專利名稱：用于檢測低水平融合蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對腫瘤特異性融合蛋白等的檢測。更特異地，本發(fā)明涉及通過檢測生物樣品中的融合蛋白的存在而提示染色體易位的存在的技術(shù)。
在對各種類型癌癥的診斷中，例如白血病、淋巴瘤和實體瘤，常常用染色體畸變進行預后相關(guān)亞組的分組。多種這樣的染色體畸變都形成了融合基因，即經(jīng)一個基因的上游部分和另一個基因的下游部分結(jié)合成的異常結(jié)合的基因，或反之亦然。融合基因可以被轉(zhuǎn)錄成融合基因轉(zhuǎn)錄物并被翻譯成融合蛋白。一般而言，融合蛋白在腫瘤發(fā)生的過程中起到了重要作用。例如，近35％的成人急性淋巴細胞白血病(ALL)和近95％的慢性髓性白血病(CML)患者在其白血病細胞中都有著染色體缺陷，即染色體9和22之間的易位，形成了費城(Ph)染色體。該易位發(fā)生在名為ABL的蛋白酪氨酸激酶的基因組位點上，形成了異常的BCR-ABL融合蛋白，它是ABL基因與另一種稱為BCR的基因的框內(nèi)融合的基因產(chǎn)物。一般而言，融合蛋白在腫瘤發(fā)生的過程中起到了重要作用。例如，BCR-ABL融合蛋白中的ABL的激酶活性被激活并下調(diào)，造成了在ALL和在CML中所觀察到的不受控制的細胞生長。
當一個患者被診斷為ALL時，其白血病細胞總數(shù)通常在1011到1012個的范圍內(nèi)。細胞生長抑制或細胞毒治療誘導了絕大多數(shù)淋巴惡性腫瘤患者的完全緩解。但是，這些患者中的許多患者都會復發(fā)。完全緩解并不意味著白血病細胞被完全地清除出體內(nèi)，只是它們的水平超出了經(jīng)典細胞形態(tài)學方法的敏感性水平。因為細胞形態(tài)學技術(shù)的檢出限度是不低于1-5％惡性細胞，這意味著在患者體內(nèi)仍有最多達1010個惡性細胞，這也被稱作為“微小殘留病變”(MRD)。當前的治療方案顯然不能殺死這些復發(fā)患者中的所有的惡性細胞，盡管根據(jù)細胞形態(tài)學標準，他們都已達到了所謂的完全緩解。因此，很明顯的是細胞形態(tài)學技術(shù)只能提供關(guān)于治療有效性的表面信息。
在早期治療反應的過程中，對較少數(shù)目的殘留惡性細胞的檢測容許對化療過程中的腫瘤減少的動力學進行精確評價?，F(xiàn)在已知MRD信息代表著一種最終預后的有力的預后因素。對MRD水平的增高的檢測使得能預測即將發(fā)生的復發(fā)。因此具有檢測MRD的高敏感性的技術(shù)對于得到更好的關(guān)于在誘導治療期間腫瘤量的縮小以及進一步的在鞏固治療期間惡性細胞的根除的認識是關(guān)鍵的。
用于檢測染色體畸變的現(xiàn)有技術(shù)包括傳統(tǒng)技術(shù)例如細胞遺傳學分析和生物分子技術(shù)例如Southern印跡法或熒光原位雜交(FISH)分析。但是細胞遺傳學、FISH分析和Southern印跡法的檢測敏感度通常都不低于1-5％，這使得它們不適用于MRD的檢測。
盡管PCR在本質(zhì)上非常適合于快速的和大量的診斷性測試或者篩選，但是每個PCR分析通常只分析0.1到4-5kb核酸(DNA或RNA)，這極大地阻礙了對巨大量的染色體和染色體內(nèi)的斷點簇或融合區(qū)域或其基因產(chǎn)物的快速篩選。PCR的其他缺點是其對錯配引物的固有的敏感性。可以一直存在于與引物互補的基因片段的核酸序列內(nèi)的較小的變更將使得按所需的作用操縱PCR成為不可能，并可以造成誤診和假陰性的結(jié)果。特別是假陰性的結(jié)果使得基于PCR的診斷性測試法雖然非常的特異，卻不適用于可靠的診斷，毫無疑問，只有對惡性腫瘤的可靠診斷才能有助于對預后的認識以及有助于對合適治療的設計。
如上所述，絕大多數(shù)的現(xiàn)有技術(shù)都針對于檢測特異的染色體畸變，包括在染色體或核酸(DNA或RNA)水平的分析。但是，在蛋白水平檢測染色體畸變也是可能的。
在白血病診斷學領(lǐng)域已經(jīng)進行了相當大的努力，以建立一種免疫檢測染色體畸變所形成的融合蛋白的合適技術(shù)。這些研究中的多個研究都集中于尋找只與腫瘤特異蛋白反應而不會免疫檢測機體內(nèi)正常生成的非融合蛋白的免疫試劑(抗體)(見，例如Nagasaki et al.，J.Imm.Methods162，235-245，1993和Van Denderen et al.，J Exp Med.1989 169(1)87-98)。這些抗體通常與正常的細胞蛋白有著交叉反應。僅僅當已知特異的融合位點時，選擇通過與融合位點的表位選擇性結(jié)合而只與腫瘤特異蛋白反應的特異的免疫試劑才是可能的。但是，患者之間(DNA水平上的不同斷點)和患者內(nèi)(mRNA剪切變異)的融合蛋白的變異是如此之大，特異的免疫試劑只有在少數(shù)情況中才能發(fā)揮作用，這常常只根據(jù)患者的個體情況(patient-by-patient)(見Van Dongen et al.，Leukemia 1999；131901-1928)。另外，包括對融合蛋白的融合點的免疫檢測的診斷性測試法有著主要的固有的缺點，就是它們要求專門的和較好裝備的實驗室以及受過訓練的和非常熟練的個人。上面的測試法通常也只用于惡性腫瘤的可疑病例，它們并不適用于對白血病患者的染色體畸變的存在情況的大規(guī)模篩查。
容許只對融合蛋白A-B進行檢測的更快速的和更便利的免疫學方法的發(fā)展是針對于檢測融合蛋白的診斷性測試領(lǐng)域的重大步驟(見PCT/NL98/00289)。所報告的方法包括應用所謂的識別融合蛋白的一部分(A部分)的捕獲抗體和標記的識別融合蛋白的另一部分(B部分)的檢測抗體。在這樣的一個系統(tǒng)中，捕獲抗體與固體的支持層相連，例如EILSA板或測試條(P.Berendes，“Recognition of tumor-specific proteins in humancancer.”PhD Thesis Erasmus University Rotterdam，ISBN 90-73436-36-2)。捕獲抗體也可以被固定到可以被流式細胞術(shù)所分析的珠上(見例如PCT/NL01/00945)。在珠結(jié)合的捕獲抗體與懷疑含有融合蛋白的細胞裂解液孵育之后，用標記的檢測抗體檢測被結(jié)合的融合蛋白。
一種(基于珠的)捕獲/檢測抗體系統(tǒng)允許只對融合蛋白進行檢測，并且它是精致和容易進行的，特別是當使用流式細胞術(shù)時。這樣的一種檢測系統(tǒng)也容許高通量的診斷多種臨床樣品。在診斷包括融合蛋白的惡性腫瘤時，當與可能含有天然(非融合的)蛋白的正常細胞的數(shù)目比較時，診斷性樣品通常含有相當大量的具有融合蛋白的惡性細胞。當一個患者被診斷為ALL時，白血病細胞的總數(shù)接近于1012個，其中通常近乎25％到98％的細胞都含有編碼融合蛋白的融合基因。因此，捕獲/檢測抗體細胞適合于快速篩查生成融合蛋白的染色體畸變。但是，捕獲/檢測抗體系統(tǒng)的敏感性常常表現(xiàn)出不足以檢測到大量正常細胞的背景中的低頻率的(＜1％)惡性細胞。作為一個實例，當前的捕獲/檢測抗體系統(tǒng)對于檢測治療隨診過程中的MRD是不適當?shù)摹Ｒ虼?，捕獲/檢測抗體系統(tǒng)的診斷性應用主要局限于最初診斷的階段，此時骨髓或血液中的惡性細胞的頻率是高的(一般＞10％)?？偠灾?，目前對容許便利地只對樣品中的融合蛋白進行檢測的方法有著特殊的需要，特別是當樣品中只含有微量的融合蛋白的情況下。
現(xiàn)在已經(jīng)意識到，在當前的方法中，融合蛋白和非融合的天然(即野生型)蛋白通常競爭與用于檢測融合蛋白的探針的特異性結(jié)合。例如，融合蛋白A-B和非融合的天然蛋白A將競爭性與那些與融合蛋白的A部分特異性反應的捕獲抗體、或其他類型的探針結(jié)合。類似的，融合蛋白A-B和非融合的天然蛋白B競爭性與那些與融合蛋白的B部分反應的捕獲抗體特異性結(jié)合。因此，樣品中所具有的融合蛋白相對于天然的非融合蛋白的比例很大程度上決定了用于檢測包括至少兩種天然蛋白的部分的融合蛋白的捕獲/檢測抗體系統(tǒng)的敏感性。當天然蛋白大大地多于感興趣的融合蛋白時，天然蛋白可能占據(jù)捕獲抗體的即使不是全部的也是絕大多數(shù)的結(jié)合位點，從而基本上阻止了融合蛋白的結(jié)合。此外，即使捕獲抗體能有效地捕獲到一些融合蛋白，但是提示標記的檢測抗體的結(jié)合的信號強度可能不足以產(chǎn)生可靠的測試結(jié)果。
本發(fā)明提供了一種觀點，即通過在檢測融合蛋白的存在之前先清除所述樣品中的一種或多種天然蛋白，以便使得所述樣品中的所述融合蛋白的量相對于一種或多種“競爭性”天然蛋白是富集的，以增加用于檢測樣品中的融合蛋白的方法的敏感性。本發(fā)明提供了一種通過對包括一個氨基末端片段和一個羧基末端片段的融合蛋白進行檢測而檢測融合蛋白(例如染色體易位形成的融合蛋白)的方法，每個末端片段各自對應于一種不同的天然蛋白，所述方法包括(i)將所述樣品與至少一種與該天然蛋白的一部分特異性反應的結(jié)合分子在容許所述的至少一種結(jié)合分子與該天然蛋白之間形成復合物的條件下相接觸，所述的天然蛋白的一部分不存在于所述融合蛋白中；(ii)從所述樣品中去除所述復合物，以基本上清除所述樣品中的所述天然蛋白，但不清除所述融合蛋白；和(iii)用至少一種針對于所述融合蛋白的抗體檢測所述樣品中的所述融合蛋白。術(shù)語天然蛋白或相關(guān)天然蛋白在此指的是可以與感興趣的融合蛋白競爭結(jié)合用于檢測融合蛋白的探針或試劑(例如捕獲抗體)的非融合的、野生型蛋白。本發(fā)明的天然蛋白可以采用天然構(gòu)象(生理環(huán)境中的蛋白的三維結(jié)構(gòu))或變性構(gòu)象。
根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白來源于惡性細胞的融合基因或來源于人工生成的融合基因。在包括一個氨基末端片段和一個羧基末端片段的融合蛋白中，每個片段各自對應于一種天然蛋白，所述片段通常是經(jīng)斷點融合或融合區(qū)域而彼此直接地融合或連接，這樣這些片段一起就代表整個融合蛋白。片段的長度或大小可以不同，無論是氨基末端或羧基末端的片段。如果融合區(qū)域定位于融合蛋白的近似中途，則融合蛋白包括一個相同大小的氨基(N)末端片段和羧基(C)末端片段。在其他情況中，融合區(qū)域定位于更接近于融合蛋白的C末端或N末端的位置，使得融合蛋白分別由大的N末端片段和小的C末端片段或者大的C末端片段和小的N末端片段構(gòu)成。本發(fā)明的融合蛋白含有足夠多的融合區(qū)域的上游氨基酸和下游氨基酸，使得容許與位于融合蛋白區(qū)域的相對側(cè)上的融合蛋白的部分特異性反應的抗體探針或在功能上與其等價的結(jié)合片段的識別。
在本發(fā)明的方法中，相對于一種或多種“競爭性”天然蛋白，樣品中的融合蛋白是富集的，造成了融合蛋白對針對所述融合蛋白的探針的結(jié)合的增加。所提供的方法特別適合于增加用于檢測融合蛋白的捕獲/檢測抗體或三明治系統(tǒng)的敏感性。因此，本發(fā)明提供了對利用現(xiàn)有的檢測方法所遇到的主要問題的解決方法，其中天然蛋白飽和或“消耗”了用于檢測融合蛋白的探針例如捕獲抗體，從而阻止了融合蛋白與所述探針的結(jié)合。顯而易見的是，天然蛋白的探針飽和降低了檢測相同樣品中所存在的融合蛋白的敏感性。通過清除本發(fā)明的樣品中的競爭性天然蛋白，極大地增加了融合蛋白/天然蛋白的比例，因此有利于檢測探針的結(jié)合以及融合蛋白的檢測。通過在此所提供的方法，現(xiàn)在以相對快速和簡單的方式特異地檢測融合蛋白的存在是可能的，甚至當樣品中只存在有限量的所述融合蛋白時。例如，這容許應用捕獲/檢測抗體系統(tǒng)檢測樣品中的腫瘤特異性融合蛋白，這樣的樣品中只包括存在于大量正常細胞背景中的小群的融合蛋白陽性的惡性細胞，含有大量的競爭性天然蛋白。
此外，通過根據(jù)本發(fā)明的方法，現(xiàn)在還有可能計算出天然蛋白的量(如正常細胞數(shù)目的測定值)相對于融合蛋白的量(如惡性細胞數(shù)目的測定值)的比例。可以用所得到的正常蛋白對融合蛋白的份額(ration)確定出惡性細胞的相對頻率，即MRD水平。
本發(fā)明提供了一種觀點，即通過清除細胞中的至少一種相關(guān)天然蛋白可以增加檢測細胞內(nèi)存在融合蛋白的敏感性，例如惡性細胞內(nèi)存在的嵌合的癌蛋白。當然，在檢測融合蛋白之前先清除一種以上的天然蛋白是可能的。顯而易見的是，當檢測也含有顯著量的能與用于捕獲融合蛋白的探針競爭結(jié)合的天然蛋白的樣品中的融合蛋白時，應用在此所提供的方法是極為有利的。在一個實例中，提供了一種通過確定樣品中存在惡性細胞而檢測MRD的方法，所述方法包括檢測樣品中的腫瘤特異性融合蛋白，所述融合蛋白包括至少兩種天然的、非腫瘤特異性蛋白的部分，在所述的檢測步驟之前進行的是“預清除”步驟，其中清除了所述樣品中的至少一種所述的天然蛋白，否則它們將競爭融合蛋白的檢測。
在本發(fā)明的方法中，用至少一種結(jié)合分子從樣品中去除一種或多種天然蛋白。樣品包括生物樣品例如血液樣品、血清樣品、組織樣品、骨髓、腦脊液樣品、活檢組織和其他可以含有一個或多個表達融合基因所編碼的融合蛋白的細胞的樣品。以使得結(jié)合分子充分地接近天然蛋白的方式處理樣品。因為許多細胞蛋白位于細胞內(nèi)，通常通過破壞細胞的膜完整性而實現(xiàn)這一點。例如，以這樣的方式處理樣品，使得產(chǎn)生了細胞裂解液或細胞勻漿，這些是例如通過細胞的機械破裂或通過將細胞暴露于含有去污劑的細胞裂解緩沖液中而得到的。合適的結(jié)合分子優(yōu)選地包括一種蛋白或一種多肽，如一種抗體或抗體片段。但是，在實現(xiàn)在此所提供的方法時也可使用其他類型的結(jié)合分子。利用本領(lǐng)域已知的各種標準的方法可以得到特異抗體或其片段，包括在實驗室動物中生成多克隆抗體的方法、利用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)得到單克隆抗體的方法、和利用噬菌體展示選擇過程的單鏈Fv抗體片段(scFv)。這樣的抗體或抗體片段在此還被叫做“清除抗體”。
對于與天然蛋白而不是與包括所述天然蛋白的一部分的融合蛋白反應的結(jié)合分子(例如清除抗體)的設計或發(fā)展，知道所述天然蛋白的哪一部分或片段是融合蛋白的部分以及哪一部分不是當然是關(guān)鍵的。換句話說，確定所檢測的融合蛋白的融合點或融合區(qū)域是優(yōu)選的。本發(fā)明的方法被優(yōu)先地用于檢測為已知染色體畸變結(jié)果的融合蛋白。在這些情況中，已經(jīng)詳細地描述了所形成的融合基因和融合蛋白。熟知的實例是形成在＞95％的CML病例和在30％的成人ALL病例中所發(fā)現(xiàn)的BCR-ABL融合基因的易位，和形成在25-30％的兒童ALL病例中所發(fā)現(xiàn)的TEL-AML1融合基因的易位。但是，已知白血病包括更多種的融合基因和所編碼的融合蛋白，例如E2A-PBX1、ETO-AML1和PML-RARα。
要明白本發(fā)明的應用并不限定于對白血病的檢測，也可用于檢測以融合基因和融合蛋白的存在為特征的一些其他的、非白血病的疾病。例如，在間變大細胞淋巴瘤(ALCL)中可以觀察到下面的ALK融合基因融合基因NPM-ALK來源于染色體畸變t(2；5)(p23；q35)；融合基因TFG-ALK來源于t(2；3)(p23；q21)和融合基因ATIC-ALK來源于inv(2)(p23q35)。根據(jù)本發(fā)明利用與天然ALK反應而不與融合蛋白反應的清除抗體對樣品中的天然ALK蛋白的清除將增加隨后的捕獲/檢測測定法的敏感性。在另一個實施方式中，本發(fā)明被優(yōu)先地應用于檢測在Ewing肉瘤(EWS)中所觀察到的染色體畸變，例如t(11；22)(q24；q12)形成了EWS-FLI1融合蛋白，t(21；22)(q22；q12)形成了EWS-ERG融合蛋白，和t(7；22)(p22；q12)生成了EWS-ETV1融合蛋白。骨的Ewing肉瘤(EWS)/周圍原始神經(jīng)外胚層瘤(PNET)是一類在兒童和青年人中常見的癌癥。發(fā)病高峰在10歲和20歲年齡之間，在小于5歲的兒童或超過30歲的成人中少見。Ewing肉瘤可以出現(xiàn)在身體的任何骨骼中；最常見的部位是骨盆、大腿、小腿、上肢、和肋骨。根據(jù)本發(fā)明，在預清除步驟中對正常的細胞EWS蛋白的清除(和/或任意地清除融合的配體基因例如FLI1、ERG或ETV1)將增加檢測與Ewing肉瘤相關(guān)的融合蛋白的敏感性。
因此，本發(fā)明容許本領(lǐng)域的熟練人員應用和實施本發(fā)明，且沒有診斷或分類任何類型的疾病的過度負擔，所述疾病與融合基因的存在有關(guān)，該融合基因被翻譯成包括一個氨基末端片段和一個羧基末端片段的融合蛋白，每個片段各自對應于一種天然蛋白。
根據(jù)融合蛋白的結(jié)構(gòu)，可以容易地確定出天然蛋白的哪個部分不存在于融合蛋白內(nèi)?？梢杂门c該部分或其伸展鏈(多肽)特異性反應的結(jié)合分子從樣品中基本上去除天然蛋白，但不清除融合蛋白。本領(lǐng)域人員將認識到需要用哪些步驟得到與天然(野生型)蛋白特異性反應而不與融合蛋白反應的結(jié)合分子。在一個優(yōu)選的實施方式中，這樣的一種特異結(jié)合分子是一種抗體或在功能上與其等價的結(jié)合片段。
生產(chǎn)抗體的方法對于本領(lǐng)域人員是已知的。例如，為了得到一種多克隆抗體，用免疫原免疫接種實驗動物。在本發(fā)明的方法中，所述的免疫原優(yōu)選地是對應于天然蛋白的所選的伸展鏈或區(qū)域的一種重組蛋白片段或一種合成的肽。通過取測試血樣和確定反應性的滴度監(jiān)測動物的免疫應答。當?shù)玫胶线m的高滴度時，收集動物的血并制備抗血清。如果需要可進行對抗血清的進一步分級分離，以富集與天然蛋白反應的抗體。見例如，Harlow et al.Antibodies.A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPublications，New York(1988)。通過各種本領(lǐng)域已知的方法可以得到多克隆抗體，例如通過經(jīng)加入聚乙二醇(PEG)的被接種小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞株的融合。將融合的細胞培養(yǎng)在選擇培養(yǎng)基中，例如含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷混和物的培養(yǎng)基。測試在該選擇培養(yǎng)基中存活的融合細胞是否生產(chǎn)所需的抗體(例如通過固相免疫測試法例如ELISA)，如果陽性，將培養(yǎng)物克隆使得在每個培養(yǎng)孔中只含有一個細胞。這就生成了來自單個祖先的細胞克隆，它是永久的和單克隆抗體的生產(chǎn)者。利用傳統(tǒng)的免疫診斷技術(shù)描繪所得到的抗體，例如通過利用表達(重組)天然蛋白或(重組)融合蛋白的細胞的裂解液的Western印跡法。僅僅那些與天然蛋白A反應而不與融合蛋白A-B反應的抗體適合于用作為本發(fā)明的方法中的清除抗體。
根據(jù)本發(fā)明，在檢測融合蛋白之前，先從樣品中去除清除抗體和天然蛋白之間的復合物。在一個實施方式中，提供了一種通過例如抗體/抗原復合物的形成使得能從細胞裂解液或勻漿中快速地和選擇性地去除或沉淀出天然蛋白的方法。為此，將樣品與至少一種與天然蛋白特異性反應的結(jié)合分子在容許在所述結(jié)合分子和所述天然蛋白之間形成復合物的條件下相接觸。在本發(fā)明的方法中，可以使用各種分離技術(shù)從樣品中去除復合物。常使用的從粗制混和物中沉淀出抗體/抗原復合物的方法包括固相免疫沉淀。在一個實施方式中，通過添加能結(jié)合所述復合物的固體珠或微球以形成在基本液體樣品中的珠的懸浮液，可以將所述復合物從所述樣品中去除。根據(jù)本發(fā)明，合適的珠包括瓊脂糖珠、或聚苯乙烯珠、或任何種類的容許從樣品中簡便地去除珠結(jié)合的復合物的固體顆粒。固體珠的優(yōu)點是它們可以被簡便地從樣品中分離沉淀出來，通常通過離心懸浮液的方法?；蛘?，通過過濾懸浮液得到了預清除的樣品。在本發(fā)明的一個實施方式中，將樣品與清除抗體接觸以形成天然蛋白和固定在珠上的免疫球蛋白結(jié)合蛋白之間的復合物，結(jié)合蛋白被用于從所述樣品中去除所述復合物。存在各種類型的可適合使用的免疫球蛋白結(jié)合蛋白(Antibodies，a Laboratory Manual，E.Harlow & D.Lane，(1988))。這些蛋白包括蛋白A、蛋白G和金黃色葡萄球菌的細菌的細胞外殼(ghost)。金黃色葡萄糖球菌在其表面上具有被稱為蛋白A的特殊蛋白，它是多能的、廣譜的IgG結(jié)合劑。蛋白A與抗體(IgG型)的Fc部分結(jié)合，但不干擾它們與抗原的結(jié)合。多種哺乳動物物種的抗體一般都與蛋白A反應。在另一個實施方式中，用2型GammaBind G或蛋白G去除樣品中的清除抗體和天然蛋白的復合物。2型GammaBind G和蛋白G是鏈球菌蛋白G的基因工程加工成的形式。兩種蛋白都在大腸桿菌中生成。它們與多種類型的免疫球蛋白G的恒定區(qū)結(jié)合，并被廣泛地用于檢測、定量和純化IgG抗體和抗原/抗體復合物。2型GammaBind G和蛋白G是可得到的最普遍適用的抗體結(jié)合蛋白。與蛋白A比較，它們與多種不同物種的抗體緊密地及特異地結(jié)合。例如，2型GammaBind G與小鼠和大鼠的IgG結(jié)合得更好，2型GammaBind G和蛋白G與來自人IgG的所有亞型都選擇性地結(jié)合?？梢詮牟煌墓讨锌缮唐坊氐玫郊毦鈿?、免疫球蛋白結(jié)合蛋白和免疫球蛋白結(jié)合蛋白所包被的珠，例如Pharmacia Biotech AB、Sigma Aldrich或Pierce。在此所提供的方法中，在形成天然蛋白和清除抗體之間的復合物之后，細菌外殼或包被珠與細胞樣品或細胞勻漿混和，在此期間免疫球蛋白結(jié)合蛋白附著到清除抗體上。簡易的和簡單的沉淀或過濾步驟可以從樣品中分離出具有附著了清除抗體/天然蛋白復合物的細菌外殼或珠。
但是，在一個優(yōu)選的實施方式中，結(jié)合分子(優(yōu)選地是一種清除抗體)被直接地結(jié)合到或固定到珠上或另一種固體顆粒上。在合成的微珠上展示生化試劑是生物分析測試法發(fā)展中的流行趨勢?；谥榈恼故鞠到y(tǒng)(例如，共價結(jié)合、生物素-抗生物素蛋白鏈菌素、His-tag)的商業(yè)化來源(例如Spherotech，IL；Bangs，IN；Polysciences；PA)；Molecular Probes，OR)目前是可獲得的。直接與珠綴合的清除抗體的應用不需要間斷使用免疫球蛋白結(jié)合蛋白，并通常將造成特異性的增高。在孵育足夠長的時間之后，可以從樣品(例如裂解液或勻漿)中去除附著有與天然蛋白復合的清除抗體的珠。例如通過離心容易并快速地實現(xiàn)從樣品中去除珠，形成了基本上清除了天然蛋白的樣品，這些天然蛋白否則將與融合蛋白競爭與針對于所述融合蛋白的探針的結(jié)合。因為這個清除步驟形成了富集了融合蛋白相對于“競爭性”天然、非融合蛋白的量的樣品，因此顯著地增加了融合蛋白與這樣的探針例如捕獲抗體結(jié)合的可能性。例如，現(xiàn)在提供了一種容許用敏感性增加的捕獲/檢測系統(tǒng)檢測融合蛋白的方法。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，將清除抗體或任何其他類型的合適的結(jié)合分子與磁珠綴合。這就容許利用免疫磁性分離法(IMS)從樣品中清除珠結(jié)合的復合物。IMS是一種技術(shù)，它包括往細胞裂解液中添加與相關(guān)抗原特異性反應的結(jié)合分子所包被的磁珠?；旌椭榧傲呀庖阂孕纬梢粋€(抗原/抗體)復合物，在此期間形成了清除抗體或其他結(jié)合分子和天然蛋白之間的復合物。在特定的孵育時間之后，應用磁場將附著有復合物的磁珠或磁性顆粒與其他物質(zhì)分離，留下了已被清除的或“預清除的”樣品。合適的磁珠是例如Spherotec Inc.(www.spherotech.Com)上市的商標名為SPHERO磁性顆粒的磁珠。通過給單分散的(即統(tǒng)一大小的)聚苯乙烯的核心顆粒包被上一層磁石和聚苯乙烯而制備出磁珠(見美國專利5,091,206)。因此，顆粒在形態(tài)上是球形的以及在性能上是順磁性的。它們在大小上也是非常統(tǒng)一的?？梢哉{(diào)整這些磁性顆粒的磁石含量，但其含量通常為約10％到15％?？梢匀菀椎貜膽腋∫褐写判缘胤蛛x出磁性顆粒。當這些顆粒從磁鐵中取出時，它們成為非磁性的，并且不保留任何可檢測到的磁性，即使在重新暴露于磁場之后?？梢詫⒋判灶w粒用于細胞分離、親和純化、DNA探針檢測、磁性顆粒EIA等。各種大小的珠例如瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠等等都是可商品化得到的。在一個優(yōu)選的實施方式中，使用了具有相當小直徑的珠，因為對于特定體積的珠，小珠比大珠具有更大的表面積。珠的表面積越大，固定到珠上的結(jié)合分子就越多，以及每體積珠從樣品中去除天然蛋白就更有效。當從小樣品量的樣品中去除天然蛋白時，這是特別有用的。
綜上，本發(fā)明解決了捕獲/檢測抗體系統(tǒng)對于檢測樣品中存在的少量融合蛋白常常不夠敏感的問題，盡管該系統(tǒng)可被快速和容易地實施。提供了一種以已增加了的敏感性檢測包括兩種不同的天然蛋白的部分的融合蛋白的方法，通過引入預處理步驟而得到樣品，所述樣品中相對于所述一種或兩種天然蛋白的量而言，感興趣的融合蛋白被富集了。進一步處理這個富集了的、或預清除了的樣品，以檢測融合蛋白的存在。理論上，利用針對于A-B融合蛋白的A部分的單個抗體(或其功能等價物)可以檢測用所提供的方法完全清除了其中的天然蛋白A的樣品中存在的融合蛋白A-B。但是，在實踐中很難得到不含有任何天然蛋白A的預清除的樣品，單個的A特異性抗體不可能一直都給出所需的檢測特異性。因此，為了只對A-B融合蛋白進行檢測，優(yōu)選地使用至少一種針對于融合蛋白的B部分的附加抗體。例如，用一組至少第一和第二抗體檢測融合蛋白，每種抗體各自能識別位于所述融合蛋白的融合區(qū)域的相對側(cè)上的一個結(jié)合位點。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了一種方法，其中通過流式細胞術(shù)檢測或通過任何其他的便利方法利用至少兩種抗體探針測定珠相關(guān)的熒光而檢測來源于融合基因的融合蛋白，其中至少一種抗體針對于包括融合蛋白的氨基末端的蛋白片段，以及至少另一種抗體針對于包括融合蛋白的羧基末端的蛋白片段。
為了檢測樣品中的抗原或抗體，當與流式細胞術(shù)聯(lián)合時，使用微球、珠或其他顆粒作為抗原-抗體反應的固體支持物是特別吸引人的(見例如，美國專利6,159,748)。在一個優(yōu)選的實施方式中，抗體探針與珠結(jié)合，這就容許經(jīng)流式細胞術(shù)檢測融合蛋白。流式細胞術(shù)具有檢測顆粒大小差異的能力，并且它是高度敏感的熒光檢測儀。通過前向角光散射(FALS)或電子體積可以確定出微球的大小。與直角光散射(RALS)聯(lián)合使用時，流式細胞術(shù)可以區(qū)分出單一的和聚集的顆粒。
本發(fā)明的方法對于腫瘤特異性蛋白的檢測是非常吸引人的，腫瘤特異性蛋白包括氨基末端片段和羧基末端片段，它們分別對應于不同的非腫瘤特異性蛋白。所述腫瘤特異性融合蛋白是例如費城染色體畸變所生成的異常BCR-ABL蛋白。在檢測之前，通過利用至少一種與ABL或BCR蛋白(的片段)特異性反應，但不與BCR-ABL融合蛋白特異性反應的結(jié)合分子從所分析的樣品中清除天然蛋白BCR和ABL中的一種或兩種。在去除了包括BCR和/或ABL的復合物之后，優(yōu)選地用一組至少第一和第二抗體檢測BCR-ABL融合蛋白，其中每個抗體識別位于融合蛋白的融合區(qū)域的相對側(cè)上的結(jié)合位點。利用捕獲/檢測系統(tǒng)可以檢測融合蛋白，例如利用流式細胞術(shù)、ELISA、或測試條法(也見下面的實施例)。
本發(fā)明的方法特別適合于檢測非常少量的表達融合蛋白的細胞(例如在MRD中所見到的＜1％)。但是，它當然也能被優(yōu)先地用于增加不需要專門的低檢測限度的檢測方法的敏感性，例如那些用于與融合蛋白的存在相關(guān)的疾病的最初診斷的檢測方法。也在這些情況中，在檢測融合蛋白之前去除一種或多種天然蛋白將造成敏感性的增加。在診斷階段，常常需要研究在同一試管內(nèi)所存在的不同的融合基因蛋白，優(yōu)選地是同時研究。這不是因為特殊的惡性腫瘤會具有超過一種的融合基因蛋白，而是因為在單一試管內(nèi)檢測同一疾病類型中的一些熟知的融合基因蛋白是便利的，例如急性髓性白血病(AML)或前體B-ALL(表1)。
表1.單一試管內(nèi)的一些融合蛋白的聯(lián)合檢測的實例
在一個優(yōu)選的實施方式中，在此所提供的方法包括通過利用不同的針對不同的融合蛋白的一部分的珠結(jié)合的捕獲抗體以及針對融合蛋白的其他部分的相關(guān)對應的檢測抗體，優(yōu)選地在單一試管檢測中，進行對不同類型的融合蛋白的流式細胞術(shù)的檢測。對于對多種融合蛋白的同步檢測而言，通過聯(lián)合FALS和熒光，使用不同大小的珠是可行的，每種珠都被包被了不同的捕獲抗體。依賴于微球的化學組成，用蛋白被動地或共價地包被微球。根據(jù)珠的不同的流式細胞術(shù)的特點(例如大小、熒光染料顏色、熒光染料染色的強度、或側(cè)向角特征)，可以在同一檢測法中特異地檢測出多種融合蛋白。這也包括對來自同一靶基因的各種不同的易位的融合蛋白以及來自具有不同的斷點的易位的融合蛋白的檢測。本發(fā)明的用于檢測一種或多種融合蛋白的方法，無論其利用的是一種捕獲/檢測系統(tǒng)還是任何其他類型的檢測方法，其關(guān)鍵部分均為在檢測融合蛋白之前先清除一種或多種相關(guān)的天然的、非融合的蛋白這一點。利用一種或多種結(jié)合分子例如清除抗體可以實現(xiàn)這一目的，結(jié)合分子可以特異地識別并與天然蛋白結(jié)合形成復合物。不同類型的蛋白可以被附著于不同的單個的如珠的固體表面上?；蛘?，與不同的天然蛋白特異性反應的多個結(jié)合配體與相同的珠結(jié)合，這樣就可以只用單一的珠同時清除樣品中的多個天然蛋白。這是特別令人感興趣的，當本發(fā)明的方法被用于研究在同一試管內(nèi)同時存在不同的融合蛋白時，例如對于在同一疾病類型內(nèi)的惡性腫瘤的診斷，特別是當在診斷時使用了具有低腫瘤負荷(例如，小于5％)的患者樣品時。
因此，當與現(xiàn)有的檢測方法比較時，本發(fā)明的方法容許在同一試管檢測中以高特異性和提高了的敏感性同時檢測第一融合蛋白A-B，它包括天然蛋白A的N末端片段和天然蛋白B的C末端片段，和第二融合蛋白C-D，它包括天然蛋白C的N末端片段和天然蛋白D的C末端片段。在這個具體的實例中，利用將具有低腫瘤負荷的患者樣品與一種與蛋白A的C末端片段特異性反應的清除抗體(抗A)以及一種與蛋白D的N末端片段特異性反應的清除抗體(抗D)接觸，以相應地從樣品中清除天然蛋白A和D。優(yōu)選地將抗A和抗D清除抗體固定到(小)珠上，基于使用效率和簡便的原因，甚至更優(yōu)選地將抗體固定到相同的珠上。在這個由珠/抗A/蛋白A/抗D/蛋白D構(gòu)成的特殊實例中，簡單的離心步驟一般足以從樣品中分離出復合物。因此，得到了基本上清除了天然蛋白A和D的樣品。這將提高融合蛋白A-B和C-D被它們的特異探針所識別的可能性，探針例如是與融合蛋白A-B的N末端片段和融合蛋白C-D的C末端片段特異性反應的捕獲抗體。
除了有限的敏感性之外，現(xiàn)有的用于檢測樣品中的融合蛋白的方法面臨著一個常見的問題，就是限制了定量所檢測的融合蛋白的量的可能性。特別的，當將這些方法應用為診斷工具時，非常希望能定量或至少半定量融合蛋白。如果有任何可能，可以將提示融合蛋白存在的檢測信號例如熒光強度表示為相對于一種無論是否存在融合蛋白都被假定為恒定的內(nèi)在對照因子的量。這樣的因子可以是例如所分析的細胞的數(shù)目或樣品的總的蛋白含量?？梢詫⑦@個相對數(shù)值用于比較不同樣品的目的，例如比較陽性和陰性對照樣品。顯而易見的，還需要更多的關(guān)于直接地描述包括兩種天然蛋白的部分的融合蛋白相對于一種或甚至兩種非融合的天然蛋白的存在情況。
至今為止，沒有一種現(xiàn)有的檢測方法容許進行定量檢測。重要的是，本發(fā)明現(xiàn)在提供了一種針對這個問題的簡單的和直接的解決方法。進一步優(yōu)選地分析在本發(fā)明的方法中從樣品中所去除的含有一種或多種清除的天然蛋白的復合物，以提示從所述樣品中所清除的天然蛋白的量。在一個優(yōu)選的實施方式中，這個分析包括至少一種能特異地結(jié)合所清除的或分離的復合物的一種或多種成分的試劑的應用，隨后確定所述試劑與所述復合物的結(jié)合以作為從所述樣品中清除的天然蛋白的量的指征。試劑優(yōu)選地包括一種結(jié)合配體，如抗體或其功能等價物片段，它能結(jié)合清除的天然蛋白。在一個優(yōu)選的實施方式中，用針對于清除的天然蛋白上的遠離天然蛋白和清除抗體之間相互作用的位點的區(qū)域的試劑檢測清除的復合物。更優(yōu)選地，用于檢測清除的天然蛋白的試劑與同樣存在于融合蛋白內(nèi)的天然蛋白的部分反應。例如，將用于檢測A-B融合蛋白的“捕獲抗體”用作試劑優(yōu)先地檢測清除的蛋白A。試劑優(yōu)選地具有一個報告分子或標記，如熒光染料，以容許通過標記的試劑與清除的蛋白的結(jié)合檢測復合物。
利用流式細胞術(shù)優(yōu)先地實施對復合物的檢測，以確定從樣品中清除的天然蛋白的量。在一個實施方式中，將清除抗體與珠綴合。合適的珠包括那些上述討論的用于檢測融合蛋白的珠，包括與流式細胞術(shù)兼容的磁珠。
當已知了清除的天然蛋白的量時，可以將這個信息作為細胞物質(zhì)的量或總蛋白含量的指征。換句話說，清除的蛋白可以用作為診斷測試中的一種“內(nèi)對照”。當描述在分離的復合物中的蛋白相對于細胞物質(zhì)的量或細胞數(shù)目的存在情況(表達)時，當然優(yōu)選地是所分離的復合物含有試劑所檢測的足夠多的所述天然蛋白。因此，進一步作為對細胞物質(zhì)的量的測定的被清除并被分析的天然蛋白優(yōu)選地包括在所述的細胞內(nèi)是相當普遍存在的蛋白。另外，重要的是所述的天然蛋白的表達沒有大的變異，例如在個體細胞之間或在不同的細胞條件下。在一個優(yōu)選的實施方式中，被清除并分析的所述的天然蛋白還是一種具有穩(wěn)定表達的高豐度蛋白，例如管家蛋白。例如，當檢測樣品中的BCR-ABL融合蛋白時，優(yōu)先清除并隨后檢測天然ABL蛋白，因為ABL是一種高豐度蛋白。
但是融合蛋白并不一直都包括一種高豐度天然蛋白的片段。例如，在E2A-PBX1融合蛋白中，堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子E2A的N末端激活結(jié)構(gòu)域被連接到前B細胞白血病轉(zhuǎn)錄因子1(PBX1)的大部分上。轉(zhuǎn)錄因子的表達通常是低水平的并是細胞類型特異的方式。因此，在這些情況中，用任何清除的天然蛋白作為一種內(nèi)對照并不是優(yōu)選的。取而代之的是，優(yōu)先使用一種附加的(抗體)探針，它能同時清除樣品中的高豐度蛋白。為了進一步說明這一點，在上面所述的情形中，將樣品例如細胞裂解液與用兩種抗體包被的珠接觸一種抗體與天然E2A反應，但不與E2A-PBX1融合蛋白反應，以清除樣品中的競爭性的E2A蛋白，以及一種抗體與管家蛋白(例如ABL)反應以同時清除樣品中的能作用為內(nèi)對照的管家蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，通過構(gòu)建描述天然蛋白的測定量(例如熒光)對“已知”量的相對值的曲線，可以進行對清除的天然蛋白的(半)定量分析。優(yōu)選地，“已知的”樣品含有所選量的天然蛋白，所選的量跨越了在“未知”樣品所預期存在的天然蛋白的濃度范圍(例如，用正常細胞的(系列)稀釋物)。然后可以用這樣的標準曲線確定出在含有清除的復合物的“未知”樣品(或其稀釋物)中的清除的天然蛋白物質(zhì)的濃度。
本發(fā)明提供了在上面所討論的方法，它使用了報告分子所標記的或綴合的探針，報告分子例如是生物素、洋地黃毒苷、酶例如過氧化物酶、堿性磷酸酶、或其他的本領(lǐng)域已知的報告分子或報告顆粒，例如珠。本發(fā)明還提供了一種診斷試劑盒，它包括實施本發(fā)明的方法所必需的所有工具，例如結(jié)合分子、(綴合的)珠、(標記的)探針或試劑或底物或說明書。優(yōu)選地用本發(fā)明所提供的方法或診斷試劑盒檢測在特定類型的癌癥中所發(fā)現(xiàn)的染色體畸變，例如白血病，試劑盒可被用于檢測患者中的(殘留)癌癥或整體地篩選大規(guī)模人群中的癌癥。
本發(fā)明的方法的優(yōu)點是(1)同時且分開地分析多個融合蛋白(最適切的是在診斷的時候)的能力；(2)結(jié)合蛋白對微球的簡便性；(3)流式細胞術(shù)檢測小顆粒大小差異的能力；和(4)流式細胞術(shù)作為一種同時檢測不同波長的檢測儀的敏銳的敏感性?？傻玫降淖詣尤酉到y(tǒng)使得它在這個方面是更為吸引人的。
本發(fā)明的方法被優(yōu)先地用于對生物樣品例如血液樣品、血清樣品、細胞樣品、組織樣品、腦脊液、骨髓、活檢組織的染色體畸變的診斷性測試。本發(fā)明提供了一種在診斷性測試中所用的方法，其中該測試需要高敏感性和高特異性。所提供的方法現(xiàn)在容許診斷惡性腫瘤和在患有各種類型癌癥的患者的隨診過程中嚴密地監(jiān)測MRD，這些癌癥包括生成融合基因的染色體畸變、倒位或缺失。在疾病的治療之前、期間和之后，提供了本發(fā)明的方法的應用以評價所述治療的有效性。
實施例對預清除的細胞裂解液中的BCR-ABL融合蛋白的檢測這個實施例說明了在捕獲/檢測抗體測定法檢測之前如何從樣品中去除正常的(即天然的)ABL，以提高在MRD測定中檢測BCR-ABL融合蛋白的敏感性?？梢杂每笰BL的N末端部分的抗ABL抗體進行這樣的“預清除”步驟。將清除所有在細胞內(nèi)所表達的正常的ABL，僅僅存在于BCR-ABL融合蛋白內(nèi)的ABL片段將與帶有抗ABL的C末端部分的抗ABL捕獲抗體的檢測珠結(jié)合。然后用與熒光標記綴合的抗BCR檢測抗體檢測與珠結(jié)合的BCR-ABL。
材料1)將取自MRD患者的白血病細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中。
2)磷酸緩沖液(PBS)/2％胎牛血清(FCS)將2ml FCS(熱滅活)加入到100ml PBS(pH 7.8)中；儲存在4℃。
3)放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液(沒有脫氧膽酸鹽)50ml RIPA-緩沖液的制備50mM Tris-HCl使用2.5ml 1M Tris-HCl儲存液150mM NaCl使用1.5ml 5M NaCl儲存液1％NP40使用0.5ml未稀釋的Nonidet P40(BDH，#56009 2L)0.1％SDS使用0.5ml 10％SDS儲存液加入45ml milliQ儲存在4℃。
4)蛋白酶抑制劑雞尾酒，Sigma，#P2714將粉末溶解在2ml milli Q中，以制備50x濃縮溶液，儲存在4℃。
5)預清除珠用針對ABL的N末端的清除抗體包被聚苯乙烯珠(＞10μM)。
6)檢測珠用針對ABL的C末端的捕獲抗體包被Luminex、PolyScience、或Molecular Probe珠。
7)檢測抗體針對于BCR的末端的FITC或生物素綴合的抗體。
8)抗生物素蛋白鏈菌素(SA)-PE，實驗室編號#SA1004-1。
方法制備細胞裂解液1)將所需要的和精確計算過的數(shù)目的細胞轉(zhuǎn)移到干凈的試管內(nèi)，并用PBS沖洗細胞兩次。對于融合蛋白的分析通常需要最少1×106個細胞。但是，如果預計MRD水平(異常融合蛋白水平)是非常低時，可能需要最多到50×106個細胞。
2)在期間，計算出制備細胞裂解液所需的RIPA-緩沖液的體積每500,000個細胞需要50μl RIPA-緩沖液。將RIPA-緩沖液轉(zhuǎn)移到15ml試管內(nèi)并加入50x濃縮的蛋白酶抑制劑雞尾酒(每1ml RIPA-緩沖液加入20μl蛋白酶抑制劑雞尾酒)。
3)將細胞碎片重懸在含有蛋白酶抑制劑的足夠多量的RIPA-緩沖液中(5×106/ml)，并將溶液轉(zhuǎn)移到干凈的eppendorf管中。
4)在冰上孵育30分鐘。
5)在10,000xg，4℃下離心10分鐘。
6)將上清液(細胞裂解物)轉(zhuǎn)移到干凈的eppendorf管中。
細胞裂解液的預清除7)往100μl細胞裂解液樣品中加入1×106個預清除珠；8)在冰上孵育30分鐘。
9)在10,000xg下旋轉(zhuǎn)3分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到新的eppendorf管中。
10)重復步驟9。
融合蛋白的檢測11)往一個試管內(nèi)加入●100μl預清除了的細胞裂解液樣品●10μl PBS+2％FCS中的10,000個捕獲珠●25μl PBS+2％FCS中的1-2μg綴合的檢測抗體12)在冰上孵育30分鐘13)用500μl PBS/2％FCS洗滌珠，并在14,000xg下旋轉(zhuǎn)1分鐘。去除上清液并重復該步驟。
當使用生物素標記的檢測抗體時，繼續(xù)步驟14-18。
當使用FITC標記的檢測抗體時，繼續(xù)步驟17和18。
14)將SA-PE在PBS/2％FCS中稀釋200倍，并珠重懸在每管20μl稀釋的SA-PE中。
15)在室溫下孵育10分鐘。
16)用500μl PBS/2％FCS洗滌珠，并在14,000xg下旋轉(zhuǎn)1分鐘。去除上清液并重復該步驟。
17)在第二次洗滌之后，將珠重懸在每管150μl PBS/2％FCS中，并將其轉(zhuǎn)移到FACS管中。
18)用流式細胞術(shù)測定珠上的標記的量。標記的量與細胞的最初數(shù)目的比率是MRD水平的測定值。
權(quán)利要求
1.一種用于測定樣品中的融合蛋白的方法，所述融合蛋白包括一個氨基末端片段和一個羧基末端片段，每個片段各自對應于一種天然蛋白，所述方法包括-將所述樣品與至少一種與所述天然蛋白的一部分特異性反應的結(jié)合分子在容許所述的至少一種結(jié)合分子與所述天然蛋白之間形成復合物的條件下相接觸，所述的天然蛋白的一部分不存在于所述融合蛋白中；-從所述的樣品中去除所述復合物，以清除所述樣品中的所述天然蛋白；和-利用至少一種針對所述融合蛋白的抗體檢測所述樣品中的所述融合蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的至少一種結(jié)合分子是一種抗體或在功能上與其等價的結(jié)合片段。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的至少一種結(jié)合分子與一種固體顆粒綴合，所述固體顆粒優(yōu)選地是一種珠。
4.權(quán)利要求3的方法，其中通過離心或通過磁性分離從所述樣品中去除所述復合物。
5.權(quán)利要求1到4中任一項的方法，其中利用一組至少第一和第二抗體檢測所述融合蛋白，每種抗體各自能夠識別位于所述融合蛋白的融合區(qū)域的相對側(cè)上的一個結(jié)合位點。
6.權(quán)利要求1到5中任一項的方法，其中至少一種抗體標記了熒光染料。
7.權(quán)利要求1到6中任一項的方法，其中至少一種抗體與珠結(jié)合。
8.權(quán)利要求1到7中任一項的方法，其中通過流式細胞術(shù)檢測所述融合蛋白。
9.前述的權(quán)利要求中任一項的方法，還包括在從所述樣品中去除所述復合物的步驟之后，利用至少一種能與所述復合物特異性結(jié)合的試劑檢測所述復合物，以及確定所述的至少一種試劑與所述復合物的結(jié)合以作為從所述樣品中清除的天然蛋白的量的指征。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述天然蛋白是一種高豐度蛋白或管家蛋白。
11.權(quán)利要求1到10中任一項的方法，其中所述融合蛋白包括一個氨基末端片段和一個羧基末端片段，每個片段各自對應于一種不同的非腫瘤特異性蛋白。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述融合蛋白是費城染色體畸變的結(jié)果。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述融合蛋白的氨基末端片段對應于ABL或BCR蛋白，而所述融合蛋白的羧基末端片段對應于BCR或ABL蛋白。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的至少一種結(jié)合分子與ABL或BCR蛋白的一個片段特異性反應，但不與所述融合蛋白特異性反應，所述的至少一種結(jié)合分子優(yōu)選地是一種抗體。
15.一種診斷試劑盒，其包括用于實施權(quán)利要求1到14中任一項的方法的一種結(jié)合分子和至少一種探針。
16.權(quán)利要求1到14中任一項的方法或權(quán)利要求15的診斷試劑盒在疾病的診斷和/或分類中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及對腫瘤特異性融合蛋白等的檢測。提供了一種用于檢測樣品中的融合蛋白的方法，所述融合蛋白包括一個氨基末端片段和一個羧基末端片段，每個片段各自對應于一種天然蛋白，所述方法包括將所述樣品與至少一種與該天然蛋白的一部分特異性反應的結(jié)合分子在容許所述的至少一種結(jié)合分子與該天然蛋白之間形成復合物的條件下相接觸，所述的天然蛋白的一部分不存在于所述融合蛋白中；從所述的樣品中去除所述復合物，以清除所述樣品中的所述天然蛋白，但不清除所述融合蛋白；和利用至少一種針對所述融合蛋白的抗體探針檢測所述樣品中的所述融合蛋白。也提供了用于實施本發(fā)明的方法的診斷試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK1836165SQ200480023036
公開日2006年9月20日 申請日期2004年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月12日
發(fā)明者弗蘭克·雅各布·特奧多爾·施塔爾, 雅各布斯·約翰內(nèi)斯·馬里亞·范東恩 申請人:鹿特丹伊拉斯姆斯大學醫(yī)療中心