專(zhuān)利名稱(chēng)：用于確定肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥的規(guī)程和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于確定肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HiT)的規(guī)程和裝置。
背景技術(shù)：
血液是將氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攜帶到各組織并帶走二氧化碳和各種排泄代謝產(chǎn)物的機(jī)體循環(huán)組織。全血包含淺黃或灰黃液體，即血漿，其中懸浮有紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和止血因子。
對(duì)于某些外科和內(nèi)科操作，以及時(shí)和有效的方式對(duì)患者血液的凝固和溶解(即止血)能力進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)是至關(guān)重要的?？焖?迅速)而準(zhǔn)確地檢測(cè)異常止血對(duì)于下述的適當(dāng)治療也是特別重要的，所述治療為對(duì)患有凝血病的患者的治療，以及需要對(duì)患者施用抗凝血?jiǎng)⒖估w維蛋白溶解劑、血栓溶解劑、抗血小板劑或血液成分的治療，所施用物質(zhì)的量的確切確定需要考慮到患者血液中的異常成分或“因子”和可能導(dǎo)致目前止血紊亂的以前止血治療。
止血是動(dòng)態(tài)的涉及許多相互作用因子的極端復(fù)雜的過(guò)程，所述相互作用因子包括凝固和纖維蛋白溶解蛋白、激活劑、抑制劑以及諸如血小板細(xì)胞骨架、血小板細(xì)胞質(zhì)顆粒和血小板細(xì)胞表層等細(xì)胞成分。因此，在激活過(guò)程中沒(méi)有靜止的或孤立工作的因子。凝固過(guò)程的起始是血小板聚集(圖1a)和酶促反應(yīng)的初始階段。凝固過(guò)程的最終結(jié)果是形成聚合的纖維蛋白(原)纖維的三維網(wǎng)絡(luò)，該聚合的纖維蛋白(原)的三維網(wǎng)絡(luò)與血小板糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)受體結(jié)合一起形成最終的凝塊(圖1b)。該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性質(zhì)是它表現(xiàn)為剛性彈性固體，能夠抗循環(huán)血液的變形剪切力。最終凝塊的抗變形剪切力的強(qiáng)度取決于纖維蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和密度以及參與其中的血小板所施加的作用力。
因此，作為激活凝固的結(jié)果而形成并粘附于受損的血管系統(tǒng)且抗循環(huán)血液的變形剪切力的凝塊，實(shí)質(zhì)上是一種為提供“臨時(shí)塞子”而形成的機(jī)械裝置，其在血管愈合過(guò)程中抗循環(huán)血液的剪切力。所述凝塊的動(dòng)力學(xué)、強(qiáng)度和穩(wěn)定性，即其抗循環(huán)血液的變形剪切力的物理性能，決定了該凝塊發(fā)揮止血作用的能力，其阻止出血而不會(huì)形成不當(dāng)?shù)难?。這正是準(zhǔn)備讓下述的血栓彈性描記器(Thrombelastograph)(TEG)止血分析系統(tǒng)所要進(jìn)行的工作，即，檢測(cè)初始纖維蛋白形成所需的時(shí)間、所述凝塊達(dá)到最大強(qiáng)度所需的時(shí)間、實(shí)際最大強(qiáng)度以及該凝塊的穩(wěn)定性。
自從Helmut Hartert教授于20世紀(jì)40年代在德國(guó)開(kāi)發(fā)出血液止血分析儀設(shè)備以后，這類(lèi)設(shè)備就已經(jīng)為人們所知。在共同轉(zhuǎn)讓的專(zhuān)利號(hào)為No.5,223,227和No.6,225,126的美國(guó)專(zhuān)利中記載了一種類(lèi)型的血液止血分析儀，在此通過(guò)參考的方式明確地引入所述專(zhuān)利所公開(kāi)的內(nèi)容。當(dāng)血液在類(lèi)似靜脈緩慢血流的低剪切環(huán)境下被誘導(dǎo)凝塊時(shí)，用該設(shè)備(TEG止血分析系統(tǒng))來(lái)檢測(cè)血液的彈性。形成中的凝塊的剪切彈性的變化模式使確定凝塊形成的動(dòng)力學(xué)以及所形成的凝塊的強(qiáng)度和穩(wěn)定性成為可能；簡(jiǎn)而言之，使確定形成中的凝塊的機(jī)械性能成為可能。如上所述，凝塊的動(dòng)力學(xué)、強(qiáng)度和穩(wěn)定性提供了有關(guān)凝塊完成“機(jī)械工作”能力的信息，所述機(jī)械工作即抗循環(huán)血液的變形剪切力；實(shí)質(zhì)上，凝塊是止血的基本結(jié)構(gòu)，TEG止血分析系統(tǒng)可以檢測(cè)凝塊在其結(jié)構(gòu)形成整個(gè)過(guò)程中執(zhí)行機(jī)械工作的能力。TEG止血分析系統(tǒng)以非孤立或靜止的方式，從檢測(cè)起始的時(shí)間到初始纖維蛋白形成，經(jīng)由凝塊速度加快階段和通過(guò)借助血小板GPIIb/IIIa受體的纖維蛋白血小板結(jié)合的最終凝塊強(qiáng)度以及凝塊溶解，以全血成分的凈產(chǎn)物形式連續(xù)檢測(cè)患者止血的全部階段。
肝素是最廣泛使用的抗凝血?jiǎng)┨幏剿幹徊⑶乙呀?jīng)非常成功。但是，肝素也有一些潛在的不利影響。和任何其它抗凝血?jiǎng)┮粯?，也存在出血的危險(xiǎn)。肝素還與骨質(zhì)疏松癥、皮膚反應(yīng)和稱(chēng)為肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HiT)的疾病的危險(xiǎn)性增加有關(guān)。
經(jīng)觀測(cè)，HiT以?xún)煞N形式發(fā)生。第一種即I型或非免疫HiT(HiTI)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于接受全劑量靜脈內(nèi)的未分餾肝素的患者中。HiT I中由肝素誘導(dǎo)的血小板計(jì)數(shù)的下降是暫時(shí)性的，即使繼續(xù)進(jìn)行肝素療法，也不會(huì)產(chǎn)生任何不利的影響，并且所述血小板計(jì)數(shù)的下降在肝素可溶解的范圍內(nèi)是自我限制性的。這主要是肝素直接與血小板結(jié)合的結(jié)果。
II型或免疫介導(dǎo)的HiT(HiT II)是抗原-抗體反應(yīng)的結(jié)果。在HiT II中，由于患者的血液頻繁地接觸肝素，因此可以形成肝素誘導(dǎo)的抗體。肝素和血小板因子4(PF4)具有很高的親和性。PF4一旦與肝素分子結(jié)合，就會(huì)暴露出抗原決定簇，該抗原決定簇引發(fā)免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生免疫球蛋白G(IGH)。
IGH抗體通過(guò)Fc片段結(jié)合到抗原和血小板上。相鄰的Fc受體在血小板膜上的占據(jù)引起血小板的劇烈激活，導(dǎo)致血小板數(shù)下降(血小板減少癥)和白色凝塊血栓形式的血栓癥，從而引起高風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)病率和死亡率。
此處肝素-PF4-IGH稱(chēng)為HiT II復(fù)合物。
用于HiT II的實(shí)驗(yàn)室診斷的測(cè)定主要有兩類(lèi)激活(功能性)測(cè)定和抗原測(cè)定。功能性測(cè)定包括血小板聚集測(cè)定和5-羥色胺釋放測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的血小板聚集測(cè)定具有超過(guò)90％的特異性。缺點(diǎn)是靈敏度低，低于35％，即相對(duì)較高的假陰性概率。
5-羥色胺釋放測(cè)定檢測(cè)5-羥色胺從血小板聚集體的釋放。其依賴(lài)于在存在肝素的情況下來(lái)自患者的血小板的聚集。該測(cè)定具有高靈敏度和高特異性。缺點(diǎn)是該測(cè)定技術(shù)上要求高并涉及放射性物質(zhì)的使用。在各種可行的功能性測(cè)定中，據(jù)認(rèn)為采用洗滌血小板的血小板聚集反應(yīng)和血小板5-羥色胺釋放是最準(zhǔn)確的。
另一類(lèi)測(cè)定是抗原測(cè)定。肝素-PF4酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)依賴(lài)于HiT IGH抗體對(duì)肝素-PF4復(fù)合物的特異性。對(duì)于檢測(cè)肝素誘導(dǎo)的抗體，所述測(cè)定比5-羥色胺釋放測(cè)定靈敏10倍。但是，肝素-PF4ELISA費(fèi)用高而且耗時(shí)。該測(cè)定還比功能性測(cè)定更容易對(duì)臨床上非顯著性抗體產(chǎn)生反應(yīng)，因此具有較低的特異性，即相對(duì)較高的假陽(yáng)性。
因此，大部分用于HiT II診斷的可行的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)費(fèi)用高、耗時(shí)、經(jīng)常自相矛盾而且在靈敏度和特異性上不穩(wěn)定。
由于用額外的肝素或血小板治療HiT II患者存在相關(guān)的發(fā)病率和死亡率風(fēng)險(xiǎn)，因此在懷疑是HiT II時(shí)臨床醫(yī)生必須經(jīng)常不必要地轉(zhuǎn)而推薦使用另外一種抗凝血?jiǎng)﹣?lái)代替肝素。然而，其它物質(zhì)所需的費(fèi)用更高，并且難以或不可能檢測(cè)抗凝血程度以給病人正確用藥來(lái)防止缺血性事件。這些抗凝血?jiǎng)┻€缺乏使它們的抗凝血作用逆轉(zhuǎn)的必要物質(zhì)，這可能導(dǎo)致無(wú)法控制手術(shù)后的出血。
因此，需要用于確定肝素誘導(dǎo)的血小板缺少癥的方法和裝置。


圖1a是表示血小板聚集機(jī)制的圖示。
圖1b是表示纖維蛋白/血小板網(wǎng)絡(luò)的圖示。
圖2是根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的止血分析儀的示意圖。
圖3是說(shuō)明由圖2所示的止血分析儀產(chǎn)生的止血概況的圖。
圖4是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的止血分析儀的示意圖。
圖5是說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的規(guī)程和裝置獲得的幾種止血概況。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，采用止血分析儀(例如可由Haemoscope Corp.，Niles，Illinois獲得的血栓彈性描記器(TEG)止血分析儀)連續(xù)實(shí)時(shí)地檢測(cè)從初始纖維蛋白形成，經(jīng)由血小板-纖維蛋白GPIIb/IIIa結(jié)合和溶解的止血過(guò)程。雖然為確定患者是否具有肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HiT)而對(duì)具體規(guī)程和裝置進(jìn)行討論，但是應(yīng)該理解，本發(fā)明在與HiT有關(guān)或無(wú)關(guān)的其它診斷技術(shù)方面具有實(shí)用性。
根據(jù)本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的規(guī)程采用止血分析儀利用患者全血或利用正常供血者富含血小板的血漿(PRP)與HiT II疑似患者的血漿的混合物，可以確定HiT II的發(fā)病初起。全血檢測(cè)規(guī)程提供現(xiàn)場(chǎng)醫(yī)護(hù)檢測(cè)能力，而PRP-患者血漿混合物規(guī)程提供實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力。兩種規(guī)程都依賴(lài)于對(duì)止血分析儀所測(cè)定的血液凝塊的一種或多種物理特征進(jìn)行檢測(cè)。這些特征包括凝塊的強(qiáng)度或彈性、最初凝塊形成的時(shí)間、凝塊形成的速度或強(qiáng)化、凝塊溶解的速度等。根據(jù)所采用的特定規(guī)程制備的數(shù)個(gè)樣品可以在一個(gè)或多個(gè)止血分析儀檢測(cè)站進(jìn)行檢測(cè)。
止血分析儀10(例如上述提及的血栓彈性描記器(TEG)止血分析儀)可以用來(lái)檢測(cè)患者血樣檢測(cè)過(guò)程中形成的凝塊的物理特性。術(shù)語(yǔ)患者血樣在全文中使用，并且可以互換地稱(chēng)為患者全血樣品，PRP-患者血漿混合物或其它適當(dāng)?shù)幕颊哐獦?。示例性的止血分析儀10在前述的美國(guó)專(zhuān)利6,225,126中有詳細(xì)的描述，在此不再重復(fù)討論。但為了有助于理解本發(fā)明，參照?qǐng)D2對(duì)血液止血儀10進(jìn)行了簡(jiǎn)要說(shuō)明。所述止血分析儀使用裝有血樣13的特殊的穩(wěn)定的圓柱形杯12。杯12與驅(qū)動(dòng)機(jī)械裝置連接，該裝置使杯以角度θ振蕩，優(yōu)選的角度約為4°45′。每一旋轉(zhuǎn)周期為10秒鐘。將軸(pin)14通過(guò)扭力絲15懸掛在血樣13中，并監(jiān)測(cè)軸14的運(yùn)動(dòng)。只有在纖維蛋白-血小板結(jié)合使杯12和軸14連接在一起之后，旋轉(zhuǎn)的杯12的扭矩才被傳送到所浸沒(méi)的軸14。纖維蛋白-血小板結(jié)合的強(qiáng)度影響軸運(yùn)動(dòng)的幅度，所以，牢固的凝塊直接帶動(dòng)軸14與杯進(jìn)行同相運(yùn)動(dòng)。因而，輸出的幅度與所形成的凝塊的強(qiáng)度直接相關(guān)。隨著凝塊的縮小或溶解，這種結(jié)合受到破壞，并且杯子運(yùn)動(dòng)的傳遞也減小了。
軸14的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)通過(guò)傳感器16轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，該電信號(hào)可以通過(guò)包括處理器和控制程序的計(jì)算機(jī)(未在圖2中示出)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
計(jì)算機(jī)可對(duì)電子信號(hào)進(jìn)行操作，以建立與被檢測(cè)的凝血過(guò)程相對(duì)應(yīng)的止血概況。此外，計(jì)算機(jī)可以包括可視顯示器或連接到打印機(jī)上，以提供止血概況的可視性顯示。這種計(jì)算機(jī)的配置完全處于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。
如還將進(jìn)行描述的，根據(jù)對(duì)止血概況所進(jìn)行的估測(cè)，計(jì)算機(jī)通過(guò)其控制程序可以適用于提供治療建議。如圖3所示，結(jié)果得到的止血概況20是對(duì)形成第一條血纖維蛋白鏈所需的時(shí)間、凝塊形成動(dòng)力學(xué)、凝塊的強(qiáng)度(以毫米(mm)為單位進(jìn)行測(cè)定，并轉(zhuǎn)換為剪切彈性單位dyn/cm2(達(dá)因/平方厘米))以及凝塊的溶解所進(jìn)行的測(cè)量。下表I提供了幾個(gè)這些所測(cè)量的參數(shù)的定義。
表I

在臨床上，這些檢測(cè)為下述監(jiān)測(cè)提供媒介提供監(jiān)測(cè)抗凝療法(例如肝素或華法令)、血栓溶解療法(例如tPA、鏈激酶、尿激酶)、抗纖維蛋白溶解劑(例如ε-氨基己酸(Amicar)、特斯樂(lè)(抑肽酶)、氨甲環(huán)酸(TX))的作用、抗血小板劑(例如阿昔單抗(ReoPro)、依替巴肽(Integrilin)、替羅非班(Aggrastat))的作用、血液成分輸血療法、在癌癥和感染中血栓形成危險(xiǎn)性估測(cè)、高風(fēng)險(xiǎn)手術(shù)和其它可能導(dǎo)致過(guò)度凝血(凝固性過(guò)高的疾病)或過(guò)度出血(凝固性過(guò)低的疾病)。然后根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案，可將止血分析儀10用于檢測(cè)藥物治療的臨床效果以阻止纖維蛋白溶解，或用于檢測(cè)血栓溶解藥物的效果以監(jiān)測(cè)血栓溶解，或用于檢測(cè)抗血小板劑的效果以監(jiān)測(cè)血小板抑制、缺血性或出血性并發(fā)癥。
在定量上，止血分析儀10和所連的計(jì)算機(jī)繪出凝塊強(qiáng)度相對(duì)于時(shí)間的圖，其中標(biāo)示出凝塊形成的初起、反應(yīng)時(shí)間(R)(圖3)。該圖還顯示出血樣的最大凝塊強(qiáng)度(或硬度)MA。MA是對(duì)血小板-纖維蛋白GPIIb/IIIa結(jié)合的總體估算，其用于例如指導(dǎo)手術(shù)后血液的血小板或纖維蛋白原更換療法。僅就血小板和纖維蛋白而言，異常低的MA指示血液中的血液血小板異常(即數(shù)量性或功能性缺陷)和/或纖維蛋白原含量異常。但是，通過(guò)保持纖維蛋白原水平和血小板數(shù)量恒定，MA的任何變化都反映血小板功能的變化。因此，升高的MA值反映較高的血小板功能，而較低的MA反映較低的血小板功能，當(dāng)血小板功能降低至血小板活性為零的限度時(shí)，則MA只受到纖維蛋白的影響。但是缺乏任何其它血小板激活劑/激動(dòng)劑時(shí)，HiT II復(fù)合物的存在激活血小板，使MA值高出纖維蛋白的MA值。因此，如上所述，為了對(duì)HiT II進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)，可以采用以下程序1.TEG-5000，如其通常用途那樣，測(cè)定由凝血酶激活的血小板功能物(platelet function)(MA)，所述凝血酶是直接激活GPIIb/IIIa受體位點(diǎn)的最有效的血小板激活劑。為了使MA對(duì)血小板功能物(血小板功能物諸如HiT II復(fù)合物)的低激活敏感，應(yīng)當(dāng)抑制凝血酶。因此，當(dāng)在TEG止血分析儀上分析血樣時(shí)，用凝血酶的直接抑制劑例如PPACK(苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸氯甲基酮)抑制凝血酶的形成。
2.遺憾的是，凝血酶還參與激活纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)化。在步驟1中抑制凝血酶的形成以后，需要用另外一種酶來(lái)激活纖維蛋白原。唯一功能為激活纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化的蛇毒凝血酶(矛頭蝮蛇毒酶)是適宜的酶。此時(shí)凝塊被蛇毒凝血酶(纖維蛋白原激活劑)和諸如HiT II復(fù)合物等較弱的血小板激動(dòng)劑所激活。如上所述，通過(guò)MA檢測(cè)凝塊的強(qiáng)度。
3.通過(guò)纖維蛋白原激活劑如蛇毒凝血酶和由HiT II復(fù)合物導(dǎo)致的血小板激活而形成的凝塊通常比通過(guò)凝血酶所形成的凝塊弱。因此，可以加入激活的因子X(jué)III(因子X(jué)IIIa)。因子IIIa導(dǎo)致稱(chēng)為纖維蛋白交聯(lián)的由氫鍵到更強(qiáng)的共價(jià)鍵的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，由此進(jìn)一步增強(qiáng)了纖維蛋白凝塊的強(qiáng)度。
基于以上所述，可以實(shí)施以下規(guī)程。
參考圖4和圖5，描述采用止血分析儀確定HiT II的規(guī)程。圖4說(shuō)明止血分析儀10′的4個(gè)檢測(cè)站10a、10b、10c和10d。各檢測(cè)站可以與結(jié)合圖2進(jìn)行描述的站10基本上相同，或可以是另外一種配置。所述檢測(cè)站還可以是分開(kāi)的檢測(cè)裝置的一部分，例如，可以是4個(gè)信號(hào)站設(shè)備、兩個(gè)雙站設(shè)備、一個(gè)四站設(shè)備等。配置各檢測(cè)站，以檢測(cè)相應(yīng)的血樣并提供血樣的特征。例如，可以配置各檢測(cè)站，以提供各血樣的參數(shù)R、α、MA和LY 30。第一個(gè)血樣13a可以是基線樣品。第二個(gè)樣品13b和第三個(gè)樣品13c可以加有不同量的肝素。第四個(gè)樣品13d可以經(jīng)制備以基本上完全抑制血小板激活。例如，這可以通過(guò)使樣品中包含足夠的大量肝素而實(shí)現(xiàn)。檢測(cè)各個(gè)樣品并報(bào)道各個(gè)樣品的MA。第一個(gè)樣品13a的MA代表基本沒(méi)有血小板激活時(shí)纖維蛋白對(duì)凝塊強(qiáng)度的作用，即MAFIB。如果樣品13d中的血小板激活幾乎受到完全抑制，該樣品的MA應(yīng)該極為近似于MAFIB。在存在HiT抗體時(shí)，將存在一些血小板-血小板聚集，導(dǎo)致比單獨(dú)的纖維蛋白作用時(shí)的MA(即MAFIB)大的MA。因此，如果測(cè)定的樣品13b和樣品13c的MA大于MAFIB，例如約大1.5倍～3倍，表明是HiT II。
根據(jù)前文，對(duì)以下規(guī)程進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采用混有HiT II患者檸檬酸鹽化血漿的正常供血者富含血小板的血漿來(lái)測(cè)定HiT II抽取正常供血者全血，并將其轉(zhuǎn)移到塑料離心管中，相對(duì)于每1ml血液所述離心管中裝有5μl～15μl的PPACK。正常供血者的血小板計(jì)數(shù)應(yīng)該大于150,000/μl，并且未服用NSAIDS(非甾體抗炎藥)或其它血小板抑制劑。對(duì)于典型的檢測(cè)，抽取12ml的血液并加到含有約180μl的PPACK的管中，將所述管蓋上蓋子并顛倒混合幾次，例如3次。在100g將該樣品離心20分鐘(對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的IEC臺(tái)式離心機(jī)，轉(zhuǎn)速為800RPM(轉(zhuǎn)/分鐘))，以將富含血小板的血漿(PRP)和其它血細(xì)胞分離。這一程序?qū)@得足夠用于3～4次待測(cè)混合物的PRP，過(guò)量的PRP可以在-35℃～-70℃貯藏到測(cè)定。
制備PRP-患者血漿混合物。采用標(biāo)準(zhǔn)程序從貯藏在-30℃～-70℃的檸檬酸鹽化全血中分離患者血漿。以約2∶1的比例將正常的PRP加入到融化的室溫下的患者血漿中，例如，將約1.6ml～1.2ml的PRP加入到約0.8ml～0.6ml待測(cè)患者血漿中，并充分混合。這一程序只用于檸檬酸鹽化血漿，不用于血清或收集到其它抗凝血?jiǎng)┲械难獫{，也不用于HiT患者全血。
準(zhǔn)備好用于檢測(cè)的四個(gè)樣品容器。向第一個(gè)樣品容器中加入5μl的鹽水。向第二個(gè)樣品容器中加入5μl的1U/ml(單位/毫升)的肝素。向第三個(gè)樣品容器中加入5μl的3U/ml的肝素。向第四個(gè)樣品容器中加入5μl的30U/ml的肝素。所述肝素可以使用預(yù)包裝管/小瓶以適當(dāng)濃度來(lái)提供。例如，可以提供含有各種量的肝素的HiT1、HiT3和HiT30小瓶。
向各樣品容器中加入350μl的PRP-患者血漿混合物并混合，例如用移液管混合3次。如果按以上順序進(jìn)行，可以使用一個(gè)移液管。在37℃溫育除了第一個(gè)容器中的樣品之外的其它樣品至少10分鐘。如果使用TEG止血分析儀，可以將杯子滑到檢測(cè)位置以進(jìn)行慢慢混合和避免蒸發(fā)。特別是如果不采用非TEG止血分析儀，可以采用進(jìn)行混合和避免蒸發(fā)的其它技術(shù)。
為了測(cè)定，向各樣品容器中加入約10μl的激活劑并立即混合，例如與另外一個(gè)移液管的350μl的PRP-患者血漿混合物混合3次。然后將樣品容器迅速移到檢測(cè)位置并開(kāi)始進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)應(yīng)該在加入所述激活劑后30秒內(nèi)開(kāi)始。激活劑可以是Reptilase與FXIIIa的組合或Reptilase、FXIIIa和腎上腺素的組合。一旦向各容器中加入μl的PRP-患者血漿混合物和10μl的激活劑，第一個(gè)容器將不含有加入的肝素，第二個(gè)容器將含有1U/ml的肝素，第三個(gè)容器將含有3U/ml的肝素，而第四個(gè)容器將含有30U/ml的肝素。
繼續(xù)檢測(cè)直到獲得穩(wěn)定的最大幅度。所預(yù)期的HiT II呈陽(yáng)性的結(jié)果為分別含有1U/ml肝素或3U/ml肝素的第二個(gè)樣品或第三個(gè)樣品將獲得大于樣品1的MA的MA反應(yīng)。例如，第二或第三個(gè)樣品的MA應(yīng)比樣品1的MA約大1.5倍～3倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用TEG止血分析儀參數(shù)MA，所預(yù)期的MA2和/或MA3大于10mm，比MA1或MA4大2倍。這可以表示為MA2和/或MA32×＞MA1≈MA4這是HiT II呈陽(yáng)性的表示。由于將優(yōu)勢(shì)量的肝素加入樣品中，血小板基本上受到完全抑制，所以含有30U/ml肝素的樣品4的MA與樣品1的MA看上去基本相等。
實(shí)施例2采用患者全血來(lái)測(cè)定HiT II將3ml的HiT II可疑患者全血樣品抽到塑料管中，相對(duì)于每1ml血液，該塑料管裝有約5μl的5mg/ml的PPACK?；颊叩难“逵?jì)數(shù)應(yīng)該大于50,000/μl。另外，患者不應(yīng)服用諸如Reopro、Integrilin和Aggrestat等GPIIb/IIIa抑制劑藥物或掩蔽由HiT II抗體復(fù)合物引起的血小板激活的其它藥物。
對(duì)于典型的檢測(cè)，將6ml的患者血液抽入裝有30μl的PPACK的塑料管中并混合。這提供足夠用于測(cè)定的血樣，并提供足夠用于分離血漿的剩余血樣以如上述實(shí)施例1所述與正常供血者血液用于確認(rèn)檢測(cè)，尤其是如果患者的血小板計(jì)數(shù)小于50,000/μl。
準(zhǔn)備好用于檢測(cè)的四個(gè)樣品容器。向第一個(gè)樣品容器中加入5μl的鹽水。向第二個(gè)樣品容器中加入5μl的1U/ml的肝素。向第三個(gè)樣品容器中加入5μl的3U/ml的肝素。向第四個(gè)樣品容器中加入5μl的30U/ml的肝素。所述肝素可以使用預(yù)包裝管/小瓶以適當(dāng)濃度來(lái)提供。例如，可以提供含有各種量的肝素的HiT1、HiT3和HiT30小瓶。
向各樣品容器中加入350μl的抗凝全血并混合，例如用移液管混合3次。如果按以上順序進(jìn)行，可以使用一個(gè)移液管來(lái)進(jìn)行添加和混合。在37℃溫育除了第一個(gè)容器中的樣品之外的其它樣品至少10分鐘。如果使用TEG止血分析儀，可以將杯子滑到檢測(cè)位置以進(jìn)行慢慢混合并避免蒸發(fā)。可以采用進(jìn)行混合和避免蒸發(fā)的其它技術(shù)。
為了測(cè)定，向各樣品容器中加入10μl的激活劑并立即混合，例如與另外一個(gè)移液管的350μl的HiT II可疑患者全血混合3次。然后將樣品容器迅速移到檢測(cè)位置并開(kāi)始進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)應(yīng)該在加入所述激活劑后30秒內(nèi)開(kāi)始。激活劑可以是Reptilase與FXIIIa的組合或Reptilase、FXIIIa和腎上腺素的組合。一旦向各容器中加入HiT II可疑患者全血和10μl的激活劑，第一個(gè)容器將不含有加入的肝素，第二個(gè)容器將含有1U/ml的肝素，第三個(gè)容器將含有3U/ml的肝素，而第四個(gè)容器將含有30U/ml的肝素。
繼續(xù)檢測(cè)直到獲得穩(wěn)定的最大幅度。所預(yù)期的HiT II呈陽(yáng)性結(jié)果為分別含有1U/ml肝素或3U/ml肝素的第二個(gè)樣品或第三個(gè)樣品將獲得比樣品1的MA大的MA反應(yīng)。例如，第二或第三個(gè)樣品的MA應(yīng)比樣品1的MA約大1.5倍～3倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用TEG止血分析儀參數(shù)MA，所預(yù)期的MA2和/或MA3大于10mm，比MA1或MA4大2倍。這可以表示為MA2和/或MA32×＞MA1≈MA4這是HiT II呈陽(yáng)性的表示。由于將優(yōu)勢(shì)量的肝素加入樣品中，血小板基本上受到完全抑制，含有30U/ml肝素的樣品4的MA與樣品1的MA看上去基本相等?；颊叩娜獧z測(cè)規(guī)程有利于提供HiT II的現(xiàn)場(chǎng)醫(yī)護(hù)確定。
利用TEG止血分析儀所得的結(jié)果并參考參數(shù)MA，在圖5a中對(duì)HiTII的陽(yáng)性指示進(jìn)行說(shuō)明。跡線22代表MA1而跡線24代表MA4，兩者基本上都低于10mm，處于2mm～5mm的級(jí)別。跡線26代表MA2而跡線28代表MA3，兩者基本上都大于10mm，分別處于15mm和40mm的級(jí)別。因此，MA2和MA3大于10mm，并且都比MA1或MA4大2倍，這基本上等同于提供HiT II的陽(yáng)性指示。
圖5b說(shuō)明沒(méi)有HiT II。跡線30代表MA1而跡線32代表MA4，兩者基本上都低于10mm，處于2mm～5mm的級(jí)別。跡線34代表MA2而跡線46代表MA3，兩者基本上也都小于10mm，并處于2～5的級(jí)別。因此，MA2和MA3都低于10mm，并且都約等于MA1或MA4，這提供了HiT II的陰性指示。
可以制備測(cè)定試劑盒。所述試劑盒可包括多個(gè)檢測(cè)容器、一定量的肝素和一定量的激活劑。各檢測(cè)容器經(jīng)配置以盛裝用于在血液止血分析儀中檢測(cè)的血樣。例如，對(duì)于TEG止血分析儀，檢測(cè)容器為杯12，并提供4個(gè)杯。對(duì)于其它類(lèi)型的檢測(cè)裝置，可以使用不同的容器。肝素的量應(yīng)當(dāng)足以制備檢測(cè)所需的肝素化血樣。但是，所述試劑盒可以包括如上所述用于測(cè)定的適當(dāng)濃度的肝素的3個(gè)分開(kāi)的管/小瓶。足以激活血樣的一定量的激活劑也包含在分開(kāi)的管/小瓶中。所述試劑盒還可以包括裝在管/或小瓶中的一定量的PPACK。可以對(duì)所述管/小瓶標(biāo)進(jìn)行色碼標(biāo)記、數(shù)字標(biāo)記或其它標(biāo)記。所述試劑盒可以是分開(kāi)的以便于貯藏。例如，可以將5mg的PPACK裝在小瓶中來(lái)提供。然后用1ml的鹽水復(fù)原。復(fù)原后的PPACK應(yīng)貯藏在0～-4℃，并在數(shù)月內(nèi)保持穩(wěn)定。從試劑盒中取出所需量，而將剩余物返回貯藏。
未開(kāi)啟的肝素儲(chǔ)存品，例如上述裝有1U/ml、3U/ml和30U/ml肝素的小瓶，可以貯藏在0～-4℃，并在數(shù)月內(nèi)保持穩(wěn)定。打開(kāi)過(guò)的管應(yīng)當(dāng)在打開(kāi)后一個(gè)星期內(nèi)丟棄。
未開(kāi)啟的包含約1.8ml激活劑的激活劑小瓶應(yīng)當(dāng)以貯藏在-70℃，并在數(shù)周內(nèi)保持穩(wěn)定。開(kāi)啟過(guò)的儲(chǔ)存品應(yīng)當(dāng)在開(kāi)啟后8小時(shí)內(nèi)丟棄。因此，可以對(duì)各小瓶進(jìn)行定量，以提供僅夠每4個(gè)樣品使用的激活劑。激活劑在使用前應(yīng)當(dāng)融化到室溫。
激活劑成分還可以在儲(chǔ)存品小瓶中提供，從所述小瓶中制備激活劑以進(jìn)行測(cè)定。例如，可以從所提供的儲(chǔ)存品小瓶中抽取例如其量為180μl的激活劑到管中。根據(jù)測(cè)定的類(lèi)型，可加入另外的成分。例如，對(duì)于正常供血者加檸檬酸鹽化患者血漿檢測(cè)(上述實(shí)施例1)，20μl的2M CaCl2可以與10μl的1mM腎上腺素一起添加。對(duì)于全血檢測(cè)(上述實(shí)施例2)，20μl的鹽水可以與10μl 1mM的腎上腺素一起添加?？梢允褂闷渌募せ顒?，這取決于激活劑成分的可獲得性和所進(jìn)行檢測(cè)的類(lèi)型。
已在幾個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案和實(shí)施例方面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明可以具有其它具體體現(xiàn)而不脫離本發(fā)明的適當(dāng)范圍，所述適當(dāng)?shù)姆秶峁┰谒降臋?quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種確定肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥II復(fù)合物(HiT II)的方法，該方法包括在存在肝素時(shí)檢測(cè)第一血樣以確定第一血樣的特征；在不存在實(shí)質(zhì)性血小板激活時(shí)檢測(cè)第二血樣以確定第二血樣的特征；和將所述第一血樣的特征與所述第二血樣的特征進(jìn)行比較以確定HiTII的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一血樣的特征包括對(duì)第一血樣所測(cè)定的凝塊強(qiáng)度、所測(cè)定的凝塊彈性、所測(cè)定的凝塊形成速度、所測(cè)定的凝塊形成時(shí)間和所測(cè)定的凝塊溶解速度中的至少一個(gè)，而所述第二血樣的特征包括對(duì)第二血樣所測(cè)定的凝塊強(qiáng)度、所測(cè)定的凝塊彈性、所測(cè)定的凝塊形成速度、所測(cè)定的凝塊形成時(shí)間和所測(cè)定的凝塊溶解速度中的至少一個(gè)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第二血樣的特征代表纖維蛋白對(duì)止血的作用。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述檢測(cè)第二血樣的步驟包括檢測(cè)經(jīng)配制以激活纖維蛋白形成的第二血樣。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述檢測(cè)第二血樣的步驟包括檢測(cè)經(jīng)配制以基本上完全抑制血小板激活的血樣。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述檢測(cè)第二血樣的步驟包括檢測(cè)用一定量的肝素進(jìn)行配制的血樣，所述一定量的肝素足以基本上完全抑制血小板激活。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一血樣的特征代表在存在HiT II時(shí)激活的血小板對(duì)止血的作用。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述檢測(cè)第一血樣的步驟包括檢測(cè)用第一量的肝素進(jìn)行配制的第一肝素化血樣和用第二量的肝素進(jìn)行配制的第二肝素化血樣，所述肝素的第二量與所述肝素的第一量不同。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一血樣和所述第二血樣各自包含富含血小板血漿(PRP)-患者血漿的混合物。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一血樣和所述第二血樣各自包含患者的全血。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一血樣和所述第二血樣各自包含激活劑。
12.一種用于確定肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥II復(fù)合物(HiT II)的裝置，該裝置包括用于在存在肝素時(shí)檢測(cè)第一血樣以確定第一血樣的特征的單元；用于在不存在實(shí)質(zhì)性血小板激活時(shí)檢測(cè)第二血樣以確定第二血樣的特征的單元；和用于將所述第一血樣的特征與所述第二血樣的特征進(jìn)行比較以確定HiT II的存在的單元。
13.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第一血樣的特征包括對(duì)第一血樣所測(cè)定的凝塊強(qiáng)度、所測(cè)定的凝塊彈性、所測(cè)定的凝塊形成速度、所測(cè)定的凝塊形成時(shí)間和所測(cè)定的凝塊溶解速度中的至少一個(gè)，而所述第二血樣的特征包括對(duì)第二血樣所測(cè)定的凝塊強(qiáng)度、所測(cè)定的凝塊彈性、所測(cè)定的凝塊形成速度、所測(cè)定的凝塊形成時(shí)間和所測(cè)定的凝塊溶解速度中的至少一個(gè)。
14.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第二血樣的特征代表纖維蛋白對(duì)止血的作用。
15.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第二血樣包含未用肝素進(jìn)行配制的血樣。
16.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第二血樣包含經(jīng)配制以基本上完全抑制血小板激活的血樣。
17.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第二血樣包含用一定量的肝素進(jìn)行配制的血樣，所述一定量的肝素足以基本上完全抑制血小板激活。
18.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第一血樣的特征代表在存在HiT II時(shí)激活的血小板對(duì)止血的作用。
19.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第一血樣包含用第一量的肝素進(jìn)行配制的第一肝素化血樣和用第二量的肝素進(jìn)行配制的第二肝素化血樣，所述肝素的第二量與所述肝素的第一量不同。
20.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第一血樣和所述第二血樣各自包含富含血小板血漿(PRP)-患者血漿的混合物。
21.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第一血樣和所述第二血樣各自包含患者的全血。
22.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述第一血樣和所述第二血樣各自包含激活劑。
23.與血液止血分析儀一起使用的試劑盒，該試劑盒用于確定肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥II復(fù)合物(HiT II)，該試劑盒包括多個(gè)檢測(cè)容器，各檢測(cè)容器經(jīng)配置以盛裝用于在血液止血分析儀中進(jìn)行檢測(cè)的血樣；一定量的肝素，其足以配制至少一個(gè)檢測(cè)用的肝素化血樣；和一定量的激活劑，其足以至少激活所述肝素化血樣和非肝素化的血樣。
24.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，該試劑盒還包括一定量的PPACK，該一定量的PPACK足以配制至少兩個(gè)檢測(cè)用血樣。
25.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，所述肝素的量足以配制至少一個(gè)檢測(cè)用的肝素化血樣和第二樣品，其中所述第二樣品用一定量的肝素進(jìn)行配制，該一定量的肝素足以基本上完全抑制血小板激活。
26.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，所述量的肝素被分裝入與待配制的用于檢測(cè)的多個(gè)各血樣相對(duì)應(yīng)的多個(gè)小瓶中。
27.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中，所述量的肝素和所述量的激活劑是分開(kāi)包裝的。
全文摘要
本發(fā)明采用諸如血栓彈性描記器
文檔編號(hào)G01N33/86GK1853104SQ200480026511
公開(kāi)日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2004年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月5日
發(fā)明者伊萊·科恩, 羅斯林·科恩, 羅杰·C·卡羅爾 申請(qǐng)人:?？娝緲?gòu)普公司