿。該血漿可以在-20℃或者更低溫度下保存，并在臨用前解凍。用于檢測的待測血漿和對照血漿用9體積PH7.35的含有0.15％檸檬酸三鈉的巴比妥緩沖等滲鹽水(veronal-buffered isotonic saline)(VBIS)進(jìn)行稀釋。可以在不含檸檬酸鹽的VBIS中進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。
可以根據(jù)如下文獻(xiàn)中的方法準(zhǔn)備毛細(xì)血管血漿Hardisty andMacpherson(1962)Thromb.Diath.Haemorrh 7，215-229。簡言之，將0.2ml自由流動(dòng)毛細(xì)血管血液添加到1.8ml含有0.2％檸檬酸三鈉的VIBS中，獲得全血液的1∶10稀釋液，如下文獻(xiàn)中所述Dormandy andHardisty(1961)J.Clin.Path.14，543，在2000g下離心15分鐘以獲得稀釋的血小板貧乏血漿。可以在VI BS中進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。如果期望獲得低濃度的凝血因子，另取0.2ml毛細(xì)血管血液添加到0.8ml含有0.22％檸檬酸三鈉的VIBS中，得到全血液的1∶5稀釋液。
凝血因子標(biāo)準(zhǔn)品此處所描述的檢測方法的另一個(gè)參數(shù)為凝血因子標(biāo)準(zhǔn)品。通常地，所述的凝血因子標(biāo)準(zhǔn)品在性質(zhì)上應(yīng)當(dāng)與待測樣品相似。這降低了非平行性的風(fēng)險(xiǎn)，消除了存在于稀釋介質(zhì)中的蛋白產(chǎn)生的影響，得到重復(fù)性更強(qiáng)的結(jié)果，該可重復(fù)性結(jié)果具有較小的方差。
如下文獻(xiàn)中描述了一種制備血漿標(biāo)準(zhǔn)品的方法Harper &Chauhan(1981)Am.J.Clin.Pathol.77，614-618。簡言之，將來自于有限數(shù)量(比如四個(gè))供血者的血漿庫等分成小份迅速冷卻，冷凍或者凍干保存。假定此標(biāo)準(zhǔn)品的臨時(shí)效價(jià)(provisionalpotency)為1U/ml(此處的單位定義為1ml標(biāo)準(zhǔn)血漿中凝血因子的量)。相對于此標(biāo)準(zhǔn)品測定新鮮血漿樣品中凝血因子的含量，直至獲得大約30到40個(gè)結(jié)果。因?yàn)檫@些樣品的平均結(jié)果是通過定義得到的1U/ml，所以標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)際效價(jià)可以通過1U/ml除以，所述的血漿的表觀平均值來計(jì)算。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，濃縮劑和血漿中的凝血因子(比如因子VIII)國際標(biāo)準(zhǔn)品的引入目前已經(jīng)取代了上述方法，該國際標(biāo)準(zhǔn)品定義了國際單位(IU)。
世界衛(wèi)生組織(WHO)設(shè)立了凝血因子(比如因子VIII)的國際標(biāo)準(zhǔn)(Bangham et al.(1971)Bull.Wld.Hlth.Org.45，337-351)，自此之后，設(shè)計(jì)了多種國際標(biāo)準(zhǔn)。國際濃縮劑標(biāo)準(zhǔn)品的不同版本由中等，高度和極高純度的來源于血漿的濃縮劑組成?，F(xiàn)在的版本(6thIS)為重組凝血因子。
這些標(biāo)準(zhǔn)品可以從如下機(jī)構(gòu)中獲得National Institute ofBiological Standards and Control，London，Potters Bar，UK。例如，可以使用21stBritish Standard FVIII plasma(NIBSC code00/586)。
測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)可以使用多種方法進(jìn)行凝固檢測。
舉例說明，水浴中的鉤或斜管可用于手工檢測?；蛘撸胱詣?dòng)凝固儀可用于檢測纖維蛋白絲的形成，粘度的增加，纖維蛋白凝塊導(dǎo)致的鋼桿或鋼珠的移位，當(dāng)血塊形成時(shí)反應(yīng)混合物透射光的降低(使用光視(photo-optical)設(shè)備或者其它以透射光束強(qiáng)度變化為基礎(chǔ)的設(shè)備)。
自動(dòng)化的儀器(比如半自動(dòng)或全自動(dòng)凝固儀)同樣可以用于檢測凝固終點(diǎn)(Harms et al.(1978)Am.J.Clin.Pathol.70，560-562)。
通常地，凝固儀提供了更快捷的測試方法。
優(yōu)越地，可以使用病人身邊檢測(near-patient testing)或現(xiàn)場實(shí)時(shí)設(shè)備(point-of-care devices)測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，一旦測定了凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)，可以應(yīng)用多種計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析的方法來測定待測樣品中凝血因子的含量。
優(yōu)選地，使用以回歸分析為基礎(chǔ)的程序化計(jì)算方法，這是因?yàn)檫@種方法可以確定檢測是否有效，并且可以提供更準(zhǔn)確的效價(jià)估值，該效價(jià)估值不存在由于手工主觀繪制劑量反應(yīng)曲線的誤差導(dǎo)致的結(jié)果偏倚。
通常地，當(dāng)劑量反應(yīng)曲線偏離線性或平行性時(shí)，認(rèn)為此檢測是無效的。上述偏離的存在可以通過方差分析的方式來判定。關(guān)于這一點(diǎn)，檢測每一稀釋液的重復(fù)樣本來測定隨機(jī)誤差是必要的，對于每一種制劑來說，應(yīng)測試其至少三種稀釋度。如下文獻(xiàn)中描述了平行線生物分析的計(jì)算機(jī)程序Williams et al.(1975)Brit.J.Haematol.31，13-23；Counts & Hays(1979)Am.J.Clin.Pathol.71，167-171；Kirkwood & Snape(1980)Clin.Lab.Haematol(1980)2，155-167。
試劑盒在另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測待測樣品中凝血因子量的試劑盒，所述的試劑盒包括一容器，該容器中含有活化混合物。
可以包括附加的容器，該容器含有或包括稀釋液。
可以包括附加的容器，該容器含有或包括鈣試劑。
可以包括附加的容器，該容器含有或包括凝血因子(比如凝血因子標(biāo)準(zhǔn)品)。
現(xiàn)場實(shí)時(shí)&病人身邊檢測優(yōu)越地，可以采用現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測設(shè)備測定凝固時(shí)間和/或凝固終點(diǎn)，其中將全血液或血漿添加到該設(shè)備的一個(gè)組件(比如注射器或測試盒)中，該組件中含有此處所描述的改進(jìn)的活化混合物。
現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測(point-of-care testing)與傳統(tǒng)檢測相比具有快速輸出結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，傳統(tǒng)檢測中有一等待期，該等待期可以從幾個(gè)小時(shí)到幾個(gè)星期，在等待期間，待測樣品被傳送到實(shí)驗(yàn)室測試設(shè)備，處理，然后傳輸結(jié)果。
現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測操作起來快速，可在原位進(jìn)行，比如可以在醫(yī)生辦公室，床邊，實(shí)驗(yàn)室(比如醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室)，野外或者其它地點(diǎn)進(jìn)行操作。
一篇關(guān)于止血的現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測的綜述文章發(fā)表在ThrombosisJournal(2003)1，1上。如此處所描述的，現(xiàn)已設(shè)計(jì)了多種用于測定凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)的方法和設(shè)備。此外，其它用于評估血液粘彈性和/或血小板功能的床邊設(shè)備可以迅速獲知關(guān)于纖維蛋白溶解和血小板功能方面的進(jìn)一步的信息。
現(xiàn)有的大多數(shù)設(shè)備可以進(jìn)行多種凝固測定實(shí)驗(yàn)，這取決于選擇哪種注射器或測試管。下面簡述了此類設(shè)備的一些例子。
Hemochron自動(dòng)設(shè)備(International Technidyne Corp，USA-ITC)J(Extra Corpor Technol 1999，31130-134)包括兩種類型的裝置，所述的裝置使用試管或注射器，所述的試管中含有硅藻土或高嶺土，所述的注射器中預(yù)先放置了由硅石，高嶺土和磷脂組成的制品。
自動(dòng)凝固計(jì)時(shí)儀Automated Coagulation Timer II(ACT II)和Hepcon止血管理系統(tǒng)-Hepcon Hemostasis Management System(HMS)(Medtronic Hemotec，USA)使用高嶺土作為激活劑，或者不太常用地，使用硅藻土作為激活劑來測量血液凝結(jié)。
肝素管理測試-Heparin management Test(HMT)與RapidpointCoag machine(Bayer，USA)執(zhí)行操作，采用可任意使用的含有反應(yīng)室的測試卡，所述的反應(yīng)室具有測試特異性試劑(硅藻土和穩(wěn)定劑)和順磁性鐵氧化物顆粒(PIOPs)，該顆粒在振動(dòng)磁場的作用下移動(dòng)。
i-STAT分析儀(Abbott，USA)是為基于全血的測試設(shè)計(jì)的，該分析儀的注射器中預(yù)先放置了硅藻土。
Actalyke Activated Clotting Time(Array Medical Somerville，NJ)測試系統(tǒng)采用電磁凝固檢測，比如Hemochron系列。除了硅藻土之外，此系統(tǒng)執(zhí)行MAX-ACT，所述的MAX-ACT是一種新型的ACT，該ACT使用的試管中含有“雞尾酒”式激活劑(硅藻土，高嶺土和玻璃珠)，以便將所有的因子XII最大限度地轉(zhuǎn)變成XIIa。
現(xiàn)已有多種用于評估血液凝塊形成的自動(dòng)化系統(tǒng)(Blood CoagFibrinol 2001，12327-337；Br J Anaesth 1995，75771-776)。
TEG設(shè)備由臺式裝置和TegR分析軟件組成，所述的臺式裝置包括雙通道凝固分析儀(TegR-Hemoscope，USA)。TEG采用圖形方式表示凝塊的形成與消失。
ROTEG分析(Pentapharm，GMBH)建立在旋轉(zhuǎn)凝血彈性描記法的基礎(chǔ)上，所述的旋轉(zhuǎn)凝血彈性描記法與傳統(tǒng)的TEG分析方法相關(guān)但在某些方面又不同于傳統(tǒng)的TEG分析方法。
Sonoclot分析儀(Sienco Inc，USA)測量血凝塊粘彈性的變化。
血小板功能分析儀-100(PFS-100，DADE Behring，USA)通過測定閉合時(shí)間(CT)來評定全血血小板功能，所述的閉合時(shí)間指的是檸檬酸鹽全血中的血小板用來閉塞合成膜中精確限定的開口所需要的時(shí)間，所述的合成膜包被有膠原質(zhì)和腎上腺素或膠原質(zhì)和腺苷二磷酸。
正如此處所描述的，接下來可以通過血液凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)計(jì)算獲得待測樣品中凝血因子的量。
優(yōu)越地，同樣可以使用病人身邊檢測(near patient testing)來測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
病人身邊檢測設(shè)備的應(yīng)用以綜述形式發(fā)表在下述文獻(xiàn)中BritishJournal of Haematology(2001)113，847-852。
一般而言，病人身邊檢測設(shè)備為小型的便攜式裝置，在將例如全血(比如檸檬酸鹽血液或血漿)添加到反應(yīng)室之后，它可以檢測血塊的形成，所述的反應(yīng)室置于小的注射器中，該注射器中摻入含有或者不含有氯化鈣的試劑(比如凍干試劑)。
在本發(fā)明的上下文中，上述注射器中可能含有改進(jìn)的活化混合物。
在一類病人身邊檢測設(shè)備中，待測樣品添加到注射器的反應(yīng)區(qū)，通常預(yù)熱至37℃，通過重新組成試劑使反應(yīng)開始。記錄從反應(yīng)開始消逝的時(shí)間，并由上述設(shè)備顯示為凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
在其它類型的病人身邊檢測設(shè)備中，將順磁性鐵氧化物顆粒和試劑在反應(yīng)室內(nèi)相混合。添加血液開始反應(yīng)，順磁性顆粒在反應(yīng)室中隨電磁體的開關(guān)自由移動(dòng)。當(dāng)血塊形成時(shí)，停止移動(dòng)，上述設(shè)備記錄此時(shí)為凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
正如此處所描述的，可以通過血液凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)計(jì)算獲得待測樣品中凝血因子的量。
其它設(shè)備包括，但又不僅限于Coagucheck(RocheDiagnostics)；Protime Microcoagulation System(International Technidyne Corp)。如下網(wǎng)站中描述了其它設(shè)備www.pointofcare.net/vendors/index.htm。
本發(fā)明在實(shí)施例中被進(jìn)一步說明，實(shí)施例的目的是輔助本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來完成本發(fā)明，而不是有意限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1已有的及改進(jìn)的一階段凝固檢測方法的對比采用低FVIIIC(大約為正常的25％)的待測血漿樣品進(jìn)行已有的及改進(jìn)的檢測方法的直接對比(圖1)。該待測樣品的FVIIIC是相對于21 st British Standard FVIII plasma計(jì)算的。
材料和方法檢測樣品參考標(biāo)準(zhǔn)品21 st British Standard FVIII plasma(NIBSC code00/586)，其中分配值為每毫升0.55IU。
待測樣品用缺乏FVIII的血漿稀釋正常人血漿，得到FVIIIC含量約為每毫升0.25IU。作為等分試樣冷凍保存。
儀器KC-4凝固儀(Amelung)。
方法采用各自的方法執(zhí)行兩組獨(dú)立的檢測，所述的方法依照于平衡設(shè)計(jì)(12處檢測)標(biāo)準(zhǔn)品/待測樣品，其中每一組測試中對標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的三種不同稀釋度重復(fù)進(jìn)行檢測。(標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度為1/10，1/30，1/100，待測樣品稀釋度為1/3，1/10，1/30)i.已有的方法(KC-4凝固儀)缺乏FVIII的血漿(Organon Teknika/Biomerieux) 0.1ml+標(biāo)準(zhǔn)品/待測樣品稀釋液0.1ml+APTT試劑(Instrumentation Laboratory APTT-SP liquid)0.1ml37℃培養(yǎng)10分鐘CaCl225mmol/L 0.1ml測量凝固時(shí)間ii.改進(jìn)方法(根據(jù)本發(fā)明)標(biāo)準(zhǔn)品/待測樣品稀釋液0.1ml(37℃)+預(yù)培養(yǎng)缺乏FVIII的血漿/APTT試劑* 0.2ml(37℃)+CaCl225mmol/L 0.1ml(37℃)測量凝固時(shí)間*-將1體積的缺乏FVIII的血漿(OrganonTeknika/Biomerieux)與1體積的APTT試劑(IL APTT-SP liquid)在37℃下共同培養(yǎng)10分鐘。
分析注意事項(xiàng)根據(jù)平行線生物分析原理來分析相對效價(jià)(potency)估計(jì)量，如下述文獻(xiàn)描述的，所述的平行線生物分析原理將劑量對數(shù)與反應(yīng)對數(shù)聯(lián)系起來關(guān)系A(chǔ).D.Curtis“The Statistical Evaluation of FactorVIII Clotting Assays”.Scand.J.Haematol.supplement(1984)41，33 p55-68。此分析方法建立在標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的劑量反應(yīng)關(guān)系的平行性的基礎(chǔ)上。此標(biāo)準(zhǔn)適用于所有的檢測

結(jié)果i.已有方法a)凝固時(shí)間(秒)

b)相對效價(jià)估計(jì)量(IU每毫升)

ii.改進(jìn)方法a)凝固時(shí)間(秒)

b)相對效價(jià)估計(jì)量(IU每毫升)

結(jié)論采用改進(jìn)方法得到的效價(jià)估計(jì)量與采用已有方法得到的效價(jià)估計(jì)量并沒有顯著差別。
實(shí)施例2活化混合物的穩(wěn)定性將Instrumentation Laboratory的APTT試劑(APTT-SP)(硅石激活劑+磷脂混合物)與相等體積的缺乏因子VIII的血漿(OrganonTeknica)混合并在37℃下培養(yǎng)10分鐘。接著將混合物在4℃或22℃下保存。
將0.2ml預(yù)激活的試劑混合物(預(yù)熱至37℃)與0.2ml因子VIII/氯化鈣的混合物(預(yù)熱至37℃)相混合后測定凝固時(shí)間。每30分鐘使用新鮮的因子VIII待測樣品的等分樣品來進(jìn)行測試(避免因子VIII的不穩(wěn)定性的影響)。
圖1和圖2示出了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
因此，上述結(jié)果表明活化混合物在4℃和22℃時(shí)至少穩(wěn)定存在5個(gè)小時(shí)。
實(shí)施例3改進(jìn)方法的靈敏度將加入不同濃度的純化的FVIII(1體積)的缺乏因子VIII的血漿與預(yù)激活的試劑(2體積)及氯化鈣(25mnol/L)(1體積)相混合后測定凝固時(shí)間，所述的預(yù)激活的試劑采用實(shí)施例2中的方法制備。
所有試劑預(yù)熱至37℃。
圖4示出了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
該圖示出了凝固時(shí)間(秒)(縱軸)和加入到缺乏因子VIII的血漿中的FVIII的濃度(橫軸)。
上述結(jié)果說明此處所描述的改進(jìn)方法適用于NPT/POC設(shè)備。
上述說明書中提到的所有文獻(xiàn)在此處引入作為參考。很顯然地，在不偏離本發(fā)明的范圍和主旨的前提下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)進(jìn)行多種改進(jìn)和變更。盡管本發(fā)明結(jié)合特定的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行了描述，可以理解，要求專利保護(hù)的本發(fā)明并不僅限于那些特定的實(shí)施例。實(shí)際上，對于生物領(lǐng)域或其它相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的用于執(zhí)行本發(fā)明的所述模式的各種改變均包括在如下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.活化混合物，包括缺乏因子的基質(zhì)血漿，激活劑和磷脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的活化混合物，其中所述的激活劑為二氧化硅微粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的活化混合物，其中所述的磷脂為合成磷脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求的活化混合物，其中所述的激活劑和磷脂是作為單一的試劑提供的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的活化混合物，其中所述的單一試劑為APTT試劑。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求的活化混合物，其中所述的缺乏因子的基質(zhì)血漿為化學(xué)去除或免疫去除的。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求的活化混合物，其中所述的活化混合物在4℃和/或22℃下至少穩(wěn)定存在5個(gè)小時(shí)。
8.權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求的活化混合物的制備方法，包括將缺乏因子的基質(zhì)血漿，激活劑和磷脂混合在一起的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的激活劑和磷脂是作為單一試劑提供的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的單一試劑為APTT試劑。
11.用于確定待測樣品中凝血因子的量的檢測方法，包括將權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)的活化混合物添加到所述待測樣品中的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的檢測方法，包括如下步驟(a)提供待測樣品；(b)提供根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求的活化混合物；(c)將上述待測樣品和活化混合物添加到一起；(d)添加鈣試劑；(e)測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)；以及(f)確定待測樣品中凝血因子的量。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的檢測方法，其中步驟(a)，(b)和(d)中提到的每一種檢測組分為預(yù)熱的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的檢測方法，其中步驟(a)，(b)和(d)中提到的每一種檢測組分預(yù)熱至大約37℃。
15.根據(jù)權(quán)利要求11到14中任一權(quán)利要求的檢測方法，其中采用凝固儀測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
16.根據(jù)權(quán)利要求11到14中任一權(quán)利要求的檢測方法，其中采用現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測設(shè)備和/或病人身邊護(hù)理設(shè)備測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
17.用于確定待測樣品中凝血因子的量的試劑盒，包括第一個(gè)容器，該容器中含有根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求的活化混合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述的試劑盒包括附加的容器，該容器中含有鈣試劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的試劑盒，其中所述的試劑盒包括附加的容器，該容器中含有凝血因子。
20.根據(jù)權(quán)利要求17到19中任一權(quán)利要求的試劑盒，其中所述的試劑盒包括現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測設(shè)備或病人身邊護(hù)理設(shè)備，所述的設(shè)備用來測量凝固時(shí)間/凝固終點(diǎn)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求的活化混合物在用于確定樣品中凝血因子的量的檢測方法中的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中所述的活化混合物為預(yù)熱的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其中所述的活化混合物預(yù)熱至大約37℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及活化混合物，該活化混合物包括缺乏因子的基質(zhì)血漿，激活劑和磷脂。本發(fā)明還涉及制備活化混合物的方法及其用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及確定待測樣品中凝血因子的量的檢測方法以及用于執(zhí)行此處所描述的檢測方法的試劑盒。
文檔編號G01N33/86GK1806176SQ200480016814
公開日2006年7月19日 申請日期2004年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者A·哈伯德 申請人:國家生物標(biāo)準(zhǔn)及控制研究所