專利名稱：人類肥大細胞表達的膜蛋白的制作方法
技術領域：
無
背景技術：
已報導過多種接收細胞外核苷酸的嘌呤型受體。這些P2嘌呤型受體是一類主要由ATP、ADP、UTP和UDP激活的G蛋白偶聯受體。P2受體可分為兩類P2X受體(離子通道)及P2Y受體(G-蛋白偶聯受體)。在P2Y家族內，已經鑒別了五種功能性人類受體(P2Y1、2、4、6和8)。此外，基于特異性藥理學已假定多種非克隆嘌呤型受體，其中最熟知的為在人類血小板中所發(fā)現的P2T受體(通常歸類為P2Y家族)?；诘鞍踪|同源同樣已假定類嘌呤型孤兒受體(P2Y5、9和10)，但是到目前為止這些受體仍然對廣泛范圍的嘌呤型配體無反應。
P2Y受體為大小范圍在328至379個氨基酸之間并且糖基化作用后分子量介于41與53KD之間的7-膜-跨度蛋白質。氨基端朝向細胞外部環(huán)境而羧基端位于質膜的細胞質面上。
已知嘌呤型受體與神經遞送、ADP誘導血小板形變與聚集、肺黏膜纖毛清除和平滑肌松弛有關。同樣已認為嘌呤型受體在心臟血管系統(tǒng)、胃-腸(GI)道、免疫系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)中具有作用。
哮喘是一種特征為氣管發(fā)炎、過度反應和變形的疾病。用于治療哮喘的主要治療藥物為p2-激動劑(使氣管狹窄所引起的癥狀減輕)和皮質類固醇(旨在縮減肺中的發(fā)炎過程和改善或減少肺功能的進一步惡化)。盡管有這些和其它形式的治療，但是哮喘發(fā)病率仍伴隨著其在世界范圍的流行而上升。
人類肥大細胞通過釋放細胞因子、趨化因子、蛋白酶和小分子介質在哮喘、過敏和炎性疾病的發(fā)展中起重要作用(Nechushtan，H.和Razin，E.1996Critical Review Oncology/Hematology 23131-150；Bradding，P.和Halgate，S.1999 Critical Review Oncology/Hematology 31119-133；Wedemeyer等人，2000 Cur.Opinion In Immunol.12624-631；Hart，PH，2000 Immunol.CellBiol.79149-153；Lee，DM等人，2002 Science 2971689；Boyce，J.2003 J.Allergy Clin.Immunol.，，11124-32)。例如，在哮喘患者中，癥狀的惡化伴隨著來自肥大細胞中的細胞因子與趨化因子的基因活化、從頭合成和釋放，其導致過度的支氣管收縮，引起人類氣管平滑肌細胞增殖，并且募集和激活炎性細胞。此外，與位于非哮喘患者氣管平滑肌上的肥大細胞數目相比，存在于氣喘患者氣管平滑肌上的肥大細胞的數目增加。
導致肥大細胞活化與哮喘的刺激(例如過敏原誘導的IgE交聯)與細胞內鈣濃度的增加和鈣介導的信號通路有關，其增強細胞因子、趨化因子和蛋白酶的表達與從頭合成(Nature 1999，402B24；Immunity 2002，16441)。活化T-細胞核因子(NFAT)與活化蛋白-1(AP-1)是在肥大細胞的信號串聯中起重要作用的轉錄因子(J.Biol.Chem.1995，27016333；Annu.Rev.Immunol.1997，15707；PNAS 2003，1001169)。因此，可使用鈣介導的通路，轉錄因子(NFAT與AP-1)和與哮喘有關的細胞因子、趨化因子和蛋白酶基因的活化作為在肥大細胞中鑒別治療靶點的一個代替物。

發(fā)明內容
本發(fā)明是關于一種篩選一種調節(jié)GPR91受體活性化合物的方法，其包含(a)制備包含一個編碼SEQ ID NO 2氨基酸序列的核酸序列的一轉染細胞；(b)使這(些)轉染細胞與至少一種其調節(jié)GPR91受體活性的能力待設法測定的化合物接觸；和(c)監(jiān)測所述細胞受體活性的改變。
可穩(wěn)定或瞬時轉染細胞。所述細胞可為肥大細胞、從GPR91-基因剔除小鼠(GPR917GPR91″)中分離的基因剔除細胞、CHO、COS-7，293細胞、HELA或由肥大細胞或白血病肥大細胞建立的細胞系。
可通過測量細胞內鈣流動、測量報告基因(如NFAT-Luc報告質粒)的表達水平、測量細胞因子表達水平和其它常用的測量受體活性或抑制作用的方法來監(jiān)測GPR91活性的調節(jié)。報告基因可操作性地連接于GPR91應答轉錄元件，例如NFAT(活化T-細胞核因子)結合基序元件。
本發(fā)明也包括一種篩選GPR91活性激動劑和拮抗劑的方法，其包含(a)使表達GPR91受體的細胞與候選化合物接觸，(b)分析細胞反應并c)將所述細胞反應與在沒有候選化合物存在下完成的標準細胞反應進行比較；借此，細胞反應較標準有所增加表明所述化合物為激動劑而細胞反應較標準有所降低表明所述化合物為拮抗劑。
本發(fā)明是關于激動劑和拮抗劑，包括那些在治療免疫疾病中提供治療利益的激動劑和拮抗劑，所述疾病包括過敏性疾病(例如哮喘)以及炎癥性疾病。在一個實施例中，拮抗劑為可溶形式的GPR91受體及源于GPR91受體的細胞外結構域能夠結合GPR91受體的可溶性多肽。拮抗劑可為選自SEQID NO2的細胞外結構域的肽或其拮抗劑片段。這些肽通過結合GPR91的自然配體并阻止配體結合天然受體來阻斷所述配體與GPR91的結合。
本發(fā)明包括特異性結合GPR91的抗體，其包括激動劑抗體、拮抗劑抗體、具有Fc介導的細胞毒性(如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC))的抗體、抗體結合體和阻斷與GPR91結合的抗體。這些抗體可為中和性、激動劑、拮抗劑或結合于GPR91而用于供診斷之目的。這些抗體可為多克隆的或單克隆的和其功能性結合片段。單克隆抗體可為人源化的、人的、嵌合的、雙特異性的或結合的。本發(fā)明同樣包括單鏈抗體。結合體可包括霉素或凋亡誘導部分，例如選自Bax-α、Bak、Bcl-Xs、Bad、Bid、Bik、Erk和Bok的Bcl-2家族的促進凋亡成員?？贵w結合體可用于消耗肥大細胞或誘導肥大細胞凋亡。
本發(fā)明包括用于診斷與/或治療的這些抗-GPR91抗體的組合物。組合物包括與適當的載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑與/或添加劑結合的抗體。
本發(fā)明另一方面是關于結合(例如配體)并/或調整GPR91蛋白質生物活性的有關鑒別試劑的篩選方法。因為GPR91蛋白質在肥大細胞中表達，所以這些試劑可與調節(jié)肥大細胞或其它免疫細胞的成熟、遷移、活化或與其它細胞通訊有關。因此，結合并調整GPR91蛋白質生物活性的試劑可有效于減輕哮喘和其它過敏性疾病、白血病的某些癥狀或減輕發(fā)炎。
本發(fā)明也包括通過使用抗-GPR91抗體對肥大細胞介導的疾病及病癥進行診斷的方法。GPR91對肥大細胞為高度特異性的，因此可用針對GPR91的抗體在既定的樣品(如組織活體切片)中檢測肥大細胞的存在和頻率。在肺部平滑肌組織中的肥大細胞水平增加的患者中，樣品中GPR91的相對增加可預示(例如)哮喘?？?GPR91抗體也可用于檢測表達GPR91的細胞的存在或增加/減少。
具體實施例方式
術語“純多肽”意思是從至少一種在其天然環(huán)境中通常與純多肽有關的雜質多肽中鑒別并分離出來的多肽，尤其是從其細胞環(huán)境中分離出的多肽。
術語“經分離的多核苷酸”意思是從至少一種在其天然環(huán)境中通常與經分離的多核苷酸有關的雜質多核苷酸中鑒別并分離出來的多核苷酸，尤其是從其細胞環(huán)境中分離的多核苷酸。
用于描述多核苷酸、多肽序列或其它分子時，術語“天然的”意思是在自然中所發(fā)現的多肽、多核苷酸或其它分子，例如存在于諸如病毒或者原核或真核細胞的生物體中的多肽或多核苷酸序列，所述生物體可從自然來源中分離并未經有意修飾而改變其結構、性能或功能。具有SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列的未經分離的細胞多核苷酸是天然多核苷酸，且具有SEQID NO2中所示的氨基酸序列的未經純化的細胞多肽是天然多肽。
術語“序列同一率”意思是在兩個或兩個以上的核苷酸或氨基酸序列的比較中所發(fā)現的序列相似率?？?例如)通過使用MEGALIGN程序(DNASTAR，Inc.，Madison Wisconsin.)用電子儀器測定同一率。MEGALIGN程序根據不同方法(如clustal法)在兩個或兩個以上的序列間建立比對。(參見例如Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73237-244。)。clustal算法通過檢查所有對間的距離將序列歸合成叢集。將叢集成對地對準且然后成群。通過將序列A的長度減去序列A中的空隙殘基的數目，減去序列B中空隙殘基的數目，除以序列A與序列B間匹配殘基的總和，乘以100來計算兩個氨基酸序列(如序列A與序列B)間的相似率。兩個氨基酸序列間低或無相似性的空隙未包括在測定相似率中。通過此項技術中的已知方法計算或算出核苷酸序列間的同一率，例如在Hein，J.(1990)Methods Enzymol.183626-645中所給出的Jotun Hein法。也可通過此項技術中已知的其它方法(如改變雜交條件)來測定序列間的同一性。
用于描述多核苷酸序列時，術語“變異體”意思是與其天然對應物有一個或一個以上的核苷酸不同并且具有與其天然對應物相同或類似生物功能的核苷酸序列。變異體包括與其天然對應物相比較時具有至少85％的序列同一率，或至少90％到95％的序列同一率，或至少99％的序列同一率的核苷酸序列，及在嚴格條件下結合天然序列或其互補序列的核苷酸序列。變異體可包括僅基于遺傳密碼簡并而編碼與其天然對應物相同的氨基酸序列但不同于天然核苷酸序列的核苷酸序列。
用于描述多肽序列時，術語“變異體”意思是與其天然對應物有一個或一個以上的氨基酸不同(包括修飾、替換、插入和缺失)并且具有與其天然對應物相同或相似的生物功能，或者可用于作為免疫原以產生結合其天然對應物的抗體或作為其天然對應物的激動劑或拮抗劑的氨基酸序列。變異體包括與其天然對應物相比具有至少70％的序列同一率，至少85％的序列同一率，并且或至少95％的序列同一率的多肽。變異體包括具有保守性氨基酸替換的多肽。
用于描述多核苷酸時，術語“片段”意思是在嚴格條件下結合其天然對應物或其互補序列的其天然對應物的核苷酸序列子集。優(yōu)選片段具有至少25至50個天然序列的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。最優(yōu)選片段具有至少50至100個天然序列的連續(xù)核苷酸的氨基酸序列。
用于描述多肽時，術語“片段”意思是其天然對應物的氨基酸序列子集，其保留其天然對應物的任何生物活性或充當能夠產生結合其天然對應物的抗體的免疫原。片段包括至少10至20個天然序列的連續(xù)氨基酸或至少20至30個天然序列的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。
術語“激動劑”意思是直接或間接地促進、提高或刺激GPR91受體的正常功能的任何分子。一種類型的激動劑是與GPR91受體以模仿其配體的方式相互作用的分子，所述配體包括(但不限于)抗體或抗體片段。
術語“拮抗劑”意思是阻斷、阻止、抑制或中和GPR91受體的正常功能的任何分子。一種類型的拮抗劑是干擾GPR91受體與其配體間相互作用的分子，所述配體包括(但不限于)抗體或抗體片段。另一種類型的拮抗劑是抑制天然GPR91受體的正常轉錄的反義核苷酸或結合天然轉錄物的siRNA。
術語“保守性氨基酸替換”意思是在多肽中的氨基酸已用具有相似側鏈的氨基酸進行替換。例如，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸具有脂肪族側鏈；絲氨酸和蘇氨酸具有脂肪族-羥基側鏈；天冬酰胺和谷氨酰胺具有含酰胺的側鏈；苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳香族側鏈；賴氨酸、精氨酸和組氨酸具有堿性側鏈；并且半胱氨酸和蛋氨酸具有含硫側鏈。優(yōu)選的保守性氨基酸替換為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯基丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
術語“基因剔除”意思是至少一部分由哺乳動物的單細胞、選定細胞或所有細胞的內源性基因所編碼的多肽(例如GPR91受體)的表達部分或全部降低。哺乳動物可為具有被破壞的內源性基因的一個等位基因的“雜合基因剔除”或具有被破壞的內源性基因的兩個等位基因的“雜合基因剔除”。
本發(fā)明不受本文所述的特定方法、協(xié)議、細胞系、載體和試劑的限制，因為它們可以變化。此外，本文所用的術語僅出于描述特定實施例的目的，而不希望限制本發(fā)明的范疇。除非文中另有明確說明，否則本文和所附的權利要求中所用的單數形式“一”、“一個”和“所述的”包括復數稱謂，例如提到“一個宿主細胞”包括復數個這些宿主細胞。
由于遺傳密碼的簡并，可產生許多編碼本發(fā)明的GPR91多肽的核苷酸序列。對于任何已知的核苷酸序列和自然存在的核苷酸序列，這些序列中的一些將為高度地同源的而一些將為最低限度地同源。本發(fā)明涵蓋不同的基于可能的密碼子選擇通過選擇組合所生成的核苷酸序列。這些組合是根據用于編碼自然存在的GPR91受體的核苷酸序列的標準三體遺傳密碼而生成的，并且認為所有這些變異體是經特別揭示的。
除非另有規(guī)定，否則本文中所用的所有技術及科學術語和任何簡稱皆具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解相同的意義。雖然任何類似于或相當于本文中所描述的那些的方法和材料皆可用在本發(fā)明的實踐中，但是本文描述仍這些方法、裝置和材料。
本文所提到的所有專利和出版物皆在法律所允許的范圍內以引用的方式并入本文，以為描述和揭示蛋白質、酶、載體、宿主細胞和其中所報導的可以本發(fā)明使用的方法的目的。然而，本文中所有內容都不應解釋為承認本發(fā)明無權優(yōu)先于根據先前發(fā)明的此類揭示。
本發(fā)明通過參考下列對本發(fā)明的詳細說明和本文所包括的實例可以更容易地理解本發(fā)明。G蛋白偶聯受體91(GPR91)與P2Y家族中的嘌呤型受體以及半胱氨酰白三烯受體共享顯著的序列同源性。與其它細胞類型相比GPR91在人類初級肥大細胞中的表達不同。GPR91也表達于人類單核細胞中，并且當在源于乳腺瘤(mastoma)組織-人類肥大細胞-1(HMC-1)細胞的人類細胞細中過度表達時激活細胞內鈣流動和鈣調神經磷酸酶介導的信號通路。因此，GPR91可在刺激哺乳動物氣管和/或周圍或結締組織中的肥大細胞活性而引起炎性和過敏性反應中起重要作用。因此，可使用GPR91作為治療肥大細胞介導的疾病的治療靶點，這些疾病例如過敏性和非過敏性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、過敏性鼻炎、過敏癥、過敏性腸胃疾病、特應性皮炎、風濕性關節(jié)炎和其它過敏性、自體免疫性與炎性疾病。用于這種治療的GPR91的活化劑/抑制劑可為抗體、肽配體模仿物、小分子、反義或RANi。
GPR91的鑒別。
通過使用基因微陣列技術比較mRNA在肥大細胞(從臍帶血液CD34+細胞中培養(yǎng)的)、PBMC(外周血單核細胞)與THP-1(急性單核細胞白血??；淋巴細胞)中的表達水平初步鑒別在人類肥大細胞中表達不同的基因。(參見實例)通過使用多種不同細胞類型和人類組織用定量RT-PCR進一步證實GPR91在肥大細胞中的差別表達。
對照公共GenBank數據庫的BLAST序列相似性搜索揭示了GPR91與P2Y嘌呤型受體以及半胱氨酰白三烯受體共享顯著的同源性。GPR91對其G蛋白的偶聯特異性的預測指出其最可能與Gαq/11亞型的相互作用有關。這個預測是基于由受體的細胞內結構域支配受體-G蛋白相互作用的特異性的事實。使用結合模式發(fā)現和膜拓撲結構預測的數據挖掘方法來發(fā)現特異性偶聯特定功能種類的G蛋白的GPCR序列細胞內結構域中的氨基酸殘基的模式。
為鑒別GPR91的功能，我們使用表達野生型(wt)GPR91(pGPR91)或經標記的GPR91(pGPR91-V5和pGPR91-20Flag)的質粒結構進行了瞬時轉染和熒光素酶報告分析。在HMC-1細胞中，wt GPR91將連接NFAT(活化T-細胞核因子)啟動子的熒光素酶報告物激活了約19.8倍，且其同樣將連接AP1-啟動子的熒光素酶報告物激活了約5.3倍。通過向鈣調神經磷酸酶施加特異性抑制劑(環(huán)孢霉素A)進一步證實GPR91對NFAT啟動子的激活，所述鈣調神經磷酸酶調節(jié)鈣流入至NFAT活化的細胞內信號轉導。環(huán)孢霉素A幾乎完全阻斷了GPR91對NFAT活化的刺激效果。這些結果指出GPR91通過熟知的細胞內信號通路激活轉錄因子NFAT，意即GPR91可募集Gαq/11(或類q/11)亞單位，從而激活G蛋白，其又激活磷脂酶Cβ并產生細胞內鈣流動而激活NFAT和AP1。
我們進一步鑒別一組基因，其啟動子由結構上的活性插入突變體(GPR91-20Flag)激活。熒光素酶報告分析顯示GPR91-20Flag提高IL8、IL13、TNF□、類胰蛋白酶□1和類胰蛋白酶□2(實例5)的啟動子活性，它們是從肥大細胞中釋放并與哮喘癥狀、過敏性和炎性疾病的惡化有關的細胞因子、蛋白酶和趨化因子的實例(Annu.Rev.Immunol.1999，17255；Am.J.Rspir.Cell Mol.Biol.1996，15473；J.Immunol.2002，1682603；J.Immunol.2002，1692662；J.Immunol.2000，1657215；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，898542；Eur.Respir.J.2001，3450s)。
因為在已出版的文獻中很好地證明了通過鈣介導的信號通路的細胞內鈣流動為激活肥大細胞脫粒和細胞因子分泌的關鍵條件之一，所以我們的發(fā)現表明GPR91可能在哮喘、過敏癥和其它炎性疾病的發(fā)展中起關鍵作用。因此，可使用GPR91作為一個治療靶點以產生抗體、篩選用于治療哮喘、過敏癥、自體免疫性疾病和其它炎性疾病的小分子與/或RNAi。
多肽在一方面，本發(fā)明提供一種經分離多肽，其具有選自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO2的變異體和SEQ ID NO2片段組成的群組的氨基酸序列。在一實施例中，所述經分離的多肽可用于作為免疫性病癥的預防藥劑，所述免疫性病癥包括關節(jié)炎、哮喘、免疫缺陷疾病，例如AIDS、白血病、風濕性關節(jié)炎、肉芽腫性疾病、炎癥性腸炎、敗血癥、痤瘡、嗜中性粒白細胞減少癥、嗜中性粒白細胞增多癥、銀屑病、超敏反應，例如T-細胞介導的細胞毒性；對移植器官和組織的免疫反應，例如宿主抗移植物與移植物抗宿主疾病，或自體免疫病癥，例如自體免疫不育癥、晶狀體組織損傷、脫髓鞘、系統(tǒng)性狼斑紅瘡、藥物誘導的溶血性貧血、風濕性關節(jié)炎、修格倫氏(Sjogren)病和硬皮病。此外，所述蛋白質可代表分泌因子，其影響其它血液細胞的分化或行為，或將造血細胞募集至損傷位置。因此，這個基因產物可用于各種血統(tǒng)的干細胞與定向祖細胞的擴充，并用于各種細胞類型的分化與/或增殖。
可溶形式的GPR91受體可用于調節(jié)細胞因子產生、抗原遞呈或其它過程(例如)以加快免疫反應等。淋巴起源細胞中的表達指出自然基因產物可能與免疫功能有關。因此其亦可用于作為免疫性病癥的藥劑，所述免疫性病癥包括關節(jié)炎、哮喘、免疫缺陷疾病，例如AIDS、白血病、風濕性關節(jié)炎、肉芽腫性疾病、炎癥性腸炎、敗血癥、痤瘡、嗜中性粒白細胞減少癥、嗜中性粒白細胞增多癥、銀屑病、超敏反應，例如T-細胞介導的細胞毒性；對移植器官和組織的免疫反應，例如宿主抗移植物與移植物抗宿主疾病，或自體免疫病癥，例如自體免疫不育癥、晶狀體組織損傷、脫髓鞘、系統(tǒng)性狼斑紅瘡、藥物誘導的溶血性貧血、風濕性關節(jié)炎、修格倫氏病和硬皮病。
本發(fā)明的多肽(包括激動劑與/或其片段)具有多種用途，包括在各種細胞、組織和器官(優(yōu)選為人類組織)中調節(jié)信號轉導活性。
表達和回收根據本發(fā)明，可通過上文所述的重組表達系統(tǒng)來制造經分離并經純化的GPR91受體。所述方法包含在足夠促進多肽表達的條件下培養(yǎng)用表達載體轉化的宿主細胞，所述表達載體包含編碼所述多肽的核苷酸序列。然后從細胞培養(yǎng)基或細胞抽提物中回收多肽，此取決于所用的表達系統(tǒng)。如技術人員所知，純化重組多肽的程序將根據以下因素而變化，例如所用的宿主細胞類型和重組多肽是否分泌進入培養(yǎng)基中素。當使用分泌重組多肽的表達系統(tǒng)時，可首先濃縮培養(yǎng)基。在濃縮步驟之后，可將濃縮物施加至例如凝膠過濾介質的純化基質中?；蛘呖墒褂藐庪x子交換樹脂，例如具有側位二乙基氨基乙基(DEAE)基團的基質或受質?；|可為丙稀酰胺、瓊脂糖、右旋糖苷、纖維素或其它在蛋白純化中常用的類型。而且，可使用陽離子交換步驟。適宜的陽離子交換包括各種不溶性基質，其中包含磺丙基或羧甲基。此外，可使用一個或一個以上的反相高效液相色譜(RP-HPLC)步驟來進一步純化蛋白，所述步驟采用疏水RP-HPLC介質(例如具有側位甲基或其它脂肪族基團的硅膠)、離子交換HPLC(例如具有側位DEAE或磺丙基(SP)的硅膠)或疏水相互作用HPLC(例如具有側位苯基、丁基或其它疏水基團的硅膠)。各種組合形式的一些或所有前述純化步驟在所屬領域中是熟知的并且可經分離并經純化的重組多肽。
通常通過下列步驟分離以細菌培養(yǎng)產生的重組多肽最初破壞宿主細胞、離心、從細胞沉淀物中提取(若為不溶性多肽)或從上清液中提取(若為可溶性多肽)、接著為一個或一個以上的濃縮、鹽析、離子交換、親和純化或尺寸排除色譜步驟。最后，對于最后的純化步驟可使用RP-HPLC?？赏ㄟ^任何常規(guī)方法破壞微生物細胞，包括凍融循環(huán)、超聲處理、機械破壞或使用細胞溶解試劑。
激動劑和拮抗劑。
本發(fā)明提供直接或間接激活或抑制GPR91表達或作用的激動劑和拮抗劑。激動劑和拮抗劑的類型包括(但不限于)多肽、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、低聚糖、核苷酸、有機分子、生物有機分子、肽模擬物、藥理學試劑與其代謝物以及轉錄和翻譯控制序列。
在一個實施例中，拮抗劑為可溶形式的GPR91受體及源于GPR91受體的的細胞外結構域能夠結合GPR91受體的可溶性多肽。拮抗劑可為選自SEQID NO2的細胞外結構域的肽或其拮抗劑片段。這些肽可通過結合GPR91自然配體并阻止配體結合天然受體來阻斷所述配體與GPR91的結合。
本發(fā)明的激動劑和拮抗劑也可包括特異性結合GPR91并影響生物作用與功能(例如)以激活或抑制細胞因子產生的抗體。抗體可為多克隆的或單克隆的，且可為嵌合的、人類的、人源化的或去免疫化的。
激動劑抗體可用于預防或治療特征為與非疾病狀態(tài)相比細胞因子或受體表達相對低的疾病。拮抗劑受體可用于預防或治療特征為與非疾病狀態(tài)相比細胞因子或受體表達相對高的疾病。
所述激動劑和拮抗劑可用于治療各種免疫性疾病，包括(但不限于)過敏性疾病，例如哮喘、過敏性鼻炎、遺傳過敏性皮炎、食物超敏反應和風疹；移植相關疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主疾病；自體免疫或免疫介導皮膚病，包括大皰性皮膚病、多型性紅斑和接觸性皮炎、銀屑病；風濕性關節(jié)炎、幼年慢性關節(jié)炎；炎癥性腸炎、(意即潰瘍性結腸炎、克羅恩氏(Crohn′s)病)；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；脊柱柱關節(jié)??；系統(tǒng)硬化癥(硬皮病)；特發(fā)性炎癥性肌病(皮肌炎、多發(fā)性肌炎)；修格倫氏綜合癥；系統(tǒng)性血管炎；結節(jié)病；自體免疫性溶血性貧血(免疫性全血細胞減少癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)，自體免疫性血小板減少癥(特發(fā)性血小板減少性紫癜、免疫介導血小板減少癥)；甲狀腺炎(格雷氏(Grave′s)病、橋本氏(Hashimoto′s)甲狀腺炎、幼年淋巴細胞性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)；糖尿??；免疫介導性腎病(血管球性腎炎、腎小管間質性腎炎)；中樞和周圍神經系統(tǒng)的脫髓鞘病，例如多發(fā)性硬化、特發(fā)性脫髓鞘性多發(fā)性神經病或格林-巴利(Guillain-Barre)綜合癥和慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經病；肝膽疾病，例如傳染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎和其他非趨肝性病毒)、自體免疫性慢性活動型肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎和硬化性膽管炎；炎性和纖維化肺病，例如囊腫性纖維化、麩質過敏性腸病和惠普爾氏(Whipple′s)?。环蚊庖咝约膊?，例如嗜酸粒白細胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和過超敏性肺炎。
激動劑和拮抗劑篩選在另一方面，本發(fā)明提供一種識別GPR91受體激動劑和拮抗劑的篩選方法。所述篩選方法包含將GPR91受體暴露于潛在的GPR91激動劑/GPR91拮抗劑并測定潛在的激動劑/拮抗劑是否結合受體。如果潛在的激動劑/拮抗劑結合受體，那么存在可靠的假定，即當所述潛在的激動劑/拮抗劑投予患者體內或暴露于天然GPR91活化受體時其實際上將充當激動劑或拮抗劑。使用這種方法所鑒別的GPR91激動劑和GPR91拮抗劑可通過將能夠產生細胞因子的細胞暴露于激動劑/拮抗劑并對照非暴露的細胞測量細胞因子產量而表征為激動劑和拮抗劑。激動劑會增加細胞因子產量；拮抗劑會降低細胞因子的產量。另一篩選方法包含用含有GPR91 DNA結合序列的報告基因結構轉染細胞。優(yōu)選的為潛在的激動劑/拮抗劑是有機化合物或多肽(包括抗體)。
各種基于細胞的功能性分析利用細胞內鈣濃度的測量值評價正常生理環(huán)境中的蛋白活性。刺激GPR91受體而引起的細胞內鈣濃度大量而快速的增加可由細胞內對鈣敏感性探針來檢測，所述探針包括熒光染料、鈣結合蛋白，例如生物熒光蛋白、水母發(fā)光蛋白和經改造的綠色熒光蛋白-鈣調蛋白嵌合體(Ungrin，M.D.，Singh，L.M.R.，Stocco，R.，Sas，D.E.，Abramovitz，M.(1999)An automated aequorin luminescence-based functional calcium assay forG-protein-coupled receptors.Anal.Biochem.272，34-42；Takahashi，A.，Camacho，P.，Lechleiter，J.D.，和Herman，B.(1999)Measurement ofintracellular calcium.Physiological Reviews 79，1089-1125；Gonzalez，J.E.，Oades，K.，Leychis，Y.Harootunian，A.，和Negulescu，P.(1999)Fluorescentindicators for Ca2+based on green fluorescent proteins and calmodulin.Nature388，882-887；Creton，R.，Kreiling，J.A.，和Jaffe，L.F.(1999)Calcium imagingwith chemiluminescence.Microsc.Res.Tech.46，390-397；Prasher，D.，McCann，R.O.，和Cormier，M.J.(1985)Cloning and expression ofthe cDNA coding foraequorin，A bioluminescent calcium-binding protein.Biochem.Biophys.Res.Commun.126，1259-1268)。
此項技術中的篩選技術人員已經使用一些方法延長可用于測量熒光或發(fā)光信號的時間。例如，一種方法是添加試劑以改變或減緩細胞報告酶反應動力學。這種方法的實例為基于熒光素酶的瞬時發(fā)光至發(fā)熱-發(fā)光形式的轉換，例如PACKARD LUCLITE.RTM熒光素酶報告基因分析試劑盒(參見美國專利第5,618,682號和歐洲專利申請案94 102 080.2)或PROMEGASTEADY-GLO.TM熒光素酶分析系統(tǒng)(參見美國專利第5,283,179號)。這些篩選方法可用于鑒別可能充當預防或治療疾病藥物的化合物，所述疾病尤其是特征為與非疾病狀態(tài)相比細胞因子產生相對低或相對高的疾病。
尤其預期用于檢測本文所述的GPR91的調節(jié)劑的高處理量篩選方法。這些高處理量的篩選方法一般包括提供含有大量潛在的治療性化合物(例如配體或調節(jié)劑化合物)的組合化學藥品或肽庫。然后用一個或一個以上的分析篩選這些組合化學藥品庫或配體庫以鑒別顯示出所要的特征活性的那些庫成員(例如(尤其是)化學物質或子類)。如此鑒別的化合物可用作常規(guī)的先導化合物，或者它們本身可用作潛在的或實際的治療物質。
組合化學藥品庫是各種通過組合多種化學結構單元(意即如氨基酸的試劑)通過化學合成或生物合成所產生的化學化合物的集合。舉例而言，通過以每種可能的方式組合一組化學結構單元達到既定的化合物長度(意即多肽或肽化合物中的氨基酸數目)來形成線性組合庫(例如多肽或肽庫)。通過這樣組合混合化學結構單元可合成數百萬的化學化合物。
組合化學藥品庫的制備和篩選對于相關領域的技術人員是熟知的。組合庫包括(不限于)肽庫(例如美國專利第5,010,175號；Furka，1991，Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493；和Houghton等人，1991，Nature，35484-88)。也可使用其他化學物產生化學多樣性庫?；瘜W多樣性庫化學物的非限制性實例包括肽(PCT公開案第WO 91/019735號)、編碼肽(PCT公開案第WO 93/20242號)、隨機生物低聚物(PCT公開案第WO 92/00091號)、苯并二氮呯(美國專利第5,288,514號)、diversomers，例如乙內酰脲、苯并二氮呯和二肽(Hobbs等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906909-6913)、插烯多肽(Hagihara等人，1992，J.Amer.Chem.Soc，1146568)、具有葡萄糖支架的非肽肽模擬物(Hirschmann等人，1992，J.Amer.Chem.Soc，1149217-9218)、類似有機合成的小化合物庫(Chen等人.，1994，J.Amer.Chem.Soc，1162661)、低聚氨基甲酸酯(Cho等人，1993，Science，2611303)與/或肽基膦酸酯(Campbell等人，1994，J.Org.Chem.，59658)、核酸庫(參見Ausubel，Berger和ambrook，所有上述內容)、肽核酸庫(美國專利第5,539,083號)、抗體庫(例如Vaughn等人，1996，Nature Biotechnology，14(3)309-314)和PCT/US96/10287)、碳水化合物庫(例如Liang等人，1996，Science，274-1520-1522和美國專利第.5,593,853號)、小有機分子庫(例如苯并二氮呯，Baum C&EN，Jan.18，1993，33頁；和美國專利第5,288,514號；類異戊二烯，美國專利第5,569,588號；噻唑啉酮和間噻嗪酮，美國專利第5,549,974號；吡咯烷，美國專利第5,525,735和5,519,134號；嗎啉化合物，美國專利第5,506,337號；等等)。
制備組合庫的裝置可以購得(例如357MPS、390MPS、Advanced ChemTech，Louisville Ky.；Symphony，Rainin，Woburn，Mass.；433A AppliedBiosystems，Foster City，Calif.；9050 Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。此外，大量的組合庫可以購得(例如ComGenex，Princeton，N.J.；Asinex，Moscow，Russia；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；ChemStar，Ltd.，Moscow，Russia；3DPharmaceuticals，Exton，Pa.；Martek Biosciences，Columbia，Md.，等等)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供高處理量形式的基于固相的體外分析，其中表達離子通道的細胞或組織附著于一固相受質。在這種高處理量分析中，可能在一天內篩選多達幾千個不同的調節(jié)劑或配體。微量滴定板的每個孔尤其可用于對一個經挑選的潛在的調節(jié)劑執(zhí)行一個單獨的分析，或者如果待觀察濃度或培育時間效應，那么每5-10個孔可測試一個單獨的調節(jié)劑。因此，單一的標準微量滴定板可分析約96個調節(jié)劑。如果使用1536孔板，則單一板可容易地分析約100至約1500種不同的化合物?？赡苊刻旆治鰩讉€不同的板；因此，(例如)對于多達約6,000-20,000種不同化合物的分析篩選可能使用所述的整合系統(tǒng)。
在另一方面，本發(fā)明涵蓋篩選和小分子(例如藥物)檢測分析，其涉及檢測或鑒別可結合既定蛋白質(意即GPR91多肽或肽)的小分子。特別優(yōu)選的為適合高處理量篩選方法的分析。
在這種基于結合的檢測、鑒別或篩選分析中，一般不需要功能分析。全部所需為靶蛋白(優(yōu)選為基本上經純化)與待篩選或分析結合蛋白靶的化合物(例如配體、藥物、小分子)或生物學實體的庫或組。優(yōu)選的為，大多數結合靶蛋白的小分子將由于其結合于蛋白質上功能區(qū)域或位置的優(yōu)先、較高的親和力而以某種方式調節(jié)活性。
這種分析的一個實例為基于熒光的熱移分析(3-DimensionalPharmaceuticals，Inc.，3DP，Exton，Pa.)，其描述于頒予Pantoliano等人的美國專利第6,020,141和6,036,920號中；也可參見，J.Zimmerman，2000，Gen.Eng.News，20(8))。這種分析允許基于通過分析蛋白質-藥物或配體復合體的熱伸展曲線而進行的結合親和力測定來檢測結合于經表達，并且優(yōu)選為經純化的離子通道多肽的小分子。如果需要，可通過例如本文所述的那些方法進一步分析通過這種技術所測定的藥物或結合小分子，以確定這些分子是否影響或調節(jié)靶蛋白的功能或活性。
為純化GPR91多肽或肽以測量生物結合或配體結合活性，來源可為可通過標準蛋白酶抑制劑存在下的連續(xù)凍融循環(huán)(例如1到3個)制備的全部細胞溶解產物。GPR91多肽可通過標準蛋白質純化方法，例如使用下文所述的特異性抗體的親和色譜，或由設計為重組GPR91多肽分子的表位標簽的特異性配體(也在本文中描述)部分或完全純化。然后可如所述測量結合活性。
根據本文所提供的方法鑒別并且調節(jié)或調控根據本發(fā)明的GPR91多肽的生物學活性或生理性質的化合物為本發(fā)明的優(yōu)選實施例。預期這些調節(jié)化合物可用于治療和療法以通過向需要這種治療的個體投予治療有效量的由本文所述的方法鑒別的化合物來治療由GPR91多肽調節(jié)的病況。
此外，本發(fā)明提供為需要這種治療的個體治療由本發(fā)明的GPR91多肽調節(jié)的疾病、病癥或病況的方法，其包含向所述個體投予治療有效量的由本文所據供的方法鑒別的GPR91調節(jié)化合物。
抗體和抗體的產生本發(fā)明的另一實施例包括免疫性特異結合SEQ ID NO2的多肽、多肽片段或變異體與/或GPR91的表位或GPR91的細胞外結構域片段的抗體。本發(fā)明的抗體包括(但不限于)多克隆的、單克隆的、單價的、雙特異性的、復共軛對配合物、多特異性的、人類的、人源化的或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表達庫制造的片段、抗獨特型(抗-Id)抗體(包括(例如)針對本發(fā)明抗體的抗-Id抗體)與上述任何的表位結合片段。
本文所用的術語“抗體”是指免疫球蛋白分子與免疫球蛋白分子的免疫學活性部分，意即含有免疫特異性結合抗原的抗原結合點的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和gY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子類的免疫球蛋白。而且，術語“抗體”(Ab)或“單克隆抗體”(Mab)意思是包括完整的分子，以及能夠特異性結合蛋白質的抗體片段(例如Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗體的Fc片段，更快的從動物或植物循環(huán)中清除，并且比完整抗體具有更少的非特異性組織結合(Wahl等人，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。因此，這些片段以及FAB或其它免疫球蛋白表達庫的產物是優(yōu)選的。而且，本發(fā)明的抗體包括嵌和的、單鏈和人源化抗體。
這些抗體可為本發(fā)明的人類抗原結合的抗體片段，并且包括(但不限于)Fab、Fab’與F(ab’)2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH結構域的片段?？乖Y合的抗體片段(包括單鏈抗體)可僅包含(多個)可變區(qū)或包含(多個)可變區(qū)與下列區(qū)域的全體或一部分的組合絞鏈區(qū)、CH1、CH2與CH3結構域。本發(fā)明同樣包括也包含(多個)可變區(qū)與絞鏈區(qū)、CH1、CH2與CH3結構域的任意組合的抗原結合片段。本發(fā)明的抗體可來自于任何動物來源，包括鳥和哺乳動物。優(yōu)選的為，抗體為人類的、鼠科的(例如小鼠和大鼠)、驢、運輸兔(ship rabbit)、山羊、豚鼠、駱駝、馬或小雞。如本文中所用，“人類”抗體包括具有人類免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，并且包括從人類免疫球蛋白庫或從對一種或一種以上的人類免疫球蛋白轉基因且不表達內源性免疫球蛋白的動物(如下文與(例如)Kucherlapati等人在美國專利第5,939,598號中所述)中分離的抗體。
本發(fā)明的抗體可為單特異性的、雙特異性的、三特異性的或為更多的多特異性。多特異性抗體可對本發(fā)明的多肽的不同表位具有特異性，或可對本發(fā)明的多肽以及對異源性表位(如異源性多肽或固態(tài)支持材料)都具有特異性。參見(例如)PCT公開案第WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793號；Tutt等人，J.Immunol.14760-69(1991)；美國專利第4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819號；Kostelny等人，J.Immunol.1481547-1553(1992)。
本發(fā)明的抗體可根據其識別或特異性結合的本發(fā)明多肽的(多個)表位或(多個)部分來描述或說明。(多個)表位或多肽的(多個)部分可如本文中所述，(例如)通過N-端和C-端位置，通過臨近氨基酸殘基的大小來說明，或列于表和圖中。也可排除特異性結合任何本發(fā)明的表位或多肽的抗體。因此，本發(fā)明包括特異性結合本發(fā)明的多肽的抗體，并允許排除其。
也可根據抗體的交叉反應性來描述或說明本發(fā)明的抗體。其中包括不結合任何其它本發(fā)明多肽的類似物、直向同源物或同源物的抗體。本發(fā)明也包括結合于與本發(fā)明多肽具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、并且至少50％同一性(使用此項技術中已知和本文所述的方法來計算)的多肽的抗體。
在特定實施例中，本發(fā)明的抗體與人類蛋白質的鼠科、大鼠與/或家兔同源物和其相應表位交叉反應。本發(fā)明也包括不結合于與本發(fā)明多肽具至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、并且至少50％同一性(使用此項技術中已知和本文所述的方法來計算)的多肽的抗體。在一個特定實施例中，上文所述的交叉反應性是關于任何單一的特異性抗原或免疫原多肽，或2、3、4、5種或5種以上的本文所揭示的特異性抗原或免疫原多肽的(多個)組合。本發(fā)明另外包括結合由在嚴格雜交條件下(如本文所述)雜交成本發(fā)明多核苷酸的核苷酸編碼的多肽的抗體。本發(fā)明的抗體也可根據其對于本發(fā)明多肽的結合親和力來描述或說明。優(yōu)選的結合親和力包括那些游離常數或Kd小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的結合親和力。
本發(fā)明也提供競爭性抑制抗體與本發(fā)明的表位結合的抗體，此通過此項技術中任何已知的測定競爭結合的方法(例如本文所述的免疫分析)來測定。在優(yōu)選的實施例中，抗體至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％地競爭性抑制對表位的結合。
本發(fā)明的抗體可充當本發(fā)明的多肽的激動劑或拮抗劑。例如，本發(fā)明包括部分或完全破壞受體/配體與本發(fā)明的多肽相互作用的抗體。優(yōu)選的為，本發(fā)明的抗體結合本文所揭示的抗原表位或其部分。本發(fā)明以受體特異性抗體和配體特異性抗體兩者為特色。本發(fā)明同樣以不阻止配體結合但阻止受體活化的受體特異性抗體為特色?？赏ㄟ^本文所述的技術或此項技術中已知的其它技術來測定受體活化(意即發(fā)出信號)。例如，可通過(例如本文所述)檢測鈣流動來測定受體活化。在特定實施例中，提供將配體活性或受體活性抑制到不存在抗體情況下活性的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％的抗體。
本發(fā)明同樣以同時阻止配體結合和受體活化的受體特異性抗體，以及識別受體-配體復合體并且優(yōu)選地不特異性識別未結合的受體或未結合的配體的抗體兩者為特色。本發(fā)明同樣包括結合配體并阻止配體結合受體的中和抗體，以及結合配體從而阻止受體活化但不阻止配體結合受體的抗體。本發(fā)明另外包括活化受體的抗體。這些抗體可充當受體激動劑，意即加強或激活配體介導的受體活化(例如通過誘導受體二聚作用)的全部或部分生物活性?？贵w可指定為對于生物活性(包含本文所揭示的本發(fā)明肽的特定生物活性)的激動劑、拮抗劑或反向激動劑。上述抗體激動劑可使用此項技術中已知的方法來制造。參見(例如)PCT公開案WO 96/40281號、美國專利第5,811,097號、Deng等人，Blood 92(6)1981-1988(1998)、Chen等人，Cancer Res.58(16)3668-3678(1998)、Harrop等人，J.Immunol.161(4)1786-1794(1998)、Zhu等人，Cancer Res.58(15)3209-3214(1998)、Yoon等人，J.Immunol.160(7)3170-3179(1998)、Prat等人，J.Cell.Sci.11(Pt2)237-247(1998)、Pitard等人，J.Immunol.Methods 205(2)177-190(1997)、Liautard等人，Cytokine 9(4)233-241(1997)、Carlson等人，J.Biol.Chem...272(17)11295-11301(1997)、Taryman等人，Neuron 14(4)755-762(1995)、Muller等人，Structure 6(9)1153-1167(1998)、Bartuneket a Cytokine 8(1)14-20(1996)(所有文獻的全文以引用的方式并入本文中)。
本發(fā)明的抗體可用于(例如，但不限于)純化、檢測和定靶GPR91，包括體外和體內的診斷和治療方法。例如，所述抗體在免疫分析中具有定性和定量測量生物樣品中GPR91含量的用途。參見Harlow等人，AntibodiesALaboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)(其全文以引用的方式并入本文中)。
在另一個實施例中，本發(fā)明的抗體可單獨或與其他組合物組合使用。所述抗體可在N或C端與異源性多肽重組融合，或者與多肽或其它組合物化學結合(包括共價和非共價結合)。例如，本發(fā)明的抗體可與在檢測分析中用作標簽的分子和例如異源性多肽、藥物、放射性核苷酸或毒素的效應物分子重組融合或結合。參見(例如)PCT公開案WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624號；美國專利第5,314,995號和歐洲專利第396,387號。
本發(fā)明的抗體包括經修飾的衍生物，意即通過任何類型的分子對抗體的共價連接并且所述共價連接不阻止抗體產生抗獨特型反應而進行的修飾。例如(但不限于)抗體衍生物包括(例如)通過糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知的保護/封端基團進行的衍生、蛋白質裂解、連接到細胞配體或其他蛋白質等而經修飾的抗體。多種化學修飾中的任一種皆可通過已知技術來實現，包括(但不限于)特定的化學裂解、乙?；⒓柞；?、衣霉素的代謝合成等。此外，衍生物可含有一種或一種以上的非標準氨基酸。
可通過此項技術中已知的任何適當方法來產生本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可包含多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法已為熟練的技術人員所知(Harlow，等人，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold spring HarborLaboratory Press，第2增補版(1988)，其全文以引用的方式并入本文中)。例如，在一個實施例中，所述方法包含在已知的制造抗體的實驗規(guī)程中使用經分離的帶有表位的GPR91多肽或其抗原片段作為免疫原制造結合GPR91的抗體。在另一個實施例中，所述方法包含使用表達重組GPR91的宿主細胞作為抗原。在另一個實施例中，所述方法包含使用含有表達受體的GPR91基因的DNA表達載體作為抗原制造抗體。
此項技術中熟知的方法包括(但不限于)體內免疫、體外免疫和噬菌體展示法。參見(例如)上述Sutcliffe等人、上述Wilson等人和Bittle等人，J.Gen.Virol，662347-2354(1985)。如果使用體內免疫，可以游離肽使動物獲得免疫；然而，可通過將肽偶聯至大分子載體(如鑰孔血藍蛋白(KLH)或破傷風菌疫苗)來提高抗肽抗體滴定率。例如，含有半胱氨酸殘基的肽可使用如馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)的連接子偶聯至載體，而其它肽可使用如戊二醛的更為通用的連接劑偶聯至載體。
可向包括(但不限于)家兔、小鼠、大鼠等的各種宿主動物投予免疫原以誘導產生含有特異于抗原的多克隆抗體的血清。免疫原GPR91多肽的投藥可需要一次或一次以上的注射，并且(如果需要)可包括佐劑。對于本發(fā)明而言，“免疫劑”可定義為編碼GPR91的多肽，包括其片段、變異體與/或衍生物，除此還有與異源性多肽和本文所述的其它形式多肽的融合體。
一般地，免疫劑與/或佐劑將通過多次皮下或腹腔內注射來注射給哺乳動物，但它們也可肌肉內與/或通過靜脈注射來給予。免疫劑可包括GPR91、GPR91的細胞外結構域、GPR91的融合蛋白或其變異體。取決于多肽的性質(意即疏水率、親水率、穩(wěn)定性、凈電荷、等電點等)，其可用于使免疫劑結合已知的在待免疫的哺乳動物中產生免疫性的蛋白質。這種結合包括通過衍生活性化學官能團與本發(fā)明多肽和免疫原蛋白兩者結合以便形成共價鍵的化學結合，或通過基于融合-蛋白方法，或其它熟練的技術人員已知的方法而形成的結合。這些免疫原蛋白的實例包括(但不限于)鑰孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰島素抑制劑。取決于宿主種類，可使用各種佐劑增加免疫反應，所述佐劑包括(但不限于)福氏(Freund)佐劑(完全或不完全)、礦物凝膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質，例如溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔血藍蛋白、二硝基酚，和潛在有用的人類佐劑，例如BCG(卡介苗)與棒狀桿菌菌苗。其它可使用的佐劑的實例包括MPL-TDM佐劑(單磷酰脂A、合成海藻糖dicorynomycolate)?？捎伤鶎兕I域的技術人員選擇免疫實驗規(guī)程而無需不當的實驗。
本發(fā)明的抗體可包含單克隆抗體?？墒褂秒s交瘤法制備單克隆抗體，例如描述于以下文獻中的那些方法Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)和美國專利第4,376,110號，Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold spring Harbor Laboratory Press，第2增補版(1988)，Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(Elsevier，N.Y.，(1981))，或技術人員已知的其它方法?？捎糜诋a生單克隆抗體的方法的其它實例包括(但不限于)人類B細胞雜交瘤技術(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 472；Cole et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030)，和EBV-雜交瘤技術(Cole等人，1985，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁)。這些抗體可為包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD的任一種類的免疫球蛋白和其任一子類?？稍隗w外或體內培養(yǎng)產生本發(fā)明的mAb的雜交瘤。在體內產生高滴定率的mAb使得這種方法成為目前優(yōu)選的產生方法。
在雜交瘤方法中，一般用引起淋巴細胞產生的免疫劑使小鼠、人源化小鼠、具有人類免疫系統(tǒng)的小鼠、倉鼠或其它合適的宿主動物獲得免疫，所述淋巴細胞可產生或能夠產生將特異性結合免疫劑的抗體?；蛘?，可在體外使淋巴細胞獲得免疫。
通常，如果需要人類來源的細胞則使用外周血淋巴細胞(″PBL″)，或如果需要非人類的哺乳動物來源則使用脾臟細胞或淋巴結細胞。然后使用適當的融合劑(例如聚乙二醇)將淋巴細胞與永生細胞系融合形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，(1986)，59-103頁)。永生細胞系通常為經轉化的哺乳動物細胞，尤其是嚙齒動物、牛和人類來源的骨髓瘤細胞。通常使用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞系?？稍趦?yōu)選地含有一種或一種以上抑制未融合、永生細胞的生長或存活的物質的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細胞。例如，如果親代細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般將包括次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT培養(yǎng)基”)，所述物質可阻止HGPRT缺陷細胞的生長。
優(yōu)選的永生細胞系為那些可有效融合、支持選定的抗體產生細胞對抗體的穩(wěn)定高水平表達、并對培養(yǎng)基(例如HAT培養(yǎng)基)敏感的細胞系。更優(yōu)選的永生細胞系為鼠骨髓瘤系，其可從(例如)San Diego，Calif.的索爾克學院細胞供應中心(Salk Institute Cell Distribution Center)與Manassas，Va.的美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)獲得。如整個說明書中所指示，同樣已有人描述用人類骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細胞系來產生人類單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)51-63頁)。
然后可分析其中培養(yǎng)有雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中是否存在針對GPR91受體的單克隆抗體。優(yōu)選地，通過免疫沉淀反應或通過體外結合分析(例如放射性免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))來測定由雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的結合特異性。這些技術在此項技術中已為人所知并且為熟練的技術人員掌握。單克隆抗體的結合親和力可通過(例如)Munson和Pollart，Anal.Biochem.，107220(1980)中的斯卡查德(Scatchard)分析來測定。
在鑒別出所要的雜交瘤細胞后，這些純系可通過限制稀釋法進行亞克隆并通過標準方法(Goding，上述文獻)使之生長。用于此目的的適宜培養(yǎng)基包括(例如)達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium)和RPMI-1640?；蛘撸s交瘤細胞可在體內(如哺乳動物的腹水中)生長。
可通過常規(guī)的免疫球蛋白純化程序從培養(yǎng)基或腹水液體中分離或純化由亞細胞系分泌的單克隆抗體，所述程序可為例如蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石色譜、凝膠排阻色譜、凝膠電泳、透析或親和色譜。
熟練技術人員會知曉此項技術中存在多種產生單克隆抗體的方法，并且因此本發(fā)明不受限于其單獨產生于雜交瘤中。例如，可通過重組DNA的方法制造單克隆抗體，如在美國專利第4,816,567號中描述的那些方法。在本文中，術語“單克隆抗體”是指起源于單個的真核、噬菌體或原核克隆中的抗體?？墒褂贸Ｒ?guī)程序(例如通過使用能夠特異性結合編碼鼠科抗體的重鏈和輕鏈，或來自人類、人源化或其它來源的這些鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地對編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA進行分離和測序。本發(fā)明的雜交瘤細胞為這種DNA的優(yōu)選來源。一經分離，即可將DNA亞克隆至表達載體中，然后將表達載體轉化至不另外產生免疫球蛋白的宿主細胞(如猿，COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中達成單克隆抗體的合成。也可(例如)通過以人類重鏈和輕鏈恒定結構域的編碼序列替換同緣鼠科序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，上述)或通過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽編碼序列的全部或部分共價鍵連接來修飾DNA。這種非免疫球蛋白多肽可替換本發(fā)明抗體的恒定結構域，或可替換本發(fā)明抗體的抗原結合位點的可變結構域以制造嵌合的二價抗體。
抗體可為單價抗體。制備單價抗體的方法在此項技術中已為人所熟知。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和經修飾重鏈的重組表達。一般在Fc區(qū)域的任意點截短重鏈以防止重鏈交聯?；蛘撸昧硪话被釟埢鎿Q相關的半胱氨酸殘基或刪除相關的半胱氨酸殘基以防止交聯。
體外法也適合制備單克隆抗體?？墒褂么隧椉夹g中已知的常規(guī)技術實現抗體消化以產生其片段，尤其為Fab片段。
例如，也可使用此項技術中已知的各種噬菌體展示法來生成本發(fā)明的抗體。在噬菌體展示法中，功能抗體區(qū)展示在載有對它們編碼的多核苷酸序列的噬菌體粒子的表面。在特殊的實施例中，這種噬菌體可用于展示自抗體譜或重組抗體庫(例如人類或鼠科)表達的抗原結合結構域。可用抗原(例如使用標記抗原，或結合或捕獲在固體表面或微球上的抗原)選擇或鑒別表達結合所關心的抗原的抗原結合結構域的噬菌體。這些方法中所用的噬菌體一般為包括從噬菌體表達的fd與M13結合結構域的絲狀噬菌體，所述噬菌體具有重組融合于噬菌體基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫化物穩(wěn)定的Fv抗體結構域?？捎糜谥圃毂景l(fā)明抗體的噬菌體展示法的實例包括下列文獻中所揭示的那些方法Brinkman等人，J.Immunol.Methods 18241-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic等人，Gene 1879-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57191-280(1994)；PCT申請案第PCT/GB91/01134；號PCT公開案WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401與美國專利第5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108，其各自的全文以引用的方式并入本文中。
如上述參考文獻中所述，在噬菌體挑選后，可分離并使用來自噬菌體的抗體編碼區(qū)域生成全部抗體(包括人類抗體或任何其它所要的抗原結合片段)并在任何所要的宿主(包括例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母與細菌)中表達，如下文中詳細描述。例如，也可使用此項技術中已知的方法利用重組產生Fab、Fab’和F(ab)2片段的技術，例如揭示于PCT公開案WO 92/22324、Mullinax等人，BioTechniques 12(6)864-869(1992)和Sawai等人AJRI 3426-34(1995)和Better等人Science 2401041-1043(1988)(所述參考文獻的全文以引用的方式并入本文中)中的那些方法?？捎糜谥圃靻捂淔vs和抗體的技術的實例包括描述于美國專利第4,946,778與5,258,498號、Huston等人，Methods in Enzymology 20346-88(1991)、Shu等人PNAS 907995-7999(1993)與Skerra等人，Science 2401038-1040(1988)中的那些技術。
對于包括抗體在人類體內使用和體外檢測分析的某些使用，優(yōu)選的為使用嵌合的、人源化的或人類抗體。嵌合抗體是其中抗體的不同部分是源于不同的動物物種的分子，例如具有源于鼠科單克隆抗體的可變區(qū)和人類免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。制造嵌合抗體的方法在此項技術中已為人所知。參見(例如)Morrison，Science 2291202(1985)、Oi等人，BioTechniques 4214(1986)、Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125191-202、美國專利第5.807,715、4,816,567與4,816397號，其全文以引用方式并入本文中。人源化抗體是來自非人類物種抗體的抗體分子，所述抗體結合具有一個或一個以上來自非人類物種的互補決定區(qū)(CDR)和來自人類免疫球蛋白分子的框架區(qū)的所要抗原。通常，用來自CDR供體抗體的相應殘基替換人類框架區(qū)中的框架殘基來改變，優(yōu)選地提高抗原結合。通過此項技術中熟知的方法鑒別這些框架替換，例如通過模擬CDR和框架殘基的相互作用來鑒別對抗原結合和序列對照重要的框架殘基以識別位于特定位置的不尋常的框架殘基。(參見(例如)Queen等人，美國專利第5,585,089號、Riechmann等人，Nature 332323(1988)，其全文以引用的方式并入本文中)?？墒褂么隧椉夹g中已知的各種技術使抗體人源化，所述技術包括(例如)CDR移植(歐洲專利239,400、PCT公開案WO 91/09967、美國專利第5,225,539、5,530,101和5,585,089號)，鑲帖或改面(歐洲專利592,106；歐洲專利519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)489-498(1991)；Studnicka等人，ProteinEngineering 7(6)805-814(1994)；Roguska等人，PNAS 91969-973(1994))和鏈替換(美國專利第5,565,332號)。人源化抗體一般具有一個或一個以上從非人類來源引入其中的氨基酸殘基。這些非人類的氨基酸殘基通常稱為“輸入”殘基，其一般取自“輸入”可變結構域?？苫旧习凑誛inter和其同事的方法(Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，2391534-1536(1988))，通過以嚙齒動物CDR或CDR序列替換人類抗體的相應序列來進行人源化。因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中基本上小于完整的人類可變結構域已由來自非人類物種的相應序列替換。實際上，人源化抗體一般為其中一些CDR殘基和可能一些FR殘基從嚙齒動物抗體的類似位置經替換的人類抗體。
一般而言，人源化抗體將基本上包含所有的至少一個并且一般為兩個的可變功結構域，其中全部或基本上全部的CDR區(qū)域對應于非人類免疫球蛋白的那些區(qū)域，并且全部或基本上全部的FR區(qū)域為人類免疫球蛋白一致序列的那些區(qū)域。人源化抗體最佳也將包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，一般為人類免疫球蛋白的Fc(Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332323-329(1988)1和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
對于治療人類患者完全人類抗體尤其理想?？赏ㄟ^此項技術中已知的各種方法(包括上文所述的噬菌體展示法)使用源自人類免疫球蛋白序列的抗體庫制得人類抗體。也可參見美國專利第4,444,887與4,716,111號、PCT公開案WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO96/34096、WO 96/33735與WO 91/10741，其各自的全文以引用的方式并入本文中。對于制備人類單克隆抗體也可用到Cole等人和Boerder等人的技術(cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Riss，(1985)；與Boerner等人，J.Immunol.，147(1)86-95，(1991))。
也可使用不能表達功能性內源免疫球蛋白但可表達人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠產生人類抗體。例如，可隨機或通過同源重組將人類重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復合體引入小鼠胚胎干細胞。或者，除人類重鏈和輕鏈基因外可將人類可變區(qū)、恒定區(qū)和多變區(qū)引入鼠胚胎干細胞。小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因可單獨地或與通過同源重組引入人類免疫球蛋白基因座同時呈現出無功能。尤其是JH區(qū)的純合缺失防止內源性抗體的產生。將使經修飾的胚胎干細胞擴展并將其微量注射入胚泡中以產生嵌合小鼠。然后使嵌合小鼠繁殖以產生表達人類抗體的純合后代。以標準方式用選定的抗原(例如全部或部分本發(fā)明的多肽)使轉基因小鼠獲得免疫?？墒褂贸Ｒ?guī)的雜交瘤技術從經免疫的、轉基因小鼠中獲得針對所述抗原的單克隆抗體。轉基因小鼠容納的人類免疫球蛋白轉基因在B細胞分化期間重新排列，并且隨后經歷類別轉換和體細胞突變。因此，使用這種技術可制造治療上有用的IgG、IgA、IgM與IgE抗體。對于制造人類抗體的這種技術的綜述，參見Lonberg與Huszar，Int.Rev.Immunol.1365-93(1995)。對于制造人類抗體和人類單克隆抗體的這種技術和制造這些抗體的實驗規(guī)程的詳細討論，參見(例如)PCT公開案WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096與WO 96/33735、歐洲專利第0 598 877號、美國專利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771與5,939,598號，其全文以引用的方式并入本文中。此外，例如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)，Genpharm(San Jose，Calif.)，與Medarex，Inc.(Princeton，N.J.)的公司可從事于使用類似于上文所述的技術提供針對選定抗原的人類抗體。
類似地，可通過將人類免疫球蛋白基因座引入其中內源性免疫球蛋白基因已經部分或完全失活的轉基因動物(例如小鼠)中來制得人類抗體。一經攻擊，即觀察到人類抗體的生產，其在所有方面(包括基因重排、組合和抗體譜的建立)皆非常類似于在人類所見。這種方法(例如)描述于美國專利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,106號和下列科學出版物中Marks等人，Biotechnol.，10779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368856-859(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.，14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.，14826(1996)；Lonberg和Huszer，Intern.Rev.Immunol.，1365-93(1995)。
可使用稱為“定向選擇”的技術產生識別選定的表位的完全人類抗體。在這種方法中，使用選定的非人類單克隆抗體(例如小鼠抗體)定向識別相同表位的完全人類抗體的選擇。(Jespers等人，Bio/technology 12899-903(1988))。
另外，可接著使用所屬領域的技術人員熟知的技術使用本發(fā)明多肽的抗體產生“模擬”本發(fā)明多肽的抗獨特型抗體。(參見，(例如)Greenspan &Bona，FASEB J.7(5)437-444；(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8)2429-2438(1991))。例如，可使用結合并競爭性抑制多肽的多元聚合與/或本發(fā)明多肽與配體結合的抗體來產生“模擬”多肽的多元聚合與/或結合結構域，并且因而結合并中和多肽與/或其配體的抗獨特型。這種中和抗獨特型或這種抗獨特型的Fab片段可用于治療方案中以中和多肽配體。例如，這些抗獨特型抗體可用于結合本發(fā)明的多肽并/或結合其配體/受體，并且從而阻斷其生物活性。
本發(fā)明的抗體可為雙特異性的抗體。雙特異性的抗體是對至少兩種不同抗原有結合特異性的單克隆的，優(yōu)選為人類或人源化抗體。在本發(fā)明中，一種結合特異性可針對本發(fā)明的多肽，其它者可針對任何其它抗原，并且優(yōu)選為針對細胞表面蛋白、受體、受體亞單位、組織特異性抗原、病毒性衍生蛋白、病毒性編碼的包膜蛋白、細菌性衍生蛋白或細菌表面蛋白等。
制造雙特異性抗體的方法在此項技術中是已知的。常規(guī)上，重組產生雙特異性抗體是基于兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共同表達，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Milstein與Cuello，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分類，所以這些雜交瘤(四源雜交瘤)產生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和色譜步驟實現正確分子的純化。類似程序揭示于1993年5月13日公開的WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.，103655-3659(1991)中。
可將具有所要結合特異性的抗體可變結構域(抗體-抗原結合位點)融合于免疫球蛋白恒定結構域序列。優(yōu)選的為與含有至少部分鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)與CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選的為具有第一重鏈恒定結構域(CH1)，其含有至少一次融合中存在的輕鏈結合所必需的位點。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體與(如果需要)免疫球蛋白輕鏈的DNA插入單獨的表達載體中，并共同轉化至適當的宿主生物體中。對于生成雙特異性抗體的更多詳細資料，參見(例如)Suresh等人，Meth.In Enzym.，121210(1986)。
本發(fā)明也涵蓋復共軛對配合物抗體。復共軛對配合抗體由兩個共價連接的抗體組成。已建議(例如)用這些抗體使免疫系統(tǒng)細胞定靶有害細胞(美國專利第4,676,980號)并用于HIV感染的治療(WO 91/00360、WO 92/20373與歐洲專利03089)。本發(fā)明涵蓋可在體外使用在合成蛋白質化學中的已知方法(包括涉及交聯劑的那些方法)來制備抗體。例如，可使用二硫化物交換反應或通過形成硫酯鍵來構建免疫毒素。用于此目的的適當試劑的實例包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-巰基丁酰亞胺酯和揭示于(例如)美國專利第4,676,980號中的那些試劑。
編碼抗體的多核苷酸本發(fā)明進一步提供包含編碼本發(fā)明的抗體和其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明也涵蓋在嚴格的或嚴格性較低的雜交條件下雜交成編碼抗體的多核苷酸的多核苷酸(例如上文所述)，所述抗體優(yōu)選地特異性結合GPR91，優(yōu)選地為結合具有SEQ ID NO2氨基酸序列多肽的抗體。
可使用此項技術中已知的任何方法獲得多核苷酸，并且測定所述多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，則可從化學合成的寡核苷酸組合編碼所述抗體的多核苷酸(例如在Kutmeier等人，BioTechniques 17242(1994)中所述)，簡而言之其涉及合成含有編碼所述抗體的序列部分的重疊寡核苷酸、將那些寡核苷酸退火與接合，并且然后通過PCR放大經接合的寡核苷酸。
或者，可從適當的來源的核酸生成編碼抗體的多核苷酸。如果不能得到含有編碼特定抗體的核酸的克隆，但抗體分子的序列是已知的，則編碼免疫球蛋白的核酸可化學合成或自適當來源(例如抗體cDNA庫，或從表達抗體的組織或細胞(例如經選定表達本發(fā)明抗體的雜交瘤細胞)產生的cDNA庫，或從其中分離的核酸(優(yōu)選的為ploy A+RNA))通過以下方法獲得使用可雜交至所述序列的3’端和5’端的合成引物進行PCR擴增，或使用對特定基因序列具有特異性的寡核苷酸探針進行克隆以從編碼所述抗體的cDNA庫鑒別(例如)cDNA克隆。然后可使用此項技術中熟知的任何方法將由PCR產生的擴增的核酸克隆至可復制的克隆載體中。
一旦測定核苷酸序列和抗體的相應氨基酸序列，即可使用此項技術中熟知的處理核苷酸序列的方法(例如重組DNA技術、定點突變、PCR等)處理抗體的核苷酸序列(參見(例如)描述于Sambrook等人，1990，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.與Ausubel等人編輯，1998，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY(其全文以引用的方式并入本文)中的技術)以產生具有不同氨基酸序列的抗體，(例如)從而制造氨基酸替換、缺失及/或插入)。
在一個特定實施例中，可通過此項技術中熟知的方法(例如通過對照其它重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序列以確定序列高度變異性的區(qū)域)檢查重鏈與/或輕鏈可變結構域的氨基酸序列以鑒別互補決定區(qū)(CDR)的序列。如上文所述，可使用常規(guī)的重組DNA技術將一個或一個以上的CDR插入框架區(qū)內，例如插入人類框架區(qū)中以將非人類抗體人源化?？蚣軈^(qū)可為自然存在的框架區(qū)或一致框架區(qū)，并且優(yōu)選的為人類框架區(qū)(參見(例如)Chothia等人，J.Mol.Biol.278457-479(1998)中的人類框架區(qū)列表)。優(yōu)選的為由組合框架區(qū)和CDR所產生多核苷酸編碼特異性結合本發(fā)明的多肽的抗體。優(yōu)選的為(如上文所論述)可在框架區(qū)內形成一個或一個以上的氨基酸替換，并且優(yōu)選的為所述氨基酸替換增強抗體對其抗原的結合。此外，這些方法可用于使參與鏈內二硫化物鍵的一個或一個以上可變區(qū)半胱氨酸殘基形成氨基酸替換或缺失以生成缺少一個或一個以上鏈內二硫化物鍵的抗體分子。本發(fā)明涵蓋對多核苷酸的其它改變并且這些改變?yōu)樗鶎兕I域的技術人員掌握。
此外，可使用經研發(fā)通過將來自具有適當抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與來自具有適當生物活性的人類抗體分子的基因接合來制造“嵌合抗體”的技術(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855(1984)；Neuberger等人，Nature 312604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314452-454(1985))。如上文所述，嵌合抗體是其中不同部分是源于不同的動物物種的分子，例如具有源于鼠科mAb的可變區(qū)和人類免疫球蛋白恒定區(qū)的那些抗體，例如人源化抗體。
或者，所述的制造單鏈抗體的技術(美國專利第4,946,778號；Bird，Science 242423-42(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883(1988)和Ward等人，Nature 334544-54(1989))可適合于制造單鏈抗體。通過經由氨基酸橋連接Fv區(qū)域的重鏈和輕鏈片段，從而產生單鏈多肽來形成單鏈抗體。也可使用在大腸桿菌(E.coli)中組合功能性Fv片段的技術(Skerra等人，Science2421038-1041(1988))。
載體另一方面，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明的抗GPR91抗體的核苷酸序列的載體與包含這種載體的宿主細胞。在細菌系統(tǒng)中，取決于待表達抗體分子的有意用途可方便地選擇多種表達載體。例如，在將產生大量的這種蛋白質以用于生成抗體分子的醫(yī)藥組合物時，針對表達高含量的容易純化的融合蛋白產物的載體可為理想的。這些載體包括(但不限于)大腸桿菌表達載體pUR278(Ruther等人，EMBO J.21791(1983))，其中抗體編碼序列可單獨地接合至載體中具有l(wèi)ac Z編碼區(qū)的框架內以便產生融合蛋白；pIN載體(Inouye&Inouye，Nucleic Acids Res.133101-3109(1985)；Van Heeke&Schuster，J.Biol.Chem.245503-5509(1989))等等。而且，可使用pGEX載體表達作為谷胱甘肽S-轉移酶(GST)的融合蛋白的外來多肽。一般而言，這些融合蛋白是可溶的且可容易地從溶解細胞中通過吸附并結合至基質谷胱甘肽-瓊脂糖微珠隨后在游離的谷胱甘肽存在下洗脫而純化。將pGEX載體設計為包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點以便克隆的靶基因產物可從GST部分中釋放出來。
在昆蟲系統(tǒng)中，使用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)作為載體來表達外來基因。這種病毒生長于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中?？蓪⒖贵w編碼序列單獨地克隆至病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)且位于AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制下。
在哺乳動物的宿主細胞中，可應用多種基于病毒的表達系統(tǒng)。在其中使用腺病毒作為表達載體的情況下，可將所關心的抗體編碼序列接合至腺病毒轉錄/翻譯控制復合體，例如晚期啟動子和三重前導序列。然后可通過體外或體內重組將這個嵌合基因插入腺病毒基因組。病毒基因組的非必需區(qū)(例如E1、E3區(qū))中的插入將產生能存活并且能夠在經感染的宿主中表達抗體分子的重組病毒(例如參見Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81355-359(1984))。插入的抗體編碼序列的有效翻譯也可需要特異性的啟動信號。這些信號包括ATG啟動密碼子和相鄰的序列。此外，啟動密碼子必須與所要編碼序列的閱讀框架同相以確保全部插入序列的翻譯。這些外源性翻譯控制信號和啟動密碼子可為各種來源的，自然的和合成的?？赏ㄟ^包含適當的轉錄增強子元件、轉錄終止基因等來提高表達效率。(參見Bittner等人，Methods in Enzymol.15351-544(1987))。
對于長期高產量地生產重組蛋白，穩(wěn)定的表達為優(yōu)選的。例如，可設計穩(wěn)定表達抗體分子的細胞系?？捎糜蛇m當表達控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止基因、多聚腺苷酸化位點等)控制的DNA和可選擇的標記物來轉化宿主細胞，而非使用含有復制的病毒源的表達載體。在引入外來DNA后，可允許經設計的細胞在加富培養(yǎng)基中生長1-2天，然后將其換入選擇性培養(yǎng)基中。重組質粒中的可選擇標記物對選擇呈現抗性，并允許細胞穩(wěn)定地將質粒整合至其染色體中并生長成灶，其又可經克隆與擴展成為細胞系。可將這種方法方便地用于設計表達抗體分子的細胞系。
可使用多種選擇系統(tǒng)，包括(但不限于)單純性皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11223(1977))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy等人，Cell 22817(1980))，可分別在tk-、hgprt-或aprt-細胞中使用基因。而且，可使用抗代謝物的抗性作為下列基因的選擇基礎對氨甲喋呤呈現抗性的dhfr(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77357(1980)；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527(1981))、對霉酚酸呈現抗性的gpt(Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072(1981))、對氨基糖苷G-418呈現抗性的neo(Clinical Pharmacy 12488-505；Wu與Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)和Morgan與Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，1993，TIB TECH11(5)155-215)與對潮霉素呈現抗性的hygro(Santerre等人，Gene 30147(1984))。常規(guī)上可使用重組DNA技術領域中通常所知的方法來選擇所要的重組克隆，并且這些方法(例如)描述于下列文獻中Ausubel等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)與Dracopoli等人(編輯)，Current Protocols in Human Genetics，JohnWiley&Sons，NY(1994)，第12章與第13章中；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.1501(1981)，其全文以引用的方式并入本文中。
可通過載體擴增來提高抗體分子的表達水平(對于綜述，參見Bebbington與Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，New York，1987))。當表達抗體的載體系統(tǒng)中的標記物可擴增時，增加存在于宿主細胞培養(yǎng)物中的抑制劑含量將增加標記基因的拷貝數。因為擴增區(qū)是與抗體基因有關的，所以抗體的產生也會增加(Grouse等人，Mol.Cell.Biol.3257(1983))。
可用本發(fā)明的兩個表達載體共同轉染宿主細胞，第一個載體編碼源于多肽的重鏈而第二個載體編碼源于多肽的輕鏈。上述兩個載體可含有相同的能夠使重鏈和輕鏈多肽同等表達的可選擇標記物?；蛘撸墒挂粋€編碼并能夠表達重鏈和輕鏈多肽兩者的單一載體。在這些情況下，應將輕鏈在重鏈之前放入以避免過量的有毒游離重鏈(Proudfoot，Nature 32252(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
此外，可將編碼適當信號肽的序列并入表達載體中，所述信號肽與GPR91非自然相關。例如，可將信號肽(分泌前導)的核苷酸序列讀框內融合于多肽序列以便將抗GPR91抗體作為包含信號肽的融合蛋白進行起始翻譯。在所希望的宿主細胞中具有功能的信號肽增強適當多肽的細胞外分泌。信號肽可從自細胞的分泌的多肽中裂解。
宿主細胞表達GPR91與抗GPR91多肽的合適的宿主細胞包括原核生物、酵母和其它真核生物。在本發(fā)明中用作宿主細胞的原核生物包括格蘭氏陰性和格蘭氏陽性生物體，如大腸桿菌或桿菌(Bacilli)。在原核宿主細胞中，多肽可包括N端蛋氨酸殘基以促進重組多肽在原核宿主細胞中的表達。N端Met可從經表達的重組GPR91受體多肽中裂解。通常用于重組原核宿主細胞表達載體的啟動子序列包括3-內酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)。
在本發(fā)明中用作宿主細胞的酵母包括那些來自酵母菌(Saccharomyces)屬、畢赤酵母(Pichia)、K放線菌類(Actinomycetes)與克魯維酵母(Kluyveromyces)的酵母。酵母載體通常會含有來自2μ酵母質粒的復制序列區(qū)、自主復制序列(ARS)、啟動子區(qū)、用于多聚腺苷酸化的序列、用于轉錄終止的序列和可選擇的標記基因。在其它序列種，用于酵母載體的合適的啟動子序列(尤其)包括用于金屬硫蛋白的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.2552073，(1980))或其它糖酵解酶。對于酵母其它合適的啟動子與載體和酵母轉化實驗規(guī)程在此項技術中已為熟知。
也可使用此項技術中熟知的哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達重組GPR91，例如用于在昆蟲細胞中產生異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)(Luckow和Summers，Bio/Technology 647(1988))或者可使用用于哺乳動物表達的NS0或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。用于哺乳動物宿主細胞表達載體的轉錄和轉錄控制序列可從病毒基因組中刪除。通常所用的啟動子序列和增強子序列源于多瘤病毒、腺病毒2、猿病毒40(SV40)和人類細胞肥大病毒。
此外，可選擇調節(jié)插入序列表達，或以所要的特定方式修飾與處理基因產物的宿主細胞菌株。蛋白質產物的這些修飾(例如糖基化)和處理(例如裂解)對于蛋白質的功能可以是很重要的。不同的宿主細胞對蛋白質和基因產物的轉錄后處理和修飾具有特征性的和特異性的機制?？蛇x擇合適的細胞系和宿主系統(tǒng)以確保正確修飾和處理經表達的外來蛋白質。為此，可使用具有適當處理基因產物的初級轉錄物、糖基化和磷酸化的細胞機器的真核宿主細胞。這些哺乳動物的宿主細胞包括(但不限于)CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38，并且尤其是例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20與T47D的乳腺癌細胞系和例如CRL7030與Hs578Bst的正常乳腺細胞系。
產生抗體的方法可通過任何此項技術中已知的用于生成和合成抗體的方法，尤其是通過化學合成或通過重組表達技術來產生本發(fā)明的抗體。
重組表達本發(fā)明的抗體，或其片段、衍生物或類似物(例如本發(fā)明的抗體的重鏈或輕鏈，或本發(fā)明的單鏈抗體)涉及構建含有編碼抗體的多核苷酸的表達載體。一旦已獲得編碼本發(fā)明的抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈，或其部分(優(yōu)選地含有重鏈或輕鏈可變結構域)的多核苷酸，即可使用此項技術中熟知的技術通過重組DNA技術產生用于生成抗體分子的載體。因此，本文描述了通過表達含有編碼抗體的核苷酸序列的多核苷酸來制備蛋白質的方法?？墒褂盟鶎兕I域的技術人員熟知的方法構建含有抗體編碼序列與適當的轉錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括(例如)體外重組DNA技術、合成技術和體內基因重組。因此，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明的抗體分子，或其重鏈或輕鏈，或重鏈或輕鏈可變結構域的以可操作方式連接于啟動子的核苷酸序列的可復制載體。這些載體可包括編碼抗體分子的恒定區(qū)的核苷酸序列(參見(例如)PCT公開案WO 86/05807、PCT公開案WO 89/01036與美國專利第5,122,464號)，并且可將抗體的可變結構域克隆至表達全部重鏈或輕鏈的那種載體中。
可用常規(guī)技術將表達載體轉入宿主細胞，并且然后用常規(guī)技術培養(yǎng)這些經轉染的細胞以產生本發(fā)明的抗體。因此，本發(fā)明包括含有編碼本發(fā)明抗體，或其重鏈或輕鏈，或本發(fā)明單鏈抗體的以可操作方式連接于異源性啟動子的多核苷酸的宿主細胞。在表達雙鏈抗體的優(yōu)選實施例中，(如下文中所詳細描述)編碼重鏈和輕鏈兩者的載體可在宿主細胞中共同表達而表達全部的免疫球蛋白分子。
可應用各種宿主表達載體系統(tǒng)表達本發(fā)明的抗體分子。這些宿主表達系統(tǒng)代表通過其可產生并隨后純化所關心的編碼序列的媒介物，但也代表用合適的核苷酸編碼序列進行轉化或轉染時在原位表達本發(fā)明的抗體分子的細胞。這些系統(tǒng)包括(但不限于)微生物，例如用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或裝配型質粒DNA表達載體轉化的細菌(例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis))，用含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉化的酵母(例如酵母菌、畢赤酵母)，用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)，用重組病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV、煙草花葉病毒TMV)感染的或用含有抗體編碼序列的重組質粒表達載體(例如Ti質粒)轉化的植物細胞系統(tǒng)，或容納重組表達結構的哺乳動物細胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3細胞)，所述表達結構含有源于哺乳動物細胞的基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源于哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7.5K啟動子)。優(yōu)選的為使用例如大腸桿菌的細菌細胞，并且更優(yōu)選的為使用真核細胞(尤其是表達全部重組抗體分子)來表達重組抗體分子。例如，哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)協(xié)同載體(例如來自人類細胞肥大病毒的主要中間早期基因啟動子元件)的為抗體的有效表達系統(tǒng)(Foecking等人，Gene 45101(1986)；Cockert等人，Bio/Technology 82(1990))。
一旦已經由動物產生、化學合成或重組表達本發(fā)明的抗體分子，即可通過此項技術中純化免疫球蛋白分子的任何已知方法將其純化，例如通過色譜法(例如離子交換色譜、親和色譜，尤其通過蛋白A后的特異性抗原的親和色譜與分級柱色譜)、離心、差異溶解或通過任何其它純化蛋白的標準技術。此外，可將本發(fā)明的抗體或其片段融合于本文所述的或此項技術中另外已知的異源性多肽序列以促進純化。
本發(fā)明涵蓋重組融合或化學鍵結合(包括共價和非共價結合兩種)于本發(fā)明的多肽(或其部分，優(yōu)選的為多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸)以生成融合蛋白的抗體。融合不必需要為直接的，而是可能通過連接子序列發(fā)生?？贵w可特異于抗原而非本發(fā)明的多肽(或其部分，優(yōu)選的為多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸)。例如，可使用抗體通過使本發(fā)明的多肽與特異于特定細胞表達受體的抗體融合或結合而使本發(fā)明的多肽在體外或體內定靶于特定的細胞類型。也可使用此項技術中已知的方法將融合或結合于本發(fā)明多肽的抗體用于體外免疫分析和純化方法中。參見(例如)Harbor等人，上文，與PCT公開案WO 93/21232；歐洲專利439,095；Naramura等人，Immunol.Lett.3991-99(1994)；美國專利第5,474,981號；Gillies等人，PNAS 891428-1432(1992)；Fell等人，J.Immunol.1462446-2452(1991)，其全文以引用的方式并入本文中。
本發(fā)明進一步包括包含融合或結合于抗體結構域而非可變區(qū)的本發(fā)明多肽的組合物。例如，本發(fā)明的多肽可融合或結合于抗體Fc區(qū)或其部分。融合于本發(fā)明的多肽的抗體部分可包含恒定區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH1結構域、CH2結構域與CH3結構域，或全部結構域或其部分的任何組合。多肽也可融合或結合于上述抗體部分而形成多聚體。例如，融合于本發(fā)明多肽的Fc部分可通過Fc部分間的二硫化物鍵形成二聚體。通過將多肽融合于IgA與IgM的部分可得到更高的多聚體形式。將本發(fā)明的多肽融合或結合于抗體部分的方法在此項技術中是已知的。參見(例如)美國專利第5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,112,946號；歐洲專利07,434；歐洲專利367,166；PCT公開案WO 96/04388、WO 91/06570；Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810535-10539(1991)；Zheng等人，J.Immunol.1545590-5600(1995)與Vil等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8911337-11341(1992)(所述參考文獻的全文以引用的方式并入本文中)。
如上文所論述，可使用此項技術中已知的方法將對應于SEQ ID NO2的多肽、多肽片段或變異體的多肽融合或結合于上述抗體部分以增加多肽的體內半衰期或用于免疫分析中。此外，可將對應于SEQ ID NO2的多肽融合或結合于上述抗體部分以促進純化。一個經報導的實例描述由人類CD4多肽的第一兩結構域和哺乳動物免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的各種結構域所組成的嵌合蛋白。(歐洲專利394,827；Traunecker等人，Nature33184-86(1988))。融合或結合于具有二硫化物連接的嵌合結構(由于IgG)的抗體的本發(fā)明的多肽也可比單獨的單體經分泌蛋白質或蛋白質片段更有效于結合與中和其它分子。(Fountoulakis等人，J.Biochem.2703958-3964(1995))。在許多情況下，融合蛋白中的Fc部分對治療和診斷是有益的，且可因此引起(例如)改良的藥代動力學性質。(歐洲專利A232,262)。或者，在已經表達、檢測并純化融合蛋白后刪除Fc部分將是理想的。例如，如果將融合蛋白用作免疫抗原則Fc部分可妨礙治療和診斷。在藥物研發(fā)中，(例如)為了進行鑒別hIL-5拮抗劑的高處理量篩選分析已將人類蛋白(例如hIL-5)與Fc部分融合。(參見Bennett等人，J.Molecular Recognition 852-58(1995)；Johanson等人，J.Biol.Chem....2709459-9471(1995))。
而且，本發(fā)明的抗體或其片段可融合于標記序列(例如肽)以促進純化。在優(yōu)選的實施例中，標記氨基酸序列為六組氨酸肽，例如pQE載體中所提供的標簽(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif，91311)，其中多種是(尤其)可以購得的。如entz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86821-824(1989)中所述，(例如)六組氨酸提供方便的融合蛋白純化。用于純化的其它肽標簽包括(但不限于)對應于源于流感病毒血細胞凝集素蛋白的肽的“HA”標簽(Wilson等人，Cell 37767(1984))和“標記”標簽。
本發(fā)明進一步涵蓋結合診斷或治療試劑的抗體或其片段。這些抗體可在診斷上用于(例如)作為臨床測試程序的一部分監(jiān)測腫瘤的發(fā)展和進行以(例如)測定既定治療方案的功效?？赏ㄟ^使抗體偶聯于可檢測的物質來促進檢測?？蓹z測物質的實例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、使用各種正電子放射斷層掃描的正電子放射金屬與非放射性順磁性金屬離子。可使用此項技術中已知的技術使可檢測物質直接，或通過中間體(例如此項技術中已知的連接子)間接地偶聯或結合抗體(或其片段)。對于可結合于根據本發(fā)明用作診斷劑的抗體的金屬離子，請參見(例如)美國專利第4,741,900號。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合體的實例包括抗生物素蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅素；發(fā)光材料的實例包括發(fā)光氨；生物發(fā)光材料的實例包括熒光素酶、蟲熒光素和水母發(fā)光蛋白；并且合適的放射性材料的實例包括125I、131I、111In.或99Tc。
此外，抗體或其片段可結合于例如細胞毒素(例如細胞抑制或殺細胞試劑)的治療性部分、治療劑或例如α-發(fā)射體(例如213Bi)的放射性金屬離子。細胞毒素或細胞毒素劑包括任何對細胞有害的試劑。實例包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、足葉乙甙、鬼臼噻吩甙、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基蒽醌、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、邦妥卡因、利多卡因、普萘洛爾、和嘌呤霉素與其類似物或同源物。治療劑包括(但不限于)抗代謝物(例如氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-巰鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟二氧嘧啶氮烯唑胺)、烷基化劑(例如二氯甲二乙胺、硫替派苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亞硝基脲氮芥(BSNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂霉素C和順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)霉素(例如柔紅霉素(先前的道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(先前的放線菌素))、博萊霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)以及抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春堿)。
本發(fā)明的結合物可用于修飾既定的生物反應，治療劑或藥物部分不應解釋為受限于傳統(tǒng)的化學治療劑。例如，藥物部分可為具有所要的生物活性的蛋白質或多肽。這些蛋白質可包括(例如)毒素，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，例如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子、組織胞漿素原活化劑，細胞凋亡劑，例如TNF-α、TNF-β、AIM I(參見國際公開案第WO 97/33899號)、AIM II(參見國際公開案第WO 97/34911號)、Fas配體(Takahashi等人，Int.Immunol.，61567-1574(1994))、VEGI(參見國際公開案第WO99/23105號)，血栓形成劑或抗血管生成劑，例如血管抑素或內皮抑素；或生物反應調節(jié)劑，例如淋巴因子、白細胞間介素-1(″IL-1″)、白細胞間介素-2(″IL-2″)、白細胞間介素-6(″IL-6″)、粒性細胞巨噬細胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒性細胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其它生長因子。
抗體也可附著在特定地用于免疫分析或純化靶抗原的固體支持物上。這些固體支持物包括(但不限于)玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙稀。
使這種治療性部分結合于抗體的技術已為熟知，參見(例如)Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(編輯)，第243-56頁(Alan R.Liss，Inc.1985)中；Hellstrom等人，″Antibodies ForDrug Delivery″，在Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編輯)，第623-53頁(Marcel Dekker，Inc.1987)中；Thorpe，″Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review″，在Monoclonal Antibodies′84Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(編輯)，第475-506頁(1985)中；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，在Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等人(編輯)，第303-16頁(AcademicPress 1985)中，與Thorpe等人，″The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62119-58(1982)。
或者，抗體可結合第二抗體形成抗體復共軛對配合物，如Segal于美國專利第No.4,676,980號中所述，其全文以引用的方式并入本文中。
單獨投藥或與組合(多種)細胞毒素因子和/或(多種)細胞因子投藥的抗體(有或無治療性部分與其結合)可用作治療劑。
本發(fā)明也涵蓋制造針對本發(fā)明的多肽的合成抗體。在Radrizzani，M.，等人，Medicina，(Aires)，59(6)753-8，(1999)中描述合成抗體的一個實例。近來，已描述過新一類的合成抗體并將其稱為分子拓印聚合物(MIP)(Semorex，Inc.)?？贵w、肽和酶通常在化學和生物感應器中用作分子識別元件。然而，它們缺乏穩(wěn)定性和信號轉換機制限制它們作為感應裝置的用途。分子拓印聚合物(MIP)能夠模仿生物受體的功能但具有較少的穩(wěn)定性限制。這些聚合物提供高靈敏性和選擇性卻保持優(yōu)良的熱與機械穩(wěn)定性。MIP具有結合小分子和靶分子(例如有機和蛋白質分子)的能力，而與自然抗體相比具有相等或較大的效能。這些“超級的”MIP對其靶物具有較高的親和力并因此對于有效的結合要求較低的濃度。
在合成期間，通過使用靶分子本身(例如多肽、抗體等)或具有非常相似的結構的物質作為其“印記”或“模板”對MIP進行拓印以便得到選定靶物的互補大小、形狀、電荷和官能團。可用提供給抗體的相同試劑衍生MIP。例如，可將熒光“超級”MIP涂布至微球或孔上，其用于高度靈敏的分離或分析或用于高處理量的蛋白質篩選。
此外，基于本發(fā)明的(多種)多肽結構的MIP可用于篩選結合本發(fā)明的(多種)多肽的化合物。這種MIP將通過模擬多肽的天然構造而發(fā)揮合成“受體”的作用。事實上，對于雌激素受體已經證實了MIP的發(fā)揮合成受體作用的能力(Ye，L，Yu，Y.，Mosbach，K，Analyst.，126(6)760-5，(2001)；Dickert，F，L.，Hayden，O.，Halikias，K，P，Analyst.，126(6)766-71，(2001))。合成受體可以整體(例如全部蛋白質)進行模擬或作為對應于蛋白質的一系列短肽進行模擬(Rachkov，A.，Minoura，N，Biochim，Biophys，Acta.，1544(1-2)255-66，(2001))。這種合成受體MIP可用于一種或一種以上的本文中別處所述的篩選方法。
MIP也已展示出可用于“感測”其模擬分子的存在(Cheng，Z，Wang，E.，Yang，X，Biosens，Bioelectron.，16(3)179-85，(2001)；Jenkins，A，L，Yin，R.，Jensen，J.L，Analyst，126(6)798-802，(2001)；Jenkins，A，L，Yin，R，Jensen，J.L，Analyst.，126(6)798-802，(2001))。例如，使用本發(fā)明的多肽所設計的MIP可用于經設計鑒別并大概地定量所述多肽在樣品中的含量的分析。這種MIP可用作本文中提供的分析或試劑盒(例如ELISA等)中所述的任何組份的替代物。
可使用多種方法制造特異性受體、配體、多肽、肽、有機分子的MIP。Esteban等人在J.Anal，Chem.，370(7)795-802，(2001)(其全文以及其中所引用的任何參考文獻皆以引用的方式并入本文中)中描述了幾種優(yōu)選的方法。另外的方法在此項技術中是已知的并包含在本發(fā)明中，例如Hart，B，R.，Shea，K，J.J.Am.Chem，Soc，123(9)2072-3，(2001)與Quaglia，M.，Chenon，K.；Hall，A，J.，De，Lorenzi，E.，Sellergren，B，J.Am.Chem，Soc，123(10)2146-54，(2001)，其全文以引用的方式并入本文中。
針對GPR91的抗體的用途本發(fā)明的抗體具有多種效用。例如，這些抗體可用于檢測樣品中GPR91的存在或量化的診斷分析。這種診斷分析可由至少兩個步驟組成。第一，使樣品與抗體作用，其中所述樣品為組織(例如人類、動物等)、生物流體(例如血液、尿液、痰液、精液、羊水、唾液等)、生物提取物(例如組織或細胞勻漿等)、蛋白微芯片(例如參見Arenkov P等人，Anal Biochem.，278(2)123-131(2000))或色譜柱等。而第二個步驟涉及對結合所述受質的抗體定量?；蛘撸龇椒闪硗獍ǖ谝徊绞箍贵w共價地、靜電地或可逆地附著在固體支持物上，并且第二步使經結合的抗體與樣品作用，如上文和本文中別處所定義。
此項技術中已知多種診斷分析技術，例如競爭結合分析、直接或間接的夾心分析和異相或均相進行的免疫沉淀分析(Zola，Monoclonal antibodiesAManual of Techniques，CRC Press，Inc.，(1987)，第147-158頁)。診斷分析中所用的抗體可用可檢測的部分標記?？蓹z測的部分應能夠產生(直接或間接)可檢測的信號。例如，可檢測的部分可為放射性同位素(例如2H、14C、32P或125I)、熒光或化學發(fā)光化合物(例如異硫氰酸熒光素、若丹明或蟲熒光素)或酶(例如堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白或辣根過氧化物)。可使用此項技術中已知的任何方法使抗體結合于可檢測的部分，包括Hunter等人，Nature，144945(1962)；Dafvid等人，Biochem.，131014(1974)；Pain等人，J.Immunol.Metho.，40219(1981)；和Nygren，J.Histochem.AndCytochem.，30407(1982)中所描述的那些方法。
針對GPR91的抗體可用于從重組細胞培養(yǎng)物或自然來源中親和純化GPR91多肽。在這個過程中，使用此項技術中熟知的方法將針對特定多肽的抗體固定在適當的支持物(例如Sephadex樹脂或濾紙)上。然后使經固定的抗體與含有待純化的多肽的樣品接觸，并隨后用合適的溶劑洗滌支持物，這種合適的溶劑會基本上除去除了所要的結合于經固定的抗體的多肽外所有樣品中的物質。最后，用另一種合適的溶劑洗滌支持物，這種溶劑會將所要的多肽從抗體中釋放出來。
本發(fā)明進一步針對于基于抗體的療法，其涉及向患者投予本發(fā)明的抗體以治療一種或一種以上所揭示的疾病、病癥或病況。本發(fā)明的治療化合物包括(但不限于)本發(fā)明的抗體(包括如本文所述的其片段、類似物和衍生物)和編碼本發(fā)明的抗體的核酸(包括如本文所述的其片段、類似物與衍生物和抗獨特型抗體)。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制或預防與本發(fā)明多肽的異常表達與/或活性有關的疾病、病癥或病況，其包括(但不限于)任何一種或一種以上的本文所述的疾病、病癥或病況。治療與/或預防與本發(fā)明多肽的異常表達與/或活性有關的疾病、病癥或病況包括(但不限于)減輕與那些疾病、病癥或病況有關的癥狀?？稍诖隧椉夹g中已知的或本文所述的醫(yī)學上可接受的組合物中提供本發(fā)明的抗體。
可在治療上使用本發(fā)明抗體的方式的概要包括在體內局部或全身地結合本發(fā)明的多核苷酸或多肽，或通過抗體的直接細胞毒性(例如補體介導的細胞毒性(CDC)或效應細胞介導的細胞毒性(ADCC))。下文更詳細地描述這些方法中的一些。利用本文所提供的教示，所屬領域的普通技術人員將知道如何使用本發(fā)明的抗體達成診斷、監(jiān)測或治療目的而無需不當的實驗。
本發(fā)明的抗體可方便地與下列物質組合使用其它單克隆或嵌合抗體，或淋巴因子或造血生長因子(例如IL-2、IL-3與IL-7)，其(例如)可增加與抗體相互作用的效應細胞的數目或活性。
本發(fā)明的抗體可進行單獨投藥或與其它類型的治療(例如放射療法、化學療法、激素療法、免疫療法和抗腫瘤劑)結合。一般而言，優(yōu)選的為投予與患者相同的物種的物種來源或物種反應性(對于抗體而言)的產物。因此，在一個優(yōu)選的實施例中，將人類抗體、片段衍生物、類似物或核酸投予人類患者用于治療或預防。
對于針對于本發(fā)明的多核苷酸或多肽(包括其片段)的免疫分析和與其有關的病癥的治療兩者，優(yōu)選的為使用針對抗本發(fā)明的多肽或多核苷酸的高親和力與/或效力的體內抑制與/或中和抗體，其片段或區(qū)域。這些抗體、片段或區(qū)將優(yōu)選地具有對本發(fā)明的多核苷酸或多肽(包括其片段)的親和力。
針對GPR91的抗體可用于在動物體內抑制過敏反應。例如，通過投予治療上可接受劑量的本發(fā)明的抗體或多種抗體，或本發(fā)明多種抗體的混合物，或與各種來源的其它抗體組合投予其，動物可能不會出現對抗原的過敏性反應。
同樣，可以預見克隆編碼針對GPR91(其具有在生物體中引發(fā)過敏與/或免疫反應的潛力)的抗體的基因，并在用所述抗體基因轉化生物體以使其表達(例如組成地或誘導地表達等)于所述生物體中。因此，生物體將有效地對由攝取或存在這種免疫/過敏反應性多肽而引起的的過敏性反應產生抵抗性。此外，本發(fā)明抗體的這種用途在預防與/或改善自體免疫疾病與/或病癥方面可具有特殊效用，因為這些病況一般起因于針對內源性蛋白質的抗體。例如，在其中本發(fā)明的多肽負責調節(jié)對自身抗原的免疫反應的情況下，用包含任何本文中所揭示的或此項技術中另外已知的啟動子，以及編碼針對本發(fā)明多肽的抗體的多核苷酸的結構來轉化生物體和/或個體可有效地抑制生物體的免疫系統(tǒng)對(多個)自身抗原產生免疫反應。本文中在它處提供了本發(fā)明的治療與/或基因治療應用的詳細說明。
使用抗GPR91抗體的診斷方法特異性結合GPR91的標記抗體與其衍生物和類似物可用于診斷的目的以檢測、診斷或監(jiān)測與本發(fā)明多肽的異常表達與/或活性有關的疾病、病癥與/或病況。本發(fā)明提供對GPR91異常表達的檢測，其包含(a)使用一種或一種以上特異于GPR91的抗體分析個體細胞或體液中GPR91的表達與(b)將所述基因表達水平與標準基因表達水平比較，借此與標準的表達水平相比GPR91基因表達水平的升高或降低指示出異常表達。
本發(fā)明提供用于診斷病癥的診斷分析，其包含(a)使用一種或一種以上特異于GPR91的抗體分析個體細胞或體液中GPR91的表達與(b)將所述基因表達水平與標準基因表達水平比較，借此與標準的表達水平相比經分析多肽的基因表達水平的升高或降低指示出特殊病癥。關于癌癥，來自個體的活檢組織中存在相對高的量的轉錄物可能表示疾病發(fā)展的傾向，或可能提供在出現實際臨床癥狀之前檢測疾病的方法。這種類型的更確定的診斷可允許健康醫(yī)生較早采用預防措施或積極治療從而預防癌癥的發(fā)展或進一步進行。
可使用所屬領域的技術人員已知的典型免疫組織學方法使用本發(fā)明的抗體來分析生物樣品中的蛋白質含量(例如參見Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen等人，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。用于檢測蛋白質基因表達的其它基于抗體的方法包括免疫分析，例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)與放射性免疫分析(RIA)。合適的抗體分析標記在此項技術中的已知的并包括酶標記(例如葡萄糖氧化酶)、放射性同位素(例如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)和锝(99Tc))、發(fā)光標記(例如發(fā)光氨)與熒光標記(例如熒光素與若丹明)和生物素。
本發(fā)明的一個方面為在動物(優(yōu)選的為哺乳動物并且最優(yōu)選的為人類)體內檢測和診斷與GPR91的異常表達有關的疾病和病癥。在一個實施例中，診斷包含a)向受試者投予(例如非經腸、皮下或腹腔內)有效量的特異性結合GPR91的標記分子；b)在投藥后等待一段時間間隔以允許標記分子優(yōu)先集中在受試者體內表達多肽的位點(并且未結合的標記分子經清除至背景含量)；c)測定含量水平；和d)檢測受試者體內的標記抗體，由此檢測到背景含量之上的標記抗體顯示受試者患有與肥大細胞有關的特定的疾病或病癥。對特定系統(tǒng)可通過多種方法測定背景含量，包括將檢測到的標記分子的量與先前測定的標準值進行比較。
應了解在此項技術中受試者的大小與所用的成像系統(tǒng)將決定產生診斷圖像所需的成像部分的數量。對放射性同位素部分而言，對于人類受試者所注射的放射量通常將在約5至20毫居里的99mTc范圍內。標記抗體或抗體片段隨后將優(yōu)先聚集在含有特異蛋白的細胞處。體內腫瘤成像描述于S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies andTheir Fragments.”(Tumor ImagingThe Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel與B.A.Rhodes，編輯，Masson Publishing Inc.(1982)中第13章)中。
取決于多個變量(包括所用的標記類型和投藥方式)，投藥后允許標記分子優(yōu)先集中在受試者體內的位點并使未結合的標記分子清除至背景含量的時間間隔為6至48小時、或6至24小時或6至12小時。在另一個實施例中，投藥后的時間間隔為5至20天或5至10天。
在一個實施例中，通過(例如)初次診斷后一個月、初次診斷后六個月、初次診斷后一年(等)重復診斷疾病或病癥的方法來對疾病或病癥進行監(jiān)測。
可使用此項技術中已知的用于體內掃描的方法檢測患者體內標記分子的存在。這些方法取決于所用的標記類型。熟練的技術人員將能夠決定檢測特定標記的合適方法。本發(fā)明的診斷方法中可使用的方法和裝置包括(但不限于)電子計算機X線體層攝影法(CT)、例如正電子放射斷層掃描(PET)的整體掃描、核磁共振成像(MRI)與超聲波掃描術。
在特定實施例中，用放射性同位素標記分子并使用放射響應性外科儀器在患者體內進行檢測(Thurston等人，美國專利第5,441,050號)。在另一實施例中，用熒光化合物標記分子并使用熒光響應性掃描儀器在患者中進行檢測。在另一實施例中，用正電子放射金屬標記分子并使用正電子放射斷層掃描在患者體內進行檢測。在另一實施例中，用順磁性標記來標記分子并使用核磁共振成像法(MRI)在患者體內進行檢測。
在另一方面，本發(fā)明提供一種方法，其用于診斷患者罹患由細胞因子未經調整的表達所引起的疾病的傾向。本發(fā)明是基于某些患者細胞、組織或體液中存在GPR91受體或其量增加顯示這個患者易患某些免疫疾病的發(fā)現。在一個實施例中，所述方法包含從患者收集已知含有(即便含有量也很少)GPR91受體的細胞、組織或體液樣品，分析組織或體液以確定組織中存在GPR91受體，并基于GPR91受體在組織或體液中的表達水平預測患者患有某些免疫疾病的傾向。在另一個實施例中，所述方法包含從患者收集已知含有規(guī)定含量GPR91受體的細胞、組織或體液樣品，分析組織或體液以確定組織中GPR91受體的量，并基于與對于正常細胞、組織或體液設定的規(guī)定或測試含量相比GPR91受體在所述組織或體液中量的變化來預測患者患有某些免疫疾病的傾向。規(guī)定的GPR91受體含量可為基于文獻值而已知的量或可提前通過測量正常細胞、組織或體液中的量來測定。特別地，測定某些組織或體液中的GPR91受體的含量允許特定并早期地(優(yōu)選地為在疾病出現之前)在患者體內檢測出免疫疾病?？墒褂帽痉椒ㄔ\斷的免疫疾病包括(但不限于)本文所述的免疫疾病。在優(yōu)選的實施例中，組織或體液為外周血液、外周血白細胞、例如肺或皮膚活體切片的活檢組織和滑液與組織。
受體表達調節(jié)又一方面，本發(fā)明提供一種通過干擾編碼GPR91活化受體的DNA或RNA多核苷酸的轉錄或翻譯而阻斷或調節(jié)細胞GPR91受體表達的方法。所述方法包含將能夠表達GPR91受體的細胞暴露于干擾編碼GPR91活化受體的DNA或RNA多核苷酸的適當轉錄和翻譯的分子。這種分子可為有機分子、生物有機分子、反義核苷酸、RNAi核苷酸或核糖酶。
在一個優(yōu)選的實施例中，所述方法包含通過將細胞暴露于多核苷酸而阻斷或調節(jié)細胞GPR91受體的表達，這種多核苷酸為反義的或與GPR91活化受體-編碼DNA或與調節(jié)GPR91活化受體-編碼DNA表達的DNA形成三重螺旋。將細胞暴露于足夠量的反義多核苷酸或形成三重螺旋的多核苷酸以抑制或調節(jié)GPR91活化受體表達。而且，本發(fā)明提供一種通過向動物投予多核苷酸而在動物體內阻斷或調節(jié)GPR91受體表達的方法，這種多核苷酸為反義的或與GPR91活化受體-編碼DNA或與調節(jié)GPR91活化受體-編碼DNA表達的DNA形成三重螺旋。向動物投予足夠量的反義多核苷酸或形成三重螺旋的多核苷酸以在動物體內抑制或調節(jié)GPR91受體的表達。優(yōu)選地，這種反義多核苷酸或形成三重螺旋的多核苷酸為DNA或RNA多核苷酸。
將細胞暴露于反義多核苷酸和向動物投予反義多核苷酸的方法在此項技術中已為熟知。在優(yōu)選的方法中，使用已知方法將多核苷酸并入細胞基因組中并使其在細胞內表達。經表達的反義多核苷酸結合于編碼GPR91受體的多核苷酸并干擾其轉錄或翻譯。
這些方法可用于抑制細胞因子和受體表達同時對各種類型的細胞(例如嗜中性粒白細胞或肥大細胞)進行研究，并且用于預防或治療特征為對比于非疾病狀態(tài)產生過多的細胞因子的動物疾病。
疾病預防和治療另一方面，本發(fā)明提供一種在動物體內預防或治療GPR91蛋白介導的疾病的方法。所述方法包含向哺乳動物投予疾病預防或治療量的GPR91激動劑或拮抗劑。激動劑或拮抗劑結合GPR91受體并調節(jié)細胞因子和細胞受體的表達以產生非疾病狀態(tài)所特有的細胞因子含量。優(yōu)選的為，這些疾病為過敏癥、哮喘、自體免疫或其它炎癥性疾病。最優(yōu)選的為所述疾病為過敏癥或哮喘。
GPR91受體激動劑或拮抗劑的劑量根據特定哺乳動物的年齡、大小和特征與疾病而變化。熟練的技術人員可根據這些因素決定劑量?？梢苑霞膊〉闹委煼桨竿队杓觿┗蜣卓箘缫恢翈滋靸韧队鑶蝿┗蜉^少幾劑以改善疾病狀態(tài)或在延長的時間內投予周期必劑量以預防過敏癥或哮喘。
可以任何可接受的方式向哺乳動物投予激動劑和拮抗劑，這些方式包括口服、經注射、使用植入物、進入肺的氣霧劑等等。注射和植入物允許精確地控制投藥所用的時機選擇和劑量水平。激動劑和拮抗劑可非經腸地投予。如本文中所用的通過靜脈內、肌肉內或腹腔內注射，或通過皮下植入物的非經腸投藥方式。
通過注射投藥時，可于可注射的調配物中將激動劑和拮抗劑投予哺乳動物，所述調配物可含有任何生物相容性試劑和與激動劑與拮抗劑可相容的載劑(例如各種媒劑、佐劑、添加劑和稀釋劑)。例如不含非揮發(fā)性熱原物的水、無菌水和抑菌水的水性媒劑也適合形成可注射的溶液。除這些形式的水外，可使用幾種其它的水性媒劑。這些媒劑包括可經滅菌的等滲注射組合物，例如氯化鈉注射液、林格氏(Ringer′s)注射液、右旋糖注射液、右旋糖與氯化鈉注射液和乳酸林格氏注射液。例如棉花子油、芝麻油或花生油的非水媒劑和例如肉豆蔻酸異丙基酯的酯類也可用作這些組合物的溶劑系統(tǒng)。此外，可添加各種提高組合物的穩(wěn)定性、無菌性和等滲性的添加劑，這些添加劑包括抗菌防腐劑、抗氧化劑、鰲合劑合緩沖液。然而，任何所用的媒劑、稀釋劑或添加劑將必需是生物相容性的并可與根據本發(fā)明的激動劑和拮抗相容。
治療和預防活性本發(fā)明的化合物和醫(yī)藥組合物優(yōu)選地在用于人類之前對于所要的治療和預防活性進行體外、(然后)體內測試。例如，證實化合物或醫(yī)藥組合物的治療或預防功效的體外分析包括化合物對細胞系或患者組織樣品的作用?？衫盟鶎兕I域的技術人員已知的技術測定化合物或組合物對細胞系與/或組織樣品的作用，這些技術包括(但不限于)玫瑰花結形成分析和細胞溶解分析。根據本發(fā)明，可用于確定顯示是否投予特定化合物的體外分析包括體外細胞培養(yǎng)分析，其中使患者組織樣品在培養(yǎng)物中生長，并暴露于或另外投予化合物，并觀察這種化合物對組織樣品的作用。
治療/預防投藥和組合物本發(fā)明提供通過向受試者投予有效量的本發(fā)明化合物或醫(yī)藥組合物(優(yōu)選地為本發(fā)明的抗體或siRNA)來進行治療、抑制和預防的方法。在一優(yōu)選方面，化合物基本上為經純化的(例如基本上沒有限制其作用或產生不期望副作用的物質)。受試者優(yōu)選為動物，包括(但不限于)例如母牛、豬、馬、小雞、貓、狗等動物，并且優(yōu)選為哺乳動物，并最優(yōu)選為人。
上文描述了當化合物包含核酸或免疫球蛋白時可采用的調配物和投藥方法；額外的適當調配物和投藥途徑可從本文以下所描述的那些當中選擇。
已知多種遞送系統(tǒng)并且可使用其投予本發(fā)明的化合物，例如封入脂質體、微粒、微膠囊、能夠表達化合物的重組細胞、受體介導的胞吞(參見例如Wu與Wu，J.Biol.Chem..2624429-4432(1987))、構造作為逆轉錄病毒或其它載體的部分的核酸等。
引入方法包括(但不限于)真皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服途徑。這些化合物或組合物可通過任何便利的途徑投藥，例如通過輸注或濃注、通過經上皮或黏膜皮層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，并可同其它生物活性劑一起投藥。投藥可為全身的或局部的。此外，期望通過任何合適的途徑(包括腦室內和鞘內注射)將本發(fā)明的醫(yī)藥化合物或組合物引入中樞神經系統(tǒng)；例如，連接儲液囊(例如腦室儲液囊)的腦室內導管可有利于腦室內注射。也可采用肺部投藥，例如通過使用吸入器或噴霧器和帶有霧化劑的調配物。
在一具體實施例中，期望將本發(fā)明的醫(yī)藥化合物或組合物局部投予需要治療的區(qū)域；這可通過(例如，但不限于)以下方式達成外科手術期間的局部輸注、外科手術后的局部敷用與(例如)傷口包扎、通過注射、借助導管、借助栓劑或借助植入物，所述植入物為多孔、無孔或凝膠狀材料(包括諸如硅橡膠膜等薄膜或纖維)。優(yōu)選地，當投予本發(fā)明蛋白質(包括抗體)時，必需小心使用蛋白質不吸收的材料。
在另一實施例中，化合物或組合物可在囊泡尤其是脂質體中遞送(參見Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat等人，in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein與Fidler(編輯)，Liss，NewYork，第353-365頁(1989)；Lopez-Berestein，如上，第317-327頁；總體參見上述)。
在又一實施例中，化合物或組合物可以控釋系統(tǒng)遞送。在一個實施例中，可使用泵(參見Langer，上述；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等人，Surgery 88507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一實施例中，可使用聚合材料(參見MedicalApplications of Controlled Release，Langer與Wise(編輯)，CRC Pres.，BocaRaton，Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen與Ball(編輯)，Wiley，New York(1984)；Ranger與Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；同樣參見Levy等人，Science 228190(1985)；During等人，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.71105(1989))。在又一實施例中，可將控釋系統(tǒng)置于靠近治療靶位(即大腦)處，從而僅需要全身劑量的一小部分(參見(例如)Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，上述，第2卷，第115-138頁(1984))。
Langer在綜述中論述了其它控釋系統(tǒng)(Science 2491527-1533(1990))。
在其中本發(fā)明的化合物為編碼蛋白質的核酸的一個特定實施例中，可將這種核酸通過以下方法體內投予以促進其所編碼的蛋白質的表達通過將核酸構造為適當的核酸表達載體的部分并將其投予患者以使其處于細胞內，其中例如通過使用逆轉錄病毒載體(參見美國專利第4,980,286號)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)、或涂以脂質或細胞表面受體或轉染劑，或通過將其連接已知進入細胞核的類同源異形盒肽來投藥(參見(例如)Joliot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868(1991))等等。或者，可通過同源重組將核酸以細胞內方式引入并且并入用于表達的宿主細胞DNA內。
本發(fā)明也提供醫(yī)藥組合物。所述組合物包含治療有效量的化合物與醫(yī)學上可接受的載劑。在特定實施例中，術語“醫(yī)學上可接受的”意思是由聯邦或州政府的管理結構所認可的，或列于美國藥典中或其它通常公認的藥典中可用于動物，并更尤其是用于人類中。術語“載劑”是指與治療劑一起投予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。這些醫(yī)藥載劑可為無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當醫(yī)藥組合物是經靜脈內投予時水為優(yōu)選的載劑。鹽溶液與右旋糖和甘油水溶液也可用作液體載劑，尤其是對于可注射的溶液。合適的醫(yī)藥賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、干脫脂乳、甘油、丙稀、乙二醇、水、乙醇等等。組合物(若需要)也可含有少量濕潤或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可采取以下形式溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋調配物等等。可用傳統(tǒng)粘合劑和載劑(例如甘油三酸酯)將組合物調配為栓劑?？诜{配物可包括標準載劑，例如醫(yī)藥級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。E.W.Martin在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述了合適的醫(yī)藥載劑的實例。這些組合物將含有治療有效量的所述化合物(優(yōu)選的為純化形式)連同合適量的載劑以便提供適于向患者投藥的形式。調配物應適合投藥方式。
在優(yōu)選的實施例中，根據常規(guī)程序將組合物調配成為適合對人類靜脈投藥的醫(yī)藥組合物。一般而言，用于靜脈投藥的組合物為無菌等滲的水性緩沖液中的溶液。必要時，組合物也可包括增溶劑與例如利多卡因的局部麻醉劑以減輕注射部位的疼痛。一般而言，這些成分可單獨提供或以單位劑量形式混合在一起，例如作為密封容器中的干燥凍干粉或無水濃縮物，所述容器例如為標識活性劑數量的安瓿或藥囊。在通過灌輸投予組合物時，可用含有無菌的醫(yī)藥級水或鹽水的灌輸瓶對其進行配制。在通過注射投予組合物時，可提供一安瓿用于注射的無菌水或鹽水以便可將這些成分在投藥前混合。
可將本發(fā)明的化合物調配為中性的或鹽形式。醫(yī)學上可接受的鹽包括那些與陰離子形成的鹽，例如那些源于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽，和那些與陽離子形成的鹽，例如那些源于鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化三鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。
可通過標準臨床技術來測定本發(fā)明的化合物在治療、抑制和預防與本發(fā)明多肽的異常表達和/或活性有關的疾病或病癥中有效的量。此外，可視情況采用體外分析幫助確認最佳劑量范圍。調配物待用的精確劑量也將取決于給藥途徑與疾病或病癥的嚴重性，并且應根據醫(yī)師的判斷和每個患者的情況來決定?？蓮脑醋泽w外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量-反應曲線推斷有效劑量。
對于抗體，投予患者的劑量一般為0.1mg/Kg至100mg/Kg患者體重。優(yōu)選的為，投予患者的劑量為介于0.1mg/Kg與20mg/Kg患者體重之間，更優(yōu)選的為1mg/Kg至10mg/Kg患者體重。一般而言，由于對外來多肽的免疫反應人類抗體在人體內具有比來自其它物種的抗體更長的半衰期。因此，較低劑量的人類抗體和較低頻率的投藥通常是可能的。另外，可通過改性(例如脂化)提高抗體的吸收和組織滲透(例如進入大腦)來降低本發(fā)明抗體的投藥劑量和頻率。
本發(fā)明也提供一種醫(yī)藥封包或試劑盒，其包含一個或一個以上填充一種或一種以上本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的成分的容器。管理制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府機構所規(guī)定的形式的注意事項可視情況附在這個(些)容器上，這個注意事項反應制造、使用或銷售機構對人類投藥的認可。
基于抗體的基因治療可投予包含編碼抗體或其功能性衍生物的序列的核酸作為基因治療來治療、抑制或預防與GPR91的異常表達與/或活性有關的疾病或病癥。基因治療是指通過向受試者投予已表達或可表達的核酸所進行的治療。在本發(fā)明的這個實施例中，核酸產生其所編碼的蛋白質來調節(jié)治療效果。
根據本發(fā)明可使用任何可用于此項技術中的基因治療方法。下文描述示范性方法。
對于基因治療方法的一般性綜述，請參見Goldspiel等人，ClinicalPharmacy 12488-505(1993)；Wu與Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science260926-932(1993)和Morgan與Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)155-215(1993).可使用重組DNA技術領域中通常所知的方法，其描述于Ausubel等人(編輯)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)與Kriegler，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中。
在優(yōu)選的方面，所述化合物包含編碼抗體的核酸序列，所述核酸序列為在合適宿主中表達抗體或其片段或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈的表達載體的部分。尤其是，這些核酸序列具有以可操作方式連接至抗體編碼區(qū)的啟動子，所述啟動子為可誘導的或構成的，并視情況為組織特異性的。在另一特定實施例中，所用的核酸分子中抗體編碼序列和任何其它所要序列側接促進基因組中所要位點的同源重組的區(qū)域，從而提供抗體編碼核酸的染色體內表達(Roller與Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342435-438(1989))。在特定實施例中，所表達的抗體分子為單鏈抗體；或者上述核酸序列包括編碼抗體的重鏈和輕鏈兩者或其片段的序列。
將核酸遞送給患者可為直接的(在這種情況下患者直接暴露于核酸或運載核酸的載體)或間接的(在這種情況下首先用核酸體外轉化細胞，然后將其移植進入患者體內)。這兩種方法分別稱為體內或體外基因治療。
在一個特定實施例中，核酸序列為直接在其經表達產生編碼產物處體內投藥?？赏ㄟ^任何此項技術中已知的多種方法來完成這個過程，例如通過將核酸序列構造為合適的核酸表達載體的部分并將其投予患者以使其處于細胞內，其中例如通過使用缺陷性或經減毒的逆轉錄病毒或其它病毒載體進行感染(參見美國專利第4,980,286號)，或通過直接注射裸DNA，或通過使用微粒轟擊(例如基因槍，Biolistic，Dupont)，或涂以脂質或細胞表面受體或轉染劑，封入脂質體、微粒或微膠囊，或通過將其連接已知進入細胞核的肽進行投藥，通過將其連接經歷受體介導的胞吞作用的配體進行投藥(參見(例如)Wu與Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))(此可用于定靶特異性表達受體的細胞類型)等。在另一實施例中，可形成核酸-配體復合體，其中配體包含融合病毒肽以破壞核內體，從而允許核酸避免溶酶體降解。在又一實施例中，對于細胞特異性吸收和表達可通過定靶特異性受體在體內定靶核酸(參見(例如)PCT公開案WO 92/06180、WO 92/22635、WO92/20316、WO93/14188、WO 93/20221)?；蛘?，可通過同源重組將核酸以細胞內方式引入并且并入用于表達的宿主細胞DNA內(Roller與Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342435-438(1989))。
在一個特定實施例中，使用含有編碼本發(fā)明的抗體的核酸序列的病毒載體。例如，可使用逆轉錄病毒載體(參見Miller et等人，Meth.Enzymol.217581-599(1993))。這些逆轉錄病毒載體含有正確包裝病毒基因組并整合至宿主細胞DNA中所必需的組分。將這些待用于基因治療中的編碼抗體的核酸序列克隆至一個或一個以上的載體中，所述載體促進基因至患者體內的遞送。在Boesen等人Biotherapy 6291-302(1994)中可找到關于逆轉錄病毒載體的更多詳細說明，該文中描述使用逆轉錄病毒載體將mdrl基因遞送至造血干細胞以使干細胞對化學療法更有抵抗力。其它說明基因治療中逆轉錄病毒載體用途的參考文獻為Clowes等人，J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem等人，Blood 831467-1473(1994)；Salmons與Gunzberg，Human GeneTherapy 4129-141(1993)和Grossman與Wilson，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3110-114(1993)。
其它可用于基因治療的病毒載體為腺病毒。對于將基因遞送至呼吸上皮細胞腺病毒為特別有吸引力的載體。腺病毒自然地感染呼吸上皮細胞而在該處引起輕微疾病。基于腺病毒的遞送系統(tǒng)的其它靶點為肝、中樞神經系統(tǒng)、內皮細胞和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞的優(yōu)點。Kozarsky與Wilson，Current Opinion in Genetics and Development 3499-503(1993)提供基于腺病毒的基因治療的綜述。Bout等人，Human Gene Therapy 53-10(1994)說明了使用腺病毒載體將基因轉移至恒河猴呼吸上皮細胞?；蛑委熤惺褂孟俨《镜钠渌鼘嵗稍赗osenfeld等人，Science 252431-434(1991)；Rosenfeld等人，Cell 68143-155(1992)；Mastrangeli等人，J.Clin.Invest.91225-234(1993)；PCT公開案WO94/12649與Wang等人，Gene Therapy2775-783(1995)中找到。在優(yōu)選的實施例中使用腺病毒載體。
也已建議將腺相關病毒(AAV)用于基因治療(Walsh等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)；美國專利申請案第5,436,146號)。
另一種基因治療的方法涉及通過例如下列的方法將基因轉移至組織培養(yǎng)物中的細胞電穿孔、脂質轉染、磷酸鈣介導的轉染或病毒感染。通常，轉移方法包括將可選擇標記物轉移至細胞。然后對這些細胞進行選擇以分離已吸收并正在表達經轉移的基因的那些細胞。然后將那些細胞遞送給患者。
在這個實施例中，在體內投予所得到的重組細胞前將核酸引入細胞。這種引入可通過此項技術中已知的任何方法來進行，這些方法包括(但不限于)轉染、電穿孔、微量注射、使用含有這種核酸序列的病毒或噬菌體載體進行感染、細胞融合、染色體介導的基因轉移、微細胞介導的基因轉移、球粒體融合等。此項技術中已知將外來基因引入細胞的多種技術(參見(例如)Loeffler與Behr，Meth.Enzymol.217599-618(1993)；Cohen等人，Meth.Enzymol.217618-644(1993)；Cline，Pharmac.Ther.2969-92m(1985)并可根據本發(fā)明使用其，只要不破壞接收細胞必需的發(fā)育和生理功能。這些技術應保證將核酸穩(wěn)定地轉移至細胞，以便核酸可由細胞表達并且優(yōu)選地可由其細胞后代遺傳和表達。
可通過此項技術中已知的各種方法將所得的重組細胞遞送給患者。優(yōu)選的為靜脈內投予重組血液細胞(例如造血干細胞或祖細胞)。預計所用的細胞量取決于所要的效果、患者狀態(tài)等，并可由所屬領域的技術人員來決定。
可將核酸引入其中用于基因治療目的的細胞包含任何所要的、可得到的細胞類型，其包括(但不限于)上皮細胞、內皮細胞、角質化細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞，例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒白細胞、嗜酸性粒白細胞、巨核細胞、粒性白細胞的血液細胞；各種干細胞或祖細胞，尤其是造血干細胞或祖細胞，例如從骨髓、臍帶血液、外周血液、胎兒肝臟等中獲得造血干細胞或祖細胞。
在一個優(yōu)選的實施例中，基因治療所用的細胞是患者自身的。在其中將重組細胞用于基因治療的實施例中，將編碼抗體的核酸序列引入細胞以便由細胞或其后代表達它們，然后將這些重組細胞體內投予患者以發(fā)揮治療作用。在一個特定實施例中，使用干細胞或祖細胞。根據本發(fā)明的這個實施例可潛在地使用任何可分離并可體外維持的干細胞與/或祖細胞(參見(例如)PCT公開案WO 94/08598；Stemple與Anderson，Cell 71973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A229(1980)和Pittelkow與Scott，Mayo ClinicProc.61771(1986))。
在一個特定實施例中，為基因治療目的而引入的核酸包含以可操作方式連接于編碼區(qū)的誘導啟動子，以便可通過控制適當轉錄誘導劑的存在或不存在來控制核酸的表達。
使用GPR91的siRNA的治療處理本發(fā)明進一步針對基于RNA干擾(RNAi)的治療，其涉及將本發(fā)明的短干擾RNA(siRNA)或siRNA表達DNA結構投予動物、優(yōu)選的為哺乳動物并最優(yōu)選的為人類患者以治療一種或一種以上所揭示的疾病、病癥或病況(Nature 2001，411494；Target 2003，242；FEBS 2002，527274)。本發(fā)明的治療化合物包括(但不限于)本發(fā)明的siRNA(包括如本文所述的其片段、類似物或衍生物)和與本發(fā)明的siRNA同源的核酸(包括如本文所述的其片段、類似物與衍生物和抗獨特型抗體)。本發(fā)明的siRNA可用于治療、抑制或預防與本發(fā)明多肽的異常表達與/或活性有關的疾病、病癥或病況，其包括(但不限于)任何一種或一種以上的本文所述的疾病、病癥或病況。治療與/或預防與本發(fā)明多肽的異常表達與/或活性有關的疾病、病癥或病況包括(但不限于)減輕與那些疾病、病癥或病況有關的癥狀?？稍诖隧椉夹g中已知的或本文所述的醫(yī)學上可接受的組合物中提供本發(fā)明的抗體。
可在治療上使用本發(fā)明siRNA的方式的概要包括在體內局部或全身地結合本發(fā)明的多核苷酸，或通過siRNA的直接細胞毒性(例如補體介導的細胞毒性(CDC)或效應細胞介導的細胞毒性(ADCC))。下文更詳細地描述這些方法中的一些。利用本文所提供的教示，所屬領域的普通技術人員將知道如何使用本發(fā)明的siRNA達成診斷、監(jiān)測或治療目的而無需不當的實驗。
本發(fā)明的siRNA可方便地與下列物質組合使用其它單克隆或嵌合抗體，或淋巴因子或造血生長因子(例如IL-2、IL-3與IL-7)，其(例如)可增加與抗體相互作用的效應細胞的數目或活性。
本發(fā)明的siRNA可進行單獨投藥或與其它類型的治療(例如放射療法、化學療法、激素療法、免疫療法和抗腫瘤劑)結合。一般而言，優(yōu)選的為投予與患者相同的物種的物種來源或物種反應性(對于siRNA而言)的產物。因此，在一個優(yōu)選的實施例中，將人類抗體、片段衍生物、類似物或核酸投予人類患者用于治療或預防。
針對本發(fā)明多肽的siRNA可用于在動物體內抑制過敏反應。例如，通過投予治療上可接受劑量的本發(fā)明的siRNA或多種siRNA，或本發(fā)明多種siRNA的混合物，或與各種來源的其它siRNA組合投予其，動物可能不會出現對抗原的過敏性反應。
同樣，可以預見克隆編碼針對本發(fā)明多肽的siRNA的基因，所述多肽具有在生物體中引發(fā)過敏與/或免疫反應的潛力，并在用所述siRNA基因轉化生物體以使其表達(例如組成地或誘導地表達等)于所述生物體中。因此，生物體將有效地對由攝取或存在這種免疫/過敏反應性多肽而引起的的過敏性反應產生抵抗性。此外，本發(fā)明siRNA的這種用途在預防與/或改善自體免疫疾病與/或病癥方面可具有特殊效用，因為這些病況一般起因于針對內源性蛋白質的siRNA。例如，在其中本發(fā)明的多肽負責調節(jié)對自身抗原的免疫反應的情況下，用包含任何本文中所揭示的或此項技術中另外已知的啟動子，以及編碼針對本發(fā)明多肽的siRNA的多核苷酸的結構來轉化生物體和/或個體可有效地抑制生物體的免疫系統(tǒng)對(多個)自身抗原產生免疫反應。本文中在它處提供了本發(fā)明的治療與/或基因治療應用的詳細說明。
基于siRNA的基因治療在一個特定實施例中，可投予包含編碼siRNA或其功能性衍生物的序列的核酸作為基因治療來治療、抑制或預防與本發(fā)明多肽的異常表達與/或活性有關的疾病或病癥。基因治療是指通過向受試者投予已表達或可表達的核酸所進行的治療。在本發(fā)明的這個實施例中，核酸產生其所編碼的蛋白質來調節(jié)治療效果。
根據本發(fā)明可使用任何可用于此項技術中的基因治療方法。下文描述示范性方法。
對于基因治療方法的一般性綜述，請參見Goldspiel等人，ClinicalPharmacy 12488-505(1993)；Wu與Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science260926-932(1993)和Morgan與Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)155-215(1993).可使用重組DNA技術領域中通常所知的方法，其描述于Ausubel等人(編輯)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)與Kriegler，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中。
在優(yōu)選的方面，所述化合物包含編碼siRNA的核酸序列，所述核酸序列為在合適宿主中表達抗體或其片段或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈的表達載體的部分。尤其是，這些核酸序列具有以可操作方式連接至抗體編碼區(qū)的啟動子，所述啟動子為可誘導的或構成的，并視情況為組織特異性的。在另一特定實施例中，所用的核酸分子中抗體編碼序列和任何其它所要序列側接促進基因組中所要位點的同源重組的區(qū)域，從而提供抗體編碼核酸的染色體內表達(Roller與Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342435-438(1989))。在特定實施例中，所表達的抗體分子為單鏈抗體；或者上述核酸序列包括編碼抗體的重鏈和輕鏈兩者或其片段的序列。
將核酸遞送給患者可為直接的(在這種情況下患者直接暴露于核酸或運載核酸的載體)或間接的(在這種情況下首先用核酸體外轉化細胞，然后將其移植進入患者體內)。這兩種方法分別稱為體內或體外基因治療。
在一個特定實施例中，核酸序列為直接在其經表達產生編碼產物處體內投藥。可通過任何此項技術中已知的多種方法來完成這個過程，例如通過將核酸序列構造為合適的核酸表達載體的部分并將其投予患者以使其處于細胞內，其中例如通過使用缺陷性或經減毒的逆轉錄病毒或其它病毒載體進行感染(參見美國專利第4,980,286號)，或通過直接注射裸DNA，或通過使用微粒轟擊(例如基因槍，Biolistic，Dupont)，或涂以脂質或細胞表面受體或轉染劑，封入脂質體、微?；蛭⒛z囊，或通過將其連接已知進入細胞核的肽進行投藥，通過將其連接經歷受體介導的胞吞作用的配體進行投藥(參見(例如)Wu與Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))(此可用于定靶特異性表達受體的細胞類型)等。在另一實施例中，可形成核酸-配體復合體，其中配體包含融合病毒肽以破壞核內體，從而允許核酸避免溶酶體降解。在又一實施例中，對于細胞特異性吸收和表達可通過定靶特異性受體在體內定靶核酸(參見(例如)PCT公開案WO 92/06180、WO 92/22635、WO 92/20316、WO 93/14188、WO 93/20221)。或者，可通過同源重組將核酸以細胞內方式引入并且并入用于表達的宿主細胞DNA內(Roller與Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342435-438(1989))。
在一個特定實施例中，使用含有編碼本發(fā)明的siRNA的核酸序列的病毒載體。例如，可使用逆轉錄病毒載體(參見Miller et等人，Meth.Enzymol.217581-599(1993))。這些逆轉錄病毒載體含有正確包裝病毒基因組并整合至宿主細胞DNA中所必需的組分。將這些待用于基因治療中的編碼抗體的核酸序列克隆至一個或一個以上的載體中，所述載體促進基因至患者體內的遞送。在Boesen等人Biotherapy 6291-302(1994)中可找到關于逆轉錄病毒載體的更多詳細說明，該文中描述使用逆轉錄病毒載體將mdrl基因遞送至造血干細胞以使干細胞對化學療法更有抵抗力。其它說明基因治療中逆轉錄病毒載體用途的參考文獻為Clowes等人，J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem等人，Blood 831467-1473(1994)；Salmons與Gunzberg，Human GeneTherapy 4129-141(1993)和Grossman與Wilson，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3110-114(1993)。
其它可用于基因治療的病毒載體為腺病毒。對于將基因遞送至呼吸上皮細胞腺病毒為特別有吸引力的載體。腺病毒自然地感染呼吸上皮細胞而在該處引起輕微疾病?；谙俨《镜倪f送系統(tǒng)的其它靶點為肝、中樞神經系統(tǒng)、內皮細胞和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞的優(yōu)點。Kozarsky與Wilson，Current Opinion in Genetics and Development 3499-503(1993)提供基于腺病毒的基因治療的綜述。Bout等人，Human Gene Therapy 53-10(1994)說明了使用腺病毒載體將基因轉移至恒河猴呼吸上皮細胞。基因治療中使用腺病毒的其它實例可在Rosenfeld等人，Science 252431-434(1991)；Rosenfeld等人，Cell 68143-155(1992)；Mastrangeli等人，J.Clin.Invest.91225-234(1993)；PCT公開案WO94/12649與Wang等人，Gene Therapy2775-783(1995)中找到。在優(yōu)選的實施例中使用腺病毒載體。
也已建議將腺相關病毒(AAV)用于基因治療(Walsh等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)；美國專利申請案第5,436,146號)。
另一種基因治療的方法涉及通過例如下列的方法將基因轉移至組織培養(yǎng)物中的細胞電穿孔、脂質轉染、磷酸鈣介導的轉染或病毒感染。通常，轉移方法包括將可選擇標記物轉移至細胞。然后對這些細胞進行選擇以分離已吸收并正在表達經轉移的基因的那些細胞。然后將那些細胞遞送給患者。
在這個實施例中，在體內投予所得到的重組細胞前將核酸引入細胞。這種引入可通過此項技術中已知的任何方法來進行，這些方法包括(但不限于)轉染、電穿孔、微量注射、使用含有這種核酸序列的病毒或噬菌體載體進行感染、細胞融合、染色體介導的基因轉移、微細胞介導的基因轉移、球粒體融合等。此項技術中已知將外來基因引入細胞的多種技術(參見(例如)Loeffler與Behr，Meth.Enzymol.217599-618(1993)；Cohen等人，Meth.Enzymol.217618-644(1993)；Cline，Pharmac.Ther.2969-92m(1985)并可根據本發(fā)明使用其，只要不破壞接收細胞必需的發(fā)育和生理功能。這些技術應保證將核酸穩(wěn)定地轉移至細胞，以便核酸可由細胞表達并且優(yōu)選地可由其細胞后代遺傳和表達。
可通過此項技術中已知的各種方法將所得的重組細胞遞送給患者。優(yōu)選的為靜脈內投予重組血液細胞(例如造血干細胞或祖細胞)。預計所用的細胞量取決于所要的效果、患者狀態(tài)等，并可由所屬領域的技術人員來決定。
可將核酸引入其中用于基因治療目的的細胞包含任何所要的、可得到的細胞類型，其包括(但不限于)上皮細胞、內皮細胞、角質化細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞，例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒白細胞、嗜酸性粒白細胞、巨核細胞、粒性白細胞的血液細胞；各種干細胞或祖細胞，尤其是造血干細胞或祖細胞，例如從骨髓、臍帶血液、外周血液、胎兒肝臟等中獲得造血干細胞或祖細胞。
在一個優(yōu)選的實施例中，基因治療所用的細胞是患者自身的。在其中將重組細胞用于基因治療的實施例中，將編碼siRNA的核酸序列引入細胞以便由細胞或其后代表達它們，然后將這些重組細胞體內投予患者以發(fā)揮治療作用。在一個特定實施例中，使用干細胞或祖細胞。根據本發(fā)明的這個實施例可潛在地使用任何可分離并可體外維持的干細胞與/或祖細胞(參見(例如)PCT公開案WO 94/08598；Stemple與Anderson，Cell 71973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A229(1980)和Pittelkow與Scott，Mayo ClinicProc.61771(1986))。
基因剔除動物在另一方面，本發(fā)明提供基因剔除動物，其包含在其內源性GPR91受體基因中具有雜合或純合破壞的基因組，此抑制或阻止生物功能性GPR91受體蛋白質的表達。優(yōu)選的為，本發(fā)明的基因剔除動物在其內源性GPR91受體基因中具有純合破壞。優(yōu)選的為本發(fā)明的基因剔除動物為小鼠?？墒褂檬炀毤夹g人員所知的技術容易地制造這些基因剔除動物?？梢詭追N方法完成基因破壞，這些方法包括將終止密碼子引入多肽編碼序列的任何部分中以產生生物學上失活的多肽，將突變引入啟動子或其它調控序列以抑制或阻止多肽表達，將外源性序列插入基因中以使基因失活，和從基因中刪除序列。
多種技術可用于將特定DNA序列引入哺乳動物種系中并實現將這些序列(轉基因)穩(wěn)定地傳給每個后代。最常用的技術為將DNA直接微量注射入受精卵母細胞的原核中。源于這些卵母細胞的小鼠或其它動物將為轉基因的始創(chuàng)者(發(fā)生率約為10％至20％)，其經繁殖而產生不同的轉基因小鼠系。通過胚胎操作與微量注射產生轉基因動物(尤其是例如小鼠的動物)的方法在此項技術中已成為常規(guī)方法，例如美國專利第4,736,866、4,870,009和4,873,191號和在Hogan，B.，Manipulating the Mouse Embryo(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)中?？墒褂妙愃频姆椒óa生其它轉基因動物。
胚胎干細胞(“ES細胞”)技術可用于制造特定地刪除基因的基因剔除小鼠(和其它動物)。將可體外培養(yǎng)并經基因修飾的全能胚胎干細胞聚集或微量注射至小鼠胎胚中以產生嵌合小鼠，其可將這種基因修飾傳給其后代。通過定向繁殖，可因此獲得缺乏這個基因的小鼠。幾種其它方法可用于產生經基因修飾的動物，例如胞質內精子注射技術(ICSI)可用于轉基因小鼠的產生。這種方法要求將精母細胞的頭部微量注射至未受精的卵母細胞的細胞質內，從而引起卵母細胞受精并隨后激活受孕前胚胎的適當細胞分裂。將因此獲得的小鼠胎胚轉入假孕受者雌鼠中。這個雌鼠將生出一窩小鼠。在應用于轉基因小鼠產生的ICSI中，用含有所需的DNA分子(轉基因)的溶液培育精子或精母細胞頭部懸浮液。這些與微量注射后充當外來DNA載劑媒介的精子相互作用。一旦處于卵母細胞內部，DNA即整合至基因組中而產生轉基因小鼠。這種方法與迄今使用傳統(tǒng)前核微量注射實驗規(guī)程所獲得的產率相比呈現出較高的轉基因小鼠產率(高于80％)。
實例通過下列實例可進一步說明本發(fā)明，但應了解所包括的這些實例僅用于說明的目的，并且不希望其限制本發(fā)明的范疇，除非另外明確指出。
實例1肥大細胞差異表達的GPR91的鑒別使用微陣列技術定量比較肥大細胞、THP1和PBMC間的基因表達，并鑒別相對THP1和PBMC在肥大細胞中那些優(yōu)先表達的基因(大小2.5倍)。
將人類臍血CD34+細胞(Bio-Whittaker，Walkersville，MD)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)達9周，培養(yǎng)基由以下物質組成RPMI1640(Invitrogen)，補充20％FBS(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2-ME、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1μg/ml慶大霉素、80ng/ml SCF、50ng/mlIL-6與5ng/ml IL-10。用抗類胰蛋白酶型mAb將細胞染色以測定肥大細胞的百分比。細胞懸浮液的接種密度為5×105細胞/ml并且一周更換一次補充細胞因子的培養(yǎng)基。使用重組人類IgE進行IgE交聯實驗。根據ATCC的建議培養(yǎng)其它細胞系。
通過使用免疫磁珠(Dynal)自細胞中去除分選出CD14和CD15表達細胞，并且在第8周收獲剩余的細胞。以基于Amersham的Ficoll-Paque淋巴細胞分離程序的梯度離心從健康供體的血液中分離PBMC細胞。在具有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類THP1細胞。使用Qiagen Total RNA提取試劑盒根據廠商的說明從這些細胞類型中分別分離RNA。
使用Affymetrix表達分析服務進行GeneChip表達分析。Affymetrix的標準分析(基因芯片人類基因組U133組)由兩個含有超過1百萬的唯一寡核苷酸的微陣列組成，這些寡核苷酸覆蓋超過39,000個轉錄物變異體，其又代表超過33,000個人類基因。
使用分別來自肥大細胞、THP1和PBMC培養(yǎng)物的高質量的總RNA獲得生物素標記的cRNA。使用存在于總RNA樣品中的poly(A)RNA經逆轉錄合成單股的cDNA，并然后將其轉化成雙股cDNA。在生物素化的UTP和CTP存在下進行體外轉錄反應以產生生物素標記的cRNA。然后在熱量和Mg2+存在下使cRNA分段。將來自每種細胞類型的片段cRNA雜交至測試陣列以評定靶物質量和標記效率。所后對測試陣列進行洗滌，用抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅蛋白染色，并使用GeneArray掃描儀進行掃描。使用質量控制參數分析圖像，所述參數例如管家基因的3′/5′比、刺突對照cRNA序列的存在、噪音(Q值)、比例因數等。評定后，在45℃下將cRNA雜交至U133標準陣列16小時。然后洗滌陣列，用抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅蛋白染色，并使用GeneArray掃描儀掃描。對陣列上的每種轉錄物使用Affymetrix MAS5.0軟件從黑白圖像提取所獲得的表達數據，并且采用統(tǒng)計學算法來計算定量值(信號強度)和定性值(存在或不存在)。
人類GeneChip微陣列數據的肥大細胞、PBMC和THP-1細胞間的比較分析顯示未知功能的G蛋白偶聯受體(GPCR)在這種體外培養(yǎng)的初級肥大細胞中高表達，但在PBMC和HTP-1細胞中僅以低水平表達。
數據庫對照揭示這種GPCR(GenBank登記號NM 348078、BC030948、AF348078、AC068647和其它同緣序列)稱為GPR91。
這種對照公共GenBank數據庫的BLAST序列相似性搜索揭示GPR91與P2Y嘌呤型受體、GPR80(GPR99)和半胱氨酰白三烯受體共享顯著的同源性。例如，使用計算機算法DNAstar的成對比較顯示GPR91與GPR80共享37.3％的氨基酸序列一致性，與P2Y受體家族的六個已知成員共享29.9％至35.7％氨基酸序列一致性，并且也與半胱氨酰白三烯受體CysLT1與CysLT2共享29.3％至31.6％的序列一致性。GPR91與其G蛋白的偶聯特異性的預測指出其最可能與和Gαq/11亞型的相互作用有關。這個預測是基于由受體的細胞內結構域支配受體-D蛋白相互作用的特異性的事實。使用結合模式發(fā)現和膜拓撲結構預測的數據挖掘方法來發(fā)現特異性偶聯特定功能種類的G蛋白的GPCR序列細胞內結構域中的氨基酸殘基的模式。
實例2在使用Primer Express 2.0(Applied Biosystems，Inc.)進行挑選后，從GPR91核苷酸序列中合成兩條寡核苷酸引物5′-TACTGCTCTGCCCCTTGAAAA-3′(SEQ ID NO 4)與5′-ACCACTGCCATGATGACCAA-3′(SEQ ID NO 5)，并然后使用其監(jiān)測GPR91的表達。
以ABI Prism 7900(Applied Biosystems，Inc.)序列檢測系統(tǒng)，使用CYBRGreen試劑根據廠商的說明進行實時定量PCR。分離總RNA以測量下列細胞中的GPR91 mRNA含量Daudi(源自克勃氏(Burkitt′s)淋巴瘤的B淋巴母細胞系，ATCC第CCL-213號)、THP-1(單核細胞白血病細胞系，ATCC第TIB202號)、HMC-1(乳腺瘤細胞系)、外周血單核細胞(PBMC)、原始單核細胞、初級B細胞、初級嗜中性粒白細胞、體外培養(yǎng)8-9周的肥大細胞。來自腦、心、腎、肝、肺、脾、胸腺和氣管的第一股cDNA自DB BioscienceClontech(Palo Alto，CA)獲得。
將來自上文所述細胞的每種等量的RNA用于逆轉錄反應以生成第一股cDNA，第一股cDNA在定量PCR反應中用作模板以獲得閾擴增循環(huán)(Ct)。使用來自18S RNA的對照Ct對這個Ct進行標準化獲得ΔCt。為比較GPR91在不同細胞下和組織中表達的相對基因表達水平，通過使用最低表達水平作為基數計算ΔΔCt值，然后將其轉化為相對表達差異值。定量RT-PCR分析顯示GPR91 mRNA在人類肥大細胞中以最高水平表達，而在腎、脾、THP-1和PBMC中以中等水平表達(表1)。
表1 通過定量RT-PCR評定GPR91 mRNA表達曲線

實例3GPR91的表達結構通過PCR從肥大細胞RNA擴增GPR91的編碼序列(SEQ ID NO 1)并然后將其克隆至pcDNA3.1TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。GPR91表達結構的序列經檢驗與NM 348078、BC030948、AF348078和AC068647(GenBank登記號)相同。通過在編碼區(qū)的多個位置插入表位標簽來構造多種突變GPR91表達結構。在GPR91-熒光素酶報告分析中，其中一個插入變異GPR91-20Flag(SEQ ID NO 3)比野生型GPR91顯示出更強的活性(表2)。經證實這種組成型活性突變體可用于解決下游信號轉導和基因活化。PCR SOEing生成GPR91-20Flag結構((Ho等人，1989 Gene 7751-59；Horton等人，1990 Biotechniques 8528-535)，其含有一個插入最初的20個氨基酸殘基后的Flag標簽序列(SEQ ID NO 3與SEQUENCE 2)。
表2用Luc報告質粒共同轉染的野生型與標記的GPR91表達結構的熒光素酶分析

實例4通過GPR91激活NFAT和AP1信號通路使用熒光素酶報告分析研究GPR91激活的細胞內信號通路。使用Lipofectamine 2000系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA)執(zhí)行瞬時轉染。對于西方墨點分析，將20微克質粒DNA轉染至100mm組織培養(yǎng)皿中的293T細胞中；并且在40小時以后，以PBS基無酶的細胞解離緩沖液(Invitrogen)收獲細胞，并如以下段落中所述處理細胞。對于熒光素酶報告分析，在HMC-1細胞中，用Mercury Pathway Profiling報告質粒或熒光素酶報告質粒(用以監(jiān)測肥大細胞活化)(DB BioScience Clontech，Polo Alto，CA)和一個對照熒光素酶質粒pRL-SChA共同轉染GPR91表達結構。40小時后收獲細胞，并使用雙重熒光素酶分析試劑盒根據廠商的實驗規(guī)程(Promega，Madison，WI)分析熒光素酶的活性。
通過將經PCR擴增的來自人類IL8、IL13、TNF-α、類胰蛋白酶β1、類胰蛋白酶β2、FcεRIα的啟動子序列和基因插入無啟動子的熒光素酶報告質粒載體TA-Luc(DB Bioscience Clontech)中，來生成監(jiān)測肥大細胞活化的螢火蟲熒光素酶報告結構。由于這些啟動子在免疫反應中具有關鍵作用，所以選擇它們。
在我們的分析中所用的Mercury Pathway Profiling熒光素酶報告物(DBBioScience Clontech)中，以兩個獨立的實驗用GPR91wt分別將熒光素報告物NFAT-Luc與AP1-Luc激活約20倍與約5倍(表3)。觀察到用插入突變結構GPR91-20Flag可更強地激活NFAT-Luc報告物，其顯示出比GPR91高出3倍多的活性(表2)。這些結果說明人類肥大細胞、HMC-1的穩(wěn)定細胞系中GPR91的表達激活了經由轉錄因子NFAT與AP1介導的細胞內信號通路。為證實GPR91激活了經由使鈣調神經磷酸酶和GPR91活化的細胞內鈣流動所介導的信號通路，我們測試熟知的鈣調神經磷酸酶抑制劑，環(huán)孢霉素A是否可以阻斷GPR91對NFAT的活化。如表4中所示，微摩爾或亞微摩爾濃度的環(huán)孢霉素A使GPR91對NFAT-Luc報告物的刺激作用降低82-87％。這些證據證實GPR91通過細胞內鈣流動和鈣調神經磷酸酶的活化來激活轉錄因子NFAT。這個過程可以GPR91募集Gαq/11(或類q/11)亞單位開始，Gαq/11(或類q/11)亞單位又激活G蛋白和磷脂酶Cβ并產生細胞內鈣流動。
表3 用Luc報告質粒共同轉染的GPR91表達結構的熒光素酶分析

表4 環(huán)孢霉素A對GPR91活性的抑制

實例5GPR91提高細胞因子和類胰蛋白酶啟動子的活性分泌細胞因子和釋放類胰蛋白酶為肥大細胞活化的標志，肥大細胞活化伴隨著增加從頭合成所釋放的蛋白質。為研究GPR91對類胰蛋白酶和細胞因子的從頭合成和啟動子活化的作用，我們使用含有類胰蛋白酶β1、類胰蛋白酶β2、IL8、IL13、TNFα、FcεRIα和啟動子的螢火蟲熒光素酶報告物在HMC-1細胞中進行瞬時轉染熒光素酶分析。這些結果(表5)顯示當用GPR91-20Flag共同轉染時，IL8與IL13熒光素酶報告物活性對比用載體pcDNA3.1共同轉染增加高達6.5至7.2倍，并且TNFa、類胰蛋白酶β1與β2熒光素酶報告物活性增加高達2.5至3.5倍(表5)。
表5 GPR91-20Flag激活類胰蛋白酶和細胞因子基因啟動子的熒光素酶報告分析

實例6篩選和鑒別GPR91配體的方法存在多種方法可用于篩選或鑒別GPR91的(多個)配體。這些方法是基于測量細胞內鈣流動或與Got亞單元結合的GTP，其是由配體與GPR91結合所引發(fā)的。這些方法簡單描述如下
A結合GPCR的配體的鈣成像分析用候選GPCR瞬時或穩(wěn)定轉染細胞(例如CHO、293T或NIH3T3)，并將其接種于高處理量細胞培養(yǎng)皿(96或384孔)中。然后對細胞加載對鈣靈敏的熒光染料指示劑，例如4-(6-乙酰氧基甲氧基-2，7-二氯-3-氧-9-占噸基)-4’-甲基-2，2’-(亞乙二氧基)雙苯胺-N，N，N’，N’-四乙酸四(乙酰氧基甲基)酯(Fluo 3-AM)或Fura-2-五(乙酰氧基甲基)酯(Fura 2-AM)。在將化合物加入細胞培養(yǎng)孔后，可通過熒光成像閱讀板儀(FLIPR)或其它熒光信號檢測裝置測量熒光信號。(參考文獻J.Biol.Chem.2001，2768608-8615；J.Biomol.Screening 2002，7233-246)。
B結合GPCR的配體的黑素細胞分析黑素細胞為含有顏料顆粒(黑素體)的爪蟾細胞，顏料顆粒在細胞質中的運動受GPCR活性和cAMP與甘油二酯的第二信使含量影響。當GPCR被其配體激活時，其又可激活Gq或Gs，導致黑素體經歷快速分布于整個細胞中并且使細胞變得黑暗。爪蟾黑素細胞可用GPR91轉染，并可接受激動劑化合物處理。可通過微型板閱讀器或視頻圖像系統(tǒng)檢測黑素體運動和細胞顏色改變。(參考文獻J.Biol.Chem.1993，2685957-5964；J.Biol.Chem.1999，2748597-8603)。這種篩選技術已描述于PCT WO92/01810中，并以以引用的方式并入本文。
C結合GPR91的配體的水母發(fā)光蛋白分析將細胞(例如CHO、293T和NIH3T3)用GPR91和水母發(fā)光蛋白表達質粒瞬時或穩(wěn)定地共同轉染，并用腔腸素(一種水母發(fā)光蛋白輔因子)培育，腔腸素與apoaequorin相互作用形成水母發(fā)光蛋白。當用(多種)激動劑化合物刺激經轉染的細胞時，水母發(fā)光蛋白將響應于細胞內鈣含量的增加而發(fā)光，此增加可通過光度計來檢測。(參考文獻Cell Calcium 1993，14663-671；Analytical Biochem.1993，209343-347)。
D結合GPR91的配體的鳥嘌呤核苷酸交換分析非活性狀態(tài)結合GDP的G蛋白的α亞單位與β亞單位密切相關，β亞單位定靶于原生質膜。配體結合GPR91依靠鳥嘌呤核苷酸交換引發(fā)異三元體G蛋白的活化，從而將α亞單位轉變成募集至GPR91的GTP結合狀態(tài)。已很好地證明可使用這個反應評定GPR91和配體的相互作用。簡而言之，分離用特異性GPCR轉染的細胞的膜質部分，并將其用例如35S-GTPγS(鳥嘌呤核苷5′-3-O-(硫)三磷酸酯)或Eu-GTP(PerkinElmer Life Science)的標記GTP來培育。洗滌后，通過濾膜結合分析測定膜質部分中結合于GPCR的GTP，并通過放射性閃爍計數器或熒光閱讀板來進行檢測。(參考文獻J.Biol.Chem.2002，27731459-31465；J.Biol.Chem.1990，26518707-18712)。
E.結合GPCR的配體的基于轉錄因子(NFAT)的報告分析激動劑與GPR91的結合和隨后的鈣流動可激活活化T細胞核因子(NFAT)(參考文獻Cell 2002，109S67-S79；Ann.Rev.Immunol.1997，15707-747)。如果將NFAT連接至報告系統(tǒng)，則可利用這個特點篩選配體或激動劑化合物，報告系統(tǒng)例如熒光素酶(DB BioSciences Clontech，Palo Alto，CA)、β-內酰胺酶或綠色熒光蛋白(DB BioSciences Clontech，Palo Alto，CA)。(參考文獻Yang J.等人.2003，J.Biol.Chem.278，in press)。
F結合GPR91的配體的由鉀決定性電流分析微量注射爪蟾卵母細胞(或哺乳動物肌細胞)，其具有編碼GPCR的RNA和鉀通道(Kir3.1-3.4)。如果配體結合在卵母細胞表面上表達的GPCR，則其將激活GPCR，從而引起從異三元體G蛋白中釋放Gβγ亞單位并隨后激活鉀通道。可用電記錄器記錄電流。(參考文獻Nature 2001，409202-205；J.Biol.Chem.2000，27530531-30536；J.Biol.Chem.1995，27029059-29062)。
G.標題方法另一種方法涉及用編碼GPR91的哺乳動物表達質粒連同由哺乳動物表達質粒cDNA組成的混合物共同轉染HEK-293細胞，所述cDNA編碼GU15(Wilkie T.M.等人Proc Natl Acad Sci USA 1991 8810049-10053)、GU16(Amatruda T.T.等人Proc Natl Acad Sci USA 1991 85587-5591)和三種稱為Gqi5、Gqs5和Gqo5的嵌合G蛋白(Conklin B R等人，Nature 1993 363274-276，Conklin B.R.等人，Mol Pharmacol 1996 50885-890)。在24小時培育后，將經轉染的HEK-293細胞放入poly-D-賴氨酸涂布的96孔黑色/透明板中(Becton Dickinson，Bedford，Mass.)。
在添加測試配體后在FLIPR(熒光成像閱讀板儀，Molecular Devices，Sunnyvale，Calif.)上分析細胞的鈣流動反應。配體的鑒別后，進行隨后的實驗以確定(若存在)何種G蛋白是功能反應所需要的，上述配體刺激表達既定的GPR和G蛋白混合物的HEK-293細胞中的鈣流動。然后用GPR91轉染HEK-293細胞，或用GPR91和G015、GD16、GqiS、Gqs5或Gqo5共同轉染。如果GPR91要求存在一種或一種以上的G蛋白用于HEK-293細胞中的功能性表達，則用以產生最佳反應的G蛋白共同轉染的HEK-293細胞進行所有的后續(xù)實驗?；蛘?，受體可表達于例如RBL-2H3的不同細胞系中，而無需額外的G蛋白。
實例7琥珀酸鹽通過GPR91刺激肥大細胞中的鈣流動最近證實琥珀酸鹽可激活GPR91轉染的293細胞((He，W.等人，2004，Nature 429188-193)。因此，使用琥珀酸鹽作為配體研究通過GPR91對肥大細胞的活化。在這項研究中使用三種類型的人類肥大細胞HMC-1、LAD2(Kirshenbaum，A.S.等人，2003 Leukemia Res.27677-682)和CBMC(源于臍帶血的肥大細胞)。如表6中所示，使用半定量基于凝膠的RT-PCR分析，GPR91在LAD2和CBMC細胞中高度表達，但不在HMC-1細胞表達。
表6 肥大細胞中GPR91 mRNA含量的RT-PCR分析

使用市售的Calcium 3 Assay試劑盒和FlexStation II(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)進行鈣流動分析。這些結果顯示琥珀酸鹽以劑量依賴方式刺激LAD2細胞中的鈣流動，并且估計50％活化水平(EC50)下的有效濃度為約180μM(表7)。類似地，琥珀酸鹽在CBMC中誘導鈣流動(數據未顯示)。相反，琥珀酸鹽在HMC-1細胞中不引發(fā)任何的鈣流動(表7)，這歸結為在這些細胞中缺少GPR91的表達。這些發(fā)現說明琥珀酸鹽在肥大細胞中通過GPR91介導的信號通路激活鈣流動。
表7 在LAD2和HMC-1細胞中響應于琥珀酸鹽處理的鈣流動峰值讀數

序列表<110>唐納士公司(TANOX，INC.)<120>人類肥大細胞表達的膜蛋白<130>Case 1043<150>60/483,360<151>2003-06-27<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1380<212>DNA<213>人類<400>1ggttatggtt taactcagca gaatttgttg aacaactacg acatgctggg gatcatggca 60tggaatgcaa cttgcaaaaa ctggctggca gcagaggctg ccctggaaaa gtactacctt 120tccatttttt atgggattga gttcgttgtg ggagtccttg gaaataccat tgttgtttac 180ggctacatct tctctctgaa gaactggaac agcagtaata tttatctctt taacctctct 240gtctctgact tagcttttct gtgcaccctc cccatgctga taaggagtta tgccaatgga 300aactggatat atggagacgt gctctgcata agcaaccgat atgtgcttca tgccaacctc 360tataccagca ttctctttct cacttttatc agcatagatc gatacttgat aattaagtat 420cctttccgag aacaccttct gcaaaagaaa gagtttgcta ttttaatctc cttggccatt 480tgggttttag taaccttaga gttactaccc atacttcccc ttataaatcc tgttataact 540gacaatggca ccacctgtaa tgattttgca agttctggag accccaacta caacctcatt 600tacagcatgt gtctaacact gttggggttc cttattcctc tttttgtgat gtgtttcttt 660tattacaaga ttgctctctt cctaaagcag aggaataggc aggttgctac tgctctgccc 720cttgaaaagc ctctcaactt ggtcatcatg gcagtggtaa tcttctctgt gctttttaca 780ccctatcacg tcatgcggaa tgtgaggatc gcttcacgcc tggggagttg gaagcagtat 840cagtgcactc aggtcgtcat caactccttt tacattgtga cacggccttt ggcctttctg 900aacagtgtca tcaaccctgt cttctatttt cttttgggag atcacttcag ggacatgctg 960atgaatcaac tgagacacaa cttcaaatcc cttacatcct ttagcagatg ggctcatgaa1020ctcctacttt cattcagaga aaagtgaggg gcttgtgaaa cagattgttc tacagatgaa1080tctgtaagcc agttacagtt tgccttaact catagacatc aatcagagag tgtcacagat1140ttaaccttga tctaaagaca agttgtaccc agagtatgtg aaaagaatgg gacgacaaga1200atgtactggt ttcttcctct aagaattgaa aggagttgaa ctgccttatg tttgggcatg1260taactccaaa atactaggta gtataaggct ttctcaatca gtgcaaaaat ggaagatata1320
taaagcaaca agttgtctgc atttgatcac tggtcagatt gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380<210>2<211>330<212>PRT<213>人類<400>2Met Ala Trp Asn Ala Thr Cys Lys Asn Trp Leu Ala Ala Glu Ala Ala1 5 10 15Leu Glu Lys Tyr Tyr Leu Ser Ile Phe Tyr Gly Ile Glu Phe Val Val20 25 30Gly Val Leu Gly Asn Thr Ile Val Val Tyr Gly Tyr Ile Phe Ser Leu35 40 45Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asn Ile Tyr Leu Phe Asn Leu Ser Val Ser50 55 60Asp Leu Ala Phe Leu Cys Thr Leu Pro Met Leu Ile Arg Ser Tyr Ala65 70 75 80Asn Gly Asn Trp Ile Tyr Gly Asp Val Leu Cys Ile Ser Asn Arg Tyr85 90 95Val Leu His Ala Asn Leu Tyr Thr Ser Ile Leu Phe Leu Thr Phe Ile100 105 110Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Lys Tyr Pro Phe Arg Glu His Leu115 120 125Leu Gln Lys Lys Glu Phe Ala Ile Leu Ile Ser Leu Ala Ile Trp Val130 135 140Leu Val Thr Leu Glu Leu Leu Pro Ile Leu Pro Leu Ile Asn Pro Val145 150 155 160Ile Thr Asp Asn Gly Thr Thr Cys Asn Asp Phe Ala Ser Ser Gly Asp165 170 175Pro Asn Tyr Asn Leu Ile Tyr Ser Met Cys Leu Thr Leu Leu Gly Phe180 185 190Leu Ile Pro Leu Phe Val Met Cys Phe Phe Tyr Tyr Lys Ile Ala Leu195 200 205Phe Leu Lys Gln Arg Asn Arg Gln Val Ala Thr Ala Leu Pro Leu Glu210 215 220Lys Pro Leu Asn Leu Val Ile Met Ala Val Val Ile Phe Ser Val Leu225 230 235 240
Phe Thr Pro Tyr His Val Met Arg Asn Val Arg Ile Ala Ser Arg Leu245 250 255Gly Ser Trp Lys Gln Tyr Gln cys Thr Gln Val Val Ile Asn Ser Phe260 265 270Tyr Ile Val Thr Arg Pro Leu Ala Phe Leu Asn Ser Val Ile Asn Pro275 280 285Val Phe Tyr Phe Leu Leu Gly Asp His Phe Arg Asp Met Leu Met Asn290 295 300Gln Leu Arg His Asn Phe Lys Ser Leu Thr Ser Phe Ser Arg Trp Ala305 310 315 320His Glu Leu Leu Leu Ser Phe Arg Glu Lys325 330<210>3<211>1029<212>DNA<213>人類<400>3atgctgggga tcatggcatg gaatgcaact tgcaaaaact ggctggcagc agaggctgcc 60gactacaaag acgatgacga caagctggaa aagtactacc tttccatttt ttatgggatt 120gagttcgttg tgggagtcct tggaaatacc attgttgttt acggctacat cttctctctg 180aagaactgga acagcagtaa tatttatctc tttaacctct ctgtctctga cttagctttt 240ctgtgcaccc tccccatgct gataaggagt tatgccaatg gaaactggat atatggagac 300gtgctctgca taagcaaccg atatgtgctt catgccaacc tctataccag cattctcttt 360ctcactttta tcagcataga tcgatacttg ataattaagt atcctttccg agaacacctt 420ctgcaaaaga aagagtttgc tattttaatc tccttggcca tttgggtttt agtaacctta 480gagttactac ccatacttcc ccttataaat cctgttataa ctgacaatgg caccacctgt 540aatgattttg caagttctgg agaccccaac tacaacctca tttacagcat gtgtctaaca 600ctgttggggt tccttattcc tctttttgtg atgtgtttct tttattacaa gattgctctc 660ttcctaaagc agaggaatag gcaggttgct actgctctgc cccttgaaaa gcctctcaac 720ttggtcatca tggcagtggt aatcttctct gtgcttttta caccctatca cgtcatgcgg 780aatgtgagga tcgcttcacg cctggggagt tggaagcagt atcagtgcac tcaggtcgtc 840atcaactcct tttacattgt gacacggcct ttggcctttc tgaacagtgt catcaaccct 900gtcttctatt ttcttttggg agatcacttc agggacatgc tgatgaatca actgagacac 960aacttcaaat cccttacatc ctttagcaga tgggctcatg aactcctact ttcattcaga1020gaaaagtga1029<210>4
<211>342<212>PRT<213>人類<400>4Met Leu Gly Ile Met Ala Trp Asn Ala Thr Cys Lys Asn Trp Leu Ala1 5 10 15Ala Glu Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Glu Lys Tyr20 25 30Tyr Leu Ser Ile Phe Tyr Gly Ile Glu Phe Val Val Gly Val Leu Gly35 40 45Asn Thr Ile Val Val Tyr Gly Tyr Ile Phe Ser Leu Lys Asn Trp Asn50 55 60Ser Ser Asn Ile Tyr Leu Phe Asn Leu Ser Val Ser Asp Leu Ala Phe65 70 75 80Leu Cys Thr Leu Pro Met Leu Ile Arg Ser Tyr Ala Asn Gly Asn Trp85 90 95Ile Tyr Gly Asp Val Leu Cys Ile Ser Asn Arg Tyr Val Leu His Ala100 105 110Asn Leu Tyr Thr Ser Ile Leu Phe Leu Thr Phe Ile Ser Ile Asp Arg115 120 125Tyr Leu Ile Ile Lys Tyr Pro Phe Arg Glu His Leu Leu Gln Lys Lys130 135 140Glu Phe Ala Ile Leu Ile Ser Leu Ala Ile Trp Val Leu Val Thr Leu145 150 155 160Glu Leu Leu Pro Ile Leu Pro Leu Ile Asn Pro Val Ile Thr Asp Asn165 170 175Gly Thr Thr Cys Asn Asp Phe Ala Ser Ser Gly Asp Pro Asn Tyr Asn180 185 190Leu Ile Tyr Ser Met Cys Leu Thr Leu Leu Gly Phe Leu Ile Pro Leu195 200 205Phe Val Met Cys Phe Phe Tyr Tyr Lys Ile Ala Leu Phe Leu Lys Gln210 215 220Arg Asn Arg Gln Val Ala Thr Ala Leu Pro Leu Glu Lys Pro Leu Asn225 230 235 240Leu Val Ile Met Ala Val Val Ile Phe Ser Val Leu Phe Thr Pro Tyr245 250 255
His Val Met Arg Asn Val Arg Ile Ala Ser Arg Leu Gly Ser Trp Lys260 265 270Gln Tyr Gln Cys Thr Gln Val Val Ile Asn Ser Phe Tyr Ile Val Thr275 280 285Arg Pro Leu Ala Phe Leu Asn Ser Val Ile Asn Pro Val Phe Tyr Phe290 295 300Leu Leu Gly Asp His Phe Arg Asp Met Leu Met Asn Gln Leu Arg His305 310 315 320Asn Phe Lys Ser Leu Thr Ser Phe Ser Arg Trp Ala His Glu Leu Leu325 330 335Leu Ser Phe Arg Glu Lys340
權利要求
1.一種篩選一調節(jié)GPR91受體活性的化合物的方法，其包含a.制備一包含編碼SEQ ID NO 2氨基酸序列的核酸序列的經轉染細胞；b.使經轉染的細胞與至少一種其調節(jié)GPR91受體活性的能力待設法測定的化合物接觸；c.監(jiān)測所述細胞以獲得調節(jié)所述受體活性的化合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞經穩(wěn)定轉染。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞經瞬時轉染。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述細胞為肥大細胞。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述化合物為激動劑。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述化合物為拮抗劑。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述化合物為抗體。
8.根據權利要求1所述的方法，其中監(jiān)測鈣流入量。
9.根據權利要求1所述的方法，其中用于步驟(a)的所述細胞進一步包含一編碼受體蛋白質的DNA，其中所述DNA以可操作方式連接于GPR91應答轉錄元件。
10.根據權利要求8所述的方法，其中步驟(b)在增加濃度的至少一化合物的存在下進行，所述化合物抑制所述受體蛋白質的信號轉導活性的能力待設法測定。
11.根據權利要求9所述的方法，其中步驟(c)包含在所述細胞中監(jiān)測所述報告蛋白質的表達水平隨所述化合物濃度的變化，由此指示所述化合物抑制信號轉導活性的能力。
12.根據權利要求8所述的方法，其中所述GPR91應答轉錄元件為cAMP應答轉錄元件。
13.一種篩選GPR91活性激動劑或拮抗劑的方法，其包含(a)使表達GPR91受體的細胞與一候選化合物接觸，(b)分析細胞反應，和c)將所述細胞反應與在沒有所述候選化合物存在下完成的標準細胞反應進行比較；借此，細胞反應較所述標準有所增加表明所述化合物為激動劑，并且細胞反應較所述標準有所降低表明所述化合物為拮抗劑。
14.一種根據權利要求1或權利要求13所述的方法鑒別的化合物。
15.一種用于預防和/或治療由肥大細胞介導的疾病的方法，其包含向需要這種治療的患者投予足夠量的GPR91受體調節(jié)劑以調節(jié)所述由肥大細胞介導的疾病。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述GPR91受體調節(jié)劑為GPR91激動劑。
17.根據權利要求15所述的方法，其中所述GPR91受體調節(jié)劑為GPR91拮抗劑。
18.根據權利要求15所述的方法，其中所述由肥大細胞介導的疾病為過敏性哮喘。
19.根據權利要求15所述的方法，其中所述激動劑為抗體。
20.一種在哺乳動物中診斷由肥大細胞介導的病癥的方法，其包含a.從懷疑患有由肥大細胞介導的病癥的哺乳動物獲得一份樣品；b.用可檢測量的抗GPR91抗體培育所述樣品；c.測量結合抗體的量；d.將所述受懷疑樣品中結合抗體的量與正常對照組相比較。
21.一種用于診斷GPR-91相關疾病或病癥的試劑盒，其包含抗GPR91抗體。
22.一種用于預防和/或治療由肥大細胞介導的疾病的方法，其包含投予具有殺滅肥大細胞的效應子功能的抗GPR91抗體。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述效應子功能為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
24.一種用于預防和/或治療由肥大細胞介導的疾病的方法，其包含投予與凋亡誘導部分結合以誘導肥大細胞凋亡的抗GPR91抗體。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述凋亡誘導部分為一選自Bax-α、Bak、Bcl-XS、Bad、Bid、Bik、Erk和Bok的促進凋亡的Bc1-2家族成員。
全文摘要
本發(fā)明涉及GPR91——一種嘌呤受體樣多肽、其于肥大細胞中的表達、和其于診斷和/或治療由肥大細胞介導的疾病中的用途，所述疾病包括過敏性和非過敏性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、過敏性鼻炎、過敏癥、過敏性腸胃疾病、特應性皮炎、風濕性關節(jié)炎和其它過敏性、自體免疫性與炎性疾病。本發(fā)明也包括篩選GPR91受體激動劑和/或拮抗劑的方法。
文檔編號G01N33/567GK1812803SQ200480017953
公開日2006年8月2日 申請日期2004年6月25日 優(yōu)先權日2003年6月27日
發(fā)明者李康, 王申戊, 胡光輝, 姚正彬 申請人:唐納士公司