專利名稱：卵巢癌的診斷標記物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及癌癥的診斷和監(jiān)測方法。特別是本發(fā)明涉及尤其在疾病早期用于卵巢癌和生殖器官其他癌癥的篩查，以及卵巢癌和其他癌癥治療和臨床控制的監(jiān)測和預后的方法，以及用于所述方法的分子標記物。
背景技術：
本說明書中引用的所有參考文獻，包括任何專利或專利申請此處引入作為參考。并不認為任何參考文獻構成先有技術。參考文獻的討論陳述其作者的主張，而本申請人保留評論所引用文獻的準確性和針對性的權利?？梢苑浅Ｃ鞔_的是，雖然此處涉及許多先有技術的出版物，在澳大利亞或任何其他國家，該參考文獻并不構成對任何這些文獻形成本領域公知常識一部分的認可。
卵巢癌為澳大利亞婦女中死于婦科惡性腫瘤的主要原因以及癌癥死亡的第四大主要原因。該癌癥為高轉移性的，引起遠離部位的二次生長，并且診斷為晚期上皮卵巢癌的大多數患者具有廣泛的轉移。卵巢癌令人生憂的結果由該腫瘤在早期、可治愈階段不能檢測到而引起。由于I級腫瘤的90％可通過目前的控制方法治愈，患有卵巢癌的患者如果在早期診斷則有恢復的良好前景。目前認為在早期、可治愈階段鑒定卵巢癌唯一可行的方法是確定癌細胞中過表達、且因此從癌細胞分泌進入腹膜腔、并且最終吸收進入循環(huán)血液中的蛋白質的身份。
迄今為止，沒有發(fā)現適于早期-階段篩查目的的、確定的卵巢癌標記物。CA 125為與卵巢癌相關的血清抗原，該抗原的單克隆抗體廣泛用于病情的診斷和監(jiān)測中。然而，由于該抗原的水平在其他婦科癌癥、非-惡性的婦科病情如卵巢囊腫、子宮內膜異位或子宮纖維瘤、肝病、腎衰竭或胰腺炎，以及有時甚至在感染的應答中提高，CA 125值并不是卵巢癌的特異性指征(Mackay和Creasman，1995)。
此外，卵巢癌的一些病例中沒有確定CA 125值和疾病進程之間的關系，使得其為卵巢癌早期篩查的不可靠標記物。近年來，腫瘤-相關的差異表達基因-12(TADG-12)，一種通過聚合酶鏈式反應克隆的絲氨酸蛋白酶，已顯示在大約75％的卵巢癌中過表達，而提示其作為一個可選擇的標記物(Underwood LJ，2000)。然而，由于與卵巢癌的低關聯度該標記物具有假陰性的可能。
因此對于降低卵巢癌的死亡率，存在鑒定分子標記物的急切需求，其優(yōu)選可在血液、血漿或血清中檢測以補充檢測早期-階段疾病中現有試驗的使用。
蛋白質組學為一種新興技術，其可在患者血清、其他生物液體和組織中以高-通量發(fā)現方法鑒定蛋白質分子，提供以足夠濃度分泌自或釋放自腫瘤細胞的蛋白質的相關信息。由于隨著疾病發(fā)展該血清蛋白分布的改變，癌癥患者的血清蛋白代表了生物標記物的豐富來源。當血清循環(huán)經過患病器官時，其挑選由腫瘤和其宿主微環(huán)境產生的蛋白質。因此癌癥-相關的血清蛋白組代表了作為疾病發(fā)展過程結果的過-表達或異常排出的蛋白質，或代表了作為蛋白水解降解途徑異?；罨Y果的從該蛋白組除去的蛋白質。因此甚至在疾病最早時期，蛋白質分子對癌細胞特異性中微小但顯著的變化可以反映在血清蛋白組中，使得能夠確定在檢測和監(jiān)測疾病中更有效的生物標記物的組合。分泌自癌細胞并且由循環(huán)血液吸收的過-表達的蛋白質是用于測定血清中蛋白質產物的測定法中潛在的候選標記物。分泌的蛋白質可在患者中激起抗體應答，而在這樣情況下基于抗體的血清標記物將是可行的。
通常用于蛋白質組方法的電離質譜技術，基質-輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)和表面-增強的激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOFMS)，具有鑒定數千蛋白質的模式或變化的潛力，并且能進行存在于復雜的生物液體(如血清或血漿)中幾乎所有小分子量蛋白質的全面分析。
最近描述了具有94％陽性預計值的將癌區(qū)別于非癌組的卵巢癌患者的血清學蛋白質組模式(Petricoin等人，2002)。該方法代表了搜索用于卵巢癌早期篩查的生物標記物的新方向，其中早期-階段癌癥患者蛋白質的獨特性分布可以產生相對于正常受試者的不同蛋白質模式，其可用作診斷標準。然而，由于其低的特異性，仍在評估該方法的適用范圍。
觸珠蛋白為結合血紅蛋白的急性期糖蛋白，由此防止由于炎癥或損傷引起的鐵損耗和腎損害(Wassell，2000)。成熟觸珠蛋白的天然形式為分子量大約90,000kDa的四聚物，由通過分子間二硫鍵連接的兩個不同α和β-亞單位組成(Hanley和Heath，2000)。
觸珠蛋白具有三種主要的表型形式，觸珠蛋白1-1、觸珠蛋白2-1和觸珠蛋白2-2，并且每個或所有的等位基因可以存在于單一個體。個體表型與多種病情相關，包括心血管的和自身免疫病癥以及一些惡性的病情。然而，在其他癌癥如前列腺癌中，觸珠蛋白的表達由于惡性轉化而終止(Meechan等人，2002)。
體內，觸珠蛋白以顯示38,000kDa分子量的單一多肽前體合成。認為成熟蛋白質所有的三種表型源自單一前體，觸珠蛋白-1前體。多肽前體經蛋白水解加工形成天然蛋白質的α和β-亞單位(Haugen等人，1981)。前體蛋白包括α鏈前氨基端18個殘基的信號序列，和/或α和β-區(qū)域間的干預多肽(Misumi等人，1983)。體內，翻譯后事件導致信號序列的蛋白水解去除以及核心寡糖側鏈通過膜-聯酶系統(tǒng)摻入β-區(qū)域(Haugen等人，1981)。翻譯后修飾還可導致前體多肽α和β區(qū)域的裂解而形成天然蛋白質(Haugen等人，1981)。觸珠蛋白生物合成和加工的獨特模式的生物學意義還不明確，但是其已顯示相當比例新-合成的觸珠蛋白以單一多肽前體分泌(Misumi等人，1983)。
在70年代早期首次在卵巢癌患者中報道血清觸珠蛋白提高的濃度。觸珠蛋白濃度證實受腫瘤負荷程度的影響，而不依賴于卵巢惡性腫瘤的組織類型或等級(Mueller等人，1971)。一些研究已顯示卵巢癌患者血清觸珠蛋白中提高的巖藻糖基化和其他糖基化的變化(Thompson等人，1992)。最近，已在卵巢癌中顯示了觸珠蛋白、CA125和白介素-6水平間的關聯性(Dobryszycka等人，1999)。由于這些研究依靠觸珠蛋白的分光光度法(Mueller等人，1971)、免疫擴散(Thompson等人，1992)和電泳(Thompson等人，1992)檢測，檢測的是同源的天然蛋白質而不是觸珠蛋白前體。
Ono等人，2000年公開了卵巢腫瘤組織中對應于觸珠蛋白α(15)-β前體的mRNA的表達。該作者并不認為可在卵巢癌患者的血清和腹水液體中檢測觸珠蛋白-1前體。雖然眾所周知生物液體中成熟觸珠蛋白的表達在如癌癥、關節(jié)炎和蛋白尿的病情中上調，觸珠蛋白的前體形式在這些情況下沒有檢測到。
上述報告均沒有提示生物液體中任何觸珠蛋白前體的檢測或測定可用于卵巢癌或任何其他癌癥的診斷、分級或預后。
發(fā)明概述利用蛋白質組和蛋白質印跡法方法我們目前已經鑒定了早期卵巢癌患者血清中的觸珠蛋白-1前體。已表明相比于正常血清，卵巢癌患者血清中觸珠蛋白-1前體的濃度提高了。因此提示觸珠蛋白-1前體作為生物標記物開發(fā)的候選物。此外，隨著卵巢癌的發(fā)展觸珠蛋白-1前體表達提高的發(fā)現使得其成為一種理想的候選物，以補充或替代廣泛使用的但非特異性的CA 125標記物。
在第一個方面，本發(fā)明提供了卵巢癌的檢測方法，包括測定來自懷疑患有卵巢癌的受試者之生物液體樣品中觸珠蛋白-1前體濃度的步驟，其中相比于對照樣品中觸珠蛋白-1前體的濃度，觸珠蛋白-1前體提高的濃度為癌癥存在的指征。
與獲得組織樣品如活體檢查相比，利用生物液體樣品檢測觸珠蛋白-1前體的能力在獲得樣品方面提供了相對的便利。此外，其使得觸珠蛋白-1前體能在卵巢癌發(fā)展中較早地檢測到，而活體檢查樣品常常取自疾病發(fā)展的后期。在卵巢癌情況下，直至腫瘤利用外科手術切除，并不經常采取活體檢查。
在第二個方面，本發(fā)明提供了監(jiān)測卵巢癌治療功效的方法，包括測定來自懷疑患有卵巢癌的受試者之生物液體樣品中觸珠蛋白-1前體濃度的步驟，其中相比于治療前的水平，觸珠蛋白-1前體水平的降低為治療功效的指征。
在第三個方面，本發(fā)明提供了評估卵巢癌嚴重程度的方法，包括定量測定來自診斷患有或懷疑患有卵巢癌的受試者之生物液體樣品中觸珠蛋白-1前體濃度的步驟，其中相比于對照樣品中觸珠蛋白-1前體的濃度，觸珠蛋白-1前體提高的濃度為癌癥存在和/或嚴重程度的指征。在本發(fā)明的所有三種方法中觸珠蛋白-1前體的水平可選擇性地和一種或多種其他卵巢癌標記物相關聯。
在本發(fā)明的所有三個方面中生物液體可以是血液、血漿、血清、腹水或尿。本領域技術人員將很容易確定是否可以使用其他生物液體，如唾液。
觸珠蛋白-1前體的濃度可通過任何用于檢測觸珠蛋白-1前體蛋白或編碼其的核酸的便利方法而測定，包括但不限于ELISA、放射免疫測定、化學發(fā)光測定、實時PCR、核酸雜交方法等等。觸珠蛋白-1前體的特異性抗體，包括單克隆抗體可利用常規(guī)方法方便地制備，并且可用于所述方法中。優(yōu)選這些抗體不與α鏈內的表位反應?？啥ㄐ曰蚨繙y定濃度。
生物液體樣品可選擇性地經過一個預處理步驟，利用親和膠Blue蛋白A或Blue瓊脂糖凝膠-蛋白A柱，或利用對應于2002年8月23日提交的澳大利亞臨時專利申請2002951240，皇家婦女醫(yī)院(RoyalWomen’s Hospital)于2003年8月22日提交的國際專利申請PCT/AU03/01075中所述的方法，而耗貧高豐度的蛋白質(如白蛋白)。此提高了低豐度蛋白質的檢測靈敏度。
可選擇的，本發(fā)明的方法還包含測定另一個卵巢癌標記物，如整聯蛋白-連接激酶(ILK)、CA 125、TADG-12、間皮素(mesothelin)、激肽釋放酶10、prostasin、骨橋蛋白、肌酸激酶β、血清轉鐵蛋白(serotransferrin)、嗜中性-明膠酶相關脂卡林(lipocalin)(NGAL)、CD163或Gc-球蛋白水平的步驟?；蛘?，也可檢測一種或多種其他假定的卵巢癌標記物，如mesothelin、激肽釋放酶10、prostasin、骨橋蛋白或肌酸激酶β提高的表達。利用本領域已知的方法可在DNA、RNA或蛋白水平檢測第二個標記物。
在第四個方面，本發(fā)明提供用于以下的試劑盒a)卵巢癌的診斷；b)卵巢癌治療功效的監(jiān)測；或c)卵巢癌嚴重程度的評估；其中包含觸珠蛋白-1前體特異性抗體或核酸探針。
在第五個方面，本發(fā)明提供觸珠蛋白-1前體特異性抗體或核酸探針在以下的用途a)卵巢癌的診斷；b)監(jiān)測卵巢癌的治療功效；或c)卵巢癌嚴重程度的評估。
在本發(fā)明的第四個和第五個方面，抗體優(yōu)選單克隆抗體。更優(yōu)選抗體不與α鏈內的表位反應，并且更加優(yōu)選抗體特異于觸珠蛋白-1前體。
雖然特別指出本發(fā)明適用于人，其也適用于獸醫(yī)用途，包括用于寵物動物(如狗和貓)，以及家畜(如馬、牛和綿羊)，或動物園動物(如非-人靈長類、貓科動物、犬科動物、?？苿游镆约坝刑泐?。
附圖簡述

圖1顯示了血清樣品在雙向電泳(2-DE)之前用親和膠Blue和蛋白A預處理的結果，圖解說明了白蛋白的減少和增強的低豐度蛋白質的檢測。圖1a通過SYPRO Ruby染料顯現的正常血清雙向電泳的分布圖；圖1b用親和膠Blue和蛋白質預處理的血清2-DE的分布圖。
圖2顯示了雙向電泳的結果，圖解說明了相比于蛋白質組分析所確定的正常受試者的表達，卵巢癌患者血清中六種不同觸珠蛋白-1前體同工型的增強的表達。圖2a正常受試者；圖2b1級卵巢癌患者；圖2c2級卵巢癌患者和圖2d3級卵巢癌患者。
圖3顯示了證實觸珠蛋白-1前體在卵巢癌患者腹水(AS)中表達的雙向電泳的分布圖。
圖4顯示了不同等級卵巢癌患者的雙向電泳分布圖，證實蛋白質的差異表達。
圖4a1級；圖4b2級；圖4c3級。
圖5顯示分離自2-DE凝膠的六種蛋白質的MALDI-TOF MS和n-ESIQ(q)TOF MS質量指紋分析結果。
圖6a圖解說明了如通過單向電泳和利用單克隆的抗-觸珠蛋白抗體的蛋白質印跡測定的，1級和3級卵巢癌患者血清中38kDa觸珠蛋白-1前體的免疫活性水平。
圖6b圖解說明了如通過單向電泳和利用單克隆的抗-觸珠蛋白抗體的蛋白質印跡測定的，正常的、良性的和臨界的受試者以及1、2和3級卵巢癌患者血清中38kDa觸珠蛋白-1前體的免疫活性水平。
圖6c顯示了正常的、良性的和臨界的受試者以及1、2和3級卵巢癌患者血清中觸珠蛋白-1前體表達的水平。
圖7a、7b和7c顯示了相比于正常血清中的水平，(a)正常受試者、(b)1級和(c)3級卵巢癌患者血清中觸珠蛋白-1前體異構型提高的免疫活性水平。表達水平通過雙向凝膠電泳和利用單克隆的抗-觸珠蛋白抗體的蛋白質印跡法測定。
圖8顯示組織樣品中免疫活性觸珠蛋白-1前體利用觸珠蛋白的單克隆抗體的免疫組織化學檢測結果。免疫活性觸珠蛋白-1前體在正常卵巢中缺乏(平板a)，但是存在于1、2和3級卵巢腫瘤組織中(血清腫瘤，平板b和子宮內膜樣腫瘤；平板c和d)。
圖9a圖解說明了如通過雙向電泳所測定的，化療治療前、后3級卵巢癌患者樣品中觸珠蛋白-1前體的表達分布。
圖9b顯示了化療治療前、后卵巢癌患者樣品中不同觸珠蛋白-1前體同工型的相對表達水平。
發(fā)明詳述定義很顯然本發(fā)明不限于此處所述的具體材料和方法，因為這些可以改變。還可明確的是此處所用術語僅是為了描述具體的實施方案，而并不試圖限制本發(fā)明的范圍，其僅僅由附加的權利要求限定。
如此處使用的，除非上下文另有明確規(guī)定，單數形式“一”、“一個”和“這個”包含對應的復數解釋。因此例如，″一種蛋白質″的解釋包括所述蛋白質的復數，并且“一種分子”的解釋指一種或多種分子的解釋。除非另外定義，此處使用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所述技術領域的普通技術人員通常理解的相同的意思。雖然與此處所述的類似的或等同的任何材料和方法可用于實踐或驗證本發(fā)明，優(yōu)選的材料和方法描述如下。
在隨后的權利要求中以及之前的發(fā)明說明書中，除了上下文由于表述語言或必需的含意所需，單詞″包括″或變體如″包含″或″含有(comprising)″用于包括端點在內的意義，即表明所述特征的存在而不排除本發(fā)明不同實施方案中另外特征的存在或加入。
當表達數值范圍時，很明確的是該范圍包涵范圍的上下限，所有值處于那些限定之中。
″觸珠蛋白-1″指分子量大約90kD的成熟的糖基化的四聚物。
“觸珠蛋白-1前體”指分子量大約38kD的單鏈前體蛋白，其包括18個氨基酸的信號序列。
“免疫活性觸珠蛋白-1前體”指利用針對成熟的觸珠蛋白-1之單克隆抗體檢測到的觸珠蛋白-1前體。
此處所用的縮寫如下1-DE 單向電泳2-DE 雙向電泳
ir 免疫活性的MALDI-TOF 基質-輔助激光解吸干涉測量-飛行時間MS 質譜法MS/MS 串聯質譜法SELDI-TOF MS 表面-增強的激光解吸電離飛行時間質譜法TOF MS 飛行時間質譜法已發(fā)現觸珠蛋白前體存在于1級、2級和3級卵巢癌患者的腹水和血清中。卵巢癌組織中，免疫活性觸珠蛋白-1前體存在于上皮細胞、基質和卵巢血管中。觸珠蛋白-1前體與成熟的觸珠蛋白有＞90％的同源性。因此觸珠蛋白的單克隆抗體能檢測免疫活性觸珠蛋白-1前體。
這些數據與觸珠蛋白-1前體的過表達為卵巢癌發(fā)病中的早期事件的假設相一致。因此觸珠蛋白-1前體增強的表達可以反應急性應答的情況，其為腫瘤發(fā)展的先決條件。
不希望限于任何可能的機制，我們認為由于大多數分泌蛋白質最早作為具有在分泌加工晚期，或在高爾基體內或有關囊泡中被裂解的、延伸的氨基末端序列的較大前體而合成，癌癥患者血清中觸珠蛋白-1前體提高的水平可能源于癌細胞特異的缺陷型胞內加工。
轉錄分布或相關的基因表達系列分析、消減雜交和差異顯示技術已經鑒定了14個候選卵巢癌標記物(Mok等人，2001；Schummer等人，1999)。這些蛋白質中，mesothelin和激肽釋放酶10通過單克隆抗體和候選基因方法分別鑒定(Scholler等人，1999；Luo等人，2001)。Mesothelin在76％的卵巢癌患者血清中增高(Diamandis等人，2000)，而激肽釋放酶10在56％的卵巢癌患者中增高(Luo等人，2001)。已認為mesothelin和/或激肽釋放酶10的測試可以配合CA 125的測試，提高在早期、可治愈階段檢測卵巢癌的希望。
由于在患有卵巢癌的患者血清中增高，基因陣列技術已用于鑒定prostasin(一種早先在前列腺分泌物中鑒定的絲氨酸蛋白酶)、骨橋蛋白(一種分泌的骨成形素)和肌酸激酶B(一種腎和肺癌的標記物)(Mok等人，2001；Kim等人，2002)。這些數據表明DNA或RNA水平的篩查方法可用于鑒定一系列的標記物，其也具有配合目前所用的CA125測試以及提供提高的特異性和靈敏度的潛力。
最近鑒定了作為卵巢癌標記物的整聯蛋白-連接激酶(ILK)的無細胞免疫活性形式，其與癌癥階段高度相關。參見皇家婦女醫(yī)院2003年8月20日提交的國際專利申請PCT/AU03/01058。
卵巢癌一種或多種另外的標記物，如ILK(PCT/AU03/01058)、CA 125(Mackay和Creasman，1995)、TADG-12(Underwood LJ 2000)或更多最近所述的標記物，血清轉鐵蛋白(Kawakami等.，1999)、嗜中性明膠酶相關脂卡林(Kjeldsen等.，1994)、可溶性CD163(Baeton等.，2003)和Gc-球蛋白(Jorgensen等.，2004)可作為觸珠蛋白-1前體檢測的輔助物而用于本發(fā)明的方法中。
常規(guī)方法雙向電泳和質譜法第一向分離25μg的血清蛋白與再水合緩沖液(7M尿素，2M硫脲，100mM二硫蘇糖醇(DTT)，4％(3-[(3-膽酰胺丙基)二甲胺基]-1-丙基磺酸酯)(CHAPS)，0.5％載體兩性電解質，0.01％溴酚藍(BPB)40mM Tris并且pH 4-7)混合至終體積200μl，并且室溫下孵育1h。該混合物隨后加樣于Ready strip(11cm，pH4-7；Bio-RadLaboratories，USA)并且在50V 20℃主動再水合16h。血清蛋白在250V等電聚焦15分鐘；電壓隨后緩慢升至8000V 150分鐘，隨后維持在8000V至總共35000Vh/凝膠(即每塊凝膠總共42000Vh)。隨后在第二向分離之前Ready Strip儲存于-80℃。
第二向的分離來自第一向分離的Ready Strip在5ml平衡緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8.8，6M尿素，30％甘油，2％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.01％BPB，2mM三丁基膦(TBP))中平衡。Strip在Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％w/v SDS；pH8.3)中漂洗并且隨后上樣至10％Tris-HCl預制的標準凝膠(Bio-Rad Laboratories，USA)頂端。在Strip的頂端鋪一層低熔點瓊脂糖(包含BPB的電泳緩沖液中，0.5％)。分子量標記(150、100、75、50、37和25kDa)同時電泳。凝膠以10mA/凝膠電泳1h、20mA/凝膠2h并且隨后30mA/凝膠30分鐘。隨后凝膠在甲醇/乙酸(dH2O中40％/10％)中室溫下固定1h并且在振蕩平臺上SYPRO Ruby(Bio-Radlaboratories，USA)中室溫下孵育16h。凝膠在甲醇/乙酸(dH2O中10％/7％)去染1h，利用Bio-Rad FX成像儀在100nm分辨率成像，并且利用PDQuest version 6軟件(Bio-Rad laboratories，USA)分析。計算機程序識別出來自凝膠數字化圖象的蛋白質斑點。一些血清樣品的分析重復三次以評估用不同凝膠的實驗之間的差異性。
質譜法成像之后，凝膠用考馬斯藍染色以使得能夠進行肉眼可見的鑒定和蛋白帶的分離。從凝膠切除考馬斯染色的條帶并且用胰蛋白酶消化。質譜實驗在Ettan MALDI-TOF儀器(Amersham Bioscience，UK)和API QSTAR Pulsari質譜儀(Applied Biosystems，MDS Sciex，Framingham，USA)上進行。通過PepSea服務器搜索TOFMS數據，其被歸入分析軟件中(Applied Biosystems，MDS Sciex，Framingham，USA)。串聯MS數據通過MASCOT搜索引擎搜索。
本發(fā)明將通過僅參照下列非限制性實施例和附圖的方法詳細描述。
實施例1 高豐度白蛋白從人血清的去除用親和膠-Blue和蛋白A(5∶1)混合物以離心柱的形式(Bio-RadLaboratories，USA)處理人血清樣品。該離心柱包含親和膠Blue和蛋白A的混合物，其選擇性地結合和除去白蛋白和免疫球蛋白。離心柱用1ml結合緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0)通過1000×g離心20秒洗滌兩次。50μl血清加至150μl的結合緩沖液，通過渦流混合，并且加載至離心柱。室溫下孵育1h后，柱在1000×g離心20秒以收集洗脫物。柱用200μl結合緩沖液洗滌并且與第一個洗脫物結合以產生廢棄的血清樣品。測定結合洗脫物的總蛋白濃度。洗脫物儲存于-80℃直至另外的分析。
圖1a表示由SYPRO Ruby染色顯現的典型2-DE人血清分布。超過300種蛋白質得到檢測并且定位于pI 4-7和20-200kDa的分子量范圍之間。68kDa附近的白蛋白模糊條帶存在于未處理的血清中，但親和膠Blue和蛋白A處理1h實現白蛋白的明顯損耗，而沒有其他所展示蛋白的明顯損耗。如圖1b中所示，伴隨白蛋白的去除一些蛋白質斑點染色強度產生顯著的提高。該結果表明人血清的親和膠Blue和蛋白A處理導致高豐度白蛋白的去除，由此提高了低豐度蛋白質的檢測，否則其在白蛋白存在時仍然是模糊不清的。我們已經執(zhí)行該白蛋白清除的方法而用于鑒定卵巢癌患者血清中差異-表達的低豐度蛋白質。
實施例2 卵巢癌患者血清和腹水中觸珠蛋白-1前體的表達蛋白質組分析和質譜法用于評估正常健康的婦女和卵巢癌患者血清中觸珠蛋白-1前體的表達。癌癥患者根據標準的組織學方法分級(Silverberg，2000)。
對照組中婦女和卵巢癌婦女的平均年齡分別為47和62歲。通過靜脈穿刺收集全血(10ml)入用于血清的平收集管中(允許血液在室溫下凝固30分鐘)。樣品在2000g離心10分鐘，隨后收集血清。移出等分試樣(100μl)用于總蛋白的測定。血清儲存于-80℃直至分析。
分析來自8個正常雌性受試者和19個卵巢癌患者血清樣品的觸珠蛋白-1前體表達。患者中，6個為1級，8個為2級，而24個為3級。還檢測卵巢癌患者腹水的觸珠蛋白-1前體表達。通過蛋白質組分析和通過利用成熟觸珠蛋白的單克隆抗體(Sigma，St Louis，USA)的非還原條件下的蛋白質印跡法檢測血清和腹水中的觸珠蛋白-1前體表達。觸珠蛋白-1前體與成熟的觸珠蛋白有＞90％的同源性。因此觸珠蛋白的單克隆抗體能檢測免疫活性觸珠蛋白-1前體。
通過靜脈穿刺收集全血(2ml)入平收集管中，并且允許血液在室溫下凝固30分鐘。樣品隨后在2000g離心10min，之后收集血清。移出等分試樣(100μl)用于總蛋白的測定。血清儲存于-80℃直至分析。血液樣本在室溫下融解，并且對樣品進行雙向電泳。
圖2顯示了正常受試者和1級、2級以及3級卵巢癌患者血清中觸珠蛋白-1前體表達的蛋白質組分析結果。圖3顯示了來自卵巢癌患者的腹水中觸珠蛋白-1前體表達的蛋白質組分析結果。
實施例3 不同組織學等級的卵巢癌患者的血清蛋白分布1級(n＝6)、2級(n＝8)和3級(n＝24)卵巢癌患者血清的蛋白質分布通過2-DE分析并且通過用SYPRO-Ruby染色顯現。利用PDQuest軟件比較來自癌癥患者樣品的平行組和正常健康婦女(n＝8)的蛋白質分布，并且圖4中顯示為高斯分布。利用Student′s t檢驗進行正常組相對1級、2級或3級卵巢癌患者中差異表達的血清蛋白的定量評估。相比于正常的健康志愿者，1、2和3級卵巢癌患者中獲得血清蛋白總分布的顯著差異。相比于正常血清，24種蛋白質在1級卵巢癌患者中差異表達(圖4a)。這些蛋白質中，15種蛋白質上調2倍，4種蛋白質為5倍以及2種蛋白質為10倍。相反，分別有一種蛋白質下調2、5和10倍。2級癌癥患者中，觀察到31種蛋白質的差異表達，其中25種上調2倍，4種為5倍以及2種為10倍。3級癌癥患者血清的分析表明25種差異表達的蛋白質中13種蛋白質下調2倍(圖4b和4c)。分別有6種蛋白質上調2倍，3種蛋白質為5倍以及2種蛋白質為10倍(p＜0.05)。
發(fā)現一些蛋白質僅在特定病理等級的癌癥患者血清中特異表達，而一些蛋白質在三種組織學等級的癌癥患者中并不持續(xù)表達。為了確保所觀察到的差異表達分布中的一致性，在三個不同天數制備的來自同一個患者的血清樣品分析重復三次，并且研究以消除可能由于樣品處理而引起的混淆因素。在不同天數重復的相同樣品的蛋白質斑點分布中沒有檢測到本質的改變。
差異表達的血清蛋白中，發(fā)現10種蛋白質在1、2和3級癌癥患者中持續(xù)表達(p＞0.05)。這些蛋白質中的6種，其具有約40kD的分子量和5.9-6.6的pI，在1、2和3級卵巢癌患者血清中明顯過表達。選擇這些用于另外的分析和鑒定。
實施例4 卵巢癌患者中過-表達蛋白質的鑒定實施例3中發(fā)現的在卵巢癌患者中過表達的6種蛋白質通過納-電離四極飛行時間質譜法(ESIQ(q)TOF MS)和基質-輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF MS)分析而鑒定。
圖5中顯示的來自6種蛋白質的質量指紋譜顯現相同的多肽裂解模式，提示了以不同pI和/或分子質量值分開的單個蛋白質的一系列翻譯后修飾的可能性。6種蛋白質的MS/MS分析證實其作為觸珠蛋白-1前體同工型的身份(Swissprot登錄號P00737)，該前體為具有38.42kD分子量和6.1-6.6 pI的蛋白質，與存在于正常血清中的肝臟糖蛋白觸珠蛋白具有90％的同源性(Beutler等人，2002)。這些多肽的氨基酸序列概括在表1中。獲得的多肽序列包含對應觸珠蛋白-1前體不同區(qū)域的氨基酸序列。
表13級卵巢癌患者血清中1-6斑點的多肽序列
Blast搜索結果SwissProt登錄號P00737質量38，427D所鑒定的蛋白質人觸珠蛋白-1前體這些多肽在全長觸珠蛋白-1前體序列中的定位顯示在表2中。
表2對應于觸珠蛋白-1前體分子的來自1-6斑點的多肽(下劃線)
蛋白質糖基化模式的差異具有改變蛋白質pI和分子量的可能性，而利用2-DE方法已證實正常血清中的觸珠蛋白不同的唾液酸化形式(Wilson等人，2002)。我們的結果與這些觀察相一致，其證實6種不同的觸珠蛋白-1前體同工型存在于卵巢癌患者血清中。
此外證實為觸珠蛋白-1前體同工型的這些蛋白質通過利用單克隆抗-人觸珠蛋白抗體的蛋白質印跡法獲得。6種觸珠蛋白-1前體的同工型通過1-DE或2-DE以及蛋白質印跡法因蛋白質斑點鏈系具有略微不同的分子量和不同的pI而檢測。天然蛋白質與前體具有90％同源性，因此單克隆-抗-觸珠蛋白抗體預期可在2-DE蛋白質印跡中顯現觸珠蛋白同工型前體。
對于蛋白質印跡，血清樣品與5倍體積的Laemmli緩沖液孵育。包含等份蛋白質(60μg)的樣品在10％SDS-PAGE凝膠電泳至非還原的狀態(tài)下，隨后轉至硝酸纖維素膜。膜用初始的觸珠蛋白抗體(Sigma，USA)，隨后為過氧化物酶-標記的二抗(Amersham，UK)探測并且通過ECL檢測系統(tǒng)根據廠家說明書顯像(Amersham，UK)。結果在圖6和7中顯示。
圖6a顯示了健康志愿者和卵巢癌患者血清中觸珠蛋白分子的1-DE Western分布?？贵w主要識別分子量約為20、40和70kD的三條帶。令人感興趣的是，由抗-觸珠蛋白抗體鑒定的40和70kD蛋白質的表達在1和3級癌癥患者中比在健康成人中更多。與之相一致的是，通過2-DE蛋白質印跡在40kD分子量的6種蛋白質組觀察到高的反應性(圖6b、6c和6d)。如在圖7中圖解說明的，利用2-DE和蛋白質印跡法獲得類似的結果。在分子量20和70kD的另外2種蛋白質也觀察到反應性，與1-DE分布一致。分子量20和70kD蛋白質的身份是未知的，而正在研究中。以具有略微不同分子量和不同pI的蛋白質斑點鏈系呈現的6種觸珠蛋白-1前體異構型提示翻譯后修飾的存在。
這些結果表明卵巢癌患者血清中觸珠蛋白-1前體表達例如通過ELISA或放射免疫測定的定量可用作篩查目的的診斷標記物。
實施例5 免疫組織化學分析從皇家婦女醫(yī)院病理系獲得石蠟-處理的歸檔組織。這些包括對照比較所需的正常卵巢(n＝6)，其由于可疑的超聲波圖象、觸摸得到的腹部塊和家族史而從患者經手術除去。通過皇家婦女醫(yī)院，Melbourne病理系的2位病理學家確定病理診斷和腫瘤等級。腫瘤的分級作為臨床診斷的一部分進行。卵巢癌的組織學等級通過Silverberg(2000)所述的方法進行。
組織切片切成4μm厚，固定于聚-L-賴氨酸涂布的載玻片上并且在60℃孵育1h。切片在梯度二甲苯和乙醇中3次脫水?？乖┞独脵幟仕猁}緩沖液(pH 6.0)在微波爐中進行。內源性的過氧化物酶利用甲醇中3％的過氧化氫除去，并且內源性的生物素活性利用稀釋的蛋清(蒸餾水中5％)和稀釋的脫脂奶粉(蒸餾水中5％)阻斷。切片在1/10000稀釋于1％BSA Tris緩沖液(100mM，pH7.6)的抗-觸珠蛋白單克隆抗體(Sigma，St Louis USA)中孵育1h?？贵w結合利用生物素和鏈親和素HRP(DAKO，Denmark)每個放大15分鐘，并且利用二氨基聯苯胺顯現復合物。細胞核用Mayer′s蘇木精淡染。適當稀釋的同位型IgG1替代抗體用作陰性對照。
切片在顯微鏡下評估陽性的二氨基聯苯胺染色。觸珠蛋白表達的強度以陰性的、弱的、中等的或強的免疫反應性的不明方式分級。除了染色類型外，測定染色的組織和胞內分布。
圖8顯示正常卵巢上皮和不同等級的血清和子宮內膜樣卵巢腫瘤樣品間的免疫組織化學比較的結果。如圖8a所示，正常的卵巢表皮或基質中未檢測到免疫活性的觸珠蛋白-1前體。如圖8b、8c和8d分別所示，在1級和3級血清和子宮內膜樣卵巢腫瘤中，表皮、基質和卵巢血管中檢測到免疫活性觸珠蛋白-1前體的高表達。由于染色的大多數在分散的細胞組中觀察到，染色主要為胞質的。具腺模式的腫瘤傾向于更多的染色。深染在粘液瘤基質或血管間隙以及卵巢血管區(qū)域中明顯。不希望限于任何可能的機制，我們認為觸珠蛋白前體由卵巢腫瘤細胞表達，而卵巢癌患者血清中增高的觸珠蛋白前體濃度很可能是肝來源的。
實施例6 化療前和化療后觸珠蛋白-1的表達評估檢測六輪化療前后卵巢癌患者生物液體樣品中觸珠蛋白-1前體表達的功效。
化療治療包括由卡波氯氨鉑(AUC 5)/紫杉酚(175mg/m2體重)組成的療法以及隨后手術的常規(guī)組合。組合藥物通過靜脈內輸液每三周給予患者。化療前樣品在手術前采集，而化療后樣品在治療完成后5個月采集。所檢的生物液體為血清。測定每輪治療前后采集的血清樣品中觸珠蛋白-1前體和CA 125的值。
化療前后觸珠蛋白-1前體的表達在圖9a和9b中顯示。可看出相對于化療前的水平，觸珠蛋白-1前體表達的水平在化療后降低。
手術前該患者血清中CA 125的水平為376U/ml。化療完成后CA125的水平降低至16u/ml。因此化療治療后生物液體中觸珠蛋白-1前體水平的降低與化療后生物液體中CA 125水平的降低相關聯。
實施例7 生物液體中觸珠蛋白-1前體和其同工型濃度的評估卵巢癌治療的功效、治療后疾病的復發(fā)以及卵巢癌發(fā)病的早期檢測通過如下定量生物液體中觸珠蛋白-1前體和其同工型的濃度而評估，(i)利用靶向中間體和β鏈表位的多克隆或單克隆抗體的直接或間接的夾心ELISA(ii)基于熒光珠的免疫測定法(Luminx技術)和/或(iii)基于磁珠的免疫測定法和質譜分析。
觸珠蛋白-1前體的測定與利用本領域已知的方法，包括但不限于ELISA測定法對CA125(Mackay和Creasman，1995)、ILK(PCT/AU03/01058)、TADG-12(Underwood LJ，2000)、血清轉鐵蛋白(Kawakami等人，1999)、嗜中性明膠酶相關脂卡林(Kjeldsen等人，1994)、可溶性CD 163(Baeton等人，2003)和Gc-球蛋白(Jorgensen等人，2004)的卵巢癌相關其他分析物的測定聯合進行。
如表3所示，觸珠蛋白-1前體的表達水平可用于和其他標記物聯合以提高測試的靈敏度和特異性。
表3化療前后卵巢癌患者血清中觸珠蛋白-1前體、血清轉鐵蛋白和可溶的整聯蛋白-連接激酶的表達
化療后2號患者中觸珠蛋白-1前體抑制的缺乏與CA 125濃度的提高有關。該結果可能表明化療劑抗性的發(fā)展，而正在進一步的研究中。
討論我們的發(fā)現顯示早期卵巢癌患者中觸珠蛋白-1前體的血清濃度顯著提高。不希望限于任何可能的機制，我們認為由于卵巢癌患者中的急性期反應，可能發(fā)生觸珠蛋白前體增強的肝內合成，其導致提高的血清觸珠蛋白前體濃度。我們已經證實觸珠蛋白前體表達水平和癌癥等級之間的半定量相關性。我們認為利用如免疫測定法的定量測定方法可很容易建立定量相關性。我們認為觸珠蛋白-1前體代表了用于卵巢癌診斷的一種新的和有效的生物標記物。正常表皮中免疫活性觸珠蛋白-1前體表達的缺乏和后期腫瘤中提高的免疫活性觸珠蛋白-1前體的表達提示觸珠蛋白-1前體對卵巢癌發(fā)展是關鍵性的。
對于本領域技術人員很顯然的是，雖然本發(fā)明為了明確和理解的目的已詳細地進行描述，可在不背離說明書中所公開的發(fā)明構思的范圍下對此處所述的實施方案和方法進行各種改進和改變。
此處引用的參考文獻如下所列。
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權利要求
1.卵巢癌的檢測方法，該方法包括測定來自懷疑患有卵巢癌的受試者之生物液體樣品中觸珠蛋白-1前體濃度的步驟，其中相比于對照樣品中觸珠蛋白-1前體的濃度，觸珠蛋白-1前體增加的濃度為癌癥存在的指征。
2.監(jiān)測卵巢癌治療功效的方法，包括測定來自懷疑患有卵巢癌的受試者之生物液體樣品中觸珠蛋白-1前體濃度的步驟，其中相比于治療前的水平，觸珠蛋白-1前體水平的降低為治療功效的指征。
3.評估卵巢癌嚴重程度的方法，包括定量測定來自診斷患有或懷疑患有卵巢癌的受試者之生物液體樣品中觸珠蛋白-1前體濃度的步驟，其中相比于對照樣品中觸珠蛋白-1前體的濃度，觸珠蛋白-1前體增加的濃度為癌癥存在和/或嚴重程度的指征。
4.根據權利要求1至3中任一項的方法，其中生物液體為血液、血漿、血清、腹水或尿。
5.根據權利要求1至4中任一項的方法，其中生物液體已經過預處理步驟以耗貧高豐度的蛋白質，因此提高低豐度蛋白質檢測的靈敏度。
6.根據權利要求1至5中任一項的方法，進一步包括將觸珠蛋白-1前體的水平與一種或多種其他卵巢癌標記物關聯的步驟。
7.根據權利要求6的方法，其中其他標記物為整聯蛋白-連接激酶(I LK)、CA 125、TADG-12、間皮素、激肽釋放酶10、prostasin、骨橋蛋白、肌酸激酶β、血清轉鐵蛋白、嗜中性-明膠酶相關脂卡林(NGAL)、CD163或Gc-球蛋白。
8.根據權利要求6或權利要求7的方法，其中其他標記物為整聯蛋白-連接激酶(ILK)、CA 125、血清轉鐵蛋白、嗜中性-明膠酶相關脂卡林(NGAL)或CD163。
9.用于以下的試劑盒a)卵巢癌的診斷；b)監(jiān)測卵巢癌的治療功效；或c)卵巢癌嚴重程度的評估；其中包含觸珠蛋白-1前體特異性抗體或核酸探針。
10.根據權利要求9的試劑盒，其中抗體為單克隆抗體。
11.根據權利要求9或權利要求10的試劑盒，其中抗體不與α鏈內的表位反應。
12.根據權利要求9至11中任一項的試劑盒，其中抗體特異于觸珠蛋白-1前體。
13.觸珠蛋白-1前體特異性抗體或核酸探針在以下的用途a)卵巢癌的診斷；b)監(jiān)測卵巢癌的治療功效；或c)評估卵巢癌的嚴重程度。
14.根據權利要求13的用途，其中抗體為單克隆抗體。
15.根據權利要求13或權利要求14的用途，其中抗體不與α鏈內的表位反應。
16.根據權利要求13至15中任一項的用途，其中抗體特異于觸珠蛋白-1前體。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過評估生物液體樣品中觸珠蛋白－1前體的濃度而檢測卵巢癌、監(jiān)測卵巢癌的治療功效和評估卵巢癌嚴重程度的方法。本發(fā)明還涉及包含觸珠蛋白－1前體特異性抗體或核酸探針的試劑盒，所述試劑盒用于卵巢癌的診斷、監(jiān)測卵巢癌的治療功效或評估卵巢癌的嚴重程度。
文檔編號G01N33/53GK1871362SQ200480030838
公開日2006年11月29日 申請日期2004年9月6日 優(yōu)先權日2003年9月5日
發(fā)明者N·阿梅德, G·E·賴斯, M·A·奎因 申請人:皇家婦女醫(yī)院