專利名稱:使用半乳凝集素-2基因內(nèi)單堿基多態(tài)性進(jìn)行的炎癥性疾病的判定方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及炎癥性疾病的診斷方法,該方法包含檢測存在于半乳凝集素-2基因中的基因多態(tài)性;還涉及該方法中使用的寡核苷酸、含有該寡核苷酸的炎癥性疾病診斷用試劑盒、以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù):
雖然生活方式發(fā)生變化以及有了新的藥理學(xué)方法,但包括心肌梗塞在內(nèi)的冠狀動脈疾病在很多國家都是主要的死亡原因(Breslow,J.L.,Nature Med.3,600-601,1997;Braunwald,E.,N.Engl.J.Med.,337,1360-1369,1997)。因此,人們強(qiáng)烈希望能夠鑒定這些發(fā)病的遺傳和環(huán)境因素。
已知共通的遺傳變異與患糖尿病或高血壓病等生活方式病的危險(xiǎn)性顯著相關(guān)(Risch,N.,等人.,Science,273,1516-1517,1996;Collins,F(xiàn).S.,等人.,Science,278,1580-1581,1997;Lander,E.S.,等人.,Science,274,536-539,1996)。鑒定多基因病的感受性基因的方法有利用“連鎖”的方法和利用“相關(guān)”的方法。連鎖分析是檢測疾病感受性基因座與遺傳標(biāo)志(主要是微衛(wèi)星)的座是否連鎖,即研究基因座之間的關(guān)系,而相關(guān)分析是檢測特定的遺傳標(biāo)志(主要是單堿基多態(tài)性SNP)的哪個形態(tài)(等位基因)與疾病相關(guān),即研究等位基因間的關(guān)系。因此可以說使用共通的變異作為標(biāo)志的相關(guān)分析比對疾病相關(guān)基因的局部存在進(jìn)行分析的連鎖分析作用更大。單堿基多態(tài)性(SNPs)是在探求與疾病的易患性或藥物反應(yīng)性有關(guān)的基因時(shí)有用的多態(tài)性標(biāo)志。SNPs對基因產(chǎn)物的質(zhì)或量有直接影響,也可能會增大某種疾病或藥物帶來嚴(yán)重副作用的危險(xiǎn)性。因此,通過探求多種SNPs,有望進(jìn)行疾病相關(guān)基因的鑒定或建立避免藥物副作用的診斷方法。
關(guān)于基因突變與心肌梗塞的關(guān)系,目前為止有對人前列環(huán)素合成酶基因的多態(tài)性進(jìn)行分析、判定心肌梗塞的遺傳因素的方法(日本特開2002-136291號公報(bào))等。但是,對于與心肌梗塞相關(guān)的基因突變的了解尚不十分清楚。
另一方面,已知目前哺乳類有10種半乳凝集素。其中的半乳凝集素-2與半乳凝集素-1顯示43%這樣高的同源性。半乳凝集素-2與半乳凝集素-1同樣,形成含有兩個14kDa亞單元的非共價(jià)鍵二聚體,在還原劑非存在下自凝聚,失去活性。另外,半乳凝集素-2與半乳凝集素-1相比,組織分布狹窄。半乳凝集素-1大量存在于以肌肉等間充組織為首的各種細(xì)胞系列中,但半乳凝集素-2在正常人組織中多見于以小腸下部為主的上皮細(xì)胞中。半乳凝集素-2的詳細(xì)功能尚未了解(Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol.9,No.45,(1997)87-93頁)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的課題是鑒定與心肌梗塞等炎癥性疾病的發(fā)病進(jìn)程有關(guān)的新型單堿基多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明另一個要解決的課題是利用鑒定出的SNP,提供心肌梗塞等炎癥性疾病的診斷方法或炎癥性疾病治療藥物的開發(fā)方法。
本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入地研究,結(jié)果,通過鑒定半乳凝集素-1和半乳凝集素-2基因產(chǎn)物與心肌梗塞感受性基因產(chǎn)物淋巴毒素-α(LTA)的結(jié)合、以及鑒定半乳凝集素-2基因內(nèi)的新型單堿基多態(tài)性(SNP)與心肌梗塞的發(fā)病進(jìn)程的相關(guān),完成了本發(fā)明。
即,本發(fā)明提供炎癥性疾病的判定方法,該方法包含檢測存在于半乳凝集素-2基因中的至少一種基因多態(tài)性。
優(yōu)選提供以下的炎癥性疾病的判定方法,該方法包含檢測存在于半乳凝集素-2基因中的至少一種單堿基多態(tài)性。
進(jìn)一步優(yōu)選提供以下的炎癥性疾病的判定方法,該方法包含檢測在SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的C/T多態(tài)性。
優(yōu)選炎癥性疾病是心肌梗塞。
本發(fā)明的另一方面提供一種寡核苷酸,該寡核苷酸可以與含有SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的、至少連續(xù)10個堿基序列、或其互補(bǔ)序列雜交,在權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法中作為探針使用。
本發(fā)明的又一方面提供一種寡核苷酸,該寡核苷酸可以擴(kuò)增含有SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的至少連續(xù)10個堿基序列、和/或其互補(bǔ)序列,在權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法中作為引物使用。
優(yōu)選引物為正向引物和/或反向引物。
本發(fā)明的另一方面提供炎癥性疾病診斷用試劑盒,該試劑盒包含一種或以上上述任一項(xiàng)記載的寡核苷酸。優(yōu)選炎癥性疾病為心肌梗塞。
本發(fā)明的又一方面提供半乳凝集素-2表達(dá)狀態(tài)的分析方法,該方法包含檢測在SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的C/T多態(tài)性。
本發(fā)明的另一方面提供炎癥性疾病治療藥物的篩選方法,該方法包含在候選物質(zhì)存在下,分析細(xì)胞內(nèi)半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表達(dá)量,選擇使該表達(dá)量變化的物質(zhì)的步驟。優(yōu)選提供以下炎癥性疾病治療藥物的篩選方法,該方法包含在候選物質(zhì)存在下分析細(xì)胞內(nèi)半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表達(dá)量,選擇使該表達(dá)量增加的物質(zhì)的步驟。
本發(fā)明的又一方面提供炎癥性疾病治療藥物的篩選方法,該方法包含在候選物質(zhì)存在下測定淋巴毒素-α(LTA)與半乳凝集素-2基因產(chǎn)物或半乳凝集素-1基因產(chǎn)物的結(jié)合,選擇抑制該結(jié)合的物質(zhì)的步驟。
本發(fā)明的另一方面提供半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的測定方法,該方法包含將含有SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的C/T多態(tài)性的半乳凝集素-2基因片段導(dǎo)入細(xì)胞,培養(yǎng)該細(xì)胞,分析該基因的表達(dá)。
本發(fā)明的又一方面提供抑制或促進(jìn)半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)的篩選方法,該方法包含將含有SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的C/T多態(tài)性的半乳凝集素-2基因片段導(dǎo)入細(xì)胞,在抑制或促進(jìn)半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的候選物質(zhì)存在下培養(yǎng)該細(xì)胞,分析該基因的表達(dá)。
本發(fā)明的又一方面提供由上述篩選方法得到的抑制或促進(jìn)半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)。
本發(fā)明的方法中,優(yōu)選將在上述半乳凝集素-2基因片段的下游結(jié)合有報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄單元導(dǎo)入細(xì)胞,培養(yǎng)該細(xì)胞,通過測定報(bào)道活性來分析該基因的表達(dá)。進(jìn)一步優(yōu)選上述報(bào)道基因是熒光素酶基因。
本發(fā)明的另一方面提供半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄控制因子的篩選方法,該方法包含使含有SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的C/T多態(tài)性的半乳凝集素-2基因片段,與預(yù)測存在半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄控制因子的試樣接觸,檢測上述片段與轉(zhuǎn)錄控制因子的結(jié)合。優(yōu)選檢測通過凝膠移位測定進(jìn)行。
附圖簡述
圖1表示確認(rèn)LTA與半乳凝集素-1和-2體外結(jié)合的試驗(yàn)的結(jié)果。
圖2表示研究半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的3279C>T的SNP對轉(zhuǎn)錄活性的影響的結(jié)果。
圖3表示研究半乳凝集素-2與微管的相互作用的結(jié)果。a表示與TAP標(biāo)記的半乳凝集素-2相互作用的蛋白質(zhì)的分離。b表示內(nèi)源性α-微管蛋白與帶有flag標(biāo)記的半乳凝集素-2或LTA免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。c表示U937細(xì)胞中的內(nèi)源性α-微管蛋白與內(nèi)源性半乳凝集素-2或LTA共存的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖4表示研究冠狀動脈粥瘤切除片中的半乳凝集素-2與LTA的表達(dá)和共存的結(jié)果。a用抗人LTA染色,b用抗人半乳凝集素-2染色,c用單克隆抗SMCα-肌動蛋白染色,d用單克隆抗CD68染色。e用抗LTA抗體和抗半乳凝集素-2抗體雙重染色。f用抗LTA染色。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明中,對于半乳凝集素-1和半乳凝集素-2基因產(chǎn)物與已知作為心肌梗塞等炎癥性疾病感受性基因產(chǎn)物的淋巴毒素-α(LTA)(OzakiK等人.Nature genetics 32,650-654,2002)產(chǎn)物的結(jié)合進(jìn)行了鑒定。還鑒定了半乳凝集素-2基因內(nèi)的新型單堿基多態(tài)性(SNP),通過PCR-DNA測序法對各約2000名心肌梗塞患者組與對照組進(jìn)行分類,進(jìn)行相關(guān)分析(x2檢驗(yàn)等),結(jié)果發(fā)現(xiàn)該新型SNP的頻率在心肌梗塞患者中在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著少。通過使用熒光素酶測定法的實(shí)驗(yàn),還表明該新型SNP具有實(shí)際的生物學(xué)功能,該半乳凝集素-2基因產(chǎn)物量的變化不僅對于心肌梗塞,還可以引發(fā)多種炎癥性疾病。
如上所述,本發(fā)明中對作為與LTA蛋白質(zhì)結(jié)合的新型分子的半乳凝集素-1和半乳凝集素-2蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定。還鑒定出半乳凝集素-2基因內(nèi)的新型SNP具有生物學(xué)功能,與心肌梗塞等疾病相關(guān)。因此,通過利用本發(fā)明鑒定的半乳凝集素-2基因的新型SNP,可以開發(fā)心肌梗塞等炎癥性疾病的新的診斷、預(yù)防方法、治療藥物。以下,對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步具體說明。
炎癥性疾病的判定方法本發(fā)明的方法是通過檢測存在于顯示與炎癥性疾病相關(guān)性的半乳凝集素-2基因中的基因多態(tài)性、特別是單堿基多態(tài)性(SNPs),來判定炎癥性疾病發(fā)病的有無、或炎癥性疾病發(fā)病的可能性的方法。
本發(fā)明中,“檢測存在于半乳凝集素-2基因中的至少一種基因多態(tài)性(單堿基多態(tài)性等)”是指以下兩種情況(i)直接檢測所述基因多態(tài)性(也稱為基因側(cè)多態(tài)性),以及(ii)檢測存在于上述基因的互補(bǔ)序列一側(cè)的基因多態(tài)性(稱為互補(bǔ)側(cè)多態(tài)性),并由該檢測結(jié)果推定基因側(cè)多態(tài)性。由于基因側(cè)的堿基與互補(bǔ)序列側(cè)的堿基不一定為完全互補(bǔ)關(guān)系,因此更優(yōu)選直接檢測基因側(cè)多態(tài)性。
存在于半乳凝集素-2基因中的基因多態(tài)性的優(yōu)選的具體例子有SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的C/T多態(tài)性。
本說明書中,SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基相當(dāng)于SEQ ID NO.2所示的半乳凝集素-2基因的基因組序列的第3449號堿基。
例如,如后述表1所示,SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基為C時(shí)(半乳凝集素-2內(nèi)含子1 3279C),可以判定為炎癥性疾病發(fā)病或者發(fā)病的可能性高。
與此相對,SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基為T時(shí)(半乳凝集素-2內(nèi)含子1 3279T),可以判定為炎癥性疾病不發(fā)病或者發(fā)病的可能性低。
本說明書中,疾病的“判定”是指疾病發(fā)病有無的判斷、疾病發(fā)病的可能性的判斷(患危險(xiǎn)性的預(yù)測)、疾病的遺傳因素的闡明等。
疾病的“判定”可以將由上述單堿基多態(tài)性的檢測法得到的結(jié)果、根據(jù)需要進(jìn)行的其它多態(tài)性分析(VNTR或RFLP)和/或其它檢查結(jié)果結(jié)合進(jìn)行。
本說明書中,“炎癥性疾病”只要是可見誘導(dǎo)了已知與炎癥性病態(tài)相關(guān)的細(xì)胞粘附因子或細(xì)胞因子的疾病即可,沒有特別限定,例如有慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、炎癥性腸炎、各種變態(tài)反應(yīng)、細(xì)菌性休克、心肌梗塞或腦卒中等動脈硬化性疾病等,特別是心肌梗塞。
(檢測對象)基因多態(tài)性的檢測對象優(yōu)選基因組DNA,但也可根據(jù)情況(即多態(tài)性位點(diǎn)及其相鄰區(qū)的序列與基因組相同或完全互補(bǔ)時(shí))使用cDNA或mRNA。另外,用于采集上述對象的試樣可以是任意的生物學(xué)試樣,例如血液、骨髓液、精液、腹腔液、尿液等體液;肝臟等組織細(xì)胞;毛發(fā)等體毛;等。基因組DNA等可以按照常規(guī)方法由這些試樣中提取、純化、制備。
(擴(kuò)增)檢測基因多態(tài)性時(shí),首先擴(kuò)增含有基因多態(tài)性的部分。擴(kuò)增例如可通過PCR法進(jìn)行,也可以通過其它公知的擴(kuò)增方法、例如NASBA法、LCR法、SDA法、LAMP法等進(jìn)行。
引物的選擇例如可選擇擴(kuò)增以下序列的引物SEQ ID NO.1(或SEQ ID NO.3)所示序列中含有上述單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的連續(xù)的至少10個堿基或以上、優(yōu)選10-100個堿基、更優(yōu)選10-50個堿基的序列,和/或其互補(bǔ)序列。
引物只要能夠發(fā)揮作為擴(kuò)增含有上述單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的規(guī)定堿基數(shù)的序列的引物功能即可,該序列中可以含有1個或更多的置換、缺失、附加。
用于擴(kuò)增的引物可以選擇只在試樣為等位基因型其中之一時(shí)才被擴(kuò)增,并且正向引物或反向引物的一方與單堿基多態(tài)性位點(diǎn)雜交。引物還可以根據(jù)需要通過熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)等來標(biāo)記。
(基因多態(tài)性的檢測)基因多態(tài)性的檢測可通過與等位基因型其中之一特異性探針雜交來進(jìn)行。探針可根據(jù)需要通過熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)等適當(dāng)?shù)氖侄蝸順?biāo)記。探針只要是含有上述單堿基多態(tài)性位點(diǎn)、與受檢試樣雜交、具有在所采用的檢測條件下可以檢測這樣程度的特異性即可,沒有任何限定。探針可以使用例如可與SEQ ID NO.1(或SEQ ID NO.3)所示序列中含有上述單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的至少連續(xù)10個堿基或以上、優(yōu)選10-100個堿基、更優(yōu)選10-50個堿基的序列或它們的互補(bǔ)序列雜交的寡核苷酸。優(yōu)選選擇單堿基多態(tài)性位點(diǎn)存在于探針的大致中心部位的寡核苷酸。該寡核苷酸只要可發(fā)揮探針功能即可,即,只要是在與目標(biāo)等位基因型的序列雜交、但不與其它等位基因型的序列雜交的條件下雜交即可,其序列中可以含有1個或更多的置換、缺失、附加。另外,探針還包含象用于RCA(滾環(huán)擴(kuò)增)法擴(kuò)增的單鏈探針(鎖扣探針)那樣,通過與基因組DNA解鏈、成為環(huán)狀而滿足上述探針條件的探針。
本發(fā)明所使用的雜交條件是足以區(qū)分等位基因型的條件。例如試樣為等位基因型其中之一時(shí)則進(jìn)行雜交、但為其它等位基因型時(shí)則不雜交的條件,例如嚴(yán)緊條件。這里,“嚴(yán)緊條件”是例如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊第2版(Sambrook等人.,1989)中記載的條件等。具體來說,例如有在含有6×SSC(6×SSC的組成0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉、pH 7.0)、0.5% SDS、5×Denhardt和100mg/ml鯡魚精DNA的溶液中與探針一起在65℃保溫過夜的條件等。
探針可以將其一端固定于基板,作為DNA芯片使用。這種情況下,DNA芯片可以只固定與等位基因型其中之一對應(yīng)的探針,也可以固定與等位基因型兩者對應(yīng)的探針。
基因多態(tài)性的檢測可通過限制酶切片段長度多態(tài)性分析法(RELP)進(jìn)行。該方法中,通過用限制酶消化原料核酸,研究消化物片段的大小,來研究該限制酶是否切斷了核酸,由此對試樣的多態(tài)性進(jìn)行分析。其中是根據(jù)所用基因型的不同,其單堿基多態(tài)位點(diǎn)被限制酶是否切斷的情況也不同。
基因多態(tài)性的檢測可通過對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接的序列確定來進(jìn)行(直接測序法)。序列的確定例如可通過雙脫氧法、Maxam-Gilbert法等公知的方法進(jìn)行。
基因多態(tài)性的檢測還可以采用變性梯度凝膠電泳法(DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(SSCP)、等位基因特異性PCR、通過等位基因特異性寡核苷酸(ASO)進(jìn)行的雜交法、化學(xué)切割錯配法(CCM)、異源雙鏈法(HET)、引物延伸法(PEX)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)法等。
炎癥性疾病診斷用試劑盒作為上述引物或探針的寡核苷酸可以以含有它們的炎癥性疾病診斷用試劑盒的形式提供。試劑盒可以含有上述基因多態(tài)性分析法中使用的限制酶、聚合酶、三磷酸核苷、標(biāo)記、緩沖液等。
半乳凝集素-2的表達(dá)狀態(tài)的分析方法根據(jù)本發(fā)明,可以通過檢測上述單堿基多態(tài)性來分析半乳凝集素-2的表達(dá)狀態(tài)。
例如,SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基為C時(shí)(半乳凝集素-2內(nèi)含子1 3279C),可以判斷半乳凝集素-2的表達(dá)量低。與此相對,SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基為T時(shí)(半乳凝集素-2內(nèi)含子1 3279T),可以判斷半乳凝集素-2的表達(dá)量高。
炎癥性疾病治療藥物的篩選方法根據(jù)本發(fā)明,可通過在候選物質(zhì)存在下分析細(xì)胞內(nèi)的半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表達(dá)量,選擇使該表達(dá)量變化的物質(zhì),來篩選炎癥性疾病的治療藥物。例如,可以在候選物質(zhì)存在下分析細(xì)胞內(nèi)的半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表達(dá)量,選擇使其表達(dá)量增加或減少的物質(zhì)、特別優(yōu)選選擇使其表達(dá)量增加的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明,還可以通過在候選物質(zhì)存在下測定淋巴毒素-α(LTA)與半乳凝集素-2基因產(chǎn)物或半乳凝集素-1基因產(chǎn)物的結(jié)合,選擇抑制該結(jié)合的物質(zhì),來篩選炎癥性疾病的治療藥物。
上述篩選的一個例子可通過如下的步驟進(jìn)行使細(xì)胞與候選物質(zhì)接觸的步驟;分析細(xì)胞內(nèi)的半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表達(dá)量的步驟;以及與候選物質(zhì)非存在下的條件相比較,選擇使上述基因的表達(dá)量變化的候選物質(zhì)作為炎癥性疾病治療藥物的步驟。
候選物質(zhì)可以使用任何物質(zhì)。候選物質(zhì)的種類沒有特別限定,可以是各種低分子合成化合物,也可以是存在于天然提取物中的化合物,或者也可以是化合物文庫、噬菌體表達(dá)文庫、組合文庫。候選物質(zhì)優(yōu)選為低分子化合物,優(yōu)選為低分子化合物的化合物文庫?;衔镂膸斓臉?gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的,也可以使用市售的化合物文庫。
半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的測定方法根據(jù)本發(fā)明,還可以通過將含有上述單堿基多態(tài)性的半乳凝集素-2基因片段導(dǎo)入細(xì)胞,培養(yǎng)該細(xì)胞,分析該基因的表達(dá)來測定半乳凝集素-2的轉(zhuǎn)錄活性。
本發(fā)明的優(yōu)選方案是將在上述半乳凝集素-2基因片段的下游結(jié)合有報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄單元導(dǎo)入細(xì)胞,培養(yǎng)該細(xì)胞,通過測定報(bào)道活性來分析該基因的表達(dá)。
例如,單堿基多態(tài)性存在于啟動子部位時(shí),在含有該單堿基多態(tài)性的基因的下游插入報(bào)道基因,將該系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞,培養(yǎng)該細(xì)胞,測定報(bào)道活性,這樣可以測定由于單堿基多態(tài)性導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄效率的不同。
這里,報(bào)道基因可以使用熒光素酶、氯霉素、乙酰轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶等的基因。
抑制或促進(jìn)半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)的篩選方法本發(fā)明中,通過將上述含有單堿基多態(tài)性的半乳凝集素-2基因片段導(dǎo)入細(xì)胞,在抑制或促進(jìn)半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的候選物質(zhì)存在下培養(yǎng)該細(xì)胞,分析該基因的表達(dá),可以篩選抑制或促進(jìn)半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)。
本發(fā)明的優(yōu)選的方案是將在上述半乳凝集素-2基因片段的下游結(jié)合有報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄單元導(dǎo)入細(xì)胞,培養(yǎng)該細(xì)胞,通過測定報(bào)道活性來分析該基因的表達(dá)。
例如在具有可見半乳凝集素-2的表達(dá)量顯著高的單堿基多態(tài)性(例如半乳凝集素-2內(nèi)含子1 3279T)的基因的下游插入報(bào)道基因,將該系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞,在候選物質(zhì)存在或非存在兩種情況下培養(yǎng)該細(xì)胞,如果在候選物質(zhì)存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)報(bào)道基因的活性下降,則可以選擇該候選物質(zhì)作為半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性抑制物質(zhì)。
這里,報(bào)道基因可以使用上述例舉的基因。
可以使用任何物質(zhì)作為候選物質(zhì)。候選物質(zhì)的種類沒有特別限定,可以是各種低分子合成化合物,也可以是存在于天然提取物中的化合物,或者也可以是化合物文庫、噬菌體表達(dá)文庫、組合文庫。候選物質(zhì)優(yōu)選為低分子化合物,優(yōu)選為低分子化合物的化合物文庫?;衔镂膸斓臉?gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的,也可以使用市售的化合物文庫。
上述的通過篩選法得到的抑制或促進(jìn)半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所述抑制或促進(jìn)半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)可用作心肌梗塞治療藥、抗炎癥藥、免疫抑制劑等各種藥物候選物質(zhì)。
半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄控制因子的篩選方法本發(fā)明中,還可以通過使含有上述單堿基多態(tài)性的基因片段與預(yù)測存在半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄控制因子的試樣接觸,檢測上述片段與轉(zhuǎn)錄控制因子的結(jié)合,來篩選半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄控制因子。對上述含有單堿基多態(tài)性的基因片段與預(yù)測存在半乳凝集素-2轉(zhuǎn)錄控制因子的物質(zhì)的結(jié)合的檢測可以通過凝膠移位法(電泳遷移率分析EMSA)、Dnase I足跡法等進(jìn)行,優(yōu)選凝膠移位法。凝膠移位法中,如果結(jié)合有蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄控制因子),則分子大小變大,電泳中的DNA遷移率降低,因此將用32P標(biāo)記的基因片段與轉(zhuǎn)錄控制因子混合,進(jìn)行凝膠電泳。觀察放射圖譜中的DNA位置,則結(jié)合有因子的DNA移動緩慢,因此可以檢測出比常規(guī)條帶移動慢的條帶。
通過以下的實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明,但本發(fā)明并不受實(shí)施例的限定。
實(shí)施例(A)方法·材料(1)大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)(E.coli two hybrid system)使用BacterioMachTM雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建試劑盒(Stratagene公司制造)進(jìn)行。用于構(gòu)建文庫的培養(yǎng)人冠狀動脈血管平滑肌細(xì)胞(HCASMC)購自BioWhittaker公司。使用FastTrack 2.0試劑盒(invitrogen公司),由1×107個細(xì)胞制備mRNA,使用5μg HCASMC mRNA,按照所附說明書構(gòu)建cDNA文庫,再按照所附說明書進(jìn)行雙雜交篩選。
(2)重組半乳凝集素-1、-2、-3和LTA的制備、通過免疫沉淀確定LTA與半乳凝集素的結(jié)合半乳凝集素-1、-2、-3通過pET 28載體系統(tǒng)(Novagen公司制備)制備全長重組體,按照所附說明書在大腸桿菌中表達(dá)、純化。LTA通過pET 29系統(tǒng)(Novagen公司制造)制備??筁TA抗體(R&D system公司制造)按照所附說明書,與HiTrap NHS-activated HP瓊脂糖(Amersham公司制造)交聯(lián)(抗LTA抗體瓊脂糖)。LTA-半乳凝集素的結(jié)合實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行向10ml結(jié)合緩沖液[10mM Tris/HCl(pH 7.5),150mM NaCl]中加入5μg半乳凝集素-1或半乳凝集素-2或半乳凝集素-3,再攪拌1小時(shí)。以1600轉(zhuǎn)離心10分鐘,撇去上清,將沉淀用清洗緩沖液[10mM Tris/HCl(pH 7.5),150mM NaCl,0.1% NP-40]洗滌3次,用50μl的5×SDS-試樣緩沖液(125mM Tris/HCl、4% SDS、20%甘油、10% β-巰基乙醇、0.04%溴酚藍(lán),pH6.8)溶解,制成試樣。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜,使用抗T7抗體(Novagen公司制造),通過ECL法(Amersham公司制造)檢測信號。使用COS7細(xì)胞(Riken cell bank),通過強(qiáng)制表達(dá)系統(tǒng)確認(rèn)LTA與半乳凝集素-2的相互作用(結(jié)合),這個過程是向pFLAG-CMV-5a載體(コスモバイオ公司制造)導(dǎo)入LTA、向pCMV-Myc載體(Clontech公司)導(dǎo)入半乳凝集素-2作為重組體,使用FuGene reagent(羅氏公司制造)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞?;厥?6小時(shí)后的細(xì)胞,通過細(xì)胞蛋白質(zhì)提取緩沖液110mM Tris/HCl,150mM NaCl,0.5% NP-40]提取蛋白質(zhì),然后為了抑制非特異性吸附,向該提取液中加入50μl的蛋白A瓊脂糖(Amersham公司制造),攪拌1小時(shí)。以1600轉(zhuǎn)離心10分鐘,將上清作為免疫沉淀的試樣。向試樣中加入5μg的抗LTA抗體,在17℃攪拌1小時(shí),然后加入50μl的蛋白A瓊脂糖,在17℃攪拌1小時(shí),以1600轉(zhuǎn)離心10分鐘,將沉淀用清洗緩沖液[10mM Tris/HCl(pH 7.5),150mM NaCl,0.1% NP-40]洗滌3次,制成試樣。SDS-PAGE后,轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜,通過抗Myc-tag抗體(SANTA CRUZ公司制造)、抗FLAG-tag抗體(SIGMA公司制造)檢測信號。
(3)半乳凝集素-2基因內(nèi)SNPs與心肌梗塞的相關(guān)分析心肌梗塞患者及對照組、其DNA采集方法、DNA的測序法、DNA分類法、相關(guān)性分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法按照已有報(bào)道實(shí)施(Ozaki K等人.Nature genetics 32,650-654,2002)。半乳凝集素-1和半乳凝集素-2基因區(qū)的SNPs通過使用分別來自16名心肌梗塞和對照的DNA,按照PCR直接測序法進(jìn)行鑒定·發(fā)現(xiàn)。
(4)熒光素酶測定法以基因組DNA為模板,通過PCR對含有半乳凝集素-2基因的3188至3404的內(nèi)含子1 3279C或T的SNP的區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,克隆到半乳凝集素-2啟動子-pGL3-增強(qiáng)子載體的熒光素酶下游。使用FuGenereagent將2μg這些質(zhì)粒和100mg pRL-TK載體(promega公司;為了使轉(zhuǎn)染效率一致的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)載體)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞(人類科學(xué)研究資源庫、JCRB9004)和HepG2細(xì)胞。24小時(shí)后收集細(xì)胞,測定熒光素酶活性。
(5)串聯(lián)親和純化串聯(lián)親和純化按照Rigaut,G等人.Nature Biotechnol,17,1030-1032(1999)的方法進(jìn)行。在pCMV-Myc載體(Sigma公司制造)中構(gòu)建編碼His標(biāo)記、TEV切斷位點(diǎn)和S標(biāo)記作為TAP標(biāo)記序列的融合盒。該TAP載體在巨細(xì)胞病毒啟動子的控制下,在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)羧基末端具有TAP標(biāo)記、氨基末端帶有Myc標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)。將TAP載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞(人類科學(xué)研究資源庫、JCRB9004)。通過APRO Life Science的MALDI/TOF質(zhì)譜測定裝置對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。
(6)免疫共沉淀試驗(yàn)使用內(nèi)源性α-微管蛋白與帶有flag標(biāo)記的半乳凝集素-2或LTA,如下進(jìn)行免疫共沉淀。使用FuGene,將帶有Flag或S的標(biāo)記的LTA、半乳凝集素-2、以及l(fā)acZ(陰性對照)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。免疫共沉淀在溶解緩沖液(20mM Tris pH7.5,150mM NaCl,0.1% Nonident P-40)中進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,溶解細(xì)胞,使用抗-Flag標(biāo)記M2瓊脂糖(Sigma公司制造)進(jìn)行免疫沉淀。使用HRP結(jié)合S-蛋白(Novagen公司制造)、抗-Flag M2過氧化物酶結(jié)合物(Sigma公司制造)或人α-微管蛋白的小鼠單克隆抗體(Molecular Probes制備)以及HRP結(jié)合抗小鼠IgG抗體,使免疫復(fù)合物可觀察。
(7)共焦顯微鏡分析使用在大腸桿菌中合成的重組蛋白質(zhì),在兔中制備多克隆抗人半乳凝集素-2抗血清。通過蛋白質(zhì)印跡分析,該抗血清與結(jié)構(gòu)類似的半乳凝集素-1和半乳凝集素-3不顯示交叉反應(yīng)性。將多克隆抗半乳凝集素-2抗血清、山羊抗人LTA IgG(R&D System制備)或小鼠抗人α-微管蛋白單克隆IgG抗體與Alexa二次抗體(Molecular Peobes制備)一同使用。將U937細(xì)胞(人類科學(xué)研究資源庫、JCRB9021)用豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)(20ng/ml)刺激30分鐘,進(jìn)行固定。然后在含有3%牛血清白蛋白的磷酸緩沖生理鹽水中與對應(yīng)的一次抗體、對應(yīng)的Alexa二次抗體一起溫育。
(8)免疫組織化學(xué)分析組織試樣通過方向性冠狀動脈粥瘤切除術(shù),由16名心肌梗塞患者獲得。免疫組織化學(xué)分析使用山羊抗人LTA IgG(R&D System制備)和兔多克隆抗人半乳凝集素-2抗體,按照已報(bào)道的方法(Minami,M等人.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.21,1796-1800(2001);和Shi,S.R.,等人.,Hum.Mutat.15,7-12(2000))進(jìn)行。相鄰切片的染色使用SMC-2肌動蛋白和抗CD68的人細(xì)胞型特異性單克隆抗體(DAKO制備)進(jìn)行。雙重標(biāo)記的免疫組織化學(xué)分析如下進(jìn)行首先將切片與抗LTA抗體一起溫育,然后與生物素化豬抗山羊IgG、以及抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物一起溫育,通過3,3’-二氨基聯(lián)苯胺四氫化氯(Vecter Labs)使其可觀察。接著,將切片與兔多克隆抗人半乳凝集素-2抗體溫育,然后與堿性磷酸酶結(jié)合豬抗兔IgG溫育,通過5-溴-4-氯-3-吲哚氧基磷酸鹽和氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)底物系使其可觀察。
(B)結(jié)果(1)與心肌梗塞感受性基因產(chǎn)物L(fēng)TA結(jié)合的蛋白質(zhì)的鑒定(篩選)為了篩選與LTA結(jié)合的新型蛋白質(zhì),利用大腸桿菌雙雜交系統(tǒng),從來自血管平滑肌細(xì)胞的雙雜交文庫中鑒定半乳凝集素-1作為LTA的結(jié)合候選蛋白質(zhì)。
(2)LTA與半乳凝集素-1、2體外結(jié)合的確認(rèn)使重組半乳凝集素-1(末端結(jié)合有T7標(biāo)記)和LTA分別在大腸桿菌中表達(dá),純化后,將它們與抗LTA抗體交聯(lián)瓊脂糖反應(yīng),洗滌后進(jìn)行SDS-PAGE,通過使用抗T7抗體的蛋白質(zhì)印跡法檢測半乳凝集素-1(圖1a)。
圖1a中,泳道1中使用抗LTA抗體瓊脂糖進(jìn)行半乳凝集素-1的免疫沉淀(陰性對照)。泳道-2中將半乳凝集素-1與LTA溫育,使用抗LTA抗體瓊脂糖進(jìn)行復(fù)合物的免疫沉淀。泳道3中,使用100ng重組半乳凝集素-1作為陽性對照。星號表示來源于抗LTA抗體瓊脂糖中的免疫球蛋白(Ig)重鏈和輕鏈的非特異性條帶。
對于與半乳凝集素-1具有高同源性的半乳凝集素-2和-3,由大腸桿菌制備重組蛋白,通過同樣的方法確認(rèn)與LTA的結(jié)合,表明半乳凝集素-2也與LTA結(jié)合(圖1b)。
圖1b中,通過抗T7標(biāo)記單克隆抗體和辣根過氧化物酶結(jié)合抗小鼠IgG,通過蛋白質(zhì)印跡分析,檢測與LTA共沉淀的半乳凝集素。泳道-1中,溫育的半乳凝集素-3和LTA,使用抗LTA抗體瓊脂糖進(jìn)行免疫沉淀。泳道-2中,溫育的半乳凝集素-2和LTA,使用抗LTA抗體瓊脂糖進(jìn)行復(fù)合物的免疫沉淀。泳道-3中,使用抗LTA抗體瓊脂糖進(jìn)行半乳凝集素-2的免疫沉淀(陰性對照)。泳道-4和5中,使用100ng半乳凝集素-3(泳道4)或半乳凝集素-2(泳道5)作為陽性對照。星號表示來源于抗LTA抗體瓊脂糖中的免疫球蛋白(Ig)重鏈和輕鏈的非特異性條帶。
對于半乳凝集素-2,與LTA Thr26和LTA Ash26(Ozaki K等人.Nature genetics 32,650-654,2002)一起導(dǎo)入COS7細(xì)胞(猴腎臟細(xì)胞株),通過使用該共強(qiáng)制表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),在培養(yǎng)細(xì)胞水平上確認(rèn)了其結(jié)合(圖1c)。
圖1C表示使用抗LTA抗體的LTA與半乳凝集素-2的免疫共沉淀的結(jié)果。對COS7細(xì)胞轉(zhuǎn)染帶Myc標(biāo)記的半乳凝集素-2質(zhì)粒或帶FLAG標(biāo)記的LTA質(zhì)粒(Thr 26或Asn 26),制備裂解液,使用蛋白A瓊脂糖和抗LTA抗體用于免疫沉淀。使用Myc(半乳凝集素-2)或FLAG(LTA)-抗單克隆抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,通過蛋白質(zhì)印跡分析,檢測與LTA共沉淀的半乳凝集素-2。泳道1和2中,將LTA26 Thr(泳道1)或LTA 26 Asn(泳道2)進(jìn)行轉(zhuǎn)染使其沉淀(LTA陽性對照)。泳道3中,將半乳凝集素-2轉(zhuǎn)染并沉淀(半乳凝集素-2陽性對照)。泳道4和5中,將半乳凝集素-2和LTA 26 Thr(泳道4)或LTA 26 Asn(泳道5)共轉(zhuǎn)染、共沉淀。
(3)半乳凝集素-2基因內(nèi)單堿基多態(tài)性與心肌梗塞的相關(guān)已經(jīng)明確半乳凝集素-1和-2與LTA結(jié)合,它們的基因產(chǎn)物的功能變化與LTA的功能變化相關(guān)聯(lián),顯示與心肌梗塞的感受性相關(guān)的可能性,因此新鑒定、發(fā)現(xiàn)這些基因內(nèi)的單堿基多態(tài)性(SNPs),使用該SNPs,對患者、對照各約2300例進(jìn)行了病例-對照關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),半乳凝集素-2基因內(nèi)內(nèi)含子1第3279位C>T新型SNP的次要純合子(minor homozygote)(TT等位基因)在心肌梗塞患者中顯著少(χ2=25.3,P=0.0000005;odds ratio=1.6)(表1)(堿基編號根據(jù)突變命名Dunnen J.T等、Hum.Mutation 15,7-12,2000)。由此可認(rèn)為半乳凝集素-2內(nèi)含子1 3279的SNP是對心肌梗塞發(fā)揮保護(hù)性作用的因子,半乳凝集素-2的功能變化顯示與心肌梗塞相關(guān)的可能性。
表1心肌梗塞與半乳糖苷凝集素-2的SNP的相關(guān)
本發(fā)明中新鑒定的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的第3279位C>T的新型SNP周圍的堿基序列(SEQ ID NO.3SEQ ID NO.3中,Y表示C或T)如下所示。
5’-CCCCCCCAGCTCTAGGGACGACCACACCCCCACCCAGTTCTGCCTGTCTCTCTCTGCGCCTTTGACTCTGTTGGGTGGGGACAAGGCTCCCGGGCCTGCACCCTCCCGCAGCTCTCAGCATCCCTATTTGTCCAAGTGCACCCCTGACCCTGGACTTCCGAGTGCTTCTGCCCTGCAGCAGCCCCCACCTCTATCCTTGGGGTTTGAGCTTTGCTGTTTCAGTCAGGCAGCCCCCAGGAGCTGCAAGGGGAGTGTGGGTGCTTCTCTTAGTCCAGGCCCAGCTCCCCTATCCTGGCCTGACTGTTGCAGGGCTCGGGGTGTGGGCACAGGCTGCTGGCAGGAGGCAGGGAGCCATCTCCTGATGCTTGGTGTTAGA[C/T]GTGTGTGTGCGCAGGGCACACGTCTGTGAGTGTCTGTGTGGCGGGCACACCTGTCTTCTGTTTCTTGTTTGAGCCCCTTTTGGACTGTCCTCACTGGATAACCTCATCTCCCAGAGATAATGGTCTTTGTCAGTGAGAGACTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCT-3’[C/T]表示內(nèi)含子1的第3279位C>T的SNP。
帶下劃線的CTGCGCCTTTGACTCTGTT和TCTTTGTCAGTGAGAGACTG表示PCR引物,帶下劃線的CCTATCCTGGCCTGACTGTT表示測序引物。
(4)半乳凝集素-2基因內(nèi)含子1 3279的SNP對半乳凝集素-2基因轉(zhuǎn)錄活性的影響為了測定內(nèi)含子1 3279的SNP對半乳凝集素-2基因轉(zhuǎn)錄活性的影響,進(jìn)行報(bào)道基因測定(熒光素酶測定)。將含有半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1 3188至3404的核苷酸的DNA片段沿5’至3’的方向克隆到pGL3-增強(qiáng)子載體的SV40增強(qiáng)子的下游,制備報(bào)道載體。將這些報(bào)道載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞,24小時(shí)后,使用雙熒光素酶報(bào)道測定系統(tǒng)(Promega公司制造)測定熒光素酶活性。結(jié)果如圖2所示(左圖表示在HeLa細(xì)胞中的結(jié)果,右圖表示在HepG2細(xì)胞中的結(jié)果)。
(5)半乳凝集素-2與微管蛋白的作用為了研究半乳凝集素-2對LTA分泌的調(diào)控機(jī)理,使用串聯(lián)親和純化(TAP)系統(tǒng),探究與半乳凝集素-2相互作用的細(xì)胞內(nèi)分子。結(jié)果,鑒定出兩個只在表達(dá)半乳凝集素-2-TAP標(biāo)記時(shí)才可檢測到的特異性條帶(圖3a)。通過MALDI/TOF質(zhì)譜分析,顯示這兩個條帶對應(yīng)微管的重要成分α-和β-微管蛋白。使用表達(dá)帶有flag標(biāo)記的半乳凝集素-2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞,可見內(nèi)源性的微管蛋白和半乳凝集素-2一起免疫沉淀(圖3b)。微管蛋白與LTA一起免疫沉淀(圖3b)。從雙重免疫染色的U937細(xì)胞的共焦顯微鏡分析圖像可見半乳凝集素-2和α-微管蛋白作為發(fā)達(dá)的網(wǎng)狀纖維網(wǎng)架而一起局部存在于細(xì)胞質(zhì)上(圖3c)。該結(jié)果顯示半乳凝集素-2與細(xì)胞內(nèi)傳輸有關(guān)的可能性。
(6)冠狀動脈粥瘤切除術(shù)試樣中半乳凝集素-2與LTA的表達(dá)和共存為了研究半乳凝集素-2與LTA是否在心肌梗塞的損傷(即冠狀動脈的粥樣硬化性損傷)中表達(dá)、以及表達(dá)時(shí)的表達(dá)部位,使用抗LTA或抗半乳凝集素-2抗體,對冠狀動脈粥瘤切除試樣進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析。如圖4a和b所示,對LTA和半乳凝集素-2的免疫反應(yīng)性在粥樣斑塊的內(nèi)膜細(xì)胞中檢測出,其中的一部分是紡錘狀或限定性地形成空泡的細(xì)胞質(zhì)團(tuán)。用抗平滑肌細(xì)胞(SMC)α-肌動蛋白或抗CD68對相鄰切片進(jìn)行免疫染色的結(jié)果可見這些細(xì)胞的大部分是平滑肌細(xì)胞或源于平滑肌細(xì)胞的泡沫細(xì)胞,也可見一部分巨噬細(xì)胞(圖4c和d)。通過雙重標(biāo)記免疫組織化學(xué)分析,LTA和半乳凝集素-2的共表達(dá)在大部分多形性平滑肌細(xì)胞中可見(圖4e)。相對照地,在細(xì)胞質(zhì)僅為纖維斑塊的萎縮性平滑肌細(xì)胞或正常的內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞中,未檢測出任何蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖4f)。這些結(jié)果顯示LTA和半乳凝集素-2在粥樣硬化性斑塊的內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中共表達(dá),但在靜止期或正常的內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞中不存在。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明新鑒定出了與心肌梗塞等炎癥性疾病的發(fā)病進(jìn)程有關(guān)的新型單堿基多態(tài)性(SNP)。利用本發(fā)明中鑒定的SNP,可以提供心肌梗塞等炎癥性疾病的診斷方法、或炎癥性疾病治療藥物的開發(fā)方法。
序列表<110>RIKEN et al.
<120>使用半乳糖苷凝集素-2基因內(nèi)單堿基多態(tài)性進(jìn)行的炎癥性疾病的判定方法<130>A41618A<160>3<210>1<211>7967<212>DNA<213>智人<400>1gtgaggacac tagccccctg ctgcctgccc cactctgttc atctttgtct ttgcctgggt 60gggggctttt agggaaaacc attgctgtcc ctctctgggc ctcagtttcc ccatctgtgc 120agcaaagaag ttggacagag gtcttttttt aaaaaacagc atcttgggcc aggcgtggtg 180gctcctgctt gtaatcccag cactttggga ggccgaggct ggtggatcat ctgaggttgg 240gagtttgaga ccagcctgac caacatggag aaaccccgtc tctactaaaa aaatacaaaa 300ttggctaggc ctggtggcac atgcctgtaa tcccagctaa tggggaggct gaggcaggag 360aatcacttgg acctgggagg cagaggttat ggtgagccga gattgtgcca ttgcactcca 420gcctgggcaa caagagtgag actccatctc aaaacaacaa caacaataca gcatcttgct 480ctgtcaccag gtggagtgca gtggtggcaa tcataactca ctacggactt gacctccttg 540gcttaaatga tcctcccacc tcagcctctt gagtagctgg gaccccaggc actcactacc 600acactggcta attttgtttg tttcttttct ttctcttttt tttttttttt ttgagatgga 660gtctcgctct gttgcccagg ctggagtgca gtggcccgat ctcagctcac tgcaacctct 720gctgcctggg ttcaagcaat tctctggtct cagcctccca agtagctggg attacaggta 780tgtgtcacca cacctggcta attttttttt ttttgttgag atggagtttc tgttgcccag 840gctggagtgc aatggcacga tctcggctca ccacaacttc cacctcccag gttcaagcga 900ttctcctgcc tcagcctcct gagtagcagg gattacaggc atgggccacc acacccgatt 960
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權(quán)利要求
1.炎癥性疾病的判定方法,該方法包含檢測存在于半乳凝集素-2中的至少一種基因多態(tài)性。
2.炎癥性疾病的判定方法,該方法包含檢測存在于半乳凝集素-2中的至少一種單堿基多態(tài)性。
3.炎癥性疾病的判定方法,該方法包含檢測在SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的C/T多態(tài)性。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法,其中炎癥性疾病是心肌梗塞。
5.寡核苷酸,該寡核苷酸可以與含有SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的、至少連續(xù)10個堿基序列、或其互補(bǔ)序列雜交,在權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法中作為探針使用。
6.寡核苷酸,該寡核苷酸可以擴(kuò)增含有SEQ ID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的、至少連續(xù)10個堿基的序列、和/或其互補(bǔ)序列,在權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法中作為引物使用。
7.權(quán)利要求6的寡核苷酸,其中引物為正向引物和/或反向引物。
8.炎癥性疾病診斷用試劑盒,該試劑盒包含一種或以上權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的寡核苷酸。
9.權(quán)利要求8的試劑盒,其中炎癥性疾病為心肌梗塞。
10.乳糖苷凝集素-2表達(dá)狀態(tài)的分析方法,該方法包含檢測在SEQID NO.1所示的半乳凝集素-2基因的內(nèi)含子1的堿基序列中第3279位堿基的C/T多態(tài)性。
11.炎癥性疾病治療藥物的篩選方法,該方法包含在候選物質(zhì)存在下分析細(xì)胞內(nèi)半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表達(dá)量,選擇使該表達(dá)量變化的物質(zhì)的步驟。
12.炎癥性疾病治療藥物的篩選方法,該方法包含在候選物質(zhì)存在下分析細(xì)胞內(nèi)半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表達(dá)量,選擇使該表達(dá)量增加的物質(zhì)的步驟。
13.炎癥性疾病治療藥物的篩選方法,該方法包含在候選物質(zhì)存在下測定淋巴毒素-αLTA與半乳凝集素-2基因產(chǎn)物或半乳凝集素-1基因產(chǎn)物的結(jié)合,選擇抑制該結(jié)合的物質(zhì)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于鑒定與心肌梗塞等炎癥性疾病的發(fā)病進(jìn)程相關(guān)的新型的單堿基多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明可提供炎癥性疾病的判定方法,該方法包含檢測存在于半乳凝集素-2中的至少一種基因多態(tài)性。
文檔編號G01N33/15GK1871361SQ20048003064
公開日2006年11月29日 申請日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月18日
發(fā)明者田中敏博, 大西洋三, 尾崎浩一, 飯?zhí)镉锌? 堀正二, 中村祐輔 申請人:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所, 田中敏博, 大西洋三, 尾崎浩一, 飯?zhí)镉锌? 堀正二