專利名稱：：受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及已知受體的新功能。具體地，本發(fā)明涉及鞘氨醇磷脂酰膽堿(sphingosylphosphorylcholine)受體和/或其配體在操縱邊緣系統(tǒng)中的用途。編碼GPR12的Annie位于人染色體13q12上。GPR12cDNA長度為1005bp。其首先由Songetal(Genomics，1995，28，347-349)公開。最初，認為它是鞘氨醇1-磷酸的受體(Uhlenbrock，K.etal.CellularSignalling2002，14941-953)。最近，其被去-孤化(de-orphanised)并顯示為鞘氨醇磷脂酰膽堿(sphingosylphosphorylcholine)(SPC)的受體(Ignatov，.etal.2003，J.Neurosci.23，(2)907-914)。SPC的多種細胞效應(yīng)可通過與S1P-EDG受體的低親和力結(jié)合以及活化來解釋。然而，SPC的一些細胞和亞細胞作用是S1P不具有的，其也在正常血漿、腹水、各種組織中鑒定，是脂質(zhì)介導(dǎo)物。現(xiàn)在認識到鞘磷脂分解產(chǎn)物在細胞信號中顯示雙重作用，作為細胞內(nèi)以及細胞外信號分子起作用。已經(jīng)顯示G蛋白偶聯(lián)的受體對鞘氨醇1-磷酸和鞘氨醇磷脂酰膽堿具有高親和力，鞘磷脂具有多種功能，包括調(diào)節(jié)心率，氧化爆發(fā)(oxidativeburst)，神經(jīng)突縮回(neuriteretraction)，傷口愈合(有絲分裂發(fā)生效應(yīng)(mitogeniceffect))和血小板活化。鞘氨醇-1磷酸(S1P)是有效的細胞外溶血磷脂磷酸介導(dǎo)物，其在例如血小板聚集過程中釋放。S1P通過多種刺激誘導(dǎo)，例如生長因子，細胞因子，GPCR激動劑，抗原等。S1P受體信號途徑與轉(zhuǎn)錄因子活化、細胞骨架蛋白，粘附分子表達等有關(guān)。因此，S1P可影響多種生物反應(yīng)，包括有絲分裂發(fā)生，分化，增殖，遷移和凋亡等。此外，S1P在鈣動員中起作用。Edg1，3和5與細胞增殖，血管生成和細胞遷移相關(guān)。(Edg8最接近Edg5，序列同源性為40％)。Edg4是卵巢癌細胞的標(biāo)記物。S1P與乳腺癌有關(guān)。S1P抑制雌激素依賴性乳腺癌細胞系MDA-MB-231中的化學(xué)侵入性(chemo-invasiveness)。白細胞遷移受S1P影響，因此S1P可能在炎癥中有作用。肥大細胞中S1P水平可決定它們的過敏反應(yīng)。Edg受體中的改變在控制S1P的細胞內(nèi)/細胞外濃度中起關(guān)鍵作用，并且這可能對多種疾病有影響。Edg受體在與失調(diào)的凋亡有關(guān)的神經(jīng)疾病諸如阿爾茨海默氏病和帕金森氏癥(Alzheimer’sandParkinson’sdisease)中起作用。通過抑制PKC局部治療疤痕是另一種有效的應(yīng)用，對于白血病而言也如此。利用Edg1空小鼠，Liu，etal.(2000)證實了經(jīng)由Edg1的S1P信號對于血管形成必不可少。顯示胚胎出血的Edg1空小鼠導(dǎo)致在胚胎日齡12.5-14.5之間的子宮內(nèi)死亡。脈管形成和血管生成在突變胚胎中表現(xiàn)正常。然而，血管成熟由于血管平滑肌細胞/周細胞缺陷而不完整。所述缺陷在平滑肌中不是普遍的缺陷，這是由于胃腸道和支氣管樹的肌肉層發(fā)育良好。利用野生型和Edge1空纖維母細胞培養(yǎng)物，發(fā)明人顯示Edg1介導(dǎo)S1P誘導(dǎo)的遷移反應(yīng)，其在突變細胞中缺陷。突變細胞也不能應(yīng)答于S1P刺激而活化Rac。Ishii，etal.(2001)破壞了小鼠中的Edg3基因，導(dǎo)致該基因、轉(zhuǎn)錄物以及蛋白質(zhì)的完全缺乏。Edg3空小鼠可存活、可生育、可正常發(fā)育而沒有明顯表型異常。野生型小鼠胚胎纖維母細胞表達Edg1，Edg5，和Edg3，并對磷酸酶C(PLC；見600810)活化、腺苷酸環(huán)化酶抑制，以及Rho(見602732)活化中的S1P高反應(yīng)。Edg3空纖維母細胞顯示PLC活化明顯減少，腺苷酸環(huán)化酶抑制稍有減少，Rho活化沒有改變。Ishii，etal.(2001)的結(jié)論是Edg3對正常小鼠發(fā)育具有非必要的作用，但顯示應(yīng)答于S1P的非多余的細胞信號。Ishii，etal.(2002)開發(fā)了Edg3和Edg5空小鼠。單獨的Edg5缺陷的小鼠可存活、生育并正常發(fā)育。Edg5-Edg3雙空雜交的同窩幼鼠的大小明顯減小，并且這些幼鼠通常不能存活至超過幼年，但是雙空存活小鼠顯示沒有明顯的表型。Ishii，etal.(2002)的結(jié)論是任何一種受體亞型都支持了胚胎發(fā)育，但是缺乏任何一種受體亞型都導(dǎo)致明顯的圍產(chǎn)期死亡。他們檢驗了小鼠胚胎纖維母細胞中受體缺失對S1P信號的影響。Edg5空纖維母細胞顯示，暴露于S1P時，Rho活化明顯降低，雙空纖維母細胞顯示Rho活化完全喪失，PLC活化和鈣動員明顯降低，而對腺苷酸環(huán)化酶抑制沒有影響。他們的結(jié)論是，在小鼠中Edg5和Edg3分別優(yōu)選與Rho和PLC/Ca(2+)途徑偶聯(lián)。最近，在胚胎發(fā)育過程中，GPR12表達在腦內(nèi)顯示，提示其在神經(jīng)元分化，成熟和增殖中的作用。實際上，河馬細胞HT22應(yīng)答于SPC導(dǎo)致細胞數(shù)目增加，用SPC處理的原代大鼠皮質(zhì)培養(yǎng)物顯示突觸接觸增加。在小鼠中，GPR12已經(jīng)在以下組織中用northern印跡檢出腦，具體在前腦和后腦，和肝。更具體地，在腦的海馬，杏仁核，梨狀皮質(zhì)以及嗅皮質(zhì)(邊緣系統(tǒng))中原位檢出(Saeki，Y.，etalFEBSletters1993336317-322)。更接近現(xiàn)在，GPR12已經(jīng)被去孤化(deorphanised)作為鞘氨醇磷脂酰膽堿(SPC)受體。GPR12是僅有的SPC受體，其主要在胚胎和成年小鼠腦內(nèi)表達。在胚胎發(fā)育過程中，GPR12mRNA在皮質(zhì)和海馬內(nèi)強表達，盡管該表達仍存在成年小鼠中，其較在發(fā)育過程中的表達更弱。發(fā)育過程中的表達也存在梨狀皮質(zhì)(piriformcortex)，尾狀核(caudate)，殼核(putamen)，中間背側(cè)核(dorsomedial)和弓狀核(arcuatenuclei)，乳頭體(mammillarybody)，后腦的運動和感覺核，腦干和脊髓。在成年小鼠中，GPR12在皮質(zhì)(軀體感覺和retrosplenial皮質(zhì))，海馬(CA2區(qū)的錐狀細胞層中的標(biāo)記最強)，伏核(nucleusaccumbens)，梨狀皮質(zhì)，中隔(septum)，嗅球(僧帽瓣狀細胞層(mitral)和小球細胞層(glomerularcelllayers))，杏仁核和膝狀核中強表達。在后腦，GPR12表達弱，僅有小腦的一些細胞(小葉9和10)顯示表達。在大鼠中，Northern顯示GPR12在腦內(nèi)以及睪丸內(nèi)的表達。通過RT-PCR顯示，GPR12存在于垂體，腦和睪丸。原位雜交顯示GPR12在垂體前葉和后葉，梨狀皮質(zhì)，以及外側(cè)隔核中的表達(Eidne，K.A.，etal.FEBSletters.1991.292.243-248)。然而，對GPR12在哺乳動物總體以及具體在腦中的作用的理解在現(xiàn)有技術(shù)中沒有報道。WO01/48483描述了提供食欲控制劑的方法，包括利用GPR12受體的一或多種激動劑或拮抗劑作為受試化合物，用作食欲控制劑。然而，cDNA序列和氨基酸序列的分析顯示許多錯誤，其不能從本說明書測定。由此這些研究不能得以重復(fù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人首次制備了GPR12敲除小鼠以研究GPR12的體內(nèi)作用。發(fā)明人顯示所述敲除小鼠與非突變體的運動(包括步態(tài))不同，學(xué)習(xí)能力也不同，提示GPR12在控制神經(jīng)元發(fā)育以及突觸形成以及神經(jīng)內(nèi)分泌行為調(diào)節(jié)中的作用。此外，所述小鼠顯示對疼痛的敏感性差異，它們是痛覺超敏的(hyperanalgesic)，即對疼痛刺激敏感。此外，所述突變體的生理和形態(tài)學(xué)提示GPR12在一些神經(jīng)疾病以及其它疾病例如阿爾茨海默病和相關(guān)疾病(Alzheimer’sandrelateddiseases)，帕金森氏癥(Parkinson’sdisease)，癲癇(epilepsy)以及致癲癇疾病(epileptogenic)，眩暈(dizziness)和暈動病(motionsickness)，運動神經(jīng)元疾病(motorneurondisease)，以及神經(jīng)元功能障礙疾病(diseasesofneuronaldysfunctions)，以及疼痛包括感受傷害性疼痛(nociceptivepain)中的作用。生物化學(xué)分子顯示所述敲除小鼠顯示肝和腎疾病(包括肝炎)，肌肉降解(muscledegradation)，甲狀腺機能低下(hypothyroidism)，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤，和糖尿病的病癥。GPR12敲除小鼠可用作疾病模型以及鑒定用于治療用途的GPR12的拮抗劑或激動劑。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了GPR12敲除哺乳動物，所述哺乳動物包含其中的GPR12多肽是功能失活的一或多種細胞。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明上述方面的GPR12敲除小鼠顯示多種確定性特征，所述特征包括選自下組的特征運動和平衡功能差(如通過抓握倒置柵格(invertedgrid)的能力較低所證實的)，rotarod成績差，步態(tài)異常、步距寬以及對疼痛的敏感性增加。敲除哺乳動物的產(chǎn)生對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟悉的，并且可利用標(biāo)準(zhǔn)實驗室技術(shù)，其包括如本文所述的同源重組。優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物是選自下組的以下哺乳動物之一小鼠，大鼠，地鼠，沙鼠，豚鼠，猴，倉鼠，貓和狗。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解該列表并非意圖窮舉。最優(yōu)選，所述哺乳動物是小鼠。如本文所述，術(shù)語“功能失活的”(GPR12，通過同源重組)表示與其中GPR12沒有被功能失活的對照相比，GPR12多肽在其天然環(huán)境(在體內(nèi)環(huán)境中)起作用時，所述多肽正常執(zhí)行的一或多種功能明顯受抑制。優(yōu)選，術(shù)語“功能失活的”指與其中GPR12沒有被功能滅活的對照相比，當(dāng)GPR12在其天然環(huán)境中(即在體內(nèi)環(huán)境中)起作用時，一種以上由GPR12正常執(zhí)行的功能顯著受到抑制。更優(yōu)選，本文術(shù)語“功能失活的”指與其中GPR12沒有被功能滅活的對照相比，當(dāng)GPR12在其天然環(huán)境中(即在體內(nèi)環(huán)境中)起作用時，所有由GPR12正常執(zhí)行的功能顯著受到抑制。同樣，本文術(shù)語“功能滅活的”GPR12核酸編碼本文定義的功能失活的GPR12。如上所述，術(shù)語“明顯受抑制的”(GPR12功能)指抑制(如上所述，通過的同源重組抑制至少一種GPR12功能)是與適宜的對照相比被抑制至少20％。適宜對照的實例是在相同或相似體內(nèi)環(huán)境中的相同或相似細胞，其中GPR12沒有通過如上所述的同源重組而被功能滅活。優(yōu)選，術(shù)語“明顯抑制的”(如上所述，通過同源重組抑制哺乳動物細胞中的GPR12功能)指與適宜對照相比，至少一種GPR12功能被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％。更優(yōu)選，術(shù)語“明顯受抑制的”(如上所述，通過同源重組抑制哺乳動物細胞中的GPR12功能)指與適宜對照相比，至少一種GPR12功能被抑制100％。另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含一或多種功能失活的GPR12基因的一或多種哺乳動物細胞的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種細胞，其包含一或多種功能活性內(nèi)源GPR12基因；(b)用功能失活的GPR12核酸轉(zhuǎn)染根據(jù)步驟(a)的一或多種細胞，所述核酸能夠通過同源重組與一或多種內(nèi)源GPR12基因重組；(c)選擇其中的一或多種內(nèi)源GPR12基因已經(jīng)與功能失活的GPR12核酸發(fā)生同源重組的一或多種細胞。有利地，本發(fā)明的哺乳動物細胞根據(jù)本發(fā)明上文詳述的方法產(chǎn)生。在本發(fā)明該方面優(yōu)選的實施方案中，所述哺乳動物細胞包含在哺乳動物中。即本發(fā)明上述方面的細胞優(yōu)選組成“敲除”哺乳動物。有利地，本發(fā)明的敲除哺乳動物是小鼠。用功能失活的GPR12轉(zhuǎn)染所述一或多種細胞的方法涉及標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)的使用，并在本發(fā)明描述。同樣地，用于選擇其中的一或多種內(nèi)源GPR12基因已經(jīng)與功能失活的GPR12核酸發(fā)生同源重組的一或多種細胞的方法利用標(biāo)準(zhǔn)實驗室技術(shù)進行，其在本文描述。另一方面，本發(fā)明提供適于功能滅活宿主細胞中的功能失活的GPR12核酸的核酸構(gòu)建體，包含(a)非同源取代區(qū)；(b)位于所述非同源取代區(qū)上游的第一同源區(qū)；(c)突變的GPR12基因，其表達時不編碼功能活性GPR12；(d)位于非同源取代部分的下游的第二同源區(qū)，所述第二同源區(qū)位于所述非同源取代區(qū)下游，其核苷酸序列與第二GPR基因具有至少90％的同一性。本發(fā)明人鑒定了與GPR12相關(guān)的數(shù)種功能，由此他們認為GPR12多肽，或其一或多種結(jié)合蛋白或編碼它們的核酸可具有治療意義。因此，另一方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含GPR12多肽，或其一或多種結(jié)合蛋白或編碼它們的核酸，以及可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。根據(jù)本發(fā)明的上述方面，所述組合物有利地包含一或多種GPR12多肽結(jié)合蛋白。優(yōu)選所述一或多種GPR12結(jié)合蛋白是GPR12的拮抗劑或激動劑。GPR12結(jié)合蛋白可為天然存在的或合成的。天然存在的結(jié)合蛋白可為多肽，諸如本文所述的抗體或核酸。合成GPR12結(jié)合蛋白有利地是小分子，并可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的并在本文描述的篩選方法來選出。在本發(fā)明另一實施方案中，優(yōu)選所述組合物包含編碼GPR12結(jié)合蛋白或GPR12多肽的核酸。本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)GPR12敲除小鼠與正常對照小鼠相比具有改變的神經(jīng)元功能。此外，GPR12敲除小鼠具有其它形態(tài)學(xué)和解剖異常。由此，本發(fā)明人認為GPR12的激動劑和/或拮抗劑或包含它們的組合物具體可用于治療神經(jīng)疾病。所述神經(jīng)疾病包括但不限于以下任意一或多種疾病阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。因此，另一方面本發(fā)明提供鑒定激動GPR12多肽的功能活性的一或多種分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，其包含功能失活的GPR12多肽；(b)用一或多種可能的GPR12類似物處理所述一或多種哺乳動物，所述GPR12類似物可能激動GPR12活性的至少一個方面；(c)檢測根據(jù)步驟(b)處理的一或多種哺乳動物，確定所述經(jīng)處理的哺乳動物與根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種恢復(fù)的性質(zhì)；和(d)選擇所述一或多種GPR12-配體類似物，其使得根據(jù)步驟(a)選出的那些哺乳動物恢復(fù)野生型哺乳動物的一或多種特征。本發(fā)明提供鑒定拮抗GPR12多肽的功能活性的一或多種分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，包含功能活性GPR12多肽；(b)用一或多種可能的GPR12類似物處理所述一或多種哺乳動物，所述GPR12類似物可能拮抗GPR12活性的至少一個方面；(c)檢測根據(jù)步驟(b)處理的一或多種哺乳動物，確定所述經(jīng)處理的哺乳動物與根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種經(jīng)調(diào)節(jié)的性質(zhì)。此外，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因GPR12敲除哺乳動物在一或多種化合物的生物效應(yīng)的測定法中的用途。根據(jù)本發(fā)明的上述方面，術(shù)語“拮抗劑”指與適宜對照相比如本文定義那樣明顯抑制GPR12的一或多種功能的分子。本發(fā)明利用GPR12本身，其激動劑和拮抗劑，以及GPR12活性的調(diào)節(jié)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到各種試劑將作用以增加和降低GPR12的效果，并且實現(xiàn)所述效應(yīng)的途徑各異；因此激動劑可模擬活化的GPR12，或結(jié)合GPR12并增加其活性；GPR12活性的激動型調(diào)節(jié)物也如此，并且可增加GPR12的內(nèi)源激動劑或內(nèi)源GPR12本身的生成。拮抗劑和拮抗型調(diào)節(jié)物可起類似作用，但是降低GPR12的生物效應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語‘哺乳動物’可以是任何哺乳動物。有利地，所述哺乳動物是非人哺乳動物。優(yōu)選，所述哺乳動物是任何選自下組的哺乳動物小鼠，大鼠，豚鼠，兔，倉鼠，沙鼠，貓，狗和猴。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解所述列表并非意圖窮舉。根據(jù)本發(fā)明的該方面，術(shù)語“治療”(利用GPR12的有效拮抗劑治療哺乳動物)指將所述哺乳動物的一或多種細胞(與GPR12的一或多種有效的拮抗劑)接觸。根據(jù)本發(fā)明上述方面，異常神經(jīng)特征的指征包括選自下組的任何一種阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。用于檢測異常神經(jīng)元功能的試驗利用標(biāo)準(zhǔn)實驗室技術(shù)，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。有利地，本發(fā)明以上方面的步驟(c)包括檢測所述一或多種哺乳動物以確定所述哺乳動物是否顯示GPR12敲除小鼠顯示的一或多種特征。根據(jù)本發(fā)明的上述方面，根據(jù)步驟(a)選出的一或多種哺乳動物優(yōu)選是GPR12敲除小鼠。優(yōu)選它們根據(jù)本文所述的方法產(chǎn)生。如本文所述，術(shù)語“功能失活的”(GPR12，通過同源重組)表示與其中GPR12沒有被功能失活的對照相比，GPR12多肽在其天然環(huán)境(在體內(nèi)環(huán)境中)起作用時，所述多肽正常執(zhí)行的一或多種功能明顯受抑制。優(yōu)選，術(shù)語“功能失活的”指與其中GPR12沒有被功能滅活的對照相比，當(dāng)GPR12在其天然環(huán)境中(即在體內(nèi)環(huán)境中)起作用時，一種以上由GPR12正常執(zhí)行的功能顯著受到抑制。更優(yōu)選，本文術(shù)語“功能失活的”指與其中GPR12沒有被功能滅活的對照相比，當(dāng)GPR12在其天然環(huán)境中(即在體內(nèi)環(huán)境中)起作用時，所有由GPR12正常執(zhí)行的功能顯著受到抑制。同樣，本文術(shù)語“功能滅活的”GPR12核酸編碼本文定義的功能失活的GPR12。如上所述，術(shù)語“明顯受抑制的”(GPR12功能)指抑制(如上所述，通過的同源重組抑制至少一種GPR12功能)是與適宜的對照相比被抑制至少20％。適宜對照的實例是在相同或相似體內(nèi)環(huán)境中的相同或相似細胞，其中GPR12沒有通過如上所述的同源重組而被功能滅活。優(yōu)選，術(shù)語“明顯抑制的”(如上所述，通過同源重組抑制哺乳動物細胞中的GPR12功能)指與適宜對照相比，至少一種GPR12功能被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％。更優(yōu)選，術(shù)語“明顯受抑制的”(如上所述，通過同源重組抑制哺乳動物細胞中的GPR12功能)指與適宜對照相比，至少一種GPR12功能被抑制100％。根據(jù)本發(fā)明的該方面，術(shù)語“治療”(利用GPR12的有效拮抗劑治療哺乳動物)指將所述哺乳動物的一或多種細胞(與GPR12的一或多種有效的拮抗劑)接觸。根據(jù)本發(fā)明的上述方面，術(shù)語“野生型哺乳動物的一或多種經(jīng)調(diào)節(jié)的特征”指與包含本文所述的功能失活的GPR12多肽的哺乳動物相比，對野生型哺乳動物顯示的一或多種特征的調(diào)節(jié)。優(yōu)選，所述調(diào)節(jié)是對喪失的功能的恢復(fù)。如本文所述GPR12類似物，與野生型GPR12的至少一種活性和功能相同。所述類似物可模擬活化的GPR12和可模擬失活的GPR12，使得它們進一步抑制功能，所述功能本身在缺乏天然失活的GPR12時受到抑制。本發(fā)明人考慮GPR12核酸或編碼GPR12的一或多種激動劑或拮抗劑的核酸可插入哺乳動物，以產(chǎn)生一或多種治療效果。因此另一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因動物，其中的至少部分細胞包含編碼一或多種選自下組的物質(zhì)的外源核酸GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑和GPR12多肽的一或多種拮抗劑。有利地，所述轉(zhuǎn)基因動物選自下組小鼠，人，豬，山羊，鹿，猴和母牛。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將理解所述列表并非意圖窮舉。根據(jù)本發(fā)明的上述方面，術(shù)語“外源核酸”指并非源自特定哺乳動物的核酸。然而，其可源自同樣的動物類型和品種。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可包含細菌來源的GPR激動核酸。優(yōu)選，轉(zhuǎn)基因動物的部分細胞中包含編碼GPR12的一或多種激動劑或一或多種拮抗劑的外源DNA。如本文所述，非人轉(zhuǎn)基因動物可為選自下組的任意一或多種小鼠，大鼠，猴，狗，貓和豬。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解該列表并非意圖窮舉。利用根據(jù)本發(fā)明制備的GPR12敲除小鼠的研究顯示，GPR12多肽與神經(jīng)元功能以及其它疾病相關(guān)。所述神經(jīng)疾病包括但不限于以下疾病中的一或多種阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。因此，另一方面，本發(fā)明提供診斷選自下組的疾病或病癥的方法阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步驟(a)選擇來自待診斷患者的細胞樣品；和(b)比較細胞樣品與一或多種來自健康個體的對照樣品中的GPR12多肽的表達水平和/或功能活性。另一實施方案中，GPR12及其天然配體中的多態(tài)性可用于診斷疾病。因此，本發(fā)明提供用于診斷選自下組的疾病或病癥阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步驟(a)選擇來自待診斷患者的細胞樣品；和(b)分析所述細胞中的內(nèi)源基因以檢測所述內(nèi)源GPR12基因或GPR12的一或多種天然配體中的多態(tài)性。根據(jù)本發(fā)明上述方面，其中GPR12的表達水平或功能活性增加，降低或改變，或其中GPR12核酸或編碼GPR12配體的核酸與一或多種來自健康個體的對照樣品相比包含一或多種多態(tài)性，表明自其獲得樣品的個體患有上述疾病中的任何一或多種。根據(jù)本發(fā)明上述方面，利用標(biāo)準(zhǔn)實驗室技術(shù)的獲自患者的細胞樣品，所述技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。如上所述，GPR12多肽的“功能活性”指GPR12在其天然環(huán)境即在其細胞中通常發(fā)揮的功能。另一方面，本發(fā)明提供了GPR12的一或多種激動劑或拮抗劑在制備用于預(yù)防或治療患者中選自下組的疾病或病癥的藥物中的用途阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。附圖簡述圖1顯示GPR12敲除以前小鼠GPR12的基因組基因座結(jié)構(gòu)。圖2顯示GPR12敲除以后小鼠GPR12的基因組基因座結(jié)構(gòu)。圖3顯示用于GPR12的同源重組的靶向型載體的結(jié)構(gòu)，包括相關(guān)限制位點。圖4顯示利用PCR以及電子Northern的GPCR12的基因表達模式。圖5顯示雄性敲除小鼠在rotarod測驗中的表現(xiàn)。圖6顯示步態(tài)評估的結(jié)果；突變體在左道，野生型在右道。圖7從5’探針FII-3’探針R1的基因組基因座。圖8顯示雄性敲除小鼠在擺尾(tailflick)試驗中的評估結(jié)果(-/-敲除，+/+野生型對照)。圖9顯示雄性敲除小鼠在熱板試驗(hotplatetest)中的評估結(jié)果。圖10顯示水迷宮試驗(watermazetest)中的評估結(jié)果(野生型空心方塊；敲除小鼠實心圓圈)。圖11a顯示小鼠攀爬過夜持續(xù)時間(climbingdurationovernight)的Laboras評估(野生型用X表示；敲除小鼠用實心三角表示)；圖11b顯示小鼠攀爬過夜頻率的Laboras評估(野生型用X表示；敲除小鼠用實心三角表示)。圖12顯示敲除小鼠中肌酐激酶的評估結(jié)果(1.野生型雌性3月齡；2.敲除(KO)雌性3月齡；3.野生型雌性9月齡；4.敲除(KO)雌性9月齡；5.野生型雄性3月齡；6.敲除(KO)雄性3月齡；7.野生型雄性9月齡；8.敲除(KO)雌性9月齡。發(fā)明詳述常規(guī)技術(shù)本發(fā)明的實施將采用，除非另有說明，常規(guī)化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的技術(shù)，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的。所述技術(shù)的解釋見文獻。參見例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，andT.Maniatis，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEdition，Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel，F(xiàn).M.etal.(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology，ch.9，13，and16，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，andA.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques，JohnWiley&Sons；J.M.PolakandJamesO’D.McGee，1990，InSituHybridizationPrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach，IrlPress；D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg，1992，MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology，AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow，DavidLane，EdHarlow(1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor)，DavidLane(Editor)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-314-2)，1855，Lars-IngeLarsson“ImmunocytochemistryTheoryandPractice”，CRCPressinc.，Bacaraton，F(xiàn)lorida，1988，ISBN0-8493-6078-1，JohnD.Pound(ed)；“ImmunochemicalProtocols，vol80”，intheseries“MethodsinMolecularBiology”，HumanaPress，Totowa，NewJersey，1998，ISBN0-89603-493-3，HandbookofDrugScreening，editedbyRamakrishnaSeethala，PrabhavathiB.Femandes(2001，NewYork，NY，MarcelDekker，ISBN0-8247-0562-9)；LabRefAHandbookofRecipes，Reagents，andOtherReferenceToolsforUseattheBench，EditedJaneRoskamsandLindaRodgers，2002，ColdSpringHarborLaboratory，ISBN0-87969-630-3；andTheMerckManualofDiagnosisandTherapy(17thEdition，Beers，M.H.，andBerkow，R，Eds，ISBN0911910107，JohnWiley&Sons)。每篇文獻都包含在本文作為參考。GPR12多肽本文術(shù)語“多肽”指任何肽或部分，其包含兩或多個氨基酸，它們通過肽鍵或修飾的肽鍵即肽等排體互相連接?！岸嚯摹敝付替?，通常指肽，寡肽或寡聚體，通常指蛋白質(zhì)。多肽可包含除所述20種基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通過天然過程諸如翻譯后加工或通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。所述修飾在基礎(chǔ)教科書種較好地描述，并在專論中更為詳細地描述，以及在大量研究文獻中也有描述。修飾可出現(xiàn)在多肽中的任何位置，包括肽主鏈，氨基酸側(cè)鏈，以及氨基或羧基末端。將理解同種類型的修飾可以相同或不同程度存在給定多肽中的數(shù)個位點。同樣，給定的多肽也含有許多類型的修飾。作為泛化的結(jié)果，多肽可以是分支狀的(遍在蛋白化的結(jié)果)，可以是環(huán)形的，有或無分支。環(huán)形、分支狀及分支環(huán)形多肽可以得自翻譯后的天然加工或者可用合成方法來制備。所述修飾包括乙酰化、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素化、共價連接黃素、共價連接亞鐵血紅素部分、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂類或脂類衍生物、共價連接磷脂酸肌醇(phosphotidylinositol)、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、去甲基化、生成共價交聯(lián)、生成胱氨酸、生成焦谷氨酸、甲?；ⅵ?羧化、糖基化、GPI錨定形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；⒀趸?、蛋白酶處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒代化(selenoylation)、磺化、轉(zhuǎn)運-RNA介導(dǎo)的蛋白添加氨基酸如精氨酸化，以及遍在蛋白化。見例如，Proteins-StructureandMolecularProperties，2ndEd.，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany，NewYork，1993andWold，F(xiàn).，PosttranslationalProteinModificationsPerspectivesandProspects，pgs.1-12inPosttranslationalCovalentModificationofProteins，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，NewYork，1983；Seifter，etal.，“Analysisforproteinmodificationsandnonproteincofactors”，MethEnzymol(1990)182626-646andRattan，etal.，“ProteinSynthesisPosttranslationalModificationsandAging”，AnnNYAcadSci(1992)66348-62。本發(fā)明術(shù)語“變體”，“同源物”，“衍生物”或“片段”指來自序列或?qū)π蛄械娜魏我换蚨鄠€氨基酸取代，改變，修飾，置換，缺失或添加。除非另有說明，參見“GPR12”以及GPR12的變體，同源物，衍生物和片段。當(dāng)參照受體諸如GPR12的“受體活性”或受體的“生物活性”時，這些術(shù)語意圖指GPR12受體的代謝或生理功能，包括相似的活性或改良的活性或與降低的不良副作用相關(guān)的活性。還包括GPR12受體的抗原或免疫原活性。GPCR活性的實例以及檢測和定量這些活性的方法是本領(lǐng)域已知的，并在本發(fā)明其它部分詳述。術(shù)語“缺失”定義為核苷酸和氨基酸序列的改變，其中一或多個核苷酸和氨基酸殘基分別缺失。本文術(shù)語“插入”和“添加”指核苷酸和氨基酸序列的改變，其導(dǎo)致與天然存在的物質(zhì)相比，一或多個核苷酸或氨基酸殘基的添加。本文術(shù)語“取代”是一或多種核苷酸或氨基酸分別被不同的核苷酸或氨基酸取代的結(jié)果。本發(fā)明的GPR12多肽也可具有氨基酸的缺失，插入或取代，其在功能等同的氨基酸序列中產(chǎn)生沉默改變并導(dǎo)致功能對等的氨基酸序列。有意的氨基酸可基于殘基的極性，電荷，溶解性，疏水性，親水性和/和兩親性的相似性進行。例如，帶負電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸殘基包括賴氨酸和精氨酸，以及具有非帶電急性頭基團的氨基酸具有相似的疏水值包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，苯丙氨酸以及酪氨酸。GPR12核苷酸和多核苷酸“多核苷酸”通常是指任意多核糖核酸(RNA)或多脫氧核糖核酸(DNA)，可以是未經(jīng)修飾的或者修飾后的RNA或DNA?！岸嗪塑账帷卑ǎ幌抻?，單鏈及雙鏈DNA，DNA為單鏈和雙鏈區(qū)的混合體，單鏈及雙鏈RNA，以及由單鏈和雙鏈區(qū)形成的RNA混合體，包含DNA和RNA的雜合分子，所述DNA和RNA可以是單鏈或更通常為雙鏈或者單鏈及雙鏈區(qū)的混合體。此外，“多核苷酸”是指三鏈區(qū)，包含RNA或DNA或者同時包含二者。術(shù)語“多核苷酸”還包括含1個或多個經(jīng)修飾的堿基的DNA或RNA以及為穩(wěn)定或其他原因?qū)羌苄揎椇蟮腄NAs或RNA?！敖?jīng)修飾的”堿基包括，例如三苯甲基化的(tritylated)堿基以及肌苷(inosine)等非常見堿基?？蓪NA及RNA作多種修飾；因此“多核苷酸”包括自然界中常見的多核苷酸的化學(xué)、酶促或代謝方式修飾的形式，以及以病毒及細胞為特征的化學(xué)形式DNA及RNA?！岸嗪塑账帷暹€包括相對短的多核苷酸，通常稱為寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解多種核苷酸序列可編碼相同的多肽，這是遺傳密碼簡并性的結(jié)果。本文術(shù)語“核苷酸序列”指核苷酸序列，寡核苷酸序列，多核苷酸序列以及其變體，同源物，片段和衍生物(諸如其部分)。核苷酸序列可以是基因組或合成或重組來源的DNA或RNA，其可為雙鏈和單鏈的，而無論其代表有義或是反義鏈或其組合。術(shù)語核苷酸序列可通過利用重組DNA技術(shù)制備(例如重組DNA)。優(yōu)選，術(shù)語“核苷酸序列”指DNA。本發(fā)明術(shù)語“變體”，“同源物”，“衍生物”或“片段”包括來自或?qū)PR12核苷酸序列的一(或多個)核酸的任何取代，改變，修飾，置換，缺失或添加。除非另有說明，參照“GPR12”和“GPR12”包括參照GPR12的所述變體，同源物，衍生物和片段。GPR12的表達測定法為了設(shè)計用于治療GPR12相關(guān)疾病的有用治療劑，確定GPR12(無論是野生型和特定的突變體)的表達圖譜是有用的。因此，本領(lǐng)域已知的方法可用于確定器官，組織和細胞類型(以及發(fā)育階段)，其中表達有GPR12。例如，可進行常規(guī)和“電子”Northern。反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)也可用于檢測GPR12基因或突變體的表達。測定GPR12的表達圖譜的更為敏感的方法包括RNAse保護試驗，如本領(lǐng)域已知那樣。Northern分析是實驗室技術(shù)，用于檢測基因轉(zhuǎn)錄物的存在，涉及使標(biāo)記的核苷酸序列與膜的雜交，所述膜上結(jié)合有來自具體細胞類型和組織的RNA。(Sambrook，supra，ch.7andAusubel，F(xiàn).M.，etal.supra，ch.4and16.)利用BLAST的類似計算機技術(shù)(“電子Northern”)可用于在核苷酸數(shù)據(jù)庫諸如GenBank和LIFESEQ數(shù)據(jù)庫(IncytePharmaceuticals)中搜索相同和相關(guān)的分子。這種類型的分析的優(yōu)勢在于它們比基于膜的多重雜交更快。此外，計算機搜索的敏感性可被修飾以確定是否任何具體的匹配被分類為準(zhǔn)確或同源。本發(fā)明的多核苷酸和多肽，包括上述探針，可用作研究試劑以及物質(zhì)，用于發(fā)現(xiàn)對動物和人疾病的治療和診斷，如本發(fā)明文件中其它部分詳述的。GPR12多肽的表達GPR12多肽的表達是GPR12抗體的產(chǎn)生所需的，所述抗體可作為本文所述的GPR12的激動劑和拮抗劑其作用。為了表達生物活性GPR12多肽，編碼GPR12的核苷酸序列或其類似物，變體或衍生物可被插入適宜的表達載體，即含有所插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的必要元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法被用于構(gòu)建含有編碼GPR12和適宜轉(zhuǎn)錄以及翻譯控制元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)，以及體內(nèi)基因重組。所述技術(shù)描述于Sambrook，J.，etal.，(1989；MolecularCloning，ALaboratoryManual，ch.4，8，and16-17，ColdSpringHarborPress，Plainview，N.Y.)andAusubel，F(xiàn).M.，etal.，(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology，ch.9，13，and16，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.)。各種表達載體/宿主系統(tǒng)可用于含有并表達編碼GPR12的序列。這些包括，但不限于，微生物，諸如用重組噬菌體，質(zhì)粒和粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌；用酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用病毒表達載體轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)(例如花椰菜花葉病毒(CaMV)或煙草花葉病毒(TMV))或利用細菌表達載體(例如TiorpBR322質(zhì)粒)；或動物細胞系統(tǒng)。本發(fā)明不受所用宿主細胞的限制?！翱刂圃被颉罢{(diào)控序列”是載體的未翻譯的區(qū)域(即增強子，啟動子，5’和3’未翻譯區(qū))，其與宿主細胞蛋白作用以執(zhí)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。所述元件的長度和特異性不同。根據(jù)所用的載體系統(tǒng)和宿主，任何數(shù)目的適宜轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和可誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動子，可以使用。例如，當(dāng)在細菌系統(tǒng)中克隆時，誘導(dǎo)型啟動子諸如BLUESCRIPT噬粒(Stratagene，LaJolla，Calif.)或PSPorT1質(zhì)粒(GIBCO/BRL)的雜合lacZ啟動子等可以使用。桿狀病毒多角體蛋白啟動子可用于昆蟲細胞。源自植物細胞基因組的啟動子或增強子(例如熱休克，RUBISCO，和儲藏蛋白基因)或來自植物病毒的(例如病毒啟動子或前導(dǎo)序列)可克隆入所述載體。在哺乳動物細胞系統(tǒng)中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子是優(yōu)選的。如果需要產(chǎn)生含有多個拷貝的GPR12多肽編碼序列的細胞系，基于SV40或EBV的載體可與適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記一起使用。在細菌系統(tǒng)中，多種表達載體可根據(jù)對于GPR12多肽的目的用途來選擇。例如，當(dāng)需要大量GPR12多肽以誘導(dǎo)抗體時，可以使用指導(dǎo)可輕易純化的融合蛋白的高水平表達的載體。所述載體包括，但不限于，多功能大腸桿菌克隆和表達載體諸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中編碼GPR12多肽的序列被連入載體，與氨基末端Met序列以及隨后的β-半乳糖苷酶的7個殘基相連，使得產(chǎn)生雜合蛋白，pIN載體(VanHeeke，G.andS.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)等。pGEX載體(Promega，Madison，Wis.)也可用于表達異源多肽作為與谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，所述融合蛋白可溶并可通過吸附于谷胱苷肽-瓊脂糖珠從裂解的細胞輕易純化，然后在游離谷胱苷肽存在下洗脫。在所述系統(tǒng)中制備的蛋白可設(shè)計成包含肝素，凝血酶，或因子XA蛋白酶裂解位點，使得目的克隆的多肽可從GST部分隨意釋放。在酵母釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，多種含有構(gòu)成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體，諸如alpha因子，乙醇氧化酶，和PGH可以使用。綜述參見Ausubel(supra)和Grantetal.(1987；MethodsEnzymol.153516-544)。使用植物表達載體的情況下，GPR12多肽編碼序列的表達可通過多種啟動子中的任何啟動子驅(qū)動。例如，病毒啟動子諸如CaMV35S和19S啟動子可單獨使用或與來自TMV的omega前導(dǎo)序列聯(lián)用。(Takamatsu，N.(1987)EMBOJ.6307-311.)可選，可以使用植物啟動子諸如RUBISCO小亞基或熱休克啟動子。(Coruzzi，G.etal.(1984)EMBOJ.31671-1680；Broglie，R.，etal.，(1984)Science224838-843；andWinter，J.，etal.，(1991)ResultsProbl.CellDiffer.1785-105.)這些構(gòu)建體可通過直接DNA轉(zhuǎn)化或病原介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染而被導(dǎo)入植物細胞。所述技術(shù)在多種常規(guī)可得的綜述中描述。(See，forexample，Hobbs，S.orMurry，LE.inMcGrawHillYearbookofScienceandTechnology(1992)McGrawHill，NewYork，N.Y.；pp.191-196.)。昆蟲系統(tǒng)也可用于表達GPR12多肽。例如，一種所述系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifomicanuclearpolyhedrosisvirus)(AcNPV)用作載體在秋粘蟲(Spodopterafrugiperd)細胞或擬尺蠖幼蟲(Trichoplusialarvae)中表達外來基因。編碼GPR12的序列可被克隆入病毒的非必需區(qū)域，諸如多角體蛋白基因，并置于多角體蛋白啟動子的控制之下。將GPR12多肽成功插入將使得多角體蛋白基因失活，并產(chǎn)生缺乏包膜蛋白的重組病毒。所述重組病毒隨后可用于感染例如秋粘蟲細胞或擬尺蠖幼蟲，其中表達有GPR12多肽。(Engelhard，E.K.，etal.，(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.913224-3227.)在哺乳動物宿主細胞中，多種基于病毒的表達系統(tǒng)可以使用。如果使用腺病毒作為表達載體，編碼GPR12多肽的序列可連入腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合體，其由晚期啟動子和三分前導(dǎo)序列組成。插入病毒基因組的非必需E1或E3區(qū)可用于獲得能在感染的宿主細胞中表達GPR12多肽的存活病毒。(Logan，J.andT.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659.)此外，轉(zhuǎn)錄增強子，諸如勞斯肉瘤病毒(RSV)增強子，可用于增強在哺乳動物宿主細胞中的表達。人類人工染色體(HAC)也可用于遞送大于質(zhì)粒中所包含并表達的DNA片段的較大DNA片段。約6kb-10Mb的HAC被構(gòu)建并經(jīng)由常規(guī)遞送方法遞送(脂質(zhì)體，多聚陽離子氨基聚合物或小泡)用于治療目的。具體起始信號也可用于實現(xiàn)GPR12多肽編碼序列的更為有效的翻譯。所述信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。在編碼GPR12多肽的序列及其起始密碼子以及上游序列被插入適宜表達載體中的情況下，無需其它轉(zhuǎn)錄和翻譯對照信號。然而，在僅僅插入編碼序列或其片段的情況下，外源翻譯控制序列包括ATG起始密碼子應(yīng)被提供。此外，起始密碼子應(yīng)當(dāng)位于正確的讀框中以保證完整插入物的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以是各種來源的，包括天然和合成的。表達效率可通過包含適于所用具體細胞系統(tǒng)的增強子而得以增強，諸如文獻中描述的那些。(Scharf，D.，etal.，(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20125-162.)。此外，可根據(jù)宿主細胞株調(diào)節(jié)插入序列的表達或以所需方式加工所表達的蛋白的能力來選擇。多肽的所述修飾包括，但不限于，乙?；?，羧化，糖基化，磷酸化，脂質(zhì)化，和?；?。切割“前原”形式的蛋白質(zhì)的翻譯后加工也可用于促進正確的插入，折疊，和/或功能。具有特異性細胞機制和翻譯后活性的特征機制的不同宿主細胞(例如CHO，HeLa，MDCK，HEK293，和WI38)，可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Bethesda，Md.)并可被選擇用于保證對外來蛋白的正確修飾和加工。對于長期、高產(chǎn)量的重組蛋白制備，穩(wěn)定的表達是優(yōu)選的。例如，能夠穩(wěn)定表達GPR12GPCR的細胞系可利用表達載體轉(zhuǎn)化，其中含有病毒復(fù)制起點和/或內(nèi)源表達元件以及選擇標(biāo)記基因，它們位于相同或分離的載體上。導(dǎo)入所述載體之后，允許細胞在富集的培養(yǎng)基中生長約1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基?？蛇x擇標(biāo)記的目的是賦予對選擇的抗性，其存在允許成功表達導(dǎo)入的序列的細胞的生長和回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞的抗性克隆可利用適于該細胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖。任何數(shù)目的選擇系統(tǒng)可用于回收轉(zhuǎn)化的細胞系。這些包括，但不限于，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(Wigler，M.etal.(1977)Cell11223-32)和腺苷酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Lowy，I.，etal.，(1980)Cell22817-23)，其可分別用于tk-或apr-細胞中。此外，抗代謝物，抗生素或除莠劑抗性可用作選擇的基礎(chǔ)。例如，dhfr賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler，M.，etal.，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt賦予對氨基糖苷類新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，F(xiàn).，etal.，(1981)J.Mol.Biol.1501-14)；和als和pat分別賦予對氯磺隆(chlorsulfuron)和草銨膦(phosphinotricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶的抗性(Murry，supra).也描述了其它選擇性基因，例如，trpB，其允許細胞利用吲哚取代色氨酸，或hisD，其允許細胞利用組氨醇(histinol)取代組氨酸。(Hartman，S.C.andR.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51.)最近，可見(visible)標(biāo)記物的利用獲得了普及，利用諸如花青苷，β-葡糖醛酸酶及其底物GUS，和螢光素酶及其底物蟲螢光素。這些標(biāo)記物不僅可用于鑒定轉(zhuǎn)化物，也可用于定量由于具體載體系統(tǒng)導(dǎo)致的瞬時或穩(wěn)定的蛋白表達(Rhodes，C.A.，etal.，(1995)MethodsMol.Biol.55121-131.)。盡管標(biāo)記基因表達的存在/缺失提示目的基因也存在，所述基因的存在和表達可能需要被證實。例如，如果編碼GPR12多肽的序列被插入標(biāo)記基因序列中，含有GPR12多肽的編碼序列的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞可通過缺乏標(biāo)記基因功能而得以鑒定。可選，標(biāo)記基因可與GPR12多肽編碼序列串聯(lián)，并在單個啟動子的控制之下。標(biāo)記基因應(yīng)答于誘導(dǎo)和選擇的表達通常也指示串聯(lián)的基因的表達。可選，含有編碼GPR12多肽的核酸序列并表達GPR12的宿主細胞可通過本領(lǐng)域已知的多種方法鑒定。這些方法包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA雜交以及蛋白生物測定或免疫測定技術(shù)，其包括基于膜，溶液，或芯片的技術(shù)，用于檢測和/和定量核酸和蛋白序列。編碼GPR12多肽的多核苷酸序列的存在可通過DNA-DNA或DNA-RNA雜交檢測或利用探針或編碼GPR12GPCR的多核苷酸的片段來擴增?；诤怂釘U增的測定法涉及利用寡核苷酸或寡聚物，基于編碼GPR12多肽的序列以檢測含有編碼GPR12的DNA或RNA的轉(zhuǎn)化體。多種用于檢測和測定GPR12表達的方案，其利用蛋白特異性多克隆或單克隆抗體，是本領(lǐng)域已知的。所述技術(shù)的實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，放射免疫測定法(RIA)，以及熒光活化的細胞分選(FACS)。利用對GPR12上的兩個非干擾型表位反應(yīng)的單克隆抗體的雙位點型、基于單克隆的免疫測定法是優(yōu)選的，但是也可采用競爭結(jié)合試驗。這些和其它測定法在本領(lǐng)域較好地描述，例如在Hampton，R.etal.(1990；SerologicalMethods，aLaboratoryManual，SectionIV，APSPress，StPaul，Minn.)和Maddox，D.E.，etal.，(1983；J.Exp.Med.1581211-1216)中。多種標(biāo)記和偶聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并可用于各種核酸和氨基酸測定法中。產(chǎn)生標(biāo)記的雜交和PCR探針以檢測與編碼GPR12的多核苷酸相關(guān)的序列的手段包括寡標(biāo)記(oligolabelling)，缺口翻譯(nicktranslation)，末端標(biāo)記(end-labelling)，或利用標(biāo)記的核苷酸的PCR擴增。可選，編碼GPR12的序列或其片段可克隆入載體用于產(chǎn)生mRNA探針。所述載體是本領(lǐng)域已知的，并且可購得，并通過加入適宜的RNA聚合酶諸如T7，T3，或SP6以及標(biāo)記的核苷酸可用于在體外合成RNA探針。這些方法可利用多種可購得的試劑盒進行，諸如Pharmacia&Upjohn(Kalamazoo，Mich.)，Promega(Madison，Wis.)，andU.S.BiochemicalCorp.(Cleveland，Ohio)提供的那些?？捎糜谝谆瘷z測的適宜的報道分子或標(biāo)記包括放射性核素，酶，熒光物質(zhì)，化學(xué)熒光物質(zhì)，或發(fā)色物質(zhì)，以及底物，輔因子，抑制物，磁性顆粒等。用編碼GPR12的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞可在適于從細胞培養(yǎng)物表達并回收蛋白的條件下培養(yǎng)。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生的蛋白可位于細胞膜內(nèi)，被分泌或包含在細胞內(nèi)，根據(jù)序列和/和所用載體而定。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，含有編碼GPR12的多核苷酸的表達載體被設(shè)計為包含信號序列，其指導(dǎo)GPR12通過原核或真核細胞膜的分泌。其它結(jié)構(gòu)可用于將GPR12的編碼序列連接于編碼促進可溶蛋白的純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。所述純化促進結(jié)構(gòu)域包括，但不限于，金屬鰲合肽，諸如組氨酸-色氨酸模塊，其允許在固定的金屬上的純化，以及允許在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域，以及用于FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)域(ImmunexCorp.，Seattle，Wash.)?？闪呀饨宇^序列，諸如對因子XA和腸激酶特異的那些(Invitrogen，SanDiego，Calif.)包含在純化結(jié)構(gòu)域和GPR12GPCR編碼序列之間可用于促進純化。一種所述的表達載體提供含有GPR12以及編碼硫氧還蛋白或腸激酶裂解位點前的6組氨酸殘基的融合蛋白的表達。所述組氨酸殘基促進在固定的金屬離子親和層析上的純化(IMIAC；describedinPo大鼠h，J.，etal.，(1992)Prot.Exp.Purif.3263-281)，腸激酶裂解位點提供從融合蛋白純化GPR12的方法。含有融合蛋白的載體的討論見Kroll，D.J.，etal.，(1993；DNACellBiol.12441-453)。GPR12的片段不僅可以通過重組制備產(chǎn)生，也可以通過直接肽合成利用固相技術(shù)制備。(MerrifieldJ.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154.)蛋白合成可通過人工技術(shù)或自動化進行。自動化的合成可例如利用AppliedBiosystems431A肽合成儀進行(PerkinElmer)。GPR12的各種片段可分別合成，然后組合以產(chǎn)生全長分子。轉(zhuǎn)基因動物(a)敲除本發(fā)明的另一方面，提供了GPR12敲除哺乳動物，其包含一或多種細胞，其中GPR12多肽是功能失活的。本發(fā)明的GPR12敲除動物可作為GPR12基因或該基因的任何部分的功能破壞的結(jié)果產(chǎn)生，包括GPR12基因的一或多種功能喪失型突變，包括GPR12基因的缺失或取代。所述突變包括單點突變，并可靶向GPR12的編碼或非編碼區(qū)。優(yōu)選，所述敲除動物是非人哺乳動物，諸如豬，綿羊或嚙齒類動物。最優(yōu)選所述敲除動物是小鼠或大鼠。所述敲除動物可用于篩選方法中以鑒定GPR12的激動劑和/或拮抗劑，以及檢測它們作為體內(nèi)疾病療法的效力。例如，經(jīng)改造GPR12產(chǎn)生缺乏的敲除動物可用于試驗中以鑒定GPR12的激動劑和/或拮抗劑。一種試驗被設(shè)計為評估潛在的藥物(候選配體或化合物)以確定其是否在缺乏GPR12受體的條件下產(chǎn)生生理反應(yīng)。這可通過將藥物給予上述敲除動物來實現(xiàn)，然后測定所述動物的特定反應(yīng)。任何生理參數(shù)可以這種方式測定。源自GPR12敲除動物的組織可用于受體結(jié)合實驗中以測定潛在的藥物(候選配體或化合物)是否與GPR12受體結(jié)合。所述試驗可通過從經(jīng)改造GPR12受體生成缺乏的敲除動物獲得第一受體制備物以及從已知結(jié)合任何鑒定的GPR12配體或化合物獲得第二受體制備物來進行。通常，所述第一和第二制備物在所有方面都類似除外它們的來源。例如，如果在實驗中使用來自敲除動物(諸如上下文所述的)的腦組織，來自正常(野生型)動物的可比腦組織也可用作第二受體制備物的來源。每種受體制備物與已知結(jié)合GPR12受體的配體一起，在單獨或存在候選配體或化合物的條件下保溫。優(yōu)選，所述候選配體或化合物將在多種濃度進行檢測。對于第一和第二受體制備物，測定已知配體的結(jié)合被受試化合物取代的程度。來自敲除動物的組織可直接用于試驗或所述組織可被加工以分離膜或膜蛋白，其本身用于所述試驗。優(yōu)選的敲除動物是小鼠。所述配體可利用任何適于結(jié)合試驗的手段標(biāo)記。這將包括，但不限于，放射活性標(biāo)記，酶促標(biāo)記，熒光標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(以及下文進一步詳述的其它標(biāo)記技術(shù))。此外，GPR12受體的拮抗劑可通過將候選化合物等給予表達有功能的GPR12的野生型動物以及被鑒定為顯示任何與GPR12受體功能的表達的降低或消除相關(guān)的表型特征的動物來鑒定。非人敲除動物的產(chǎn)生方法在下文更為詳細的描述。轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體可被導(dǎo)入動物的生殖細胞系以制備敲除哺乳動物。例如，所述構(gòu)建體的一個或多個拷貝可通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)摻入哺乳動物胚胎的基因組。在示例性實施方案中，本發(fā)明的敲除非人動物通過將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙游锏纳诚祦碇苽?。各種發(fā)育階段的胚胎靶細胞可用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚胎靶細胞的發(fā)育階段可采用不同方法。選擇用于實施本發(fā)明的任何動物的具體細胞系根據(jù)該動物總體健康狀況好，胚胎生長良好，胚胎內(nèi)的原核(pronuclear)可見性好，以及生殖健康良好來選擇。此外，單體型是明顯的因素。將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛タ赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法實現(xiàn)，諸如顯微注射，電穿孔或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。例如，GPR12受體轉(zhuǎn)基因可通過以下方法導(dǎo)入哺乳動物將所述構(gòu)建體顯微注射到受精的哺乳動物卵中導(dǎo)致所述構(gòu)建體的一或多個拷貝被保持在發(fā)育中的哺乳動物細胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入受精卵之后，所述卵可在體外保溫不同時間，和/或再植入代理宿主。體外保溫到成熟是本領(lǐng)域范圍之內(nèi)的。一種常規(guī)方法是在體外保溫所述胚胎約1-7天，根據(jù)物種而不同，然后將它們再植入代理宿主中?？赏ㄟ^對組織片段的Southern印跡分析來檢測轉(zhuǎn)基因操作的胚胎的子代中所述構(gòu)建體的存在。如果外源克隆的構(gòu)建體的一或多個拷貝保持整合入所述敲除胚胎的基因組，可能確定攜帶轉(zhuǎn)基因添加的構(gòu)建體的永久敲除哺乳動物系。敲除改變的哺乳動物的幼崽可在出生后檢測所述構(gòu)建體向后代基因組中的摻入。優(yōu)選，該實驗通過使對應(yīng)編碼所需重組蛋白產(chǎn)物或其片段的DNA序列的探針雜交到來自子代的染色體物質(zhì)上來實現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)基因組中含有至少一個拷貝的所述構(gòu)建體的那些哺乳動物子代生長至成熟。為了本發(fā)明的目的，受精卵主要是雙倍體細胞的形成，其能夠發(fā)育成完整的生物體。通常，受精卵由含有天然或人工形成的細胞核組成，通過將來自一或多個配子的兩個單倍體細胞核進行融合。因此，配子細胞核必需是能天然相容的，即產(chǎn)生能夠進行分化并發(fā)育成有功能的生物體的存活合子的那些。通常，整倍體合子是優(yōu)選的。如果獲得非整倍體合子，染色體的數(shù)目變化就配子來源的生物體的整倍體數(shù)目而言應(yīng)不超過1個。除了類似的生物考慮，物理因素也控制可加入合子細胞核或形成部分合子細胞核的遺傳物質(zhì)的外源遺傳物質(zhì)的量(例如體積)。如果沒有去除遺傳物質(zhì)，可加入的外源遺傳物質(zhì)的量受到將被吸收而不被物理破壞的量的限制。通常，插入的外源遺傳物質(zhì)的體積將不超過約10皮升。加入的物理效應(yīng)必需不大到物理破壞所述合子的生存力的程度。DNA序列的數(shù)量和品種的生物限制將根據(jù)具體的合子以及所述外源遺傳物質(zhì)的功能而不同，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，這是由于產(chǎn)生的合子的遺傳物質(zhì)，包括外源遺傳物質(zhì)，必需在生物上能夠啟動并保持合子分化并發(fā)育成功能生物體。加入合子的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的拷貝數(shù)量有賴于加入的外源遺傳物質(zhì)的總量，并將是能夠使得遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)生的量。理論上，僅僅需要一個拷貝；然而，通常利用多個拷貝，例如1,000-20,000個拷貝的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，以保證一個拷貝是有功能的。根據(jù)本發(fā)明，通常每種插入的外源DNA序列具有超過一個的功能拷貝對于增強外源DNA序列的表型表達是有利的。允許加入外源遺傳物質(zhì)到細胞核遺傳物質(zhì)中的任何技術(shù)可被利用，只要其對細胞，細胞核膜和其它存在的細胞或遺傳結(jié)構(gòu)沒有破壞性。所述外源遺傳物質(zhì)優(yōu)選通過顯微注射被插入核遺傳物質(zhì)。細胞和細胞結(jié)構(gòu)的顯微注射是已知的并可用于本領(lǐng)域。再植入利用標(biāo)準(zhǔn)方法實施。通常，代理宿主被麻醉，將胚胎插入輸卵管。插入具體宿主的胚胎的數(shù)量根據(jù)不同物種而不同，但通常與所述物種天然產(chǎn)生的后代數(shù)目相當(dāng)?？赏ㄟ^任何適宜方法篩選代理宿主的敲除后代中的轉(zhuǎn)基因的存在和/或表達。篩選通常通過Southern和Nothern印跡分析，利用與該轉(zhuǎn)基因的至少一部分互補的探針實施。利用針對所述轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白的抗體的Western印跡分析可作為篩選所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在的可選或其它方法。通常，DNA自尾組織制備，并通過Southern分析或PCR來分析所述轉(zhuǎn)基因?？蛇x，據(jù)信表達所述轉(zhuǎn)基因水平最高的組織和細胞利用Southern分析和PCR檢測所述轉(zhuǎn)基因的存在或表達，但是任何組織或細胞類型可用于該分析。用于評估所述轉(zhuǎn)基因存在的可選或其它方法包括，但不限于，適宜的生物化學(xué)測定法諸如酶和/或免疫測定法，針對具體標(biāo)記物或酶活性的組織學(xué)染色，流式細胞分析等。血液的分析也可用于檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在血液中的存在，以及評估所述轉(zhuǎn)基因?qū)Ω鞣N類型的血細胞以及其它血液成分的水平的影響。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染也可用于將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙游?。發(fā)育中的非人胚胎可在體外培養(yǎng)到胚泡階段。在該時期內(nèi)，分裂球可用作逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的靶(Jaenich，R.(1976)PNAS731260-1264)。分裂球的有效感染通過酶處理去除透明帶(zonapellucida)獲得(ManipulatingtheRatEmbryo，Hoganeds.(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1986)?？捎糜趯⑥D(zhuǎn)基因?qū)氲牟《靖腥鞠到y(tǒng)通常是攜帶所述轉(zhuǎn)基因的、復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahneretal.(1985)PNAS826927-6931；VanderPuttenetal.(1985)PNAS826148-6152)。轉(zhuǎn)染可通過在病毒生成細胞的單層上培養(yǎng)分裂球輕易且有效地獲得(VanderPutten，supra；Stewart，etal.，(1987)EMBOJ.6383-388)?？蛇x，感染可在以后的階段進行。病毒或病毒生成細胞可被注入囊胚腔(Jahner.，etal.，(1982)Nature298623-628)。大多數(shù)初始動物對于轉(zhuǎn)基因而言是嵌合的，這是由于摻入僅僅在形成轉(zhuǎn)基因非人動物的細胞亞組中出現(xiàn)。此外，初始動物可含有多種在基因組不同位置的轉(zhuǎn)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒插入物，其通常將在子代中分離。此外，也可能通過子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄感染孕中期胚胎而將轉(zhuǎn)基因?qū)肷臣毎?Jahner.，etal.，(1982)見上文)。第三種類型的轉(zhuǎn)基因?qū)胗冒屑毎桥咛ジ杉毎?ES)。ES細胞可獲自培養(yǎng)在體外的植入前的胚胎并與胚胎融合(Evans.，etal.，(1981)Nature292154-156；Bradley.，etal.，(1984)Nature309255-258；Gossler.，etal.，(1986)PNAS839065-9069；andRobertson，.etal.，(1986)Nature322445-448)。轉(zhuǎn)基因可通過DNA轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有效導(dǎo)入ES細胞。所述轉(zhuǎn)化的ES細胞此后可與來自非人動物的胚泡結(jié)合。隨后，ES細胞定植在胚胎并對產(chǎn)生的嵌合動物的生殖系有貢獻。綜述參見Jaenisch，R.(1988)Science2401468-1474。本發(fā)明還涉及用于功能破壞宿主細胞中的GPR12基因的核酸構(gòu)建體。所述核酸構(gòu)建體包括a)非同源取代部分；b)所述非同源取代部分上游的第一同源區(qū)，具有與第一GPR12基因序列基本相同一的核苷酸序列的第一同源區(qū)；和c)位于該非同源取代部分下游的第二同源區(qū)，具有與第二GPR12基因序列基本相同的核苷酸序列的第二同源區(qū)，所述第二GPR12基因序列具有位于天然存在的內(nèi)源GPR12基因中的第一GPR12基因序列的下游的位置。此外，當(dāng)核酸分子被導(dǎo)入宿主細胞時，所述第一和第二同源區(qū)長度足以使得在核酸構(gòu)建體與該宿主細胞的內(nèi)源GPR12基因之間進行同源重組。優(yōu)選實施方案中，非同源取代部分包含表達報道物，優(yōu)選包括lacZ和陽性選擇表達盒，優(yōu)選包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其可操作連接于調(diào)節(jié)元件。GPR12GPCR缺陷轉(zhuǎn)基因動物可通過以下方法產(chǎn)生(a)GPR12基因靶向型載體的構(gòu)建小鼠GPR12基因組克隆分離自獲自HGMP(Hinxton，UK)的小鼠大插入物PAC文庫，所述分離利用自部分預(yù)測的小鼠開放讀框cDAN序列(SEQIDNO4)擴增的探針序列，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行。分離的小鼠GPR12基因組克隆隨后利用小寡核苷酸探針和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在GPR12基因的區(qū)域中限制作圖。對小鼠基因組基因座進行部分測序使得能夠設(shè)計同源臂以克隆入靶向型載體。DNA的兩個區(qū)域(通常大小為1-5kb，從待缺失開放讀框的區(qū)域的任何一側(cè)起)，稱為5’和3’同源臂，通過PCR擴增并克隆入靶向型載體。這些臂的位置被選擇為使得同源重組事件將通過缺失至少七個跨膜橫跨(spanning)區(qū)域來功能破壞GPR12基因。制備靶向型載體，其中缺失的GPR12序列被非同源序列取代，所述非同源序列由選擇盒上游的內(nèi)源基因表達報道物(框-獨立的LacZ基因)啟動的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因組成，所述非同源序列以與GPR12基因相同的方向排列。(b)胚胎干細胞的轉(zhuǎn)染和分析胚胎干細胞(EvansandKaufman，1981)培養(yǎng)在新霉素抗性胚胎纖維母細胞培養(yǎng)層上，生長于Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中補充有20％胎牛血清，10％新生牛血清，2mM谷氨酰胺，非必需氨基酸，100μM2-巰基乙醇和500u/ml白血病抑制因子。培養(yǎng)基每天更換，ES細胞每三天傳代一次。5×106ES細胞用5μg線性化的質(zhì)粒通過電穿孔(25μF電容(capacitance)和400伏特)轉(zhuǎn)染。電穿孔24小時以后，轉(zhuǎn)染的細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)9天，所述培養(yǎng)基含有200μg/ml新霉素。將克隆挑入96孔板，用PCR篩選之前進行復(fù)制和擴增，以鑒定其中在內(nèi)源GPR12基因和靶向型構(gòu)建體之間發(fā)生了同源重組的克隆。所鑒定的陽性克隆比例通常為1-5％。擴增這些克隆以允許復(fù)制子被冷凍，制備足夠高的量的DNA用于利用外部5’和3’探針通過Southern印跡證實靶向型事件，所有均利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Russ，etal.，2000，Nature2000Mar2；404(6773)95-9)。(c)GPR12缺陷小鼠的產(chǎn)生使C57BL/6雌性和雄性小鼠交配并分離孕3.5天的胚泡。10-12個來自所選克隆的細胞被注入每個胚泡，7-8個胚泡被植入假孕F1雌性小鼠的子宮。出生的嵌合同窩幼仔含有多只高水平(達100％)的具深淺環(huán)紋的雄性(深淺環(huán)紋外皮顏色指示來自靶向的克隆的細胞后代的分布)。雄性嵌合體與雌性以及MF1和129小鼠交配，種系傳播分別通過深淺環(huán)紋外皮顏色以及PCR基因分型來確定。其它非人轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明還涉及非人轉(zhuǎn)基因動物，其導(dǎo)致GPR12受體的過表達或低表達(與適宜對照相比)。所述動物可用于鑒定受體功能的激動劑和拮抗劑，其也為治療性的?？贵w如本文所述的抗體可用作GPR12多肽的激動劑或拮抗劑。為本發(fā)明的目的，除非具體指明為相反的含義，術(shù)語“抗體”包括但不限于，多克隆，單克隆，嵌合，單鏈，F(xiàn)ab片段以及Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。所述片段包括完整抗體的片段，其保持對靶物質(zhì)的結(jié)合活性，F(xiàn)v，F(xiàn)(ab’)和F(ab’)2片段，以及單鏈抗體(scFv)，融合蛋白和其它合成蛋白，其包含抗體的抗原結(jié)合片段。抗體及其片段可為人源化的抗體，例如EP-A-239400所述。此外，具有完整人可變區(qū)(或其片段)的抗體(例如US專利5,545,807和6,075,181中所述)也可使用。中和型抗體，即抑制物質(zhì)氨基酸序列的生物活性的那些，對于診斷和治療而言尤其優(yōu)選?？贵w也可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備，諸如免疫化和通過利用噬菌體展示文庫。本發(fā)明的多肽和肽可用于通過已知技術(shù)開發(fā)抗體。所述抗體可特異性結(jié)合GPR12蛋白和同源物，片段等。如果需要多克隆抗體，選定的哺乳動物(例如小鼠，兔子，山羊，馬等)可用免疫原組合物免疫，所述組合物包含本發(fā)明的多肽或肽。根據(jù)宿主的物種，各種佐劑可用于加強免疫反應(yīng)。所述佐劑包括，但不限弗氏(Freund’s)佐劑，礦物凝膠諸如氫氧化鋁，以及表面活性劑諸如溶血卵磷脂pluronic多元醇，多聚陰離子，肽，油乳劑，匙孔血藍蛋白，以及二硝基酚。BCG(卡介苗(BacilliCalmette-Guerin))和短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)可用作人佐劑，如其是純化的，可用于將物質(zhì)氨基酸序列給予免疫受損的個體以刺激系統(tǒng)防御。收集來自免疫的動物的血清并根據(jù)已知方法處理。如果含有可得自本發(fā)明多肽表位的多克隆抗體的血清含有針對其它抗原的抗體，所述多克隆抗體可通過免疫親合層析純化。用于制備并加工多克隆抗血清的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。為了制備所述的抗體，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的氨基酸序列或其片段，其對其它氨基酸序列半抗原化，在動物或人類中用作免疫原。針對可得自本發(fā)明的多肽或肽的表位的單克隆抗體也可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易制備。通過雜交瘤制備單克隆抗體的常用方法是已知的。永生化的抗體生成細胞系可通過細胞融合產(chǎn)生，并且也通過其它技術(shù)諸如利用原癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細胞，或用EB病毒轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生?？珊Y選產(chǎn)生的針對眶表位的單克隆抗體的圖譜(panel)的各種性質(zhì)；即篩選同種型和表位親和力。單克隆抗體可利用任何提供通過連續(xù)細胞系培養(yǎng)基中的產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)來制備。這些包括，但不限于，雜交瘤技術(shù)，最初由KoehlerandMilstein(1975Nature256495-497)描述，三交瘤(trioma)技術(shù)，人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor.，etal.，(1983)ImmunolToday472；Cote.，etal.，(1983)ProcNatlAcadSci802026-2030)，EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole.，etal.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，pp.77-96，AlanR.Liss，Inc.，1985)。此外，可采用被開發(fā)用于制備“嵌合抗體”的技術(shù)，即小鼠抗體基因與人抗體基因的拼接以獲得具有適當(dāng)抗原特異性以及生物活性的分子(Morrison.，etal.，(1984)ProcNatlAcadSci816851-6855；Neuberger.，etal.，(1984)Nature312604-608；Takeda.，etal.，(1985)Nature314452-454)?？蛇x，被描述用于制備單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,779)可用于制備物質(zhì)特異性單鏈抗體。針對來自本發(fā)明的多肽和肽的表位的單克隆和多克隆抗體，具體用于診斷中，其中中和型的那些抗體可用于被動免疫。具體地，單克隆抗體可用于激發(fā)抗獨特型抗體?？躬毺匦涂贵w是攜帶物質(zhì)的“內(nèi)部”圖像的免疫球蛋白和/或需要針對其的保護的藥劑。用于激發(fā)抗獨特性抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。這些抗獨特型抗體也可用于治療?？贵w也可通過誘導(dǎo)在淋巴細胞群體中的體內(nèi)生成或通過篩選重組免疫球蛋白文庫或高特異性結(jié)合藥劑的圖如Orlandi.，etal.，(1989，ProcNatlAcadSci863833-3837)，以及WinterG和MilsteinC(1991；Nature349293-299)公開的。含有多肽或肽的特異性結(jié)合位點的抗體片段也可產(chǎn)生。例如，所述片段包括，但不限于F(ab’)2片段，其可通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生，以及Fab片段，其可通過還原F(ab’)2片段的二硫橋產(chǎn)生。可選，F(xiàn)ab表達文庫可被構(gòu)建以允許快速并容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段(HuseWD.，etal.，(1989)Science2561275-1281)。用于制備單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)也可用于制備本發(fā)明多肽的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物體包括其它哺乳動物也可用于表達人源化的抗體。因此，本發(fā)明人考慮GPR12抗體或包含其的組合物，具體可用于治療神經(jīng)性、生殖激素相關(guān)的以及其它疾病。所述神經(jīng)疾病包括但不限于以下疾病中的任何一或多種阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。診斷實驗另一方面，本發(fā)明提供診斷選自下組的疾病或病癥的方法阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步驟選擇來自待診斷患者的細胞樣品；和比較細胞樣品與一或多種來自健康個體的對照樣品中的GPR12多肽的表達水平和/或功能活性。本發(fā)明還涉及利用GPR12多核苷酸，編碼多核苷酸的GPR12肽配體的多核苷酸以及多肽(以及其同源物，變體或衍生物)，作為診斷劑用于診斷或用于基因分析的用途?；パa于或能與GPR12核酸(包括同源物，變體和衍生物)雜交的核酸，以及針對GPR12多肽的抗體和GPR12配體多肽可用于所述測定法中。檢測GPR12基因或其它天然配體基因的與功能障礙相關(guān)的突變形式將提供診斷工具，其可添加或限定由于GPR12或其天然配體的表達低下，過表達或表達改變導(dǎo)致的疾病或?qū)λ黾膊〉囊赘行缘脑\斷。攜帶GPR12基因中的突變的個體(包括控制序列)可通過各種技術(shù)在DNA水平檢測。例如，DNA可分離自患者，切GPR12的DNA多態(tài)性模式可測定。鑒定的模式與已知患有與GPR12過表達、表達低下或表達異常相關(guān)的疾病的患者的對照比較。表達與GPR12相關(guān)疾病相關(guān)的遺傳多態(tài)性模式的患者隨后被鑒定。GPR12基因的遺傳分析可通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進行。例如，個體可通過測定GPR12等位基因的DNA序列通過RFLP或SNP分析等來篩選。通過檢測GPR12基因序列中的DNA或任何控制其表達的序列中多態(tài)性的存在，患者可被鑒定為具有對與GPR12過表達、表達低下或表達異常相關(guān)的疾病的遺傳易感性。如此鑒定的患者可隨后被治療以防止GPR12相關(guān)疾病的出現(xiàn)，或在GPR12或相關(guān)疾病的早期階段更為積極進行以防止疾病的進一步出現(xiàn)或發(fā)展。GPR12相關(guān)疾病包括阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。優(yōu)選的實施方案中，GPR12相關(guān)疾病包括阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病中的任意一種。本發(fā)明進一步公開了試劑盒，其用于鑒定與GPR12相關(guān)疾病有關(guān)的患者遺傳多態(tài)性模式。所述試劑盒包括DNA樣品收集裝置以及用于測定遺傳多肽性模式的裝置，其隨后與對照樣品比較以測定患者對GPR12相關(guān)疾病的易感性。也提供用于診斷GPR12相關(guān)疾病的試劑盒包含GPR12多肽和/或針對所述多肽(或其片段)的抗體。用于診斷的核酸可獲自受試者的細胞，諸如來自血液，尿液，唾液，組織活檢或尸檢物質(zhì)。優(yōu)選的實施方案中，所述DNA獲自來自收集在吸收紙上的患者指血的血細胞。在優(yōu)選實施方案中，所述血液收集在AmpliCardTM(UniversityofSheffield，DepartmentofMedicineandPharmacology，RoyalHallamshireHospital，Sheffield，EnglandS102JF)上。所述DNA可直接用于檢測或可利用PCR或其它擴增技術(shù)進行酶促擴增然后進行分析?？芍苽浒邢蚰康幕蛑械奶禺愋远鄳B(tài)性DNA區(qū)域的寡核苷酸DNA引物使得實現(xiàn)靶序列擴增的PCR反應(yīng)。RNA或cDNA也可以類似方式用作模板。自模板DNA擴增的DNA序列隨后利用限制酶分析以確定存在擴增的序列中的遺傳多態(tài)性，并由此提供患者中的遺傳多態(tài)性圖譜。限制片段長度可通過凝膠分析鑒定。可選或同時，也可采用諸如SNP(單核苷酸多態(tài)性)分析。缺失和插入可通過擴增的產(chǎn)物與正?；蛐拖啾鹊拇笮「淖儊頇z測。點突變可通過使擴增的DNA與標(biāo)記的GPR12核苷酸序列雜交來鑒定。非常匹配的序列可通過RNase消化和通過融解溫度的差異來與錯配雙鏈區(qū)分。DNA序列差異可通過DNA片段在凝膠中的電泳淌度(mobility)的改變(所述凝膠中含有和不含有變性劑)，或通過直接DNA測序來檢測。見，例如，Myers.，etal.，Science(1985)2301242。特定位點的序列改變也可通過核酸酶保護試驗來顯示，諸如RNase和S1保護或化學(xué)裂解方法。見Cotton.，etal.，ProcNatlAcadSciUSA(1985)854397-4401。其它實施方案中，可構(gòu)建包含GPR12核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針的陣列以有效篩選，例如基因突變。陣列技術(shù)方法是已知的并具有廣泛的可用性，并可用于說明包括基因表達、遺傳連鎖以及遺傳變異在內(nèi)的多種分子遺傳學(xué)問題。(見例如M.Chee.，etal.，Science，Vol274，pp610-613(1996))。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)可用于檢測突變體和野生型核酸之間的電泳淌度差異(Orita.，etal.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA862766，seealsoCotton(1993)Mutat.Res.285125-144；andHayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.973-79)。樣品的單鏈DNA片段和對照GPR12核酸可被變性并允許復(fù)性。不同序列的單鏈核酸的二級結(jié)構(gòu)不同，產(chǎn)生的電泳淌度改變使得能夠檢測甚至單個堿基的改變。DNA片段可被標(biāo)記或用標(biāo)記的探針檢測。試驗的敏感度可通過利用RNA(而不是DNA)來提高，其中所述二級結(jié)構(gòu)對序列中的改變更為敏感。優(yōu)選的實施方案中，受試方法利用基于電泳淌度的改變對分離的雙鏈異二聚體分子的異源雙鏈分析(Keen.，etal.，(1991)TrendsGenet7:5)。通過用所述方法檢測GPR12基因中的突變，診斷試驗提供診斷和測定對感染諸如細菌、真菌、原生動物和病毒感染的易感性，具體是HIV-1或HIV-2導(dǎo)致的感染；疼痛；癌癥；糖尿病，肥胖；食欲減退；貪食癥；哮喘；帕金森氏癥；血栓形成；急性心衰；低血壓；高血壓；勃起功能障礙；尿潴留；代謝性骨病諸如骨質(zhì)疏松和大理石樣骨??；心絞痛；心肌梗死；潰瘍；哮喘；過敏；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；炎性腸病；腸易激綜合征；良性前列腺肥大；以及精神和神經(jīng)疾病，包括焦慮，精神分裂癥，燥狂型抑郁癥，譫妄，癡呆，嚴重智力落后和運動功能障礙，諸如亨廷頓氏癥或GillesdelaTourett′s綜合征。具體優(yōu)選的實施方案中，所述診斷試驗用于診斷或測定對阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病的易感性。GPR12多肽和核酸的存在可在樣品中檢測。因此，上述的感染和疾病可通過這樣的方法診斷，其中包含測定源自受試者的樣品中GPR12多肽或GPR12mRNA的水平的異常降低或增加。所述樣品可包含來自患有或可疑患有與GPR12表達的增加，降低或其它異常相關(guān)的疾病的生物體的細胞或組織樣品，包括表達水平或模式的空間或時間改變?；加谢蚩梢苫加兴黾膊〉纳矬w中的GPR12表達的水平或模式可與正常生物體中的表達水平或模式相比較作為診斷疾病的手段。因此通常，本發(fā)明包括檢測樣品中包含GPR12核酸的核酸的存在，通過將樣品與至少一種特異于所述核酸的核酸探針接觸，并監(jiān)測所述樣品中核酸的存在來進行。例如，所述核酸探針可特異性結(jié)合GPR12核酸或其一部分，并檢測二者之間的結(jié)合；所述復(fù)合體本身的存在也可被檢測。此外，本發(fā)明包括檢測GPR12多肽的存在的方法，通過將細胞樣品與能夠結(jié)合多肽的抗體接觸，以及監(jiān)測所述樣品中該多肽的存在來進行。這可通過監(jiān)測抗體和多肽之間形成的復(fù)合體的存在來實現(xiàn)，或檢測所述多肽與抗體之間的結(jié)合。檢測兩種實體之間的結(jié)合的方法是本領(lǐng)域已知的，并包括FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)，表面胞質(zhì)團共振等。降低或增加的表達可利用本領(lǐng)域已知用于定量多核苷酸的任何方法諸如PCR，RT-PCR，RNase保護，Northern印跡和其它雜交方法在RNA水平測定?？捎糜跈z測源自宿主的樣品中的蛋白質(zhì)諸如GPR12的水平的實驗技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。所述實驗方法包括免疫測定法，競爭結(jié)合測定法，Western印跡分析以及ELISA實驗。本發(fā)明涉及診斷疾病或疾病易感性的試劑盒，所述疾病包括阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病中的任何一種。具體優(yōu)選的診斷試劑盒用于檢測或診斷疾病或?qū)σ韵录膊≈腥我庖环N的易感性阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。所述診斷試劑盒包含GPR12多核苷酸或其片段；互補核苷酸序列；GPR12多肽或其片段，或抗GPR12多肽抗體。預(yù)防和治療方法本發(fā)明提供了治療與GPR12多肽活性的量過剩或不足相關(guān)的異常疾病的方法，并且考慮到GPR12多肽，其結(jié)合蛋白和/或編碼它們的核酸可具體用于治療神經(jīng)性，生殖激素相關(guān)的，以及其它一些疾病。所述神經(jīng)疾病包括但不限于以下疾病中的任何一或多種阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。如果GPR12活性過量，可采用多種方法。一種方法包括給予受試者本文所述的抑制性化合物(拮抗劑)以及可藥用的載體，其量可通過阻斷配體與GPR12的結(jié)合，或通過抑制第二信號有效抑制活化，并由此緩解異常疾病。其它方法中，可給藥仍能與內(nèi)源GPR12競爭結(jié)合配體的GPR12多肽的可溶形式。這種競爭物的常見實施方案包括GPR12多肽的片段。其它方法中，編碼內(nèi)源GPR12多肽的基因的表達可利用表達阻斷技術(shù)來抑制。已知的所述技術(shù)包括反義序列的使用，而無論其是內(nèi)部生成的或是分別給藥的。見，例如，O’Connor，JNeurochem(1991)56560inOligodeoxynucleotidesasAntisenseInhibitorsofGeneExpression，CRCPress，Bocaraton，F(xiàn)la.(1988)?？蛇x，可采用與該基因形成三螺旋的寡核苷酸。見，例如，Lee.，etal.，NucleicacidsRes(1979)63073；Cooney.，etal.，Science(1988)241456；Dervan.，etal.，Science(1991)2511360。這些寡聚物自身可給藥或相關(guān)寡聚物可在體內(nèi)表達。為治療與GPR12表達低下及其活性相關(guān)的異常疾病，也可采用多種方法。一種方法包括給予受試者治療有效量的化合物，其模擬配體結(jié)合的GPR12，即上述激動劑，與可藥用的載體聯(lián)合，由此緩解所述異常疾病。可選，基因治療可用于實現(xiàn)通過受試者中相關(guān)細胞的GPR12的內(nèi)源性產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的多核苷酸可被改造用于在復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中表達，如上所述。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒表達構(gòu)建體可隨后被分離，并導(dǎo)入用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細胞，所述載體含有編碼本發(fā)明多肽的RNA，使得所述包裝細胞現(xiàn)在產(chǎn)生含有目的基因的感染性病毒顆粒。這些產(chǎn)生者細胞可給予受試者用于在體內(nèi)改造細胞并在體內(nèi)表達所述多肽。對于基因治療的綜述，參見HumanMolecularGenetics，TStrachanandAPRead，BIOSScientificPublishersLtd(1996)中的Chapter20，GeneTherapyandOtherMolecularGenetic-basedTherapeuticApproaches。配制和給藥肽，諸如GPR12多肽的可溶形式，以及激動劑和拮抗劑肽或小分子，可與適宜的可藥用載體配制在一起。所述配制劑包含治療有效量的多肽或化合物，以及可藥用載體或賦形劑。所述載體包括但不限于，鹽水，緩沖的鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其組合。配制應(yīng)當(dāng)適合給藥方式，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明還涉及藥物包以及試劑盒，其含有一或多個充滿了本發(fā)明前述組合物的一或多種成分的容器。本發(fā)明的多肽和其它化合物可單獨使用或與其它化合物聯(lián)用，諸如治療性化合物。系統(tǒng)給藥所述藥物組合物的優(yōu)選形式包括注射，通常通過靜脈內(nèi)注射。其它注射途徑，諸如經(jīng)皮下，經(jīng)肌內(nèi)或經(jīng)腹腔內(nèi)，也可使用?？蛇x用于系統(tǒng)給藥的方式包括利用穿透劑諸如膽鹽或梭鏈孢酸(fusidicacid)或其它清潔劑的透粘膜和透皮給藥。此外，如果適當(dāng)配制在腸溶或包被的制劑中，口服給藥也是可能的。這些化合物的給藥也可是局部的和/或局限化的，采用軟膏，糊劑，凝膠等的形式。所述劑量范圍需要依賴于所選的肽，給藥途徑，配制劑的形式，受試者疾病的性質(zhì)，以及臨床醫(yī)師的判斷。但適宜的劑量的范圍是0.1-100μg/kg受試者。然而，所需劑量中的較大變化可預(yù)期根據(jù)可得化合物的種類以及各種給藥途徑的效率不同而異。例如，預(yù)期口服給藥需要高于通過靜脈給藥的劑量。這些劑量水平的不同可利用經(jīng)驗優(yōu)化途徑調(diào)整，這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。用于治療的多肽也可是在受試者中內(nèi)源產(chǎn)生，在治療模式中通常稱為如上所述“基因治療”。因此，例如來自受試者的細胞可用多核苷酸改造，諸如DNA或RNA，以離體編碼多肽，并例如利用逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒載體。所述細胞隨后被導(dǎo)入受試者。藥物組合物本發(fā)明還提供了藥物組合物，包括給藥治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的GPR12多肽，其結(jié)合分子或編碼它們的核酸，以及可選的可藥用載體，稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。所述藥物組合物可在人和動物藥物中用于人或動物，并將通常包含一或多種可藥用稀釋劑，載體或賦形劑。用于治療用途的可接受載體或稀釋劑是制藥領(lǐng)域已知的，并在例如Remington’sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中描述。藥物載體，賦形劑或稀釋劑的選擇可根據(jù)意圖給藥途徑以及標(biāo)準(zhǔn)制藥實踐來選出。所述藥物組合物可包含作為或作為除載體，賦形劑或稀釋劑以外的任何適宜的粘合劑，潤滑劑，懸浮劑，包被劑，助溶劑。防腐劑，穩(wěn)定劑，染料以及甚至調(diào)味劑可在藥物組合物中提供。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉，山梨酸和p-羥基苯甲酸的酯。也可使用抗氧化劑和懸浮劑。根據(jù)不同遞送系統(tǒng)，存在不同組合物/配制劑的要求。通過舉例，本發(fā)明的藥物組合物可配制成利用微型泵或經(jīng)粘膜途徑遞送，例如作為鼻噴霧或氣溶膠用于吸入或內(nèi)服溶液，或經(jīng)胃腸外遞送，其中所述組合物配制成可注射的形式，用于通過例如經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)肌內(nèi)或經(jīng)皮下途徑遞送?？蛇x，所述配制劑可被設(shè)計為經(jīng)兩種途徑遞送。所述藥劑經(jīng)胃腸道粘膜遞送，其將能夠在通過胃腸道運送的過程中保持穩(wěn)定；例如，其應(yīng)抵抗蛋白水解降解，在酸性pH穩(wěn)定并對膽汁的清潔效應(yīng)抵抗。適宜的情況下，所述藥物組合物可通過吸入給藥，以栓劑或陰道栓的形式給藥，以洗液、溶液、乳膏、油膏或粉末的形式經(jīng)局部給藥，通過使用皮膚貼劑給藥，以含有賦形劑諸如淀粉或乳糖的片劑的形式口服給藥，或單獨或與賦形劑混合在膠囊或扁囊中給藥，或以酏劑、含有調(diào)味劑或著色劑的溶液或懸液的形式給藥，或它們可經(jīng)胃腸外諸如，例如經(jīng)靜脈內(nèi)，經(jīng)肌內(nèi)或經(jīng)皮下給藥。對于經(jīng)胃腸外給藥，所述組合物最好以無菌含水溶液的形式使用，其中包含其它物質(zhì)，例如足夠的鹽或單糖以制備與血液等張的溶液。對于經(jīng)頰或舌下給藥，所述組合物可以片劑或錠劑的形式給藥，其可以常規(guī)方式配制。給藥通常，醫(yī)師將確定最適合個體受試者的實際劑量，其隨具體患者的年齡，體重和反應(yīng)而不同。以下劑量是平均情況的示例。當(dāng)然可以存在個別情況，其中較高或較低的劑量范圍有利。本發(fā)明的藥物組合物可通過直接注射給藥。所述組合物可配制用于經(jīng)胃腸外，經(jīng)粘膜，經(jīng)肌內(nèi)，經(jīng)靜脈內(nèi)，經(jīng)皮下，經(jīng)眼內(nèi)或透皮給藥。通常，每種蛋白可以0.01-30mg/kg體重的劑量給藥，優(yōu)選0.1-10mg/kg，更優(yōu)選0.1-1mg/kg體重。術(shù)語“給藥”包括通過病毒或非病毒技術(shù)遞送。病毒遞送機制包括但不限于腺病毒載體，腺伴隨病毒(GPR12V)載體，皰疹病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，和桿狀病毒載體。非病毒遞送機制包括脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，陽離子表面兩性分子(CFAs)及其組合。所述遞送機制的途徑包括但不限于，經(jīng)粘膜，經(jīng)鼻，經(jīng)胃腸外，經(jīng)胃腸道，經(jīng)局部或經(jīng)舌下途徑。術(shù)語“給藥”包括但不限于，通過粘膜途徑，例如作為鼻噴霧或氣溶膠用于吸入或作為可攝入的溶液遞送；經(jīng)胃腸外途徑遞送，其中遞送通過可注射的形式，諸如經(jīng)靜脈內(nèi)，經(jīng)肌內(nèi)或經(jīng)皮下途徑進行。術(shù)語“共給藥的”指例如本發(fā)明的多肽和其它實體諸如佐劑的每一種的給藥位點和時間，使得實現(xiàn)免疫系統(tǒng)的必要調(diào)節(jié)。因此，雖然所述多肽和佐劑可同時給藥同一位點，在不同于佐劑的時間和給藥位點給藥多肽可以是有利的。所述多肽和佐劑甚至可在相同的遞送載體中遞送，并且所述多肽和抗原可偶聯(lián)和/或非偶聯(lián)和/或基因偶聯(lián)和/或非偶聯(lián)的。所述多肽，多核苷酸，肽，核苷酸，以及可選的佐劑可作為單個劑量或在多個劑量中分別給藥或共同給藥宿主受體。本發(fā)明的藥物組合物可通過多種給藥途徑給藥，諸如注射(其包括胃腸外，經(jīng)皮下和經(jīng)肌內(nèi)注射)，經(jīng)鼻內(nèi)，經(jīng)粘膜，口服，經(jīng)陰道內(nèi)，經(jīng)尿道或經(jīng)眼給藥。本發(fā)明的藥物組合物可常規(guī)經(jīng)胃腸外給藥，其通過注射，例如經(jīng)皮下或經(jīng)肌內(nèi)進行。其它適于其它給藥模式的配制劑包括栓劑，并且在一些情況中，口服制劑。對于栓劑，常規(guī)粘合劑和載體可包括，例如聚烷撐二醇或甘油三酯；所述栓劑可從含有活性成分的混合物形成，所述活性成分的范圍為0.5％-10％，可為1％-2％?？诜苿┌ㄋ龀Ｒ?guī)應(yīng)用的賦形劑，諸如藥物級別的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。這些組合物為溶液，懸液，片劑，丸劑，膠囊，持續(xù)釋放配制劑或粉末的形式，并含有10％-95％的活性成分，優(yōu)選25％-70％。如果所述疫苗組合物是凍干的，所述凍干的物質(zhì)可被溶解然后給藥，例如作為懸液給藥。溶解優(yōu)選在緩沖液中進行。本發(fā)明現(xiàn)在參照具體實施例描述，其不應(yīng)被認為是對本發(fā)明的限制。實施例1.轉(zhuǎn)基因GPR12敲除小鼠構(gòu)建GPR12基因靶向型載體含有PAC的小鼠GPR12基因利用放射活性標(biāo)記的PCR片段鑒定，所述片段含有部分編碼序列。其它側(cè)接編碼序列的基因組序列可利用限制位點錨定的PCR技術(shù)由內(nèi)部獲得。組裝8kb帶缺口的片段組(contig)，提供足夠的序列信息以允許設(shè)計靶向型載體。隨后的生物信息工作將該片段組延伸到14kb，并填充了缺失的序列。該片段組提供了足夠的側(cè)接序列信息，使得能夠設(shè)計同源臂以克隆入靶向型載體(所用靶向型載體的結(jié)構(gòu)，包括相關(guān)限制位點，顯示于圖3)。小鼠GPR12基因具有單個編碼型外顯子。靶向型策略設(shè)計為去除部分編碼外顯子，然后是7tm編碼結(jié)構(gòu)域的開始，并包括整個7tm結(jié)構(gòu)域。側(cè)接待缺失含7tm的區(qū)域的3.7kb5’同源臂和1.1kb3’同源臂通過PCR擴增并且將所述片段克隆入靶向型載體。用于擴增所述臂的每個寡核苷酸引物的5’末端被合成為含有罕見切割型(rare-cutting)限制酶的不同識別位點，與載體多聚接頭的克隆位點相容，并且其本身自臂缺乏。在GPR12的情況下，所述引物被設(shè)計為下表所列的序列，具有NotI/SpeI的5’臂克隆酶以及AscI/FseI的3’臂克隆酶。除了臂引物對(5’臂F/5’臂R)和(3’臂F/3’臂R)，設(shè)計其它GPR12基因座特異性引物用于以下目的5’和3’探針引物對(5’prF/5’prR和3’prF/3’prR)以擴增每個臂的外部以及延伸超過每條臂的非重復(fù)性基因組DNA的兩個短的150-300bp片段，以允許對分離的推定靶向的克隆中被靶向的基因座進行Southern分析；小鼠基因分型引物對(hetF和hetR)，其允許野生型，雜合子和純合子小鼠之間的區(qū)分，當(dāng)其用于利用載體特異性引物的多聚體PCR中，在本發(fā)明情況中為Asc403；最后是靶篩選引物(3’scr)，其在3’臂區(qū)的末端的下游退火，并且其與特異于載體(neo36)3’末端的引物配對時產(chǎn)生靶事件特異性1.5kb擴增物。所述擴增物可僅僅源自來自細胞的模板DNA，其中所需的基因組改變已經(jīng)出現(xiàn)并允許從含有隨機整合的拷貝的載體的克隆的背景鑒定正確靶向的細胞。這些引物的位置以及用于靶向策略中的GPR12基因座基因組結(jié)構(gòu)顯示于SEQIDNO14(圖7)。musGPR125’prFGPR12actcatggctgcctagagcGPR12cttg-SeqID1musGPR125’prRTggtgtgcttGPR12gacttttgttaccac-SeqID2GPR12GPR12GPR12gcggccgcGPR12cagtcattcGPR12ggagcGPR12gGmusGPR125’臂FPR12gtc-SeqID3musGPR125’臂RTtttttactagtgggaggggacagcggctgagatgttc-SeqID4musGPR123’臂FGPR12GPR12GPR12ggcgcgccagGPR12agccctctgcctcatttgctg-SeqID5musGPR123’臂RTttttggccggccgcttcagatgcGPR12tttgccctaccGPR12c-SeqID6musGPR123’scrTgtgccattcaggGPR12ttctttcacttc-SeqID7musGPR123’prFActaggtctgaggcacgcccagctGPR12c-SeqID8musGPR123’prRAcagccatgagcccattgcGPR12actgag-SeqID9musGPR12hetFGPR12AGGGGTCTCGACCCTGGCTCTCATC-SeqID10musGPR12hetRGATGCACCCACAGCGPR12ATGAGGCAGAG-SeqID11Asc403CAGCCGGPR12CTGTTCGCCAGGCTCGPR12GG-SeqID12Neo36CGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGAC-SeqID13表1.GPR12引物序列選擇同源臂的位置以通過缺失所有7個跨膜區(qū)功能破壞GPR12基因。制備靶向型載體，其中待缺失的GPR12序列被位于選擇盒上游的內(nèi)源基因表達報道物(框架非依賴性lacZ基因)組成的非同源序列取代，所述表達盒由與GPR12基因方向相同的啟動的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因組成。一旦5’和3’同源臂已經(jīng)被克隆入靶向型載體pTK5IBLMNL(見圖5)，較大的高純度DNA制備物通過利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備。20μg新鮮制備的無內(nèi)毒素DNA用其它罕見的切割限制酶PmeI限制切割，其存在于載體骨架中氨芐西林抗性基因和復(fù)制的細菌起點之間的獨特位點。線性化的DNA隨后被沉淀并重懸于100μl磷酸鹽緩沖的鹽水，備用于電穿孔。電穿孔后24小時，經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞在含有200μg/ml新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)9天?？寺”惶羧?6孔板，復(fù)制并擴增，然后通過PCR篩選(利用引物3’scr和neo36，如上所述)以鑒定其中同源重組在內(nèi)源GPR12基因和靶向型構(gòu)建體之間發(fā)生的克隆。鑒定的陽性克隆比例為1-5％。這些克隆被擴增以允許復(fù)制物被冷凍，并且制備足夠的高質(zhì)量DNA用于利用如上制備的外部5’和3’探針通過Southern印跡證實靶向型事件，所有都利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Russ，.etal.，Nature2000Mar2；404(6773)95-99)。當(dāng)用診斷性限制酶消化的DNA的Southern印跡與外部探針雜交時，同源靶向的ES細胞克隆通過突變體帶以及未改變的野生型帶的存在證實。例如，利用5’探針，EcoRI消化的DNA將產(chǎn)生5.5kb野生型帶，和4.0kb靶向的帶。類似地，利用3’探針，BamHI將產(chǎn)生3.9kb野生型帶，和1.5kb靶向的帶。敲除前小鼠GPR12的基因組基因座的結(jié)構(gòu)在圖1描述。敲除后小鼠GPR12的基因組基因座的結(jié)構(gòu)在圖2中顯示。Southern證實相關(guān)酶的位點已經(jīng)被標(biāo)明。GPR12GPCR缺陷小鼠的產(chǎn)生使C57BL/6雌性和雄性小鼠交配并在孕3.5日分離胚泡。來自所選克隆的10-12個細胞被注入每個胚泡并將7-8個胚泡植入假孕F1雌性的子宮。嵌合小鼠同窩幼仔出生時含有數(shù)只高水平(達100％)帶深淺環(huán)紋的雄性(所述深淺環(huán)紋外皮顏色表明靶向的克隆的后代的細胞的貢獻)。這些雄性嵌合小鼠與雌性MF1和129小鼠交配，種系傳遞通過深淺環(huán)紋外皮顏色并通過PCR基因分型分別確定。PCR基因分型在裂解的尾片段(lysedtailclips)上，利用引物hetF和hetR以及第三種載體特異性引物(Asc403)進行。該多聚體PCR允許從野生型基因座(如果存在)自引物hetF和hetR擴增，產(chǎn)生219bp帶。hetF的位點在敲除小鼠中缺失，使得從靶向的等位基因的擴增失敗。然而，Asc403引物將從靶向的基因座擴增441bp帶，其中聯(lián)合hetR引物，其與3’臂內(nèi)部的區(qū)域退火。因此，該復(fù)合體PCR解釋同窩幼鼠的基因型如下野生型樣品將顯示單個219bp帶；雜合DNA樣品產(chǎn)生兩條位于219bp和441bp的帶；純合樣品將僅僅顯示靶特異性441bp帶。實施例2B)結(jié)果I)基因表達模式1)電子Northern利用電子Northern，所述基因顯示在以下器官中表達睪丸，小腸，肺，腦，心臟和脾(圖4)。2)LacZ染色的結(jié)構(gòu)列表LacZ染色顯示Annie在腦內(nèi)的強表達以及具體在嗅球、梨狀皮質(zhì)(嗅覺)，紋狀體(計劃和調(diào)節(jié)運動途徑，也參與多種其它認知過程包括執(zhí)行功能)，丘腦(接受聽覺，軀體感覺和視覺感覺信號)，海馬(在學(xué)習(xí)和記憶鞏固中重要)，膝狀體核(外側(cè)視覺；中間聽覺)和皮質(zhì)中表達。II)解剖觀察一些雄性的背部具有白色成片的皮毛。敲除動物中沒有觀察到明顯的解剖學(xué)缺陷。III)行為對所有動物進行圈養(yǎng)，可自由獲取食物和水，在12小時光/12小時黑暗的光-黑暗周期中進行，在7am開始給光。在設(shè)定的時間檢測動物以避免生理節(jié)奏效應(yīng)。試驗顯示突變體和野生型之間的差異。a).Pop-Map雄性敲除小鼠顯示對于倒置柵格以及線操作的抓握表現(xiàn)差。b).Rotarod雄性敲除小鼠在加速rotarod上表現(xiàn)不佳。對于雌性突變體沒有觀察到差異。這指示小腦學(xué)習(xí)和運動協(xié)調(diào)，以及運動疾病諸如帕金森氏癥和亨廷頓舞蹈癥(Huntington’sChorea)。c).足跡/步態(tài)試驗據(jù)觀察突變體雄性步態(tài)異常，步距寬于野生型動物。d).擺尾試驗突變體雄性利用擺尾試驗檢測，該實驗室試驗用于檢測痛覺，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。該實驗用作敲除小鼠對感受傷害性疼痛的反應(yīng)的指征。觀察到所述突變體對熱誘導(dǎo)的疼痛顯示痛覺過敏。所述突變體據(jù)觀察擺動尾部的潛伏期較短(圖8)。e).熱板試驗熱板試驗用于指示敲除小鼠對感受傷害性疼痛的反應(yīng)。敲除小鼠對熱誘導(dǎo)的疼痛更為敏感，這可通過熱誘導(dǎo)的舔足潛伏期縮短證實。該試驗證實了以前在GPR12敲除小鼠的擺尾(tail-flick)實驗(圖9)中見到的痛覺過敏表型.f).水迷宮試驗水迷宮是廣泛用于評估嚙齒類空間學(xué)習(xí)能力的試驗。學(xué)習(xí)是作為整個實驗中達到隱藏的平臺的時間減少來評估的。這些數(shù)據(jù)提示利用空間線索學(xué)習(xí)隱藏平臺的位置的能力降低(圖10)。該試驗缺陷表示各種病理情況中的學(xué)習(xí)和記憶問題，諸如阿爾茨海默氏癥，老年性癡呆，或總體學(xué)習(xí)和記憶困難。g).LaborasLaboras是長期監(jiān)測系統(tǒng)，其使得嚙齒類能夠被長期檢測并評估它們的運動。過夜LABORAS監(jiān)測Annie小鼠顯示，與野生型小鼠相比它們具有降低的爬行傾向(持續(xù)時間(圖11a)和頻率(圖11b))。這些數(shù)據(jù)支持了rotarod數(shù)據(jù)并提示運動協(xié)調(diào)或力量缺陷。h).生化分析完整生化分析在來自Annie敲除小鼠的樣品上進行，包括血液生物化學(xué)和激素分析。雄性Annie敲除小鼠具有升高的肌酸激酶(CK)水平(圖12)。CK轉(zhuǎn)化ATP和肌酐稱為ADP和肌酸磷酸，并且在細胞損傷之后從心臟，骨骼肌以及腦釋放。CK的增加指示神經(jīng)肌肉疾病，例如心臟疾病，線粒體疾病，炎性肌病，肌無力，多發(fā)性肌炎，McArdle’s疾病，NMJ疾病，肌肉萎縮，ALS，甲狀腺功能低下-&甲狀腺功能亢進疾病，中央軸空病(centralcoredisease)，酸性麥芽糖酶缺乏，肌球蛋白尿癥，橫紋肌溶解，MND和類風(fēng)濕疾病。肌肉損傷也可通過行為研究中降低的運動協(xié)調(diào)/力量得到支持。生化分子中見到的其它明顯改變包括1.葡萄糖在3和9月齡雄性和3月齡雌性中增加(～20％)。增加的葡萄糖水平指示疾病諸如糖尿病以及肝病。2.肌酐(肌肉代謝廢物)在9月齡雄性中增加(增加的水平見于腎疾病和肌肉變性)。3.甘油三酯在3月齡雌性和9月齡雄性中增加(～25％)(指示肝病，甲狀腺功能減退，胰腺炎和MI)。4.尿酸(見于肝和腎中，是嘌呤代謝的終產(chǎn)物)在3月齡雄性和(～15％)9月齡雄性中增加(～80％)(增加的水平見于痛風(fēng)，感染，腎病，吸收障礙，肝損傷或過酸腎(overacidkidney))。5.白蛋白在9月齡雄性中增加(～25％)(增加的白蛋白見于肝病，多發(fā)性骨髓瘤)。6.門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(～80％)在3&9月雄性中增加(指示急性肝細胞損傷或肝炎)。總體結(jié)果提示肝或腎功能障礙。本文件中涉及的申請和專利中的每一個，以及其中引用或參照的每篇文獻，包括每篇申請和專利(“申請引用的文件”)，包括在每篇申請和專利的過程中以及任何申請引用的文獻中引用或涉及的產(chǎn)品的生產(chǎn)商說明或分類，均包含在本文作為參考。此外，本文引用的所有文獻，以及本文引用的文獻中的所有引用或參考文獻，以及本文引用或涉及的產(chǎn)品的任何生產(chǎn)商說明，包含在本文作為參考。本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種修飾和改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，不偏離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明已經(jīng)通過具體優(yōu)選實施方案描述，應(yīng)理解權(quán)利要求所述的發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)仫@示到所述具體實施方案，對其進行的修飾和添加應(yīng)在本發(fā)明范圍內(nèi)進行。實際上，實施本發(fā)明的所述模式的各種改變對于分子生物領(lǐng)域或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，意圖包含在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。此外，可針對獨立權(quán)利要求的特征對從屬權(quán)利要求的特征進行各種組合，并且不偏離本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.GPR12敲除哺乳動物，其包含一或多種細胞，所述細胞中的GPR12多肽在功能上無活性。2.權(quán)利要求1的GPR12敲除小鼠，其與野生型對照相比具有任意一或多種以下特征Rotarod測驗、倒置柵格、酒操縱測驗、步態(tài)試驗的成績降低。3.權(quán)利要求2的GPR12敲除小鼠，其具有選自下組的特征阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。4.產(chǎn)生一或多個包含一或多個功能失活的GPR12基因的哺乳動物細胞的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多個包含一或多個功能活性內(nèi)源GPR12基因的細胞；(b)將步驟(a)的一或多個細胞用功能失活的GPR12核酸進行轉(zhuǎn)染，所述核酸能夠通過同源重組與一或多個內(nèi)源GPR12基因進行重組；和(c)選擇一或多個其中的一或多個內(nèi)源GPR12基因已經(jīng)與功能失活的GPR12核酸發(fā)生同源重組的細胞。5.適于功能滅活宿主細胞內(nèi)的一或多個內(nèi)源GPR12基因的核酸構(gòu)建體，包括(a)非同源取代區(qū)；(b)位于所述非同源取代區(qū)上游的第一同源區(qū)；(c)突變的GPR12基因，其在表達時不編碼功能活性GPR12；(d)位于所述非同源取代部分的下游的第二同源區(qū)，所述第二同源區(qū)位于所述非同源取代區(qū)的下游，所述第二同源區(qū)具有與第二GPR基因有至少90％的同一性的核苷酸序列。6.組合物，其包含GPR12多肽，或其一或多種結(jié)合蛋白，或編碼它們的核酸，以及可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。7.鑒定GPR12多肽的功能活性的一或多種拮抗劑的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，其包含功能活性GPR12多肽；(b)用GPR12多肽的一或多種可能的拮抗劑處理所述一或多種哺乳動物；(c)檢測所述一或多種哺乳動物以確定所述哺乳動物是否顯示GPR12敲除小鼠的一或多種特征，所述特征選自以下特征組成的組阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿??；和(d)選擇顯示步驟(c)的一或多種特征的一或多種拮抗劑。8.權(quán)利要求的7的方法，其中步驟(c)包括檢測所述一或多種哺乳動物以確定那些哺乳動物是否顯示所述的特征。9.鑒定一或多種激動GPR12多肽的功能活性的分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，其中包含功能失活的GPR12多肽；(b)用一或多種可能的GPR12類似物處理所述一或多種哺乳動物，所述GPR12類似物有效激動GPR12活性的至少一個方面；(c)檢測根據(jù)步驟(b)處理的一或多種哺乳動物，確定所述經(jīng)處理的哺乳動物與根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種恢復(fù)的性質(zhì)；和(d)選擇所述一或多種GPR12-配體類似物，其使得根據(jù)步驟(a)選出的那些哺乳動物恢復(fù)野生型哺乳動物的一或多種特征。10.鑒定一或多種拮抗GPR12多肽的功能活性的分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，其中包含功能活性GPR12多肽；(b)用一或多種可能的GPR12拮抗劑處理所述一或多種哺乳動物，所述GPR12拮抗劑有效拮抗GPR12活性的至少一個方面；和(c)檢測根據(jù)步驟(b)處理的一或多種哺乳動物，確定所述經(jīng)處理的哺乳動物與根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種經(jīng)調(diào)節(jié)的性質(zhì)。11.轉(zhuǎn)基因GPR12敲除哺乳動物在一或多種化合物的生物效應(yīng)測定法中的用途。12.診斷選自以下疾病組成的組的疾病或病癥的方法阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步驟(a)選擇來自待診斷患者的細胞樣品；和(b)比較所述細胞樣品與來自健康個體的一或多種對照樣品中的GPR12多肽的表達水平和/或功能活性。13.轉(zhuǎn)基因動物，其中至少部分細胞中包含編碼選自下組的一或多種物質(zhì)的外源核酸GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑和GPR12活性的一或多種調(diào)節(jié)物。14.治療患者中選自下組的疾病的方法阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病，包含用治療有效量的選自下組的一或多種物質(zhì)治療所述患者的步驟GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑和GPR12活性的一或多種調(diào)節(jié)物。15.選自GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑和GPR12活性的一或多種調(diào)節(jié)劑組成的組的一或多種物質(zhì)在制備用于預(yù)防或治療患者中的疾病的藥物中的用途，所述疾病選自以下疾病組成的組阿爾茨海默氏癥以及相關(guān)疾病，帕金森氏癥，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動癥，運動神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發(fā)性骨髓瘤和糖尿病。16.操縱患者中的神經(jīng)元增殖和突觸形成的方法，包括用治療有效量的選自下組的一或多種物質(zhì)治療患者的步驟GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑以及GPR12活性的一或多種調(diào)節(jié)物。17.選自下組的物質(zhì)在制備用于操縱動物中的神經(jīng)元增殖和突觸形成的藥物中的用途GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑以及GPR12活性的一或多種調(diào)節(jié)物。全文摘要本發(fā)明涉及已知受體的新功能。具體地，本發(fā)明涉及鞘氨醇磷脂酰膽堿受體和/和其配體在神經(jīng)元和邊緣系統(tǒng)的操作以及疼痛的診斷和治療中的用途。文檔編號G01N33/50GK1893821SQ200480027168公開日2007年1月10日申請日期2004年9月8日優(yōu)先權(quán)日2003年9月19日發(fā)明者馬克·卡爾頓,約翰·狄克遜,阿蘭·亨德里克,索菲·梅塞杰,珍妮弗·M·霍伍德,德克·詹申請人:帕拉迪姆醫(yī)療有限公司