專利名稱：血紅蛋白a1c的測定方法和用于此目的的酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及無需分離操作而使用酶特異測定糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端的方法、測定試劑盒、可以用于該特異測定的蛋白酶和其生產(chǎn)方法、其篩選方法、和可以用于該特異測定的酮胺氧化酶。
背景技術(shù)：
測定糖化蛋白質(zhì)在診斷和控制糖尿病方面是非常重要的。尤其是，近來對血紅蛋白A1c的研究已經(jīng)證明，通過將水平控制在7％或更低可以顯著地降低并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展危險，由此該水平常常被用作臨床領(lǐng)域中地一個基本指標。作為血紅蛋白A1c的定量方法，有通常已知的電泳、離子交換層析、親和層析、免疫和酶學(xué)方法。然而，電泳和層析方法需要昂貴的專用設(shè)備，而且其處理速度緩慢，因此這些方法并不適用于處理大量樣品的臨床檢查。同時，免疫分析方法相對容易，可以在短時間內(nèi)實施，這導(dǎo)致該方法在近年來快速擴展。然而，由于該方法使用抗原-抗體反應(yīng)來完成，這就導(dǎo)致一個問題--由于共存物質(zhì)的再現(xiàn)性和影響，準確度并不總是很好。
同時，酶學(xué)方法已經(jīng)被提示是一種無需專用設(shè)備的測定方法，具有高處理速度、高準確性、并且簡單而價廉(JP-A-08-336386，WO97/13872，JP-A-2001-95598，JP-A-2000-300294，和Clinical Chemistry49(2)269-274(2003))。
血紅蛋白在分子內(nèi)賴氨酸的ε-氨基基團上以及在α-和β-鏈N末端纈氨酸的α-氨基基團上發(fā)生糖化，而血紅蛋白A1c是在血紅蛋白β鏈N末端纈氨酸的α-氨基基團上發(fā)生糖化的血紅蛋白(被接受為國際標準的定義，見Clinical Chemistry and Laboratory Medicine40(1)78-89(2002))。因此，為了能夠使用蛋白酶和酮胺氧化酶特異地測定糖化的血紅蛋白的糖化β-鏈N末端而無需分離操作過程，蛋白酶和酮胺氧化酶之一或兩者的酶學(xué)反應(yīng)的特異性被認為是必要的。
具體地，糖化的血紅蛋白具有三個糖化位點，即，分子內(nèi)的賴氨酸、α-鏈N末端和β-鏈N末端，這樣為了僅僅測定糖化的β-鏈N末端，需要根據(jù)如下所述將酶聯(lián)合起來。
即，在蛋白酶和酮胺氧化酶分別屬于(P1)至(P4)和(K1)至(K5)類時，需要按如下方式聯(lián)合這些酶<(P1)和(K1)或(K2)或(K3)或(k4)>，<(P2)和(K1)或(K3)>，<(P3)和(K1)或(K2)>，<(P4)和(K1)>，<(P3)和(K5)和(K3)>，和<(P3)和(K5)和(K4)>。
各類酶的性質(zhì)如下
(P1)僅從糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端切除糖化氨基酸和/或糖化肽；(P2)僅從糖化血紅蛋白的糖化α-和β-鏈N末端切除糖化氨基酸和/或糖化肽；(P3)僅從糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端和包括分子內(nèi)賴氨酸的位點上切除糖化氨基酸和/或糖化肽；(P4)從糖化血紅蛋白的糖化α-和β-鏈N末端和包括分子內(nèi)賴氨酸的位點上切除糖化氨基酸和/或糖化肽；(K1)僅與由組合使用的蛋白酶從糖化血紅蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中來自糖化β-鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)；(K2)僅與由組合使用的蛋白酶從糖化血紅蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中來自糖化α-和β-鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)；(K3)僅與由組合使用的蛋白酶從糖化血紅蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中來自糖化β鏈N末端和來自包括分子內(nèi)賴氨酸的位點的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)；(K4)與由組合使用的蛋白酶從糖化血紅蛋白上切下的來自糖化α-和β-鏈N末端及包括分子內(nèi)賴氨酸的位點的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)；和(K5)與由組合使用的蛋白酶從糖化血紅蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中來自包括分子內(nèi)賴氨酸的位點的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)，但不與來自糖化β-鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)。
然而，對于從糖化血紅蛋白或其片段產(chǎn)生用作酮胺氧化酶底物的糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶，已有在JP-A-08-336386、WO97/13872、JP-A-2001-95598、JP-A-2001-57897、WO 00/50579、WO00/61732、Clinical Chemistry 49(2)269-274(2003)等中描述的已知蛋白酶。然而，沒有關(guān)于從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β-鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化α-鏈N末端切割糖化氨基酸或糖化肽的特異性的描述。
此外，從已知的底物特異性上，JP-A-2000-300294中描述的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶也被估計可以與β-鏈N末端的糖化三肽反應(yīng)，但沒有報道顯示從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β-鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽但不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化α-鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的特異性，例如，沒有報道給出血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶對α-鏈N末端糖化三肽和對β-鏈N末端糖化三肽的特異性的定量結(jié)果。
再者，在JP-A-2000-300294中，也沒有描述過用于從糖化血紅蛋白產(chǎn)生β-鏈N末端糖化三肽的胰蛋白酶、脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶和羧肽酶P并不從包括分子內(nèi)賴氨酸的位點和糖化α-鏈N末端產(chǎn)生糖化氨基酸和糖化肽。
而且，本發(fā)明發(fā)明人證實，血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶在一般的反應(yīng)條件下幾乎不從β-鏈N末端糖化三肽上切割果糖基纈氨酸，因此，血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶并不被認為是可以從糖化β-鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從α-鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。
如上述，尚沒有已知的蛋白酶和蛋白酶反應(yīng)條件可以用于從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β-鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化α-鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽，即，尚沒有已知的具有上述(P1)或(P3)特異性的蛋白酶和設(shè)計用于實現(xiàn)上述(P1)或(P3)特異性的蛋白酶反應(yīng)條件。
一般地，以下篩選方法被視為是可以從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β-鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化α-鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶的篩選方法，即，具有上述(P1)或(P3)特異性的蛋白酶的篩選方法。具體地，糖化血紅蛋白被分為α-鏈N末端被糖化的血紅蛋白和β-鏈N末端被糖化的血紅蛋白，對于在這些血紅蛋白用作底物時選擇性地僅從β-鏈N末端被糖化的血紅蛋白上切割糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶，可以通過使用與該蛋白酶切割下來的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)的酶(例如，酮胺氧化酶)、基于顏色改變來進行尋找。然而，天然存在的糖化血紅蛋白具有低的糖化率(大約5％)。因此，分離α-鏈N末端被糖化的血紅蛋白和β-鏈N末端被糖化的血紅蛋白的產(chǎn)率是非常低的，而且由于血紅蛋白是紅色的，使用這些物質(zhì)作為底物難于檢測蛋白酶的活性。正如上述，尚未有簡單有效的篩選方法。
另一方面，酮胺氧化酶包括以下酶
1)來源于鐮孢屬(Fusarium)(JP-A-07-289253)、赤霉屬(Gibberella)、假絲酵母屬(Candida)(JP-A-06-46846)或曲霉屬(Aspergillus)(WO 97/20039)的微生物并主要與ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸(此后也稱作FK)或包括它的肽及果糖基纈氨酸(此后也稱作FV)反應(yīng)的酮胺氧化酶；
2)來源于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(JP-A-61-280297)、青霉屬(Penicillium)(JP-A-08-336386)或絲孢酵母屬(Trichosporon)(JP-A-2000-245454)的微生物并主要與FV反應(yīng)的酮胺氧化酶。一般地，使用蛋白酶從血紅蛋白β-鏈N末端糖化肽切割FV的步驟存在缺陷，因為該反應(yīng)通常幾乎不發(fā)生，其實施必需大量的酶和長時間；因此為了克服此缺陷，需要也可以與從血紅蛋白β-鏈N末端糖化肽上經(jīng)過蛋白酶作用切割下來的糖化肽反應(yīng)的酮胺氧化酶用作血紅蛋白A1c測定過程中使用的酮胺氧化酶。因此，
3)近年來已經(jīng)報道了具有上述性質(zhì)的來源于棒狀桿菌屬(JP-A-2001-95598)的突變酮胺氧化酶和來源于Achaetomiella屬、Achaetomium屬、Thielabia屬、毛殼屬(Chaetomium)、麻孢殼屬(Gelasinospora)、小囊菌屬(Microascus)、Coniochaeta屬或Eupenicillium屬(EP 1,291,416)的微生物并與1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸(此后也稱作FVH)反應(yīng)的酮胺氧化酶。
然而，屬于1)的酮胺氧化酶具有性質(zhì)(K4)，屬于2)的酮胺氧化酶具有性質(zhì)(K2)，但是沒有它們與FVH反應(yīng)的描述。當(dāng)與FVH的反應(yīng)被定義為100％時，屬于3)的酮胺氧化酶，甚至是來源于Eupenicillium屬微生物并與FK以最低比率反應(yīng)的酮胺氧化酶，與FK以9.78％的比率反應(yīng)(EP 1,291,416)。因此，該酮胺氧化酶被認為可以充分地與從糖化血紅蛋白經(jīng)蛋白酶作用切割下來的來自包括分子內(nèi)賴氨酸的位點的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)，然而關(guān)于與從糖化血紅蛋白經(jīng)蛋白酶作用切割下來的來自糖化α-鏈N末端的糖化肽的反應(yīng)，例如與1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-亮氨酸(此后也稱作FVL)的反應(yīng)，沒有描述，因此該酮胺氧化酶不被認為是具有性質(zhì)(K1)、(K2)或(K3)的酮胺氧化酶。
如上所述，尚沒有報道過具有性質(zhì)(K1)；具有性質(zhì)(K2)并與FVH反應(yīng)；或具有性質(zhì)(K3)的酮胺氧化酶。
此外，為了制備具有性質(zhì)(K1)并具有性質(zhì)(K2)且與FVH反應(yīng)的酮胺氧化酶，可以考慮通過氨基酸替代、缺失、插入等方式修飾已知的酮胺氧化酶。然而，該酶一級結(jié)構(gòu)中有助于降低與FK或FZK的反應(yīng)的氨基酸殘基尚屬未知。因此，不可能通過修飾任何酮胺氧化酶基因來降低對FK或ε-1-脫氧果糖基-(α-芐氧羰基-L-賴氨酸)(此后也稱作FZK)的活性，即，通過修飾來制備具有性質(zhì)(K1)并具有性質(zhì)(K2)且與FVH反應(yīng)的酮胺氧化酶的方法仍是未知的。
同時，通過調(diào)節(jié)能夠與FVH反應(yīng)的酮胺氧化酶的反應(yīng)條件來降低酶對FK或FZK的活性與酶對FVH的活性的比，也是未知的。
為了使用蛋白酶和酮胺氧化酶清楚地區(qū)分和確定糖化血紅蛋白中存在的β-鏈N末端纈氨酸的α-氨基基團的糖化，如上所述必須聯(lián)合蛋白酶和酮胺氧化酶的特異性。然而，在JP-A-08-336386、WO97/13872、JP-A-2001-95598和Clinical Chemistry 49(2)269-274(2003)中，沒有關(guān)于特異確定血紅蛋白的糖化β-鏈N末端的描述，而僅有關(guān)于通過HPLC方法獲得的或可以通過該方法獲得的數(shù)據(jù)與通過公開的酶學(xué)方法獲得的測定數(shù)據(jù)顯著相關(guān)的報道。而且，沒有過所用蛋白酶和酮胺氧化酶的特異性的提及，而通過蛋白酶降解糖化血紅蛋白而被簡單地切割的糖化氨基酸和/或糖化肽通過酮胺氧化酶檢測，這樣據(jù)認為所檢測的是分子內(nèi)賴氨酸的ε-氨基和α-及β-鏈N末端纈氨酸的α-氨基已經(jīng)被糖化的血紅蛋白的混合物。而且，在JP-A-2001-95598的例子中，使用蛋白酶和與FVH反應(yīng)的酮胺氧化酶測定糖化血紅蛋白。然而，實施了離心操作，而沒有不經(jīng)分離操作可以實施測定的描述。
JP-A-2000-300294提示了特異地僅僅測定在血紅蛋白β-鏈N末端纈氨酸的α-氨基被糖化的血紅蛋白的酶學(xué)方法。在該方法中，利用能夠切割血紅蛋白β-鏈N末端第3位亮氨酸的羧基側(cè)的蛋白酶、然后利用能夠從果糖基-Val-His-Leu切下His-Leu由此產(chǎn)生果糖基纈氨酸的蛋白酶進行相繼處理，并特異地測定血紅蛋白β-鏈N末端纈氨酸的α-氨基糖化的量。然而，該方法具有如下缺點該方法需要兩個階段的蛋白酶反應(yīng)；嚴格地控制第一個階段中用于從血紅蛋白β-鏈N末端切割第3位亮氨酸的羧基側(cè)的蛋白酶反應(yīng)是困難的；而且在第二階段從血紅蛋白β-鏈N末端糖化肽上切下α-糖化氨基酸的反應(yīng)通常幾乎不進行，而必須使用大量的酶和長時間來實施。此外，在實施例顯示的方法中，進行了兩次繁瑣的分離操作(超過濾)，而且沒有本申請的方法能夠無需分離操作即可特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端的描述。
EP 1,291,416提示了用能夠與蛋白酶例如Molsin、AO-蛋白酶、肽酶(Peptidase)(可從Kikkoman Corporation獲得)、羧肽酶Y或Protin P(可從Daiwa Kasei K.K.獲得)作用所釋放的FVH反應(yīng)的氧化酶測定糖化蛋白酶例如血紅蛋白A1c的方法。該說明書還指出，在通過蛋白酶作用產(chǎn)生的FK構(gòu)成問題的情況下，可以在用與FK反應(yīng)的果糖基胺氧化酶消除FK后利用能夠與FVH反應(yīng)的氧化酶進行測定，或者可以使用與FVH反應(yīng)而幾乎不與FK反應(yīng)的氧化酶進行測定。然而，沒有提及過與來自糖化血紅蛋白的糖化α-鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽的區(qū)分，也沒有通過該提示方法測定糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端的證實性實施例。此外，也沒有描述該提示方法可不經(jīng)分離操作來進行。
盡管上述涉及糖化血紅蛋白的測定方法是已知的，但是無需分離操作而使用酶特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端的方法和試劑盒是未知的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供無需分離操作、能夠特異地僅測定糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端的方法、測定試劑盒、可以用于該特異測定的蛋白酶、其生產(chǎn)方法和篩選方法、和可以用于該特異測定的酮胺氧化酶。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，結(jié)果首先發(fā)明了篩選在糖化血紅蛋白或其片段的β-鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地在α-鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶的方法。即，發(fā)明了檢測如下蛋白酶活性的方法，其中所說蛋白酶活性從糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端切下用作酮胺氧化酶底物的糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白的糖化α-鏈N末端切下用作酮胺氧化酶底物的糖化氨基酸和糖化肽，所述方法通過使用糖化血紅蛋白的α-鏈N末端和β-鏈N末端存在的糖化肽作為蛋白酶的底物來實施。
其次，本發(fā)明篩選方法可以用于篩選各種各樣可以從β-鏈N末端的糖化五肽切下用作酮胺氧化物底物的糖化氨基酸和/或糖化肽但不實質(zhì)性地從α-鏈N末端的糖化五肽切下用作酮胺氧化酶底物的糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在商業(yè)可獲得的蛋白酶制品例如來源于芽孢桿菌屬種(Bacillus sp.)的中性蛋白酶(由Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))中或在細菌例如芽孢桿菌屬種、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)或產(chǎn)酶溶桿菌產(chǎn)生的蛋白酶中存在此目的蛋白酶反應(yīng)。
此外，發(fā)現(xiàn)在這些蛋白酶中嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)產(chǎn)生的蛋白酶與已知的彈性蛋白酶具有同源性。常規(guī)地，已知彈性蛋白酶具有底物特異性，是在亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或丙氨酸的C端側(cè)切割肽鍵的酶。本發(fā)明第一次揭示了該彈性蛋白酶在1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-蘇氨酰-L-脯氨酸(以下也稱作血紅蛋白β鏈N末端的糖化五肽)中不在亮氨酸的C端側(cè)而是在N端側(cè)切割肽鍵以釋放FVH。
再者，已經(jīng)完成了當(dāng)目的蛋白酶不僅從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而且從糖化血紅蛋白或其片段切割FK和/或包括FK的糖化肽但不從糖化血紅蛋白或其片段的糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽時，不經(jīng)分離操作、使用酶特異地測定糖化血紅蛋白或其片段的糖化β鏈N末端的方法，該方法通過先用不與來自糖化β鏈N末端的糖化肽反應(yīng)但與FK或包括FK的糖化肽反應(yīng)的酮胺氧化物消除FK和/或包括FK的糖化肽來實現(xiàn)。
此外，發(fā)現(xiàn)了在蛋白酶不僅從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而且從糖化血紅蛋白或其片段切割FK和/或包括FK的糖化肽但不從糖化血紅蛋白或其片段的糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的情況下能夠顯著地降低酮胺氧化酶對FZK的反應(yīng)性的反應(yīng)條件。制備和使用具有高特異性的與FZK以5％或更低比率反應(yīng)(相較于定義為100％的與FVH的反應(yīng)而言)的新酮胺氧化酶使得可以特異地僅測定從糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽。即，本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在來源于Curvulariaclavata的酮胺氧化酶中在58和62位的氨基酸替代有助于降低對FZK的反應(yīng)性?；诖耸聦嵵苽浜褪褂迷撗趸笇?dǎo)致完成了無需分離操作、使用酶特異地測定糖化血紅蛋白或其片段的糖化β鏈N末端的方法。
而且，發(fā)現(xiàn)了用于目的蛋白酶降解糖化血紅蛋白或其片段的如下反應(yīng)條件
i)不切割可以與和目的蛋白酶聯(lián)用的酮胺氧化酶反應(yīng)的FK和/或包括FK的糖化肽的條件；
ii)不切割來源于糖化α鏈N末端并可以與和目的蛋白酶聯(lián)用的酮胺氧化酶反應(yīng)的糖化氨基酸和糖化肽的條件；
iii)切割來源于糖化β鏈N末端并可以與和目的蛋白酶聯(lián)用的酮胺氧化酶反應(yīng)的糖化氨基酸或糖化肽的條件。結(jié)果，本發(fā)明人完成了使用酶不經(jīng)分離操作而特異地測定糖化血紅蛋白或其片段的糖化β鏈N末端的方法。
即，本發(fā)明具有如下內(nèi)容
(1)可從糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽但不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白的糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。
(2)可從糖化血紅蛋白的包括糖化β鏈N末端的片段切割糖化氨基酸和/或糖化肽但不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白的包括糖化α鏈N末端的片段切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。
(3)當(dāng)其從糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的反應(yīng)被定義為100％時，其從糖化血紅蛋白的糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸或糖化肽的反應(yīng)以10％或更少發(fā)生的蛋白酶。
(4)根據(jù)以上(1)至(3)項之任一的蛋白酶，其中從糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端或從糖化血紅蛋白的包括糖化β鏈N末端的片段切下的糖化肽是1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸。
(5)根據(jù)以上(1)至(4)項之任一的蛋白酶，其中不被實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白的糖化α-鏈N末端或糖化血紅蛋白的包括糖化α-鏈N末端的片段切下的糖化氨基酸和糖化肽分別是1-脫氧果糖基-L-纈氨酸和1-脫氧果糖基-L-纈氨酸-L-亮氨酸。
(6)根據(jù)以上(1)至(5)項之任一的蛋白酶，其是來源于溶桿菌屬(Lysobacter)細菌的蛋白酶。
(7)根據(jù)以上(1)至(5)項之任一的蛋白酶，其是來源于芽孢桿菌屬種ASP-842(FERM BP-08641)或嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)NBRC3820的蛋白酶。
(8)根據(jù)以上(1)至(7)項之任一的蛋白酶，其是金屬蛋白酶、中性蛋白酶或彈性蛋白酶。
(9)切割蛋白質(zhì)或肽中的亮氨酸的N端側(cè)肽鍵的彈性蛋白酶。
(10)產(chǎn)酶溶桿菌YK-366(FERM BP-10010)株。
(11)芽孢桿菌屬種ASP-842(FERM BP-08641)株。
(12)根據(jù)以上(6)項的蛋白酶的生產(chǎn)方法，其包括以下步驟(a)和(b)
(a)在培養(yǎng)液中培養(yǎng)溶桿菌屬細菌；和
(b)從培養(yǎng)液中提取蛋白酶。
(13)根據(jù)以上(7)項的蛋白酶的生產(chǎn)方法，其包括以下步驟(a)和(b)
(a)在培養(yǎng)液中培養(yǎng)芽孢桿菌屬種ASP-842(FERM BP-08641)或嗜水氣單胞菌NBRC 3820；和
(b)從該培養(yǎng)液提取蛋白酶。
(14)具有以下特性(A)的酮胺氧化酶
(A)與對1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸的反應(yīng)性相比而言，對ε-1-脫氧果糖基-(α-芐氧羰基-L-賴氨酸)的反應(yīng)性是5％或更低。
(15)根據(jù)以上(14)項的酮胺氧化酶，其還具有以下特性(B)和(C)
(B)由與SEQ ID NO1所示氨基酸序列有至少75％同源性的氨基酸組成；和
(C)在SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的第58或62位至少一個氨基酸被其它氨基酸替代。
(16)根據(jù)以上(15)項的酮胺氧化酶，其中在(C)中所述的氨基酸替代中，第58位的氨基酸被纈氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸替代；而第62位的氨基酸被組氨酸替代。
(17)編碼以上(14)至(16)項之任一的酮胺氧化酶的氨基酸序列的基因。
(18)含有以上(17)項的基因的酮胺氧化酶表達載體。
(19)含有以上(18)項的表達載體的宿主細胞。
(20)不經(jīng)分離操作，使用酶特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端的方法。
(21)根據(jù)以上(20)項的測定方法，其中所述酶包括蛋白酶(i)。
(22)根據(jù)以上(21)項的測定方法，其中所述酶還包括酮胺氧化酶(ii)。
(23)根據(jù)以上(22)項的測定方法，其中N末端通過以下反應(yīng)步驟(iii)和/或(iv)特異地進行測定
(iii)反應(yīng)步驟，其中蛋白酶(i)從糖化血紅蛋白的糖化β-鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽但不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白切割可與酮胺氧化酶(ii)反應(yīng)的ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸和/或包括ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸的糖化肽；和
(iv)反應(yīng)步驟，其中酮胺氧化酶(ii)對ε-1-脫氧果糖基-(α-芐氧羰基-L-賴氨酸)的反應(yīng)性與其對1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸的反應(yīng)性相比是30％或更低。
(24)根據(jù)以上(23)項的測定方法，其中反應(yīng)步驟(iii)在pH 5.0至6.0的反應(yīng)條件下進行。
(25)根據(jù)以上(23)或(24)項的測定方法，其中反應(yīng)步驟(iv)在pH 5.5至6.5的反應(yīng)條件下進行。
(26)根據(jù)以上(21)至(25)項之任一的測定方法，其中蛋白酶(i)是根據(jù)以上(1)至(8)項之任一項的蛋白酶。
(27)根據(jù)以上(22)至(26)項之任一的測定方法，其中酮胺氧化酶(ii)是可與蛋白酶自糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)的酮胺氧化酶。
(28)根據(jù)以上(27)項的測定方法，其中酮胺氧化酶來源于彎孢屬(Curvularia)細菌。
(29)根據(jù)以上(22)至(28)項之任一的測定方法，其中酮胺氧化酶(ii)包括以下兩種酮胺氧化酶(a)和(b)
(a)與蛋白酶自糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)的酮胺氧化酶；和
(b)與蛋白酶自糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽不發(fā)生實質(zhì)性反應(yīng)但與ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸和/或包括ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸的糖化肽反應(yīng)的酮胺氧化酶。
(30)根據(jù)以上(29)項的測定方法，其中酮胺氧化酶(a)來源于彎孢屬細菌和/或酮胺氧化酶(b)來源于鐮孢屬(Fusarium)細菌。
(31)根據(jù)以上(22)至(26)項之任一的測定方法，其中酮胺氧化酶(ii)是根據(jù)以上(14)至(16)項之任一的酮胺氧化酶。
(32)篩選可從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β鏈N末端切下糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化α鏈N末端切下糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶的方法，其中使用具有3至20個氨基酸長的血紅蛋白α鏈N末端糖化肽和具有3至20個氨基酸長的血紅蛋白β鏈N末端糖化肽。
(33)根據(jù)以上(32)項的篩選方法，其中血紅蛋白α鏈N末端糖化肽和血紅蛋白β鏈N末端糖化肽具有5個氨基酸長。
(34)用于不經(jīng)分離操作而特異測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的試劑盒，其包括以下(i)和(ii)
(i)蛋白酶；和
(ii)根據(jù)以上(14)項的酮胺氧化酶。
根據(jù)本發(fā)明，提供無需分離操作而能夠特異地僅測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的方法、測定試劑盒、用于該特異測定的蛋白酶、該蛋白酶的生產(chǎn)方法或篩選方法、和可以用于該特異測定的酮胺氧化酶。
附圖簡述


圖1顯示酮胺氧化酶氨基酸序列的同源性。
圖2顯示來源于芽孢桿菌屬種ASP 842的蛋白酶的最適pH。
圖3顯示來源于芽孢桿菌屬種ASP 842的蛋白酶的pH穩(wěn)定性。
圖4顯示來源于芽孢桿菌屬種ASP 842的蛋白酶的最適溫度。
圖5顯示來源于芽孢桿菌屬種ASP 842的蛋白酶的熱穩(wěn)定性。
圖6顯示來源于嗜水氣單胞菌NBRC 3820的蛋白酶的最適pH。
圖7顯示來源于嗜水氣單胞菌NBRC 3820的蛋白酶的pH穩(wěn)定性。
圖8顯示來源于嗜水氣單胞菌NBRC 3820的蛋白酶的最適溫度。
圖9顯示來源于嗜水氣單胞菌NBRC 3820的蛋白酶的熱穩(wěn)定性。
圖10顯示來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶的最適pH。
圖11顯示來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶的pH穩(wěn)定性。
圖12顯示來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶的最適溫度。
圖13顯示來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶的熱穩(wěn)定性。
圖14顯示質(zhì)粒pPOSFOD923的限制性圖譜。
圖15顯示吸光度差ΔAs和FVH濃度之間的關(guān)系。
圖16顯示蛋白酶反應(yīng)時間和所得測定值之間的關(guān)系。
圖17顯示利用FOD2消除掉在蛋白酶降解糖化血紅蛋白后來源于糖化賴氨酸和包括糖化賴氨酸的肽的信號后，使用FOD923測定FVH的量時的測定方案。
圖18顯示在不消除蛋白酶降解糖化血紅蛋白后來源于糖化賴氨酸和包括糖化賴氨酸的肽的信號的情況下，使用FOD923測定FVH的量時的測定方案。
圖19顯示在不消除蛋白酶降解糖化血紅蛋白后來源于糖化賴氨酸和包括糖化賴氨酸的肽的信號的情況下，使用FOD923M測定FVH的量時的測定方案。
最佳實施方式
以下更詳細地描述本發(fā)明的內(nèi)容和優(yōu)選實施方式。
<Amadori化合物>
術(shù)語“Amadori化合物”在本發(fā)明中指具有通式-(CO)-CHR-NH-(R表示氫原子或羥基)代表的酮胺結(jié)構(gòu)的化合物，該化合物由具有氨基基團的化合物例如蛋白質(zhì)和具有醛基基團的化合物例如葡萄糖的美拉反應(yīng)(Maillard reaction)產(chǎn)生。Amadori化合物包括糖化蛋白質(zhì)例如糖化血紅蛋白或糖化白蛋白；通過肽的糖化產(chǎn)生的糖化肽；等等。
<糖化血紅蛋白>
該術(shù)語指通過美拉反應(yīng)對血紅蛋白進行糖化后產(chǎn)生的Amadori化合物，其中α鏈和β鏈N末端中的纈氨酸的各α-氨基基團或分子內(nèi)賴氨酸的ε-氨基基團被認為經(jīng)歷了糖化。糖化血紅蛋白的片段指通過降解糖化血紅蛋白得到的肽。
<血紅蛋白A1c>
在接受為國際標準的定義中，血紅蛋白A1c被認為是血紅蛋白β鏈N末端中的纈氨酸的α-氨基基團被糖化的糖化血紅蛋白(ClinicalChemistry and Laboratory Medicine 36(5)299-308(1998))。
<特異地>
短語“特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端”用于如下情況通過測定糖化血紅蛋白的糖化水平獲得的值以80％比例或更高比例、期望地90％或更高比例、更期望地95％或更高比例來自血紅蛋白β鏈N末端中纈氨酸α-氨基基團的糖化。
<糖化氨基酸和糖化肽>
在短語“蛋白酶不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸或糖化肽”中，術(shù)語“糖化氨基酸”指1-脫氧果糖基-L-纈氨酸，而術(shù)語“糖化肽”指具有來自血紅蛋白α鏈N末端的20個或更少氨基酸的長度、包括1-脫氧果糖基-L-纈氨酸作為N末端纈氨酸、并可以通過與蛋白酶聯(lián)用的酮胺氧化酶檢測的肽。例如，在來源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶與蛋白酶聯(lián)用的情況下，該術(shù)語指1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-亮氨酸。
在短語“蛋白酶可從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸或糖化肽”中，術(shù)語“糖化氨基酸”指1-脫氧果糖基-L-纈氨酸，而術(shù)語“糖化肽”指具有來自血紅蛋白β鏈N末端的20或更少個氨基酸的長度、包括1-脫氧果糖基-L-纈氨酸作為N末端纈氨酸、并可以被與蛋白酶聯(lián)用的酮胺氧化酶檢測的肽。例如，在來源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶與蛋白酶聯(lián)用時，該術(shù)語指1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸。在短語“蛋白酶可從糖化血紅蛋白切割包括ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸的糖化肽”中，術(shù)語“糖化肽”指具有50或更少個氨基酸的長度的糖化肽。
注意，Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)已經(jīng)于2003年2月12日保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)，Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本。
<實質(zhì)性地>
在蛋白酶反應(yīng)中，短語“從糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽”是指如下事實當(dāng)將從糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的反應(yīng)性定義為100％時，從糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸或糖化肽的反應(yīng)性為10％或更低，期望地1％或更低，更期望地0.1％或更低。注意，上述蛋白酶反應(yīng)使用酮胺氧化酶，優(yōu)選地來源于Curvulariaclavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶或來源于尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)的酮胺氧化酶(由Asahi Kasei PharmaCorporation生產(chǎn))，通過檢測切割的產(chǎn)物進行測定。
在酮胺氧化酶反應(yīng)中，短語“與ε-糖化氨基酸反應(yīng)而不實質(zhì)性地與蛋白酶自糖化β-鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)”是指如下事實當(dāng)將與ε-糖化氨基酸的反應(yīng)性定義為100％時，與蛋白酶自糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽的反應(yīng)性為10％或更低、優(yōu)選地8％或更低、更優(yōu)選地1％或更低、最優(yōu)選地0.1％或更低。同時，在酮胺氧化酶反應(yīng)中，短語“與蛋白酶自糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)而不實質(zhì)性地與ε-糖化氨基酸反應(yīng)”是指如下事實當(dāng)將與蛋白酶自糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽的反應(yīng)性定義為100％時，與ε-糖化氨基酸的反應(yīng)性為8％或更低、期望地1％或更低、更期望地0.1％或更低。注意，酮胺氧化酶反應(yīng)通過檢測產(chǎn)生的過氧化氫進行測定。
<酮胺氧化酶>
該術(shù)語指可與具有酮胺結(jié)構(gòu)的化合物反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫的酶，該酶也稱作果糖基-胺氧化酶。<相比于和1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸的反應(yīng)性，和ε-1-脫氧果糖基-(α-芐氧羰基-L-賴氨酸)的反應(yīng)性為5％或更低的酮胺氧化酶>
短語“相比于和1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸(以下也稱作FVH)的反應(yīng)性，酮胺氧化酶和ε-1-脫氧果糖基-(α-芐氧羰基-L-賴氨酸)(以下也稱作FZK)的反應(yīng)性為5％或更低”是指這樣的事實通過如下步驟進行測定時，反應(yīng)性的比例為5％或更低向200μl反應(yīng)溶液(50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)、0.1％Triton X-100、0.03％4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)、0.02％TOOS、5U/ml過氧化物酶和2mM FZK或FVH)加入20μl酮胺氧化酶；允許混合物在37℃反應(yīng)5分鐘；添加0.5ml 0.5％SDS；測定555nm的吸光度(A1)；使用不含F(xiàn)ZK和FVH的反應(yīng)溶液進行相同操作以測定吸光度(Ab)；和從差(A1-Ab)確定反應(yīng)性。
<分離操作>
術(shù)語“分離操作”是指在一系列用于測定樣品(例如全血樣品或溶血的紅細胞樣品)中糖化血紅蛋白的測定步驟的過程中，用于增加糖化血紅蛋白或來源于糖化血紅蛋白的物質(zhì)的純度或濃度的操作，其包括柱層析操作、膜過濾操作、吸附分離操作和沉淀分離操作。
為了不經(jīng)分離操作而使用酶特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端，在糖化血紅蛋白的三種糖化位點——分子內(nèi)賴氨酸、α鏈N末端和β鏈N末端——中，酶必須具有僅僅針對β鏈N末端的糖化位點的特異性。作為用于獲得該特異性的酶，可以使用一種酶或可以聯(lián)合使用多種酶。例如，可以通過聯(lián)合與通過蛋白酶降解糖化血紅蛋白切下的來自糖化β鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)的酶——氧化酶、脫氫酶、激酶等——獲得該特異性。而且，為了使用蛋白酶或酮胺氧化酶僅僅測定糖化的β鏈N末端，必須根據(jù)如下特異性來聯(lián)合酶。
即，在蛋白酶和酮胺氧化酶分別劃分為(P1)至(P4)和(K1)至(K5)類時，需要按如下聯(lián)合這些酶<(P1)和(K1)或(K2)或(K3)或(K4)>，<(P2)和(K1)或(K3)>，<(P3)和(K1)或(K2)>，<(P4)和(K1)>，<(P3)和(K5)和(K3)>，及<(P3)和(K5)和(K4)>。
各類酶的性質(zhì)如下
(P1)僅從糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽，
(P2)僅從糖化血紅蛋白的糖化α鏈和β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽，
(P3)僅從糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端及包括分子內(nèi)賴氨酸的位點切割糖化氨基酸和/或糖化肽，
(P4)從糖化血紅蛋白的糖化α鏈和β鏈N末端及包括分子內(nèi)賴氨酸的位點切割糖化氨基酸和/或糖化肽，
(K1)僅與所聯(lián)用的蛋白酶自糖化血紅蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中來自糖化β鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)，
(K2)僅與所聯(lián)用的蛋白酶自糖化血紅蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中來自糖化α鏈和β鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)，
(K3)僅與所聯(lián)用的蛋白酶自糖化血紅蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中來自糖化β鏈N末端及包括分子內(nèi)賴氨酸的位點的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)，
(K4)與所聯(lián)用的蛋白酶自糖化血紅蛋白上切下的、來自糖化α鏈和β鏈N末端及來自包括分子內(nèi)賴氨酸的位點的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)，
(K5)與所聯(lián)用的蛋白酶自糖化血紅蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中來自包括分子內(nèi)賴氨酸的位點的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)，但不與來自糖化β鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)。
<蛋白酶的篩選>
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，結(jié)果發(fā)明了在使用血紅蛋白α鏈N末端糖化肽和血紅蛋白β鏈N末端糖化肽作為底物時僅利用血紅蛋白β鏈N末端糖化肽作為底物以切割糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶的選擇方法，作為獲得具有(P1)或(P3)特異性的蛋白酶的篩選方法。以上所用α鏈N末端糖化肽和β鏈N末端糖化肽的長度不受特別的限制，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用長度為3至20個氨基酸的糖化肽可以進行篩選。這些肽可以從化學(xué)合成的化合物或天然產(chǎn)物例如糖化血紅蛋白獲得。
其具體例子包括作為β鏈N末端糖化肽，1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-蘇氨酰-L-脯氨酸(由Peptide Institute，Inc.生產(chǎn)，之后也稱作β糖化五肽)；和作為α鏈N末端糖化肽，1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-L-脯氨酰-L-丙氨酸(由PeptideInstitute，Inc.生產(chǎn)，之后也稱作α糖化五肽)。當(dāng)這些五肽用作底物時，蛋白酶可以切下糖化氨基酸、糖化二肽、糖化三肽或糖化四肽。蛋白酶自α鏈N末端糖化肽和β鏈N末端糖化肽切下的糖化氨基酸和/或糖化肽可以使用與切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)而不實質(zhì)性地與α鏈N末端糖化肽和β鏈N末端糖化肽反應(yīng)的酶進行檢測，這些酶的實例包括氧化酶、脫氫酶和激酶。
氧化酶的例子包括酮胺氧化酶。酮胺氧化酶的例子包括來源于Achaetomiella屬、Achaetomium屬、草根霉屬(Thielavia)、毛殼霉屬(Chaetomium)、麻孢殼屬(Gelasinospora)、小囊菌屬(Microascus)、Coniochaeta屬、Eupenicillium屬(其全部描述在EP 1,291,416的說明書中)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(JP-A-61-268178)、曲霉屬(JP-A-03-155780)、青霉屬(Penicillium)(JP-A-04-4874)、鐮孢屬(JP-A-05-192193，JP-A-07-289253，JP-A-08-154672)、赤霉屬(JP-A-05-192153，JP-A-07-289253)、假絲酵母屬(JP-A-06-46846)、曲霉屬(JP-A-10-33177，JP-A-10-33180)、Neocosmospora vasinfecta(NBRC 7590)、Coniochaetidium savoryi(ATCC36547)、Arthrinium屬種TO6(FERM P-19211)、Arthrinium phaeospermum(NBRC31950)、Arthrinium phaeospermum(NBRC 6620)、Arthriniumjaponicam(NBRC 31098)、Pyrenochaeta屬種YH807(FERMP-19210)、Pyrenochaeta gentianicola(MAFF425531)、Pyrenochaetaterrestris(NBRC 30929)、Leptosphaeria nodorum(在分生孢子世代，名稱為Phoma hennebelgii)(NBRC 7480)、桶孢小球腔菌(Leptosphaeria doliolum)(JCM2742)、Leptosphaeria maculans(在分生孢子世代，名稱為Phoma lingam)(MAFF726528)、蔥葉格孢腔菌(Pleospora herbarum)(NBRC 32012)、Pleospora betae(在分生孢子世代，名稱為Phoma betae)(NBRC 5918)、Ophiobolus herpotrichus(NBRC 6158)、Curvularia clavata YH923(FERM BP-10009)的酶及其突變酶。
來源于Curvularia clavata YH923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶對FVH的底物特異性為100％，而對1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酸(之后也稱作β糖化三肽或FVHL)、1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-蘇氨酸(之后也稱作β糖化四肽或FVHLT)、β糖化五肽、1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-亮氨酸(之后也稱作FVL)和α糖化五肽的底物特異性分別為0.09％、0.0009％、0％、3.4％和0.01％。因此，蛋白酶從β糖化五肽切割FVH的活性和蛋白酶從α糖化五肽切割FVL的活性可以使用該酮胺氧化酶進行檢測。當(dāng)通過蛋白酶切割的糖化氨基酸和/或糖化肽使用氧化酶檢測時，可以通過電極、發(fā)光、熒光、吸光度等檢測產(chǎn)生的過氧化氫的量，但是容易的是使用過氧化物酶和色素原檢測吸光度。例如，可以通過使用4-氨基安替比林(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)和TODB(由Dojindo Laboratories生產(chǎn))作為色素原測定從540nm至570nm的吸光度改變，容易地證實蛋白酶活性。
通過上述篩選方法獲得的具有(P1)或(P3)特異性的蛋白酶的實例包括來源于芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬和溶桿菌屬細菌的蛋白酶。更具體的實例包括來源于芽孢桿菌屬種的中性蛋白酶(由Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))；和來源于芽孢桿菌屬種ASP842(FERM BP-08641)、嗜水氣單胞菌NBRC 3820或產(chǎn)酶溶桿菌YK-366(FERM BP-10010)的蛋白酶。
在這些菌株中，芽孢桿菌屬種ASP842(FERM BP-08641)和產(chǎn)酶溶桿菌YK-366(FERM BP-10010)是本發(fā)明人分離的新菌株，芽孢桿菌屬種ASP842(FERM BP-08641)和產(chǎn)酶溶桿菌YK-366(FERMBP-10010)已經(jīng)分別于2004年2月24日和2004年1月30日保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(InternationalPatent Organism Depository，National Insititute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本。
這些保藏菌株的真菌學(xué)特性顯示如下，并按如下鑒定
1.ASP842(FERM BP-08641)是0.8至1.0×2.0至3.0μm大小并具有表1所示特性的革蘭氏陽性細菌，因此根據(jù)Bergy’s Manual ofSystematic Bacteriology(1984)其被鑒定為芽孢桿菌屬種。
表1
2.YK-366(FERM BP-10010)是具有0.4×5至50μm大小以及表2所示特征的革蘭氏陰性需氧桿菌，因此根據(jù)Bergy’s Manual ofSystematic Bacteriology(1989)，其被鑒定為產(chǎn)酶溶桿菌。
表2
*PCA平板菌落計數(shù)瓊脂
<從培養(yǎng)產(chǎn)物產(chǎn)生蛋白酶>
接下來，描述培養(yǎng)可以用于本發(fā)明的蛋白酶生產(chǎn)細菌的方法和產(chǎn)生該蛋白酶的方法。對于培養(yǎng)本發(fā)明的蛋白酶生產(chǎn)細菌的方法，可以使用固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)，但優(yōu)選使用搖瓶、小型發(fā)酵罐等進行有氧液體培養(yǎng)。對于培養(yǎng)基，可以使用一般用于細菌培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基。可用的碳源的實例包括葡萄糖、甘油、山梨糖醇、乳糖、甘露糖等?？捎玫牡吹膶嵗ń湍柑崛∥铩⑷飧?、胰蛋白胨、蛋白胨等。可用的無機鹽的實例包括氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈣等。對于培養(yǎng)條件，可以使用致使靶蛋白酶在pH 5.0至8.0及25至37℃的培養(yǎng)溫度下達到最大效價或最大純度的培養(yǎng)時間，例如，可以進行16至72小時的培養(yǎng)。
之后將描述蛋白酶的收集。當(dāng)細胞分泌蛋白酶時，使用通過過濾、離心等方式從培養(yǎng)基中除去細胞后獲得的含有粗蛋白酶的溶液。而在蛋白酶存在于細胞中時，使用通過下述步驟獲得的含有粗蛋白酶的溶液通過過濾、離心等從培養(yǎng)基中分離細胞；將細胞懸浮在緩沖液例如磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液中，如果必要，所述緩沖液中補加表面活性劑、金屬鹽、糖、氨基酸、多元醇、螯合劑等；使用溶菌酶、超聲波、玻璃珠等勻漿細胞；和通過過濾、離心等方式除去不溶性產(chǎn)物。含有粗蛋白酶的溶液使用已知的用于蛋白質(zhì)或酶的分離或純化方式處理，產(chǎn)生純化的蛋白酶。例如，可以適當(dāng)?shù)剡x擇并組合一般的酶純化方法，例如使用有機溶劑(包括丙酮或乙醇)的分級沉淀方法、使用硫酸銨等的鹽析方法、離子交換層析方法、疏水層析方法、親和層析方法和凝膠過濾方法，以獲得純化的蛋白酶。在添加單獨一種或組合添加兩種或更多種的適當(dāng)穩(wěn)定劑例如蔗糖、甘油或氨基酸(大約1至50％)和輔酶等(大約0.01至1％)后，可以冷凍保藏純化的蛋白酶。
<篩選酮胺氧化酶>
對于獲得具有性質(zhì)(K1)；具有性質(zhì)(K2)并可與FVH反應(yīng)；或具有性質(zhì)(K3)的酮胺氧化酶的篩選方法，其實例包括基于與如下物質(zhì)的反應(yīng)性的指數(shù)的方法作為來源于α鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽的代表性例子的FVL；作為來源于β鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽的代表性例子的FVH；或作為來自包括分子內(nèi)賴氨酸的位點的糖化氨基酸和/或糖化肽的代表性例子的FK或ZFK；其中，這些物質(zhì)已經(jīng)通過蛋白酶作用從糖化血紅蛋白上切割下來。具體地，該方法基于與FVH的反應(yīng)性相比，與FK或FZK的反應(yīng)性為5％或更低的指數(shù)進行。該反應(yīng)性優(yōu)選為4％或更低，更優(yōu)選2％或更低。由此獲得的具有性質(zhì)(K1)；具有性質(zhì)(K2)并與FVH反應(yīng)；或具有性質(zhì)(K3)的酮胺氧化酶可以是從自然界分離的天然酮胺氧化酶；通過使用已知的遺傳工程技術(shù)，例如氨基酸替代、缺失或插入，人為地修飾天然酮胺氧化酶獲得的突變酮胺氧化酶；和可以通過使用聚乙二醇衍生物、琥珀酰亞胺衍生物、馬來酰亞胺衍生物等，化學(xué)修飾天然和突變酮胺氧化酶獲得的酮胺氧化酶。
<突變的酮胺氧化酶>
對于可以通過人為地修飾(例如替代、缺失或插入)其一個或多個氨基酸用于獲得具有性質(zhì)(K1)；具有性質(zhì)(K2)并與FVH反應(yīng)；或具有性質(zhì)(K3)的突變酮胺氧化酶的已有酮胺氧化酶，沒有特別的限制。其實例包括在篩選方法中描述的、用于獲得具有(P1)或(P3)特異性的蛋白酶的酮胺氧化酶。
此外，可與FVH反應(yīng)的酮胺氧化酶的實例包括來源于Coniochaeta屬(EP 1,291,416)、Eupenicillium屬(EP 1,291,416)、彎孢屬和Neocosmospora屬微生物的酮胺氧化酶。
這些酶已經(jīng)在遺傳水平上進行了分析，所估計的一級結(jié)構(gòu)顯示在圖1中。這些酶在氨基酸水平上的同源性為75％或更高，存在符號“*”表示的保守區(qū)域，因此包括這些酶以作為包含與SEQ ID NO1所示氨基酸序列有至少75％同源性的氨基酸序列的酮胺氧化酶的實例。而且，只要實施的突變可以達到具有性質(zhì)(K1)；具有性質(zhì)(K2)并與FVH反應(yīng)；或具有性質(zhì)(K3)的目的，并不對氨基酸的替代、缺失或插入加以限制；但是期望地，例如，對相應(yīng)于SEQ ID NO1所示氨基酸序列中第58和62位氨基酸的氨基酸中至少一個進行替代。更期望的是，用纈氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸替代相應(yīng)于第58位氨基酸的氨基酸；和用組氨酸替代相應(yīng)于第62位氨基酸的氨基酸。
<突變酮胺氧化酶的表達載體和宿主細胞>
具有性質(zhì)(K1)；具有性質(zhì)(K2)并與FVH反應(yīng)；或具有性質(zhì)(K3)的酮胺氧化酶可以按如下方式獲得如果必要，編碼該酶的基因與質(zhì)粒載體連接；將基因轉(zhuǎn)移到宿主微生物例如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、支頂孢屬(Acremonium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、棲熱菌屬(Thermus)或埃希氏桿菌屬(Escherichia)微生物中；培養(yǎng)微生物；或者體外轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼基因；和使用已知用于蛋白質(zhì)或酶的分離或純化方法進行處理。
<測定試劑盒>
通過使用蛋白酶和酮胺氧化酶、不經(jīng)分離操作而特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的方法和試劑盒可以包括為獲得對糖化β鏈N末端的特異性而組合的蛋白酶和酮胺氧化酶以及過氧化物酶和色素原，而且如果必要，可以適當(dāng)?shù)靥砑泳彌_液成分、鹽、表面活性劑、金屬離子、電子受體、螯合劑、糖、氨基酸、抗壞血酸氧化酶、四唑鹽、多元醇、酶穩(wěn)定劑、酶反應(yīng)促進劑、抗細菌劑、抗氧化劑、還原劑、輔酶等。
當(dāng)?shù)鞍酌负屯费趸副环謩e劃分成如上述的(P1)至(P4)和(K1)至(K5)時，如下組合均可以用作蛋白酶和酮胺氧化酶的組合以獲得對糖化β鏈N末端的特異性<(P1)和(K1)或(K2)或(K3)或(K4)>、<(P2)和(K1)或(K3)>、<(P3)和(K1)或(K2)>、<(P4)和(K1)>、<(P3)和(K5)和(K3)>、及<(P3)和(K5)和(K4)>。然而，一般地，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的N末端氨基基團已經(jīng)被糖化時，從N末端區(qū)域切割糖化氨基酸的反應(yīng)性低。因此，期望的是，蛋白酶從β鏈N末端的糖化氨基酸切下糖化肽?？梢酝ㄟ^上述蛋白酶篩選獲得的、具有性質(zhì)(P3)并具有從β鏈N末端切割FVH的性質(zhì)的蛋白酶的實例包括來源于屬于芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬、溶桿菌屬等的細菌的蛋白酶。更具體的實例包括來源于芽孢桿菌屬種的中性蛋白酶(由Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))、來源于芽孢桿菌屬種ASP-842(FERM BP-08641)、嗜水氣單胞菌NBRC 3820和產(chǎn)酶溶桿菌YK-366(FERM BP-10010)的蛋白酶。此外，為了提高反應(yīng)性并同時保持特異性，所篩選的蛋白酶可以和其它適當(dāng)?shù)牡鞍酌嘎?lián)用。
從血紅蛋白的糖化β鏈N末端切下的糖化肽的長度為20個氨基酸或更短，并且只要可以使用所聯(lián)用的酮胺氧化酶檢測該肽，該長度不受特別限制。例如，在使用來源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶的情況下，期望的是，通過蛋白酶自血紅蛋白的糖化β鏈N末端切下的糖化肽是FVH。
盡管只要酮胺氧化酶可以與蛋白酶構(gòu)建上述的聯(lián)合，對該酮胺氧化酶不加以限制，但是期望的是，就反應(yīng)性而言，蛋白酶自β鏈N末端切割的是糖化肽而不是糖化氨基酸。因此，期望地，在(K1)至(K5)中提及的來源于糖化β鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽是來源于糖化β鏈N末端的糖化肽。例如，來源于Curcularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶可與來源于糖化β鏈N末端的糖化二肽(FVH)反應(yīng)，但不實質(zhì)性地與來源于糖化α鏈N末端的糖化二肽(FVL)反應(yīng)，這樣該酮胺氧化酶可以用作具有性質(zhì)(K3)的酮胺氧化酶。而且，相對于和FVH的反應(yīng)性而言和FZK的反應(yīng)性為5％或更低的突變體可以用作具有性質(zhì)(K1)的酮胺氧化酶，而來源于尖孢鐮孢的果糖基胺氧化酶(由Asahi Kasei Pharma Corparation生產(chǎn))可以用作具有性質(zhì)(K5)的酮胺氧化酶。
<反應(yīng)條件>
蛋白酶切割糖化血紅蛋白糖化β鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽的反應(yīng)條件只要足夠反應(yīng)進行，即可不加限制。例如，一般地，期望的是，通過調(diào)節(jié)pH、鹽濃度、添加的表面活性劑的量、添加的金屬離子的量、反應(yīng)溫度、添加的氧化劑-還原劑的量、或緩沖液濃度增加具有(P3)或(P2)性質(zhì)的蛋白酶的特異性從而獲得性質(zhì)(P1)的反應(yīng)條件。具體地，對于來源于芽孢桿菌屬種的中性蛋白酶(由Toyobo Co.Ltd.生產(chǎn))和來源于芽孢桿菌屬種ASP-842(FERM BP-08641)、嗜水氣單胞菌NBRC 3820和產(chǎn)酶溶桿菌YK-366(FERM BP-10010)的蛋白酶，當(dāng)來源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶用作待聯(lián)合的酮胺氧化酶時，這些蛋白酶必須在pH 5.0至6.0的反應(yīng)條件下成為具有性質(zhì)(P1)的蛋白酶，因此優(yōu)選該反應(yīng)條件。
酮胺氧化酶的反應(yīng)條件只要足夠反應(yīng)進行，即可不加以限制。例如，期望是，通過調(diào)節(jié)pH、鹽濃度、添加的表面活性劑的量、添加的金屬離子的量、反應(yīng)溫度、添加的氧化還原量、或緩沖液濃度從而對FZK獲得30％或更低的反應(yīng)性的反應(yīng)條件。尤其期望的是pH5.5至6.5的反應(yīng)條件，因為可以增強對FVH——通過蛋白酶的切割作用來源于β鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽——的特異性。
上述利用蛋白酶和酮胺氧化酶不經(jīng)分離操作而特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的方法和試劑盒對糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的正確測定，可以通過使用其中的血紅蛋白含量和血紅蛋白β鏈N末端的糖化率得到正確證實的樣品進行驗證。對于其中的血紅蛋白含量和血紅蛋白β鏈N末端的糖化率得到正確證實的樣品，期望使用的是通過Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 40(1)78-89(2002)描述的方法獲得的測定值(IFCC值)得到明確說明的樣品?；蛘?，在明確說明了通過其它方法獲得的測定值的樣品中，可以通過RinshoKensa 46(6)，729-734(2002)所述的換算公式獲得IFCC值。而且，可以從人血液通過適當(dāng)?shù)亟M合操作例如血細胞分離、溶血、離心、透析、離子交換層析和親和層析(Clinical Chemistry and LaboratoryMedicine 36(5)299-308(1998))制備糖化血紅蛋白樣品，或者可以購買和使用市售樣品。
<測定對象>
上述使用蛋白酶和酮胺氧化酶不經(jīng)分離操作而特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的方法和試劑盒的測定對象，只要包括糖化血紅蛋白即可不加限制，其實例包括全血樣品、溶血的血細胞樣品和純化的血紅蛋白樣品。
以下將通過參考實施例和實施例描述本發(fā)明。
盡管Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)產(chǎn)生可與FVH反應(yīng)的酮胺氧化酶(之后也稱作FOD923)，但是酮胺氧化酶的產(chǎn)量低。因此，如下述，在大腸桿菌中表達FOD923基因，并加以純化以得到FOD923。
(1)制備Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的染色體DNA
將100ml Sabouraud氏培養(yǎng)基(葡萄糖4.0％、聚胨1.0％、pH 5.6)倒入500ml體積的搖瓶中，高壓滅菌，向其中接種Curvularia clavataYH 923(FERM BP-10009)，25℃振蕩培養(yǎng)4天，之后使用2號濾紙過濾培養(yǎng)基，由此收集細胞。所收集的細胞經(jīng)液氮冷凍后在研缽中粉碎得到細粉末。然后，向其中加入15ml用于DNA提取的緩沖液(5.0％SDS，0.1M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0)，緩慢地搖動混合物以溶解粉末。隨后，離心(5,000rpm，6min，室溫)收集上清液，進行3次苯酚/氯仿提取和2次醚提取，蒸發(fā)剩余在水層中的醚。然后，加入1ml 3M乙酸鈉和25ml乙醇，混合物在-30℃放置30分鐘。
之后離心(12,000rpm，10min，4℃)收集染色體DNA，70％乙醇洗滌，溶解在400μl TE中。之后，向所獲DNA溶液中加入10μl(0.132U)RNase，混合物在37℃處理1小時。然后加入5μl(0.6U)蛋白酶K，混合物在50℃處理1小時。之后，苯酚/氯仿提取(2次)和氯仿/異戊醇提取(1次)，乙醇沉淀收集DNA。收集的DNA用70％乙醇溶液洗滌，除去乙醇后溶解在200μl TE中，由此得到染色體DNA溶液。
(2)擴增FOD923基因片段
(a)獲得FOD923基因片段
基于已知的酮胺氧化酶基因信息，設(shè)計以下引物P11和P12。P11 AA(A/G)GC(C/T)AT(C/T)AACGC(C/T)AT(C/T)GG(SEQID NO2)P12 AC(C/G)ACGTGCTT(A/G)CC(A/G)ATGTT(SEQ ID NO3)
使用通過上述方法獲得的染色體DNA作為模板DNA，利用引物P11和引物P12組合，進行35個PCR循環(huán)。結(jié)果，特異地擴增了大約800bp的DNA片段，測序該擴增的DNA片段(SEQ ID NO1中第1021位堿基至第1790位堿基的序列)。
(b)FOD923基因測序
(a)中獲得的大約800bp的DNA片段的相鄰5’上游區(qū)DNA片段通過盒連接介導(dǎo)的PCR，使用LA-PCR體外克隆試劑盒(由Takara BioInc.生產(chǎn))，在用限制性酶XbaI消化染色體DNA后進行擴增。即，XbaI盒(由Takara Bio Inc.生產(chǎn))與限制性酶處理染色體DNA后獲得的片段連接，使用所得DNA作為模板DNA并利用引物C1(由Takara Bio Inc.生產(chǎn))以及以下引物P13進行35個PCR循環(huán)。然后，利用稀釋反應(yīng)溶液100倍得到的溶液作為模板，利用引物C2(由Takara Bio Inc.生產(chǎn))以及以下引物P14，再進行35個PCR循環(huán)。結(jié)果特異地擴增了1,200bp大小的DNA片段。然后，測序該擴增的DNA片段(在SEQ IDNO1中從第1位堿基至第1044位堿基的序列)。
(a)中獲得的大約800bp的DNA片段的相鄰3’下游區(qū)DNA片段通過盒連接介導(dǎo)的PCR，使用LA-PCR體外克隆試劑盒(由Takara BioInc.生產(chǎn))，在用限制性酶SalI消化染色體DNA后進行擴增。即，SalI盒(由Takara Bio Inc.生產(chǎn))與限制性酶處理染色體DNA后獲得的片段連接，使用所得DNA作為模板DNA并利用引物C1(由Takara Bio Inc.生產(chǎn))以及以下引物P15進行35個PCR循環(huán)。然后，利用稀釋反應(yīng)溶液100倍得到的溶液作為模板，利用引物C2(由Takara Bio Inc.生產(chǎn))以及以下引物P16，再進行35個PCR循環(huán)。結(jié)果特異地擴增了1,000bp大小的DNA片段。然后，測序該擴增的DNA片段(在SEQ IDNO1中從第1775位堿基至第2212位堿基的序列)。
連接以上確定的堿基序列以確定FOD923基因的堿基序列(SEQID NO1)。
P13 GCCAAAAGAGGCTGCTTGAACGAT
(與SEQ ID NO1的1,083至1,106的堿基序列互補的序列)
P14 GCATCCAGCACCACCAAAACAAAC
(與SEQ ID NO1的1,062至1,086的堿基序列互補的序列)
P15 TGGTGCCAGAACAACATGTACTGACC
(SEQ ID NO1的1,713至1,738的堿基序列)
P16 ACCTGGTTTGCCTAGGCACACA
(SEQ ID NO1的1,736至1,757的堿基序列)
(3)制備表達來源于Curvularia clavata YH923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶的大腸桿菌(Escherichia coli)
為了在大腸桿菌中表達FOD923，從微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)來源的酮胺氧化酶(JP-A-11-46769)和構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)來源的酮胺氧化酶之間的同源性，估計SEQ IDNO1中的三個區(qū)域，即，SEQ ID NO1中第753位堿基至第807位堿基的序列，SEQ ID NO1中第1231位堿基至第1279位堿基的序列，和SEQ ID NO1中第1696位堿基至1750位堿基的序列，是內(nèi)含子。
通過如下操作除去內(nèi)含子并產(chǎn)生在大腸桿菌中的表達質(zhì)粒。
首先，合成DNA片段P22至P27——其具有包括40至50個堿基而位于待除去的內(nèi)含子所在區(qū)域的側(cè)翼的序列的正序列及互補序列；DNA片段P21——其通過在FOD923基因的起始密碼子ATG上添加限制性酶NcoI的限制性序列獲得；和DNA片段P28——其具有通過在恰好位于FOD923基因終止密碼子后面的位點上添加限制性酶SacI而獲得的互補序列。
隨后，使用Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的染色體DNA作為模板并分別使用引物P21和P23、P22和P25、P24和P27、以及P26和P28的聯(lián)合，進行4種PCR，由此產(chǎn)生大小分別為327bp、480bp、471bp或254bp的、已經(jīng)除去了內(nèi)含子區(qū)域的擴增DNA片段。然后，所得4個片段混合并用作模板，通過使用P21和P28作為引物再次進行PCR，由此得到大小約1.4kb的DNA片段，該DNA片段具有一個由四個片段在三個同源區(qū)域連接而成的、除去了內(nèi)含子的FOD923基因。
為了在大腸桿菌中高水平地產(chǎn)生FOD923，使用來源于淺綠氣球菌(Aerococcus viridans)的丙酮酸氧化酶啟動子(JP-A-07-67390)——一種高表達啟動子。其具體步驟描述如下。
1)為了從包括淺綠氣球菌的丙酮酸氧化酶基因(見JP-B-07-67390)的質(zhì)粒pOXI3獲得丙酮酸氧化酶基因的啟動子區(qū)域，用DraI切割pOX13以分離具有SEQ ID NO6所示202bp大小的DNA序列的丙酮酸氧化酶基因啟動子區(qū)，然后與SalI切割pUC13并用T4DNA聚合酶平端化后得到的片段連接，由此得到質(zhì)粒pKN19，在pKN19中pUC13的氨芐青霉素抗性基因的方向和丙酮酸氧化酶基因啟動子的方向相同。
2)為了通過啟動子更有效地表達，合成具有SEQ ID NO7所示堿基序列的DNA片段P31——該片段經(jīng)設(shè)計可以在pKN19的丙酮酸氧化酶基因啟動子下游提供核糖體結(jié)合序列區(qū)和多克隆位點；和具有其互補序列的DNA片段P32——P32具有SEQ ID NO8所示堿基序列。然后，實施退火，將這些片段與XbaI和EcoRI切割的pKN19連接，由此制備質(zhì)粒pPOS2。
3)約1.4kb大小并包括上述已經(jīng)除去了內(nèi)含子的FOD923基因的DNA片段用NcoI和SacI切割，所得產(chǎn)物整合在也用NcoI和SacI切割的pPOS2中，由此制備質(zhì)粒pPOSFOD923，其中FOD923基因整合在丙酮酸氧化酶基因啟動子的下游。
4)用所得pPOSFOD923轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110以產(chǎn)生表達FOD923的大腸桿菌FAOD923。
P21
CACACATCCTCGTCATTTCGCCATGGCGCCCTCAAGAGCAAA
C(SEQ ID NO4)
P22
CAAAGAGTATTTCCACAACACTGGAAGACTCGACTGTGCACATGGGGAAGAGG(SEQ ID NO1中725至752和808至832的堿基序列)
P23
CCTCTTCCCCATGTGCACAGTCGAGTCTTCCAGTGTTGTGGAAATACTCTTTG(SEQ ID NO1中725至752和808至832的堿基序列的互補序列) P24
GACCTGGAAGATCAATGCGTTTCAAAAGCTTGGGTATATGCTCACATACAGCTTAC(SEQ ID NO1中1,204至1,230和1,280至1,308的堿基序列)
P25
GTAAGCTGTATGTGAGCATATACCCAAGCTTTTGAAACGCATTGATCTTCCAGGTC(SEQ ID NO1的1,204至1,230和1,280至1,308的堿基序列的互補序列)
P26
CTTTGTGCTGGCGACAGGGGACAGCGGGCACACATTCAAACTTTTGCCAAATATC(SEQ ID NO1的1,669至1,695和1,751至1,778的堿基序列)
P27
GATATTTGGCAAAAGTTTGAATGTGTGCCCGCTGTCCCCTGTCGCCAGCACAAAG(SEQ ID NO1的1,669至1,695和1,751至1,778的堿基序列的互補序列)
P28
CACGCTACAAGACGAGTTTCGAGCTCTATAACTTGGACTTGACAAC(SEQ ID NO5)
P31
CTAGAGGAATAACACCATGGCCGTCGACGCTAGCATGCATGGATCCCGGGTACCGAGCTCG(SEQ ID NO7)
P32
AATTCGAGCTCGGTACCCGGGATCCATGCAGCTAGCGTCGACGGCCATGGTGTTATTCCT(SEQ ID NO8)
(4)制備來源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶
在2.4cm直徑的試管中接種上述制備的大腸桿菌FAOD923，其中每個試管中含有10ml具有3％山梨糖醇、1.5％蛋白胨、1.5％啤酒酵母提取物和50μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)基(pH 7.0)，在28℃振蕩培養(yǎng)12小時得到接種物。在含有20L培養(yǎng)基(pH 7.0)的30L小型發(fā)酵罐中接種該接種物，其中所述培養(yǎng)基含有3％山梨糖醇、1.5％蛋白胨、1.5％啤酒酵母提取物、0.1％消泡劑和50μg/ml氨芐青霉素，37℃攪動培養(yǎng)18小時。
培養(yǎng)完成后，收集培養(yǎng)細胞并懸浮在4L 10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中，通過超聲粉碎進行溶解(212KU)。溶解的溶液在8,000rpm離心30分鐘，上清液使用Q-Sepharose Big Beads樹脂(2L)(Amersham生產(chǎn))進行離子交換層析。用包括0M、0.1M、0.3M或0.5MNaCl的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)實施洗脫。結(jié)果，收集用包括0.3M和0.5M NaCl的緩沖液洗脫的級分作為活性級分(180KU)。通過組件(Amicon生產(chǎn))將酶溶液濃縮到750ml，濃縮的溶液在10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中透析過夜。使用Q-Sepharose HP樹脂(Amersham生產(chǎn))(500ml)對透析的溶液進行離子交換層析。用包括0至0.3M NaCl的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)通過線性梯度進行洗脫，收集用包括0.15至0.2M NaCl的緩沖液洗脫的級分(92KU)。將酶溶液濃縮到500ml，濃縮的溶液對10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)透析過夜，之后冷凍干燥得到純化的FOD923。以下描述用于FOD923活性的測定試劑和測定方法。
<測定試劑>
50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)
1mM FVH(Peptide Institute，Inc.生產(chǎn))
0.02％4-氨基安替比林(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))
0.02％TOOS(Dojindo Laboratories生產(chǎn))
5U/ml過氧化物酶(Sigma Corporation生產(chǎn))
(TOOSN-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺)
<測定方法>
將1ml測定試劑加入試管，在37℃預(yù)熱5分鐘，然后向其中加入0.05ml酶溶液，允許溶液反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)后，加入2ml 0.5％SDS終止反應(yīng)，測定550nm波長的吸光度(Aa)。同時，作為空白試驗，使用不包括FVH的測定試劑實施相同操作以測定吸光度(Ab)。從吸光度(Aa)和空白的吸光度(Ab)的吸光度差(Aa-Ab)，計算酶活性。
一個單位的酶活性定義為37℃下1分鐘產(chǎn)生1μmol過氧化氫的酶量。
盡管Neocosmospora vasinfecta 474產(chǎn)生與FVH反應(yīng)的酮胺氧化酶(以下也稱作FOD474)，但酮胺氧化酶的產(chǎn)量低。因此，如下述，在大腸桿菌中表達該酮胺氧化酶基因并純化得到酮胺氧化酶。
(1)制備Neocosmospora vasinfecta 474的染色體DNA
將100ml Sabouraud培養(yǎng)基(葡萄糖4.0％、聚胨1.0％、pH 5.6)倒入500ml體積的Sakaguchi瓶中，高壓滅菌，向其中接種Neocosmospora vasinfecta 474，25℃振蕩培養(yǎng)4天，之后使用2號濾紙過濾培養(yǎng)基，由此收集細胞。收集的細胞用液氮冷凍，在研缽中粉碎得到細的粉末，使用DNeasy Plant Maxi試劑盒(QIAGEN生產(chǎn))獲得染色體DNA溶液。
(2)克隆酮胺氧化酶基因
(a)制備放射性DNA探針
預(yù)期Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶基因與FOD923基因同源。因此，用限制性酶NcoI和SacI切割包括FOD923基因的上述質(zhì)粒pPOSFOD923，分離約1.4kb大小并包括酮胺氧化酶基因的DNA片段。然后，使用BcaBEST標記試劑盒(Takara Bio Inc.生產(chǎn))和[α-32P]dCTP及該DNA片段制備放射性DNA探針。
(b)通過Southern雜交檢測含有酮胺氧化酶基因的DNA片段
為了從通過(1)中所述操作獲得的Neocosmospora vasinfecta 474的染色體DNA制備基因文庫，用各種限制性酶切割該染色體并檢測含有靶基因的DNA片段的長度。首先，用各種限制性酶切割Neocosmospora vasinfecta 474的染色體DNA，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，將DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Biodyne APALLCorporation生產(chǎn))。接著，膜空氣干燥后浸沒在雜交溶液(0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％牛血清白蛋白，0.75M氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，50mM磷酸三鈉，0.1％十二烷基硫酸鈉，250μg/ml鮭精DNA，和50％甲酰胺)中，42℃預(yù)雜交2小時。預(yù)雜交后，將雜交溶液更換為新的雜交溶液，加入(a)中制備的放射性DNA探針，之后在42℃雜交過夜。雜交后，膜用洗滌溶液(75mM氯化鈉，7.5mM檸檬酸鈉和0.1％SDS)在50℃洗滌10分鐘，自然干燥。干燥的膜放置在X光片上，-70℃曝光24小時。
曝光后，X光片顯影，觀察通過各種限制性酶切割染色體顯示的陽性條帶的大小。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在通過用SacI切割獲得的大約8kb大小的DNA片段上存在酮胺氧化酶基因，使用通過SacI切割而獲得的8kb染色體DNA片段產(chǎn)生基因文庫。
(c)制備基因文庫
通過(1)中所述操作獲得的Neocosmospora vasinfecta 474染色體DNA用限制性酶SacI切割，進行瓊脂糖電泳以分離大約8kb大小的DNA片段。所得DNA片段使用DNA連接試劑盒(Takara Bio Inc.生產(chǎn))與在用限制性酶SacI切割后用堿性磷酸酶脫磷酸化的pUC119連接。用所得物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109感受態(tài)細胞(Takara Bio Inc.生產(chǎn))，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(Becton，Dickinson andCompany生產(chǎn))上培養(yǎng)，得到大約5,000個氨芐青霉素抗性菌落，這些菌落用作基因文庫。
(d)通過菌落雜交篩選包含含有酮胺氧化酶基因的DNA片段的重組大腸桿菌
將(c)中獲得的基因文庫復(fù)制在尼龍膜(Biodyne APALLCorporation生產(chǎn))上，根據(jù)膜的所附手冊，將細胞的DNA固定于其上。將固定了DNA的膜浸沒在(b)中所示雜交溶液中，42℃預(yù)雜交1小時。預(yù)雜交后，將雜交溶液更換為新的雜交溶液，加入(a)中制備的放射性DNA探針，之后42℃雜交處理過夜。雜交后，膜用(b)中所示洗滌溶液在50℃洗滌10分鐘，自然干燥。干燥的膜放置在X光片上，-70℃曝光24小時。曝光后，X光片顯影，鑒定到顯示陽性信號的8個菌落。
(e)提取重組質(zhì)粒和測序酮胺氧化酶基因
將(d)中選擇的顯示陽性信號的菌落接種在含有50μg/ml氨芐青霉素的1.5ml LB液體培養(yǎng)基(Becton，Dickinson and Company生產(chǎn))中，37℃振蕩培養(yǎng)16小時，提取質(zhì)粒。結(jié)果，來源于8個菌落的質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)具有相同的染色體DNA片段。對于其中一個質(zhì)粒，鑒定到與FOD923基因同源的一個區(qū)域，并對FOD474基因進行測序。SEQ IDNO9顯示測定的FOD474基因堿基序列和由其編碼的氨基酸序列。
(3)構(gòu)建表達Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶的大腸桿菌
為了在大腸桿菌中表達FOD474，合成在FOD474基因的起始密碼子ATG上添加了限制性酶BspHI的限制性序列的引物P41(SEQID NO10)；和恰好在酮胺氧化酶基因的終止密碼子后面的位點上添加了限制性酶SacI的識別序列的、具有互補序列的引物P42(SEQ IDNO11)。
之后，使用Neocosmospora vasinfecta 474的染色體DNA作為模板，使用P41和P42作為引物進行25個PCR循環(huán)，由此產(chǎn)生大約1.4kb大小并包括FOD474基因的DNA片段。用BspHI和SacI切割DNA片段，將所得產(chǎn)物摻入NcoI和SacI切割的pPOS2以制備質(zhì)粒pPOSFOD474，在該質(zhì)粒中酮胺氧化酶基因整合在丙酮酸氧化酶基因啟動子的下游。此外，將通過用XbaI和SacI切割獲得的、大約1.4kb大小并包括FOD474基因的DNA片段摻入質(zhì)粒pUC119，由此產(chǎn)生質(zhì)粒p119-FOD474(FERM BP-08642)，并測序。結(jié)果，證實沒有發(fā)生由于PCR引起的突變。用所得pPOSFOD474轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110，以構(gòu)建表達FOD474的大腸桿菌FAOD474。
質(zhì)粒p119-FOD474(FERM BP-08642)已經(jīng)于2004年2月24日保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心，TsukubaCentral 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本。
P41 TTTTTTCATGACCACCCCCCGCAAAGAAACCACCGTCCTC(SEQ ID NO10)
P42 TTTTTGAGCTCATCTTGACTCGCTGTCCTGATCGTGCTTC(SEQ ID NO11)
(4)制備來源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶
使用大腸桿菌FAOD474以和所述FOD923相同的方式進行操作。同時，用于FOD474活性的測定試劑和方法也與上述用于FOD923的相同。
將20μl酶溶液加入200μl反應(yīng)溶液(50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)、0.1％Triton X-100、0.03％4-氨基安替比林、0.02％TOOS、5U/ml過氧化物酶和2mM底物)中，混合物在37℃反應(yīng)5分鐘，然后加入0.5ml 0.5％SDS。測定555nm的吸光度(A1)，使用不含底物的反應(yīng)溶液進行相同操作以測定吸光度(Ab)，由此從(A1-Ab)差確定反應(yīng)性。表3顯示所用來源于FOD923、FOD474和尖孢鐮孢(由Asahi KaseiPharma Corporation生產(chǎn)之后也稱作FOD2)的酮胺氧化酶的酶溶液濃度；所用底物；吸光度差(A1-Ab)；和相對活性(％)。
將來源于豬腎的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(Sigma Corporation生產(chǎn)之后稱作ACEP)和來源于兔肺的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(Sigma Corporation生產(chǎn)之后稱作ACER)溶解在酶溶解溶液(100mM HEPES(pH 8.3)，300mM NaCl)中以具有20U/ml濃度，從而制備ACEP溶液和ACER溶液。之后，將20μl所述酶溶解溶液、ACEP溶液和ACER溶液分別加入各含有20μl 2mM FVHL(Peptide Institute，Inc.生產(chǎn))溶液的三個試管中，混合物在37℃反應(yīng)1小時。然后，將200μl顯色溶液(50mMTris-HCl(pH 7.5)、0.1％Triton X-100、5U/ml POD、50U/ml FOD2和0.02mM DA-64)加入各反應(yīng)物，混合物在37℃反應(yīng)5分鐘。之后，加入500μl 0.5％SDS終止顯色反應(yīng)，測定730nm的吸光度。除了使用蒸餾水代替2mM FVHL溶液外，進行相同反應(yīng)。同時，向40μl FV溶液(0，5，10，20或50μM)加入200μl顯色溶液，按以上相同的方式進行測定。然后，產(chǎn)生校準曲線，并確定分別通過ACEP和ACER從FVHL釋放的FV量。FV的校準曲線揭示，在5μM、10μM、20μM和50μM的FV濃度(μM)下吸光度差分別為0.019、0.033、0.065和0.0154。同時，發(fā)現(xiàn)顯示通過ACEP反應(yīng)釋放的FV的吸光度差為-0.006，而發(fā)現(xiàn)顯示通過ACER反應(yīng)釋放的FV的吸光度差為0.000。這些結(jié)果揭示，在一般的反應(yīng)中通過ACEP和ACER幾乎不能從FVHL釋放FV。而且發(fā)現(xiàn)，當(dāng)通過向40μl樣品(25μM FV，10U/mlACER)添加顯色溶液進行相同測定時，吸光度差是0.062，由此說明在該顯色溶液中ACER幾乎不抑制顯色反應(yīng)。
表3
實施例1
篩選用于血紅蛋白A1c測定(pH 7.5)的蛋白酶
顯示篩選如下蛋白酶的方法，所述蛋白酶可從血紅蛋白β鏈的N末端糖化五肽切割糖化肽而不實質(zhì)性地從血紅蛋白α鏈的N末端糖化五肽切割糖化氨基酸和糖化肽。將各10μl用于篩選的樣品分別放入96孔板的3個孔。然后，第一個孔補加50μlα溶液，第二個孔補加50μl β溶液，而第三個孔補加50μl對照溶液。板子在37℃溫育60分鐘后，加入50μl蒸餾水和50μl顯色溶液，整個在室溫放置30分鐘。然后，使用小平板讀數(shù)器(550型，Bio-Rad生產(chǎn))測定550nm測量波長下的吸光度和595nm參考波長下的吸光度，以選擇如下樣品，對于所述樣品，補加β溶液的孔和補加對照溶液的孔之間的吸光度差大于補加α溶液的孔和補加對照溶液的孔之間的吸光度差。由此選擇目的蛋白酶。所用樣品包括羧肽酶B(Sigma-Aldrich Corp.生產(chǎn))；羧肽酶W(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))；羧肽酶Y(Oriental Yeast Co.，Ltd.生產(chǎn))；蛋白酶(XXVII類nagaseSigma-Aldrich Corp.生產(chǎn))；蛋白酶(VIII類枯草桿菌蛋白酶CarlsbergSigma-Aldrich Corp.生產(chǎn))；蛋白酶(XXIV類BacterialSigma-AldrichCorp.生產(chǎn))；蛋白酶K(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))；中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))；羧肽酶A(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.生產(chǎn))；嗜熱菌蛋白酶(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))；和蒸餾水。為了驗證通過顯色溶液造成的顯色程度，將10μl 1mM FVH(Peptide Institute Inc.生產(chǎn))和1mM FVL(PeptideInstitute Inc.生產(chǎn))分別加入孔中，之后添加50μl對照溶液。整個在37℃溫育60分鐘。然后，加入50μl蒸餾水和50μl顯色溶液，整個在室溫放置30分鐘，之后按上述相似的方式實施測定。結(jié)果顯示在表4和表5。結(jié)果證實，羧肽酶B、羧肽酶W、中性蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶是在pH 7.5下從血紅蛋白β鏈N末端糖化五肽切割糖化肽而不實質(zhì)性地從血紅蛋白α鏈N末端糖化五肽切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。
<α溶液>
50mM Tris-HCl(pH 7.5)
0.1％Triton X-100
0.2mM α糖化五肽(Peptide Institute Inc.生產(chǎn))
<β溶液>
50mM Tris-HCl(pH 7.5)
0.1％Triton X-100
0.2mM β糖化五肽(Peptide Institute Inc.生產(chǎn))
<對照溶液>
50mM Tris-HCl(pH 7.5)
0.1％Triton X-100
<顯色溶液>
100mM Tris-HCl(pH 7.5)
0.09％4-氨基安替比林(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))
0.06％TODB(Dojindo Laboratories生產(chǎn))
15U/ml過氧化物酶(Sigma-Aldrich Corp.生產(chǎn))
18.75U/ml FOD923
(TODBN，N-二(4-磺基丁基)-3-甲基苯胺)
表4
原始數(shù)據(jù)(pH 7.5)
表5
原始數(shù)據(jù)(pH 7.5)
實施例2
篩選用于血紅蛋白A1c測定(pH 3.5)的蛋白酶
顯示篩選如下蛋白酶的方法，所述蛋白酶從血紅蛋白β鏈的N末端糖化五肽切割糖化肽而不實質(zhì)性地從血紅蛋白α鏈的N末端糖化五肽切割糖化氨基酸和糖化肽。將各10μl用于篩選的樣品分別放入96孔板的3個孔。然后，第一個孔補加50μlα溶液，第二個孔補加50μlβ溶液，而第三個孔補加50μl對照溶液。板子在37℃溫育60分鐘后，加入50μl調(diào)節(jié)pH的溶液和50μl顯色溶液，整個在室溫放置30分鐘。然后，使用小平板讀數(shù)器(550型，Bio-Rad生產(chǎn))測定550nm測量波長下的吸光度和595nm參考波長下的吸光度，以選擇如下樣品，對于所述樣品，補加β溶液的孔和補加對照溶液的孔之間的吸光度差大于補加α溶液的孔和補加對照溶液的孔之間的吸光度差。由此選擇目的蛋白酶。所用樣品包括羧肽酶B(Sigma-Aldrich Corp.生產(chǎn))；羧肽酶W(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))；羧肽酶Y(Oriental Yeast Co.，Ltd.生產(chǎn))；蛋白酶(XXVII類nagaseSigma-Aldrich Corp.生產(chǎn))；蛋白酶(VIII類枯草桿菌蛋白酶CarlsbergSigma-Aldrich Corp.生產(chǎn))；蛋白酶(XXIV類BacterialSigma-AldrichCorp.生產(chǎn))；蛋白酶K(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))；中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))；和蒸餾水。為了證實通過顯色溶液造成的顯色程度，將10μl 1mM FVH(Peptide Institute Inc.生產(chǎn))和1mM FVL(Peptide Institute Inc.生產(chǎn))分別加入孔中，之后添加50μl對照溶液。整個在37℃溫育60分鐘。然后，加入50μl調(diào)節(jié)pH的溶液和50μl顯色溶液，整個在室溫放置30分鐘，之后按上述相似的方式實施測定。結(jié)果顯示在表6中。結(jié)果證實，羧肽酶B是在pH 3.5下從血紅蛋白β鏈N末端糖化五肽切割糖化肽而不實質(zhì)性地從血紅蛋白α鏈N末端糖化五肽切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。
<α溶液>
50mM乙酸-乙酸鈉(pH 3.5)
0.1％Triton X-100
0.2mM α糖化五肽(Peptide Institute Inc.生產(chǎn))
<β溶液>
50mM乙酸-乙酸鈉(pH 3.5)
0.1％Triton X-100
0.2mM β糖化五肽(Peptide Institute Inc.生產(chǎn))
<對照溶液>
50mM乙酸-乙酸鈉(pH 3.5)
0.1％Triton X-100
<調(diào)節(jié)pH的溶液>
100mM CAPS-NaOH(pH 11.0)
(CAPS3-環(huán)己基氨基丙磺酸Dojindo Laboratories生產(chǎn))
<顯色溶液>
100mM Tris-HCl(pH 7.5)
0.09％4-氨基安替比林(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))
0.06％TODB(Dojindo Laboratories生產(chǎn))
15U/ml過氧化物酶(Sigma-Aldrich Corp.生產(chǎn))
18.75U/ml FOD923
(TODBN，N-二(4-磺基丁基)-3-甲基苯胺)
表6
原始數(shù)據(jù)(pH 3.5)
實施例3
篩選用于血紅蛋白A1c測定的來源于微生物的蛋白酶
在Difco Lactobacilli MRS液體培養(yǎng)基(Becton，Dickinson andCompany生產(chǎn))、MM培養(yǎng)基(2.5％甘露糖、2.5％啤酒酵母提取物、pH 7.0)和YPG培養(yǎng)基(2％葡萄糖、1％聚胨、2％酵母提取物、0.1％磷酸二氫鉀、0.05％硫酸鎂七水合物、pH 7.0)中在28至30℃溫度下振蕩培養(yǎng)各種細菌1至7天。然后，離心從培養(yǎng)液中除去細胞以獲得培養(yǎng)物上清液。通過用10mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)稀釋所獲的培養(yǎng)物上清液10倍，制備樣品，并以和實施例1所述相似的方式進行測定。表7顯示從MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細菌獲得的結(jié)果，表8顯示從MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細菌獲得的結(jié)果，表9顯示從YPG培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌獲得的結(jié)果(注意，表9中未確定參考波長)。
表7
原始數(shù)據(jù)(pH 7.5)
表8
原始數(shù)據(jù)(pH 7.5)
表9
原始數(shù)據(jù)(pH 7.5)
實施例4
純化來源于芽孢桿菌屬種ASP842(FERM BP-08641)的蛋白酶的方法及該蛋白酶的物理化學(xué)性質(zhì)
在4個加有150ml Difco Lactobacilli MRS液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中28℃振蕩培養(yǎng)芽孢桿菌屬種ASP842(FERM BP-08641)3天。然后，離心從培養(yǎng)液中除去細胞以獲得培養(yǎng)物上清液(77mU/ml，560ml)。向培養(yǎng)上清液添加210g硫酸銨和8.4g珍珠巖(Toko PerliteIndustry Co.，Ltd.生產(chǎn))，整個進行攪拌。然后，用90mm直徑的5A號濾紙(Toyo-Roshi Kaisha，Ltd.生產(chǎn))過濾，收集沉淀的蛋白酶。隨后，將沉淀物懸浮在10mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)中，隨后使用5A濾紙(Toyo-Roshi Kaisha，Ltd.生產(chǎn))過濾，由此獲得具有蛋白酶活性的濾液(215mU/ml，90ml)。濾液使用5L 10mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)透析。在10mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)平衡的柱(26×94mm)中用DEAE-Sepharose FF(Amercham生產(chǎn))吸附透析后的蛋白酶溶液，通過用0M至0.5M NaCl梯度洗脫獲得具有蛋白酶活性的級分(217mU/ml，54ml)。將硫酸銨加入該級分中至1M濃度后，在用1M硫酸銨和10mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)平衡的柱子(15×150mm)中用Phenyl-Sepharose CL-4B(Amersham生產(chǎn))吸附所述級分。然后，用1M硫酸銨、0％乙二醇至0M硫酸銨、20％乙二醇的梯度洗脫具有蛋白酶活性的級分(237mU/ml，18ml)，用Amicon Ultra 10000MWCO(Millipore生產(chǎn))濃縮，由此獲得純化的蛋白酶(13.9U/ml，0.42ml)。如下描述用于本發(fā)明蛋白酶活性測定的試劑和方法。
<測定試劑>
50mM Tris-HCl(pH 7.5)
2mM氯化鈣
0.1％Triton X-100
0.03％4-氨基安替比林
0.02％TOOS
5U/ml過氧化物酶
5U/ml FOD923
0.25mM底物
<測定方法>
將0.2ml測定試劑放入試管，37℃預(yù)熱5分鐘。然后，向其中加入0.02ml酶溶液，進行10分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，加入0.5ml 0.5％SDS以終止反應(yīng)。然后，測定555nm波長的吸光度(Aa)。此外，代替酶溶液加入蒸餾水作為空白對照，通過實施相似操作以確定吸光度(Ab)。從吸光度(Aa)和空白的吸光度(Ab)的差(Aa-Ab)，獲得酶活性。一個單位酶活性定義為37℃下每分鐘允許產(chǎn)生1μmol過氧化氫的酶量。注意，β糖化五肽被用作底物。
<物理化學(xué)性質(zhì)>
(1)底物特異性
除了將FOD923的濃度更改為50U/ml以及使用0.25mM β糖化五肽、0.25mM α糖化五肽、0.03mM FVH、0.03mM FVL和0.03mMFV作為底物外，根據(jù)實施例4中的<測定方法>實施測定。此外，將FOD923改為FOD2，進行相似測定。而且，使用中性蛋白酶(ToyoboCo.，Ltd.生產(chǎn))進行相似測定以用于比較。表10顯示所獲的吸光度差(Aa-Ab)。結(jié)果證實，本發(fā)明蛋白酶以和中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))的切割方式相同的方式，從β糖化五肽切割FVH而不從α糖化五肽切割糖化氨基酸和糖化肽。
表10
(2)最適pH
圖2顯示，根據(jù)實施例4所述的測定方法，但是分別使用50mMTris-HCl(pH 8.0，8.5)、50mM PIPES(pH 6.0，6.5，7.0)和50mM檸檬酸-檸檬酸鈉(pH 5.5，6.0，6.5)代替50mM Tris-HCl(pH 7.5)并將0.25mM底物更換為0.1mMβ糖化五肽進行測定所得到的結(jié)果。這些結(jié)果證實大約6.0的pH是最適的。
(3)pH穩(wěn)定性
用50mM Tris-HCl(pH 7.5，8.0，8.5)和50mM PIPES(pH 6.0，6.5，7.0)在50℃處理酶20分鐘，測定其殘余活性。圖3顯示了結(jié)果。
(4)最適溫度
將20μl蛋白酶溶液加入100μl反應(yīng)溶液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，2mM氯化鈣，0.1％Triton X-100，2.5mMβ五肽)。在30、37、42、50、55、60和65℃進行反應(yīng)(每個溫度各進行10分鐘)，之后通過加入5μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。然后，向其中添加95μl顯色溶液(0.03％4-氨基安替比林，0.02％TOOS，50U/ml過氧化物酶，10.5U/mlFOD923)，37℃反應(yīng)5分鐘。隨后，向其中添加95μl 0.5％SDS，測定555nm吸光度，由此確定最適溫度。圖4顯示了結(jié)果。
(5)熱穩(wěn)定性
將蛋白酶放入50mM Tris-HCl(pH 7.5)中，在4，37，50，60和70℃處理(每個溫度處理10分鐘)，之后測定殘余活性。圖5顯示了結(jié)果。
(6)分子量
35kDa(SDS-PAGE)
32,721Da(MALDI-TOF MASS分析)
實施例5
嗜水氣單胞菌NBRC 3820株來源的蛋白酶的培養(yǎng)方法和純化方法及其酶學(xué)性質(zhì)
<培養(yǎng)方法>
將各100ml的YPG培養(yǎng)基(2.0％葡萄糖，1.0％聚胨，2.0％酵母提取物，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，pH 7.0)放入10個500mlSakaguchi瓶并滅菌，之后接種嗜水氣單胞菌NBRC 3820。整個在30℃振蕩培養(yǎng)2天。
<純化方法>
離心所得培養(yǎng)溶液。向所得培養(yǎng)上清液添加硫酸銨至40％飽和度，將離心的上清液加至用添加了40％飽和硫酸銨的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 7.3)平衡的Butyl Toyopearl 650M柱(30×150mm，TosohCorp.生產(chǎn))。用含有加至10％飽和度的硫酸銨的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 7.3)實施洗滌，用0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 7.3)實施洗脫。將洗脫的活性級分在50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.3)中透析，之后活性級分加至用相同緩沖液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(30×150mm，Amersham生產(chǎn))，用0至0.5M梯度的NaCl進行洗脫。向洗脫的活性級分添加硫酸銨至40％飽和度。整個加至用添加40％飽和度硫酸銨的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 7.3)平衡的Butyl-Toyopearl650M(18×150mm，Tosoh Corp.生產(chǎn))柱，用具有40％至0％線性梯度的飽和硫酸銨進行洗脫。收集活性級分，用蒸餾水透析，由此獲得純化的蛋白酶。表11顯示純化過程。
本發(fā)明酶的活性按如下方式測定。將其中溶解了β糖化五肽至0.5mM的0.45ml 100mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)放入具有1cm光程長度的小池中。整個在37℃預(yù)熱5分鐘，之后加入0.05ml酶溶液，進行10分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，向其中加入0.5ml測定試劑(含有0.04％TOOS、0.06％4-氨基安替比林、10U過氧化物酶和10U來源于Curvularia clavata YH923的酮胺氧化酶的100mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5))。顯色2分鐘后，加入2ml 0.5％SDS終止反應(yīng)，然后測定550nm波長的吸光度(Aa)。此外，通過使用不含底物的各種緩沖液作為空開對照，進行相似操作以測定吸光度(Ab)。從吸光度(Aa)和空白對照的吸光度(Ab)的差(Aa-Ab)，獲得酶活性。
表11
純化來源于嗜水氣單胞菌NBRC3820的蛋白酶
<物理化學(xué)性質(zhì)>
(1)作用
表12顯示本發(fā)明來源于嗜水氣單胞菌NBRC 3820的蛋白酶對α糖化五肽和β糖化五肽的作用。在該反應(yīng)中各底物的濃度設(shè)定為0.25mM。向其中加入來源于嗜水氣單胞菌NBRC 3820的蛋白酶(1.0U)，在30℃反應(yīng)5至60分鐘。然后，將反應(yīng)溶液加入蛋白質(zhì)測序儀(Shimadzu Corp.生產(chǎn))，確定通過蛋白酶作用產(chǎn)生的肽的N末端氨基酸序列。
結(jié)果，來源于嗜水氣單胞菌NBRC 3820的蛋白酶不作用于α糖化五肽，但其切割β糖化五肽中組氨酸和亮氨酸之間的肽鍵，產(chǎn)生FVH和亮氨酰-蘇氨酰-脯氨酸(LTP)。
(2)最適pH
將pH 3.0至11.0的0.45ml不同緩沖液(pH 3-5的100mM乙酸鹽緩沖液、pH 5-7的100mM檸檬酸鹽緩沖液、pH 7-9的100mM Tris-HCl緩沖液、和pH 9-11的100mM硼酸鹽緩沖液)加入具有1cm光程長度的小池中，其中在所述緩沖液中各溶解了β糖化五肽至0.5mM。整個在37℃預(yù)熱5分鐘，之后添加0.05ml酶溶液并進行10分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，向其中添加0.5ml測定試劑(含有0.04％TOOS、0.06％4-氨基安替比林、10U過氧化物酶和10U來源于Curvularia clavata YH923的酮胺氧化酶的100mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5))。顯色2分鐘后，加入2ml 0.5％SDS以終止反應(yīng)，然后測定550nm波長的吸光度(Aa)。此外，通過使用不含底物的各種緩沖溶液作為空白對照進行相似操作，測定吸光度(Ab)。從吸光度(Aa)和空白對照的吸光度(Ab)之差(Aa-Ab)，獲得酶活性。圖6顯示了結(jié)果。
(3)pH穩(wěn)定性
用10mM各種緩沖液在4℃處理酶溶液24小時，根據(jù)<純化方法>中描述的活性測定方法測定殘余活性。圖7顯示結(jié)果。
(4)最適溫度
將0.45ml溶解了β糖化五肽至0.5mM的100mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)放入光程長度1cm的小池。整個在15至70℃預(yù)熱5分鐘，之后加入0.05ml酶溶液，反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)后，整個在冰上冷卻。然后，添加0.5ml測定試劑(含有0.04％TOOS、0.06％4-氨基安替比林、10U過氧化物酶和10U來源于Curvularia clavata YH923的酮胺氧化酶的100mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5))。顯色2分鐘后，加入2ml0.5％SDS以終止反應(yīng)，然后測定550nm波長的吸光度(Aa)。此外，通過使用不含F(xiàn)VH的各種緩沖溶液作為空白對照進行相似操作，測定吸光度(Ab)。從吸光度(Aa)和空白對照的吸光度(Ab)之差(Aa-Ab)，獲得酶活性。圖8顯示了通過將溫度從15℃改變至70℃而獲得的最適溫度結(jié)果。
(5)<熱穩(wěn)定性>
針對各溫度，用100mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)處理酶溶液30分鐘，根據(jù)上述用于酶的活性測定方法測定殘余活性。圖9顯示結(jié)果。
(6)分子量
使用YMC-Pack Diol-200G(6.0×300mm，YMC生產(chǎn))，通過凝膠過濾獲得本發(fā)明酶的分子量。使用牛血清白蛋白、卵清蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑(所有均由Sigma Corp.生產(chǎn))作為標準蛋白質(zhì)。結(jié)果，分子量為大約33,000。
使用Laemmli氏方法的10％凝膠進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)導(dǎo)致大約33,000的分子量。注意，SDS-PAGEStandard Low(Bio-Rad生產(chǎn))用作標準蛋白質(zhì)。
以上結(jié)果揭示，本發(fā)明來源于嗜水氣單胞菌NBRC3820的蛋白酶是單體。
(7)N末端部分的氨基酸序列
根據(jù)以上方法，在蒸餾水中溶解從嗜水氣單胞菌NBRC 3820培養(yǎng)溶液獲得的純化酶，并使用N末端測序儀(PPSQ-21，Shimadzu Corp.生產(chǎn))進行分析。SEQ ID NO12顯示了所獲序列。對所獲的N末端部分氨基酸序列與已知蛋白酶進行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)所獲的N末端部分氨基酸序列與來源于嗜水氣單胞菌的彈性蛋白酶具有98％同源性。Val Asp Ala Thr Gly Pro Gly Gly Asn Val Lys Thr Gly Lys Tyr PheTyr Gly(SEQ ID NO12)
(8)部分氨基酸序列
使用根據(jù)以上方法從嗜水氣單胞菌NBRC3820培養(yǎng)溶液獲得的純化酶的60g凍干產(chǎn)物，根據(jù)“Method of purifying minor proteins formcirosequence，p48-52，1992，Yodosha Co.，Ltd.”，獲得酶片段以確定其序列。具體地，添加50μl的45mM二硫蘇糖醇，整個在50℃處理15分鐘，之后加入5μl的100mM碘乙酰胺，放置15分鐘。隨后，加入140μl蒸餾水和1.0μg內(nèi)切蛋白酶Lys-C(Roche Diagnostics生產(chǎn))，整個在37℃孵育過夜。通過HPLC分離片段化后的酶，由此獲得各酶片段。各片段使用N末端測序儀(PPSQ-21，Shimadzu Corp.生產(chǎn))進行分析。以下的SEQ ID NO13和14顯示了所獲序列。所獲的兩個部分氨基酸序列分別與來源于嗜水氣單胞菌的彈性蛋白酶的氨基酸序列完全匹配。Leu Asp Val Ala Ala His Glu Val Ser His(SEQ ID NO13)Phe Gly Asp Gly Ala Thr(SEQ ID NO14)
表12顯示來源于嗜水氣單胞菌NBRC 3820的蛋白酶的上述性質(zhì)。
表12
實施例6
用于來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366株(FERM BP-10010)的蛋白酶的培養(yǎng)方法和純化方法及該蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)
<純化方法>
通過與實施例5所述制備方法和純化方法相同的方法收集活性級分，并在蒸餾水中透析，由此獲得純化的蛋白酶。表13顯示純化過程。活性測定方法按照與實施例5中方法相同的方式實施。
表13
來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶的純化
<物理化學(xué)性質(zhì)>
(1)作用
表14顯示本發(fā)明來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶對α糖化五肽和β糖化五肽的作用。按照實施例5之(1)中所述方法，研究來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶對α糖化五肽和β糖化五肽的作用。結(jié)果，來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶不作用于α糖化五肽，但其切割β糖化五肽中組氨酸和亮氨酸之間的肽鍵，產(chǎn)生FVH和LTP。
(2)最適pH
按照實施例5之(2)中所述方法研究來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶的最適pH，所獲結(jié)果顯示在圖10中。
(3)pH穩(wěn)定性
按照實施例5之(3)中所述方法研究來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶的pH穩(wěn)定性，所獲結(jié)果顯示在圖11中。
(4)最適溫度
按照實施例5之(4)中所述方法研究來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶的最適溫度，所獲結(jié)果顯示在圖12中。
(5)熱穩(wěn)定性
按照實施例5之(5)中所述方法研究來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶的熱穩(wěn)定性，所獲結(jié)果顯示在圖13中。
(6)分子量
根據(jù)實施例5之(6)中所述方法通過凝膠過濾和SDS-PAGE獲得分子量，結(jié)果所得分子量均為大約35,000。
以上結(jié)果揭示，本發(fā)明來源于產(chǎn)酶溶桿菌YK-366的蛋白酶是單體。
(7)N末端部分的氨基酸序列
根據(jù)以上方法，在蒸餾水中溶解從產(chǎn)酶溶桿菌YK-366培養(yǎng)溶液獲得的純化酶，并使用N末端測序儀(PPSQ-21，Shimadzu Corp.生產(chǎn))進行分析。SEQ ID NO15顯示了所獲序列。Ala Leu Val Gly Thr Gly Pro Gly Gly Asn Gln Lys Thr Gly Gln TyrGlu Tyr Gly Thr(SEQ ID NO15)
(8)部分氨基酸序列
使用根據(jù)以上方法從產(chǎn)酶溶桿菌YK-366培養(yǎng)溶液獲得的純化酶的60g凍干產(chǎn)物，根據(jù)常規(guī)方法(“Method of purifying minor proteinsfor mcirosequence，p48-52，1992，Yodosha Co.，Ltd.”)，獲得酶片段以確定其序列。具體地，添加50μl的45mM二硫蘇糖醇，整個在50℃處理15分鐘，之后加入5μl的100mM碘乙酰胺，放置15分鐘。隨后，加入140μl蒸餾水和1.0μg內(nèi)切蛋白酶Lys-C(Roche Diagnostics生產(chǎn))，整個在37℃孵育過夜。通過HPLC分離片段化后的酶，由此獲得各酶片段。各片段使用N末端測序儀(PPSQ-21，Shimadzu Corp.生產(chǎn))進行分析。以下的SEQ ID NO16和17顯示了所獲序列。Tyr Ser Xaa Asn Tyr Glu Asn Ala(SEQ ID NO16)Phe Gly Asp Gly Ala Thr(SEQ ID NO17)
表14顯示來源于產(chǎn)酶溶桿菌NBRC 3820的蛋白酶的上述性質(zhì)。
表14
實施例7
通過基因修飾獲得對FZK具有降低活性的突變酮胺氧化酶
<構(gòu)建來源于Curvularia clavata YH923的酮胺氧化酶的突變文庫>
從利用DNA聚合酶的錯讀的易錯PCR，構(gòu)建FOD923的突變文庫。易錯PCR使用上述參考實施例中描述的pPOSFOD923作為模板，利用P51引物和P52引物(見如下SEQ ID NO18和19)和Ready-To-Go PCR珠(Amersham生產(chǎn))進行，因此添加氯化鎂至2.5mM的終濃度。在如下循環(huán)條件下進行PCR94℃×40秒、55℃×30秒、72℃×1分鐘；和25個循環(huán)。
P51 ACACCATGGCGCCCTCAAGAGCAAACACT(SEQ ID NO18)
P52 TTCGAGCTCTATAACTTGGACTTGACAACATCGTC(SEQID NO19)
使用GFX PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒(Amersham生產(chǎn))，純化擴增的PCR產(chǎn)物。
用限制性酶NcoI和SacI消化0.2μg純化的PCR產(chǎn)物，并通過乙醇沉淀收集。此外，也利用相同的限制性酶消化0.5μgpPOSFOD923，通過瓊脂糖凝膠電泳分離不含酮胺氧化酶基因的2.9kbp DNA片段，使用GFX PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒收集。上述兩個DNA片段使用Ligation High試劑盒(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))在16℃進行30分鐘反應(yīng)，以彼此連接。利用連接的DNA片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化體涂布在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)直至菌落生長至大約1-2mm。
<篩選對FZK具有降低活性的突變酮胺氧化酶>
將100μl預(yù)滅菌的表達培養(yǎng)基(含有3％山梨糖醇、1.5％聚胨、1.5％酵母提取物和50μg/ml氨芐青霉素及調(diào)節(jié)至pH 7.0的培養(yǎng)基)加至96孔微量培養(yǎng)板。其中接種生長的轉(zhuǎn)化體，并在30℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)結(jié)束后，在96孔板的兩個孔中各分配5μl培養(yǎng)溶液，向每個孔各添加50μl測定試劑(50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)，含有1mMFVH或FZK、0.02％TOOS、0.02％4-氨基安替比林和10U/ml過氧化物酶)，30℃反應(yīng)10至60分鐘。加入150μl 0.5％SDS終止反應(yīng)，使用Microreader(450型，Bio-Rad生產(chǎn))測定550nm吸光度。從構(gòu)建的突變文庫，選擇產(chǎn)生作用于FVH但對FZK具有降低活性的酮胺氧化酶的重組體。篩選結(jié)果是，獲得了有利的突變株923-F1和923-F2。測序這些突變株含有的酮胺氧化酶，得到在表15中所示的堿基中引入了突變。
表15
注意所述堿基編號從位置471開始計算，位置471在SEQ ID NO1的堿基序列中被認為是除了內(nèi)含子位點外的第一個位置。
<證實突變酮胺氧化酶的底物特異性>
將來自所選菌株的菌落接種至5ml LB培養(yǎng)基(含有50μg/ml氨芐青霉素)，30℃振蕩培養(yǎng)20小時。培養(yǎng)結(jié)束后通過離心從培養(yǎng)液收集細胞，懸浮在5ml 0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中，通過超聲破碎進行溶解。離心溶解的溶液(8,000rpm，10分鐘)，使用得到的上清液作為酮胺氧化酶的粗酶溶液。利用此粗酶溶液以及使用FVH和FZK作為底物，根據(jù)<篩選對FZK具有降低活性的突變酮胺氧化酶>中所述的活性測定方法，獲得特異性(對FZK的活性相對于對FVH的活性而言的比活性；此后表示為FZK/FVH)。結(jié)果是，923-F1和923-F2的FZK/FVH比分別是0.24和0.025(見表15)，這說明突變酶對FZK的活性大幅度降低。
<鑒定有效的突變位置>
為了鑒定對上述底物特異性的提高產(chǎn)生影響的有效突變位置，通過如下方法產(chǎn)生引入了表15中所示點突變的突變酮胺氧化酶。
1)從利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌獲得突變酶923-F330L和923-Fro2，其中所述質(zhì)粒通過如下方式獲得基于圖14所示的質(zhì)粒pPOSFOD923的限制性酶圖譜，用表15所示限制性酶處理野生型酶或突變型酶923-F2的基因；切下含有目的突變位置的片段；和將該片段插入用相同限制性酶處理的其它質(zhì)粒。
(2)從使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌獲得突變酶923-I58V，其中所述質(zhì)粒通過如下方式獲得用突變引物P53和P54(SEQ ID NO20和21顯示)進行PCR以擴增含有目的突變的區(qū)域；用表15中所示限制性酶處理獲得的片段；并將片段插入相同限制性酶切割的pPOSFOD923中。表15顯示通過<篩選對FZK具有降低活性的突變酮胺氧化酶>中所述測定方法評估這些突變酶的結(jié)果。結(jié)果說明，纈氨酸替代58位的亮氨酸(I58)或組氨酸替代62位的精氨酸(R62)可以有效地降低酶對FZK的活性。
P53
CGACTCTAGAGGAATAACACCATGGCGCCCTC(SEQ ID NO20，包括位于pPOS2的多克隆位點下游的XbaI位點)
P54
GCTTCTAGACTCAATTGGAGATCGACCTTGTTCCGCAAGCGGATACCCATGACCTTAT(SEQ ID NO21，SEQ ID NO1的637至694的序列的互補序列，其含有導(dǎo)致在FOD923中V替代氨基酸58I的突變)
<測試有效突變氨基酸殘基的點突變>
高度有效的58位氨基酸亮氨酸(I58)由另一氨基酸替代以尋找有效的點突變型酮胺氧化酶。使用P53(SEQ ID NO20)和具有(表15-2)所示序列的引物(P55-64)，通過<鑒定有效突變位置>之2)中所述方法，制備突變株。通過<篩選對FZK具有降低活性的突變酮胺氧化酶>中所述方法測定突變酶對FZK的活性和對FVK的活性，所得結(jié)果顯示在(表15-2)中。
結(jié)果揭示，對于降低對FZK的活性，除了使用纈氨酸外，使用蘇氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、絲氨酸和丙氨酸替代58位氨基酸亮氨酸(I58)也是有效的。
表15-2
<制備突變酮胺氧化酶>
通過參考實施例所述相同方法純化突變酮胺氧化酶并制備之。
本發(fā)明突變果糖基胺氧化酶對各種底物的特異性顯示在表16中。注意，各底物的濃度設(shè)定為1mM，而其它反應(yīng)條件根據(jù)<篩選對FZK具有降低活性的突變酮胺氧化酶>中所述活性測定方法設(shè)定。結(jié)果顯示，923-F2(之后也稱作FOD923M)對FV具有最高反應(yīng)性，并對FVH也具有高反應(yīng)性，而其對FZK和FVL分別具有2.5％和0.5％反應(yīng)性，由此相對于對FVH的反應(yīng)性而言，幾乎不具有反應(yīng)性，這說明本發(fā)明酶是基本不對FZK和FVL產(chǎn)生作用的酶。
表16
<來源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶的突變體>
來源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶(FOD474)與含有FOD923的酮胺氧化酶有高同源性，而且，如圖1所示，其氨基酸序列在含有FOD923的I58的N末端區(qū)高度保守。使用pPOSFOD474，獲得了FOD474的I58由不同氨基酸(蘇氨酸)替代的FOD474突變株474-F1。表17顯示FOD474和474-F1對各種底物的特異性。由于在FOD474中對FVH的底物特異性也得以提高，這說明，即使對于來源于其它微生物物種的酮胺氧化酶，58位氨基酸區(qū)域也是強烈地影響對FVH的特異性的位點。
表17
實施例8
酮胺氧化酶FOD923、FOD474和FOD923M對FVH和FZK的活性的pH依賴性
將20l酶溶液加入200μl反應(yīng)溶液(50mM緩沖液、0.1％TritonX-100、0.03％4-氨基安替比林、0.02％TOOS、5U/ml過氧化物酶、2mM底物)。整個在37℃溫育5分鐘，然后向其中加入500μl0.5％SDS，之后測定555nm吸光度。使用Tris-HCl(pH 7.5，8.0，8.5)、PIPES(pH 6.0，6.5，7.0)和Bistris-HCl(pH 5.0，5.5，6.0，6.5)作為緩沖液用于測定。此外，也使用不含底物的反應(yīng)溶液測定吸光度。表18顯示了分別使用FVH和FZK作為底物時的吸光度差和所用酶溶液中的酶濃度。表19顯示將FVH和FZK分別用作底物時由(FZK/FVH)表示的比活性(％)。結(jié)果證實，當(dāng)pH為大約6時，對FVH的特異性顯著增加。
實施例9
酮胺氧化酶FOD923M的底物特異性
使用<參考實施例來源于Curvularia clavata YH923(FERMBP-10009)的酮胺氧化酶、來源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶和來源于尖孢鐮孢的酮胺氧化酶(Asahi Kasei Pharma生產(chǎn))的底物特異性>中所述相同的方法進行測定。表3顯示結(jié)果。
表18
表19
實施例10
<測定血紅蛋白A1c>
為了產(chǎn)生校準曲線，在具有1cm光程長度的小池中，將324μl R1(-蛋白酶)和90μl R2加入36μl其中添加了FVH的血紅蛋白Ac1標準溶液。整個在37℃溫育200秒后，加入10μl R3并整個在37℃溫育100秒。隨后，向其中加入10ul R4，整個在37℃溫育100秒。在該過程中，測定R2添加后180秒的730nm吸光度(A1s)、R3添加后90秒的730nm吸光度(A2s)和R4添加后90秒的730nm吸光度(A3s)。類似地，使用未添加FVH的血紅蛋白A1c標準溶液進行相同操作，也測定R2添加后180秒的730nm吸光度(A1sb)、R3添加后90秒的730nm吸光度(A2sb)和R4添加后90秒的730nm吸光度(A3sb)。從吸光度差ΔAs＝(A3s-A2s)-(A3sb-A2sb)和FVH濃度的關(guān)系，構(gòu)建了圖15所示的校準曲線。
接著，向各36μl低或高水平的血紅蛋白A1c標準溶液加入324μlR1(+蛋白酶)。37℃溫育60分鐘后加入90μl R2。整個在具有1cm光程長度的小池中37℃溫育200秒，之后加入10μl的R3并37℃溫育100秒。隨后，向其中加入10μl的R4，整個在37℃溫育100秒。在該過程中，測定R2添加后180秒的730nm吸光度(A1)、R3添加后90秒的730nm吸光度(A2)和R4添加后90秒的730nm吸光度(A3)。此外，除了用R1(-蛋白酶)替代R1(+蛋白酶)外，使用相同樣品進行上述相同操作，并測定R2添加后180秒的730nm吸光度(A1b)、R3添加后90秒的730nm吸光度(A2b)和R4添加后90秒的730nm吸光度(A3b)。從吸光度差ΔA＝(A3-A2)-(A3b-A2b)和FVH濃度的關(guān)系，可以獲得在各低或高水平血紅蛋白A1c標準溶液中血紅蛋白的糖化β鏈N末端的量。如表20所示，理論值和測定值十分相符。注意，吸光度差ΔAε＝(A2-A1)-(A2b-A1b)被認為與糖化血紅蛋白中賴氨酸殘基的糖化ε-氨基基團的量成比例。
<R1(+蛋白酶)>
20mM Tris-HCl(pH 7.5)
0.1％Triton X-100
150mM氯化鈉
2mM氯化鈣
2.1kU/ml來源于芽孢桿菌屬種的中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))
<R1(-蛋白酶)>
20mM Tris-HCl(pH 7.5)
0.1％Triton X-100
150mM氯化鈉
2mM氯化鈣
<R2>
20mM Tris-HCl(pH 7.5)
6.35mM WST3(Dojindo Laboratories生產(chǎn))
0.08mM DA-64(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))
25U/ml過氧化物酶(Sigma-Aldrich Corp.生產(chǎn))
(WST-32-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑)
(DA-64N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)-二苯基胺)
<R3>
500U/ml FOD2
<R4>
500U/ml FOD923
<低水平血紅蛋白A1c標準溶液>
為了進行制備，將可獲得的具有低值(表示為血紅蛋白A1c值(JDS值)5.6％)的用于血紅蛋白測定的校準劑凍干產(chǎn)品(用于HbA1c的測定對照Kyowa Medex Co.，Ltd.生產(chǎn))溶解在蒸餾水中至4mg/ml。
使用“Rinsho Kensa，46(6)729-734，2002”描述的公式(JDS值)＝0.9259(IFCC值)+1.6697進行換算，該血紅蛋白A1c值(IFCC值)經(jīng)換算為4.2％。因此，當(dāng)血紅蛋白是由兩條α鏈和兩條β鏈組成的四聚體并具有64,550分子量時，在該標準溶液中糖化β鏈N末端濃度的理論值將是0.0052mM。
<高水平血紅蛋白A1c標準溶液>
為了進行制備，將可獲得的具有高值(表示為血紅蛋白A1c值(JDS值)10.2％)的用于血紅蛋白測定的校準劑凍干產(chǎn)品(用于HbA1c的測定對照Kyowa Medex Co.，Ltd.生產(chǎn))溶解在蒸餾水中至4mg/ml。
使用“Rinsho Kensa，46(6)729-734，2002”描述的公式(JDS值)＝0.9259(IFCC值)+1.6697進行換算，該血紅蛋白A1c值(IFCC值)經(jīng)換算為9.2％。因此，當(dāng)血紅蛋白是由兩條α鏈和兩條β鏈組成的四聚體并具有64,550分子量時，在該標準溶液中糖化β鏈N末端濃度的理論值將是0.0114mM。
<添加了FVH的血紅蛋白A1c標準溶液>
為了進行制備，向上述低水平血紅蛋白A1c標準溶液中加入FVH(Peptide Institute Inc.生產(chǎn))至0.030mM和0.015mM。
<不添加FVH的血紅蛋白A1c標準溶液>
使用以上低水平的血紅蛋白A1c標準溶液。
實施例11
<蛋白酶反應(yīng)時間和血紅蛋白A1c測定值之間的關(guān)系>
在實施例10所用低和高血紅蛋白A1c標準溶液中使蛋白酶的反應(yīng)時間從30分鐘到360分鐘變化。圖16顯示獲得的血紅蛋白A1c的測定值。這說明，實施例10中理論值和測定值的相符并非是由于將蛋白酶反應(yīng)時間限定為60分鐘而偶然獲得的。這也說明，當(dāng)?shù)鞍酌阜磻?yīng)時間從30分鐘至360分鐘變化時，測定值隨時間幾乎是穩(wěn)定的，因此利用本發(fā)明的測定方法可以測定糖化血紅蛋白中糖化β鏈N末端的實際量。
實施例12
1)在芽孢桿菌屬種來源的中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.)降解糖化血紅蛋白的反應(yīng)中評價pH的影響
1-a)蛋白酶反應(yīng)后利用FOD2消化糖化賴氨酸和含有糖化賴氨酸的肽并隨后使用FOD923測定FVH的量的情況
將30.4μl 20mM WST3和36μl糖化血紅蛋白樣品加入324μl R1反應(yīng)溶液(20mM緩沖液、表面活性劑、氯化鈉、2mM氯化鈣、1.2kU/ml中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn)))。60秒后，向其中加入44.6μlR2反應(yīng)溶液(100mM緩沖液、50U/ml過氧化物酶、0.16mM DA-64)，再300秒后加入5μl 0.5M EDTA和15μl pH調(diào)節(jié)溶液。再50秒后，向其中加入10μl 1,500U/ml FOD2，再250秒后添加5μl 500U/mlFOD923，整個反應(yīng)150秒。所有反應(yīng)均在吸光計的小池中37℃進行。監(jiān)測730nm吸光度，以獲得加入FOD2后240秒的吸光度和加入FOD923后140秒的吸光度的差(A1)。圖17顯示了測定方案。
在向R1反應(yīng)溶液預(yù)先添加FVH至3.33μM的情況下進行相似操作，以獲得吸光度差(A2)。此外，除了在添加糖化血紅蛋白之前而非在添加R2反應(yīng)溶液后加入5μl 0.5M EDTA和15μl pH調(diào)節(jié)溶液外，實施相同操作，由此獲得空白反應(yīng)的吸光度差(Ab)。
蛋白酶自糖化血紅蛋白上切下的FVH可以利用這些吸光度差從公式“測定值(μM)＝(A1-Ab)/(A2-A1)×30”計算。注意，加入EDTA以終止或抑制蛋白酶反應(yīng)。添加pH調(diào)節(jié)溶液以將酮胺氧化酶FOD2和FOD923反應(yīng)時的pH調(diào)節(jié)為大約7.5。R1和R2反應(yīng)溶液中使用的緩沖液、表面活性劑、氯化鈉濃度和pH調(diào)節(jié)溶液的組合及其測定值顯示在表21中。
1-b)蛋白酶反應(yīng)后不利用FOD2消化糖化賴氨酸和含有糖化賴氨酸的肽而使用FOD923測定FVH的量的情況
將30.4μl 20mM WST3加入324μl R1反應(yīng)溶液(20mM緩沖液、表面活性劑、氯化鈉、2mM氯化鈣、1.2kU/ml中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn)))，向其中加入36μl糖化血紅蛋白樣品。60秒后，向其中加入44.6μl R2反應(yīng)溶液(100mM緩沖液、50U/ml過氧化物酶、0.16mMDA-64)，再300秒后加入5μl 0.5M EDTA和15μl pH調(diào)節(jié)溶液。再50秒后，向其中加入5μl 500U/ml FOD923，整個反應(yīng)150秒。所有反應(yīng)均在吸光計的小池中37℃進行。監(jiān)測730nm吸光度，以獲得加入0.5MEDTA和pH調(diào)節(jié)溶液后40秒的吸光度和加入FOD923后140秒的吸光度的差(A1)。圖18顯示了測定方案。
在向R1反應(yīng)溶液預(yù)先添加FVH至3.33μM的情況下進行相似操作，以獲得吸光度差(A2)。此外，除了在添加糖化血紅蛋白之前而非在添加R2反應(yīng)溶液后加入5μl 0.5M EDTA和15μl pH調(diào)節(jié)溶液外，實施相同操作，由此獲得空白反應(yīng)的吸光度差(Ab)。蛋白酶自糖化血紅蛋白上切下的FVH可以利用這些吸光度差從公式“測定值(μM)＝(A1-Ab)/(A2-A1)×30”計算。注意，加入EDTA以終止或抑制蛋白酶反應(yīng)。添加pH調(diào)節(jié)溶液以將酮胺氧化酶FOD2和FOD923反應(yīng)時的pH調(diào)節(jié)為大約7.5。R1和R2反應(yīng)溶液中使用的緩沖液、表面活性劑、氯化鈉濃度和pH調(diào)節(jié)溶液的組合及其測定值顯示在表21中。
表20
(2)在芽孢桿菌屬種ASP842來源的蛋白酶降解糖化血紅蛋白的反應(yīng)中評價pH的影響
2-a)蛋白酶反應(yīng)后利用FOD2消化糖化賴氨酸和含有糖化賴氨酸的肽并隨后使用FOD923測定FVH的量的情況
對于實施例12之1-a)中的R1反應(yīng)溶液，向其中加入來源于芽孢桿菌屬種ASP842的蛋白酶至0.85U/ml而非加入1.2kU/ml中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn)))。使用表22中所示用于R1和R2反應(yīng)溶液中的緩沖液、表面活性劑、氯化鈉濃度和pH調(diào)節(jié)溶液的組合，實施與1-a)相似的操作。表22也顯示了測定結(jié)果。
2-b)蛋白酶反應(yīng)后不利用FOD2消化糖化賴氨酸和含有糖化賴氨酸的肽而使用FOD923測定FVH的量的情況
對于實施例12之1-b)中的R1反應(yīng)溶液，向其中加入來源于芽孢桿菌屬種ASP842的蛋白酶至0.85U/ml而非加入1.2kU/ml中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))。使用表22中所示用于R1和R2反應(yīng)溶液中的緩沖液、表面活性劑、氯化鈉濃度和pH調(diào)節(jié)溶液的組合，實施與1-b)相似的操作。表22也顯示了測定結(jié)果。
(3)在產(chǎn)酶溶桿菌YK-366來源的蛋白酶降解糖化血紅蛋白的反應(yīng)中評價pH的影響
將30.4μl 20mM WST3和36μl糖化血紅蛋白樣品及5μl蒸餾水加入R1反應(yīng)溶液(20mM緩沖液、表面活性劑、氯化鈉、2mM氯化鈣、0.43U/ml產(chǎn)酶溶桿菌YK-366來源的蛋白酶)。60秒后，向其中加入44.6μl R2反應(yīng)溶液(100mM緩沖液、50U/ml過氧化物酶、0.16mMDA-64)，再300秒后加入15μl pH調(diào)節(jié)溶液。50秒后，向其中加入5μl500U/ml FOD923，反應(yīng)150秒。所有反應(yīng)均在吸光計的小池中37℃進行。預(yù)先監(jiān)測730nm吸光度，以獲得加入pH調(diào)節(jié)溶液后40秒的吸光度和加入FOD923后140秒的吸光度的差(A1)。圖19顯示了測定方案。
表21
表22
表23
在向R1反應(yīng)溶液預(yù)先添加FVH至3.33μM的情況下進行相似操作，以獲得吸光度差(A2)。此外，使用95℃預(yù)先處理10分鐘而失活的蛋白酶進行相似操作，以獲得空白反應(yīng)的吸光度差(Ab)。
蛋白酶自糖化血紅蛋白上切下的FVH可以利用這些吸光度差從公式“測定值(μM)＝(A1-Ab)/(A2-A1)×30”計算。
使用表23中所示R1和R2反應(yīng)溶液中使用的緩沖液、表面活性劑、氯化鈉濃度和pH調(diào)節(jié)溶液的組合，進行與實施例12之1-b)相似的操作。其測定結(jié)果顯示在表23中。
使用就IFCC值而言5.9mg/ml為16.7％的糖化血紅蛋白樣品(糖化β鏈N末端的濃度的理論值為30.5μM)。表21至表23中所示結(jié)果說明當(dāng)?shù)鞍酌阜磻?yīng)中pH為5.0-6.0時，該蛋白酶不從糖化血紅蛋白切下可以與FOD923反應(yīng)的含有糖化賴氨酸的肽。因此，這些結(jié)果說明，不利用FOD2進行消化，已特異并精確地測定了FVH的量(糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的量)，即，精確測定了血紅蛋白A1c的量。
實施例13
利用具有高特異性的突變酮胺氧化酶FOD923測定蛋白酶降解糖化血紅蛋白的降解產(chǎn)物中的FVH
1-a)蛋白酶反應(yīng)后利用FOD2消化糖化賴氨酸和含有糖化賴氨酸的肽并隨后使用FOD923M測定FVH的量的情況
除了使用Tris-HCl(pH 7.5)作為R1反應(yīng)溶液的緩沖液、使用0.1％Triton X-100作為表面活性劑和使用150mM的氯化鈉濃度、及添加5μl 32U/ml FOD923M而非5μl 500U/ml FOD923外，實施與實施例12之1-a)相似的操作。根據(jù)測定，F(xiàn)VH的測定值為28.6μM。
1-b)蛋白酶反應(yīng)后不利用FOD2消化糖化賴氨酸和含有糖化賴氨酸的肽而使用FOD923M測定FVH的量的情況
除了使用Tris-HCl(pH 7.5)作為R1反應(yīng)溶液的緩沖液、使用0.1％Triton X-100作為表面活性劑和使用150mM的氯化鈉濃度、及添加5μl 32U/ml FOD923M而非5μl 500U/ml FOD923外，實施與實施例12之1-b)相似的操作。根據(jù)測定，F(xiàn)VH的測定值為30.0μM。
從以上可以看出，使用高特異性的酮胺氧化酶可以在pH 7.5(即，蛋白酶從糖化血紅蛋白切割糖化賴氨酸和含有糖化賴氨酸的肽的條件)下不經(jīng)FOD2消化而特異地測定FVH的量(糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的量)，即，這允許精確測定血紅蛋白A1c的量。
工業(yè)實用性
可以提供使用酶但不經(jīng)分離操作而特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的方法和包含測定試劑的試劑盒。
(1)
i.保藏目的生物材料的保藏單位的名稱和地址
獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(International Patent Organism Depository，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)
Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本(郵政編碼305-8566)
ii.向i的保藏單位提交生物材料保藏的日期
2003年2月12日(原始保藏日)
2004年4月12日(從原始保藏轉(zhuǎn)為布達佩斯條約下的保藏的日期)
iii.由i的保藏單位指定的保藏號
FERM BP-10009
(2)
i.保藏目的生物材料的保藏單位的名稱和地址
獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心
Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本(郵政編碼305-8566)
ii.向i的保藏單位提交生物材料保藏的日期
2004年2月24日(原始保藏日)
iii.由i的保藏單位指定的保藏號
FERM BP-08641
(3)
i.保藏目的生物材料的保藏單位的名稱和地址
獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心
Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本(郵政編碼305-8566)
ii.向i的保藏單位提交生物材料保藏的日期
2004年1月30日(原始保藏日)
2004年4月12日(從原始保藏轉(zhuǎn)為布達佩斯條約下的保藏的日期)
iii.由i的保藏單位指定的保藏號
FERM BP-10010
(4)
i.保藏目的生物材料的保藏單位的名稱和地址
獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心
Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本(郵政編碼305-8566)
ii.向i的保藏單位提交生物材料保藏的日期
2004年2月24日(原始保藏日)
iii.由i的保藏單位指定的保藏號
FERM BP-08642
序列表
序列表
<110>Asahi Kasei Pharma Corporation
ICHIBIKI Company Limited
<120>血紅蛋白Alc測定方法和用于此目的的酶及其生產(chǎn)方法
<130>ASAHI-43
<140>PCT/JP2004/007341
<141>2004-05-21
<150>JP2003-143966
<151>2003-05-21
<150>JP2004-063100
<151>2004-03-05
<160>31
<210>1
<211>2212
<212>DNA
<213>Curvlaria claveta
<220>
<221>CDS
<222>連接(471..752，808..1230，1280..1695，1751..1952)
<223>果糖基胺氧化酶
<400>1
ggtatcagat cagatacaag atagacccca gattttctgt tatcagcacg ctccgatatc60
gacaaggcga aggtgcgttg agtgctccag tttaggagat acggacagcc cgtcttcgat120
tgacgttgtg ctgacgtccg atgagctaac ttcgttggga tattataaca gtcaggatca180
ccaagcgaga cccaggcgcc atcccatggc cgagcgtcgc ccccagtcag cggtacatgg240
agcggaaggc ttcaattact caatcaaaac ttgttggagc tcgcaattga gcggggagta300
tgcctcgcta tcgtatcatt gagctggtgg cgtgtgcaga cttcattgat acttaaccgg360
cgggcgttga gcctgaccca ttgtggattg cttctgatca cggcttgcgc cttcgtccag420
caaaacttca gccatccggg aatccgacca cacatcctcg tcatttcgac atg gcg 476
Met Ala
1
ccc tca aga gca aac act tct gtt atc gtt gtc ggt ggc ggt ggc act 524
Pro Ser Arg Ala Asn Thr Ser Val Ile Val Val Gly Gly Gly Gly Thr
5 10 15
att ggc tct tca acc gct ctt cat cta gtc cgc tcg ggc tac aca cca 572
Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr Thr Pro
20 25 30
tct aac atc acc gtt ctt gac aca tac cct atc cca tca gcg cag tca 620
Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala Gln Ser
35 40 45 50
gct gga aat gac ctg aat aag atc atg ggt atc cgc ttg cgg aac aag 668
Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg Asn Lys
55 60 65
gtc gat ctc caa ttg agt cta gaa gcc agg cag atg tgg aga gag gat 716
Val Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Arg Glu Asp
70 75 80
gac cta ttc aaa gag tat ttc cac aac act gga aga gtatgtacag tcagca768
Asp Leu Phe Lys Glu Tyr Phe His Asn Thr Gly Arg
85 90
gagtgactgt ttgaagattg gagctgacgg aagatgtag ctc gac tgt gca cat 822
Leu Asp Cys Ala His
95
ggg gaa gag gga ctt gca gat ttg aga cag gca tac cag gct ctg ctc 870
Gly Glu Glu Gly Leu Ala Asp Leu Arg Gln Ala Tyr Gln Ala Leu Leu
100 105 110 115
gac gct aac gcg ggt ctc gaa gaa aca aca gaa tgg ctt gac tcc gaa 918
Asp Ala Asn Ala Gly Leu Glu Glu Thr Thr Glu Trp Leu Asp Ser Glu
120 125 130
gac gaa att cta aag aaa atg ccg ctt ctg gac cgc gag caa atc aag966
Asp Glu Ile Leu Lys Lys Met Pro Leu Leu Asp Arg Glu Gln Ile Lys
135 140 145
ggc tgg aaa gcg gtt tac agc caa gac ggc ggc tgg ctg gct gca gca1014
Gly Trp Lys Ala Val Tyr Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu Ala Ala Ala
150 155 160
aaa gcc atc aat gct ata ggc gag tac ttg cga gac caa gga gtt aag1062
Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Glu Tyr Leu Arg Asp Gln Gly Val Lys
165 170 175
ttt ggt ttt ggt ggt gct gga tcg ttc aag cag cct ctt ttg gcc gag1110
Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu Leu Ala Glu
180 185 190 195
gga gtg tgc att ggc gta gag aca gtc gac ggg acg agg tac tac gcc1158
Gly Val Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly Thr Arg Tyr Tyr Ala
200 205 210
gat aaa gtt gtg ctt gca gct ggt gct tgg agt ccg gta ttg gtc gac1206
Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser Pro Val Leu Val Asp
215 220 225
ctg gaa gat caa tgc gtt tca aaa gtaggtcttt gtgacggtgc tgcttcatat 1260
Leu Glu Asp Gln Cys Val Ser Lys
230 235
gcaaatctaa ctttgttag gct tgg gta tat gct cac ata cag ctt acg cct 1312
Ala Trp Val Tyr Ala His Ile Gln Leu Thr Pro
240 245
gag gaa gca gca gag tac aaa aac gtg cct gtg gta tac aac ggc gac1360
Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Lys Asn Val Pro Val Val Tyr Asn Gly Asp
250 255 260
gtc ggc ttc ttc ttc gag cct gac gag cac ggc gtt atc aag gtt tgt1408
Val Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp Glu His Gly Val Ile Lys Val Cys
265 270 275
gac gaa ttt cca ggt ttt aca cgc ttc aag caa cat cag cca tat ggc1456
Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg Phe Lys Gln His Gln Pro Tyr Gly
280 285 290
gcc aaa gca ccg aaa cgt atc tcc gtg ccc aga tcg gca gcg aag cac1504
Ala Lys Ala Pro Lys Arg Ile Ser Val Pro Arg Ser Ala Ala Lys His
295 300 305 310
ccg acg gat act tac ccc gat gcg tcg gag aag agc atc cgc aag gcc1552
Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala Ser Glu Lys Ser Ile Arg Lys Ala
315 320 325
att gca act ttc ctg ccc aag ttc aca gag aag gag cta ttc aac cgg1600
Ile Ala Thr Phe Leu Pro Lys Phe Thr Glu Lys Glu Leu Phe Asn Arg
330 335 340
cat cta tgt tgg tgt acg gat acg gct gac gct gcg cta ttg atg tgt1648
His Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr Ala Asp Ala Ala Leu Leu Met Cys
345 350 355
gag cat ccc gag tgg aag aac ttt gtg ctg gcg aca ggg gac agc gg gt 1697
Glu His Pro Glu Trp Lys Asn Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gl
360 365 370
atgtatctca tcctttggtg ccagaacaac atgtactgac ctggtttgcc tag g cac1754
y His
375
aca ttc aaa ctt ttg cca aat atc ggc aag cat gtg gtt gag ctt ctc 1802
Thr Phe Lys Leu Leu Pro Asn Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu
380 385 390
gag ggt aca ctc gcg gag gat ctg gca cat gca tgg aga tgg cgg cct 1850
Glu Gly Thr Leu Ala Glu Asp Leu Ala His Ala Trp Arg Trp Arg Pro
395 400 405
ggt act ggc gat gcg ctg aaa tca aga aga gcg gca ccg gcg aag gat1898
Gly Thr Gly Asp Ala Leu Lys Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp
410 415 420
tta gca gat atg cct ggc tgg aag cat gac gat gtt gtc aag tcc aag1946
Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys His Asp Asp Val Val Lys Ser Lys
425 430 435
tta tag tgatggaaac tcgtcttgta gcgtgtctag gatagtaatc aaacgcgctc tc 2004
Leu Stop
440
tgtcttaagc aacggagatt tgttgtgcta gacgggaaga gtaaggagta accacaaaat 2064
aagcaacttg aattagtcgt gttgaccgga accatggtgc attttgtttc tgaacttagg 2124
atttcaccga agatggccat gatggcagag aaagggaagt cgcacagggc cagcttggtg 2184
cgactggtgc aggggaaaga atctgatc 2212
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P11引物
<400>2
aargcyatya acgcyatygg20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P12引物
<400>3
acsacgtgct trccratgtt20
<210>4
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P21引物
<400>4
cacacatcct cgtcatttcg ccatggcgcc ctcaagagca aac43
<210>5
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P28引物
<400>5
cacgctacaa gacgagtttc gagctctata acttggactt gacaac46
<210>6
<211>202
<212>DNA
<213>淺綠氣球菌(Aerococcus viridans)
<220>
<223>丙酮酸氧化酶啟動子的基因組DNA
<400>6
aaaagttctt gatttataag ggtttctgga cttcttactg tactagtaca atttcgcccc 60
ttgtaccatt tttctgatac agaaacaata ttgtactgaa aaaagggtat ttttggctaa 120
ttatggacct cacaaaggat atttgtggca attcattgga ataagctgtt ttaagtgcta180
ttatttcaat tgtgatattt tt 202
<210>7
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P31引物
<400>7
ctagaggaat aacaccatgg ccgtcgacgc tagcatgcat ggatcccggg taccgagctc60
g61
<210>8
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P32引物
<400>8
aattcgagct cggtacccgg gatccatgca tgctagcgtc gacggccatg gtgttattcc 60
t 61
<210>9
<211>1323
<212>DNA
<213>Neocosmospor a vasinfecta
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1323)
<223>果糖基胺氧化酶
<400>9
atg acc acc ccc cgc aaa gaa acc acc gtc ctc atc atc gga ggc ggc48
Met Thr Thr Pro Arg Lys Glu Thr Thr Val Leu Ile Ile Gly Gly Gly
1 5 10 15
ggc aca atc ggc tcc tcc acc gcc cta cac ctc ctc cgc gca ggc tac96
Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr
20 25 30
acc ccc tcc aac atc acc gtc ctc gac acc tac ccc atc ccg tca gct144
Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala
35 40 45
cag tcc gcc ggc aac gac cta aac aag atc atg ggc atc cgc ctg cgg192
Gln Ser Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg
50 55 60
aac aaa gtc gac ctg cag ctc agc ctg gaa gcg cgg gac atg tgg cgc240
Asn Lys Val Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Arg Asp Met Trp Arg
65 70 75 80
aac gac gcg ctg ttc cgg ccc ttt ttc cac aat acg ggc cgg ctg gac288
Asn Asp Ala Leu Phe Arg Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Leu Asp
85 90 95
tgc gag agc agc gcg gag ggg gtg gag ggt ttg cgg agg gag tat cag336
Cys Glu Ser Ser Ala Glu Gly Val Glu Gly Leu Arg Arg Glu Tyr Gln
100 105 110
aag ctg gtt gag gcg ggt gtg ggg ttg gag gag acg cat gag tgg ctt384
Lys Leu Val Glu Ala Gly Val Gly Leu Glu Glu Thr His Glu Trp Leu
115 120 125
gat agt gag gag gcg att ttg gag aag gca ccg ttg ttg cag agg gag432
Asp Ser Glu Glu Ala Ile Leu Glu Lys Ala Pro Leu Leu Gln Arg Glu
130 135 140
gag atc gag ggg tgg aag gcg att tgg agt gag gag ggg ggt tgg ttg480
Glu Ile Glu Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Glu Glu Gly Gly Trp Leu
145 150 155 160
gct gct gct aag gcg att aac gcc atc ggg gag gag ttg cag cgg cag528
Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Glu Glu Leu Gln Arg Gln
165 170 175
ggg gtt agg ttt ggg ttt ggg ggt gct ggg tcc ttc aag cgg cct ttg576
Gly Val Arg Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Arg Pro Leu
180 185 190
ttt gct gat gat ggg aca act tgc atc ggt gtg gaa acg gtc gac ggg624
Phe Ala Asp Asp Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly
195 200 205
acc cag tac cat gcg gac aaa gtc gtc ctg gcc gct ggg gcg tgg agt672
Thr Gln Tyr His Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser
210 215 220
ccg gcc ctg gtc gac ctg gaa gag cag tgc tgc tcc aag gcg tgg gtg720
Pro Ala Leu Val Asp Leu Glu Glu Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val
225 230 235 240
tac gca cac atg cag ctg acc ccg gag gaa gcg gcc gta tac aag ggc768
Tyr Ala His Met Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Val Tyr Lys Gly
245 250 255
tgt ccg gtt gtc tac cac ggc gat gtc ggc ttc ttc ttc gag ccg aac816
Cys Pro Val Val Tyr His Gly Asp yal Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn
260 265 270
gag aac ggg gtg atc aaa gtc tgc gac gag ttc cct ggg ttc act cgg864
Glu Asn Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg
275 280 285
ttc aag cag cac cag ccg tac ggc gcg ccg gca ccg aag cct gtc tcg912
Phe Lys Gln His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Pro Lys Pro Val Ser
290 295 300
gtc ccg cgg tct cat gcc aaa cat ccc acc gac acg tac cca gac gcg960
Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala
305 310 315 320
tct gag gag agc atc aag cga gct gtt tcg acg ttc ctg ccg aga ttc1008
Ser Glu Glu Ser Ile Lys Arg Ala Val Ser Thr Phe Leu Pro Arg Phe
325 330 335
aag gac aag ccg ctg ttc aac cgg gcg ctg tgc tgg tgc acc gat aca1056
Lys Asp Lys Pro Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr
340 345 350
gcc gac tcg gcg ctg ctc atc tgt gag cat ccg aga tgg aag aac ttc1104
Ala Asp Ser Ala Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Arg Trp Lys Asn Phe
355 360 365
atc ctg gcc acg ggc gac agc ggg cac agt ttt aag ctg ttg ccc att1152
Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Ile
370 375 380
att ggc aag cat gtt gtt gag ctg gtc gag ggc agg tta gct gat gat1200
Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Val Glu Gly Arg Leu Ala Asp Asp
385 390 395 400
ttg gct gag gcg tgg agg tgg cgg ccc ggt cag ggg gat gcg cgc aag1248
Leu Ala Glu Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gln Gly Asp Ala Arg Lys
405 410 415
tcg atc cgt gct gcg ccg gca aag gat ctg gct gat atg ccc ggt tgg1296
Ser Ile Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp
420 425 430
aag cac gat cag gac agc gag tca aga1323
Lys His Asp Gln Asp Ser Glu Ser Arg
435 440
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P41引物
<400>10
ttttttcatg accacccccc gcaaagaaac caccgtcctc40
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P42引物
<400>11
tttttgagct catcttgact cgctgtcctg atcgtgcttc40
<210>12
<211>18
<212>PRT
<213>嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophia)
<400>12
Val Asp Ala Thr Gly Pro Gly Gly Asn Val Lys Thr Gly Lys Tyr Phe Tyr Gly
1 5 10 15
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>嗜水氣單胞菌
<400>13
Leu Asp Val Ala Ala His Glu Val Ser His
1 5 10
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>嗜水氣單胞菌
<400>14
Phe Gly Asp Gly Ala Thr
1 5
<210>15
<211>20
<212>PRT
<213>產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)
<400>15
Ala Leu Val Gly Thr Gly Pro Gly Gly Asn Gln Lys Thr Gly Gln Tyr Glu Tyr Gly Thr
1 5 10 15 20
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>產(chǎn)酶溶桿菌
<220>
<221>Unsure
<222>(3)..(3)
<223>Xaa表示任何氨基酸
<400>16
Tyr Ser Xaa Asn Tyr Glu Asn Ala
1 5
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>產(chǎn)酶溶桿菌
<400>17
Phe Gly Asp Gly Ala Thr
1 5
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P51引物
<400>18
acaccatggc gccctcaaga gcaaacact29
<210>19
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P52引物
<400>19
ttcgagctct ataacttgga cttgacaaca tcgtc35
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P53引物
<400>20
cgactctaga ggaataacac catggcgccc tc32
<210>21
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P54引物
<400>21
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat gaccttat58
<210>22
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P55引物
<400>22
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat aaacttat58
<210>23
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P56引物
<400>23
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat cagcttat58
<210>24
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P57引物
<400>24
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat catcttat58
<210>25
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P58引物
<400>25
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat ggtcttat58
<210>26
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P59引物
<400>26
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat cgccttat58
<210>27
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P60引物
<400>27
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat atacttat58
<210>28
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P61引物
<400>28
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat gttcttat58
<210>29
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P62引物
<400>29
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat gcacttat58
<210>30
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P63引物
<400>30
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat gctcttat58
<210>31
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P64引物
<400>31
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat ggccttat58
權(quán)利要求
1.可從糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白的糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。
2.可從糖化血紅蛋白的包括糖化β鏈N末端的片段切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白的包括糖化α鏈N末端的片段切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。
3.一種蛋白酶，其中，當(dāng)將從糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的反應(yīng)定義為100％時，該蛋白酶從糖化血紅蛋白的糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的反應(yīng)以10％或更低發(fā)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之任一項的蛋白酶，其中從糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端或從糖化血紅蛋白的包括糖化β鏈N末端的片段切割的糖化肽是1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之任一項的蛋白酶，其中不被實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白的糖化α鏈N末端或糖化血紅蛋白的包括糖化α鏈N末端的片段切下的糖化氨基酸和糖化肽分別是1-脫氧果糖基-L-纈氨酸和1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-亮氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之任一項的蛋白酶，其是來源于屬于溶桿菌屬(Lysobacter)的細菌的蛋白酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5之任一項的蛋白酶，其是來源于芽孢桿菌屬種(Bacillus sp.)ASP-842(FERM BP-08641)或嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)NBRC 3820的蛋白酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之任一項的蛋白酶，其是金屬蛋白酶、中性蛋白酶或彈性蛋白酶。
9.切割蛋白質(zhì)或肽中亮氨酸N端側(cè)的肽鍵的彈性蛋白酶。
10.產(chǎn)酶溶桿菌(產(chǎn)酶溶桿菌)YK-366(FERM BP-10010)株。
11.芽孢桿菌屬種ASP-842(FERM BP-08641)株。
12.制備根據(jù)權(quán)利要求6的蛋白酶的方法，其包括以下步驟(a)和(b)
(a)在培養(yǎng)液中培養(yǎng)屬于溶桿菌屬的細菌；
(b)從該培養(yǎng)液中提取蛋白酶。
13.制備根據(jù)權(quán)利要求7的蛋白酶的方法，其包括以下步驟(a)和(b)
(a)在培養(yǎng)液中培養(yǎng)芽孢桿菌屬種ASP-842(FERM BP-08641)或嗜水氣單胞菌NBRC 3820；
(b)從該培養(yǎng)液中提取蛋白酶。
14.具有以下性質(zhì)(A)的酮胺氧化酶
(A)與對1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸的反應(yīng)性相比，對ε-1-脫氧果糖基-(α-芐氧羰基-L-賴氨酸)的反應(yīng)性為5％或更低。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的酮胺氧化酶，其還包括以下性質(zhì)(B)和(C)
(B)由與SEQ ID NO1所示氨基酸序列具有至少75％同源性的氨基酸組成；
(C)至少在SEQ ID NO1所示氨基酸序列的位置58或62的氨基酸被其它氨基酸替代。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的酮胺氧化酶，其中，在(C)所述氨基酸替代中，58位的氨基酸由纈氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸替代；而62位的氨基酸由組氨酸替代。
17.編碼根據(jù)權(quán)利要求14至16之任一項的酮胺氧化酶的氨基酸序列的基因。
18.包含根據(jù)權(quán)利要求17的基因的酮胺氧化酶表達載體。
19.包含根據(jù)權(quán)利要求18的表達載體的宿主細胞。
20.使用酶不經(jīng)分離操作而特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的方法。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的測定方法，其中所述酶包括蛋白酶(i)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的測定方法，其中所述酶還包括酮胺氧化酶(ii)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的測定方法，其中通過以下反應(yīng)步驟(iii)和/或(iv)特異地測定所述N末端
(iii)這樣的反應(yīng)步驟，其中蛋白酶(i)從糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白切割可以和酮胺氧化酶(ii)反應(yīng)的ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸和/或包括ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸的糖化肽；
(iv)這樣的反應(yīng)步驟，其中酮胺氧化酶(ii)對ε-1-脫氧果糖基-(α-芐氧羰基-L-賴氨酸)的反應(yīng)性與對1-脫氧果糖基-L-纈氨酰-L-組氨酸的反應(yīng)性相比為30％或更低。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的測定方法，其中反應(yīng)步驟(iii)在pH 5.0至6.0的反應(yīng)條件下進行。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的測定方法，其中反應(yīng)步驟(iv)在pH 5.5至6.5的反應(yīng)條件下進行。
26.根據(jù)權(quán)利要求21至25之任一項的測定方法，其中蛋白酶(i)是根據(jù)權(quán)利要求1至8之任一項的蛋白酶。
27.根據(jù)權(quán)利要求22至26之任一項的測定方法，其中酮胺氧化酶(ii)是可與由蛋白酶自糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)的酮胺氧化酶。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的測定方法，其中酮胺氧化酶來源于彎孢屬(Curvularia)。
29.根據(jù)權(quán)利要求22至28之任一項的測定方法，其中所述酮胺氧化酶(ii)包括以下兩類酮胺氧化酶(a)和(b)
(a)可與由蛋白酶自糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)的酮胺氧化酶；
(b)可與ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸和/或包括ε-1-脫氧果糖基-L-賴氨酸的糖化肽反應(yīng)而不實質(zhì)性地與由蛋白酶自糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反應(yīng)的酮胺氧化酶。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的測定方法，其中酮胺氧化酶(a)來源于屬于彎孢屬的細菌和/或酮胺氧化酶(b)來源于鐮孢屬(Fusarium)。
31.根據(jù)權(quán)利要求22至26之任一項的測定方法，其中酮胺氧化酶(ii)是根據(jù)權(quán)利要求14至16之任一項的酮胺氧化酶。
32.篩選可從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶的方法，
其中，使用長度為3個至20個氨基酸的血紅蛋白α鏈N末端糖化肽和長度為3個至20個氨基酸的血紅蛋白β鏈N末端糖化肽。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的篩選方法，其中所述血紅蛋白α鏈N末端糖化肽和所述血紅蛋白β鏈N末端糖化肽具有5個氨基酸的長度。
34.用于不經(jīng)分離操作而特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的試劑盒，其包含以下(i)和(ii)
(i)蛋白酶；
(ii)權(quán)利要求14的酮胺氧化酶。
全文摘要
本發(fā)明提供使用酶不經(jīng)分離操作而特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的方法和用于此的測定試劑盒。篩選從糖化血紅蛋白或其片段的糖化β鏈N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不實質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化α鏈N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。通過使用通過該篩選方法獲得的蛋白酶，提供了特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端的方法和測定試劑盒。根據(jù)本發(fā)明，可以不經(jīng)分離操作而特異地測定糖化血紅蛋白的糖化β鏈N末端。
文檔編號G01N33/66GK1823166SQ20048001988
公開日2006年8月23日 申請日期2004年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月21日
發(fā)明者松岡毅, 古賀晉治, 高妻卓司, 芳陵一生, 西村篤壽, 伊藤譽, 熊澤利彥, 畔柳孝 申請人:旭化成制藥株式會社, 一引株式會社