專利名稱：微孔陣列芯片及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的第一方案涉及可用于抗原特異性淋巴細(xì)胞等生物體細(xì)胞的檢測等的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第一方案特別涉及可容易地進(jìn)行微孔定位的微孔陣列芯片(Microwell Array Chip)。
本發(fā)明的第二方案涉及微孔對(duì)生物體細(xì)胞的捕集率和收集率均優(yōu)異的微孔陣列芯片及其制造方法。
本發(fā)明的第三方案涉及可用于抗原特異性淋巴細(xì)胞等生物體細(xì)胞的檢測等的硅制微孔陣列芯片。本發(fā)明的第三方案特別涉及根據(jù)需要，可容易地將容納在微孔中的生物體細(xì)胞進(jìn)行回收的微孔陣列芯片。
背景技術(shù)：
以往，抗原特異性淋巴細(xì)胞通過例如使用96孔板，每孔加入約200,000個(gè)淋巴細(xì)胞，在抗原存在下培養(yǎng)3天至一周，由此進(jìn)行檢測(“リンパ球機(jī)能檢索法”矢野純一、藤原道夫編著，中外醫(yī)學(xué)社(1994年)；“免疫實(shí)驗(yàn)操作法I、II”右田俊介、紺田進(jìn)、本庶佑、濱岡利之編集，南江堂(1995年))。該方法中，可確認(rèn)約200,000個(gè)淋巴細(xì)胞群中存在抗原特異性淋巴細(xì)胞。但是無法鑒定存在于淋巴細(xì)胞群中的各抗原特異性淋巴細(xì)胞。
對(duì)于此，近年來人們開發(fā)利用了通過將用熒光染料標(biāo)記的抗原分子與淋巴細(xì)胞混合，來使熒光標(biāo)記抗原與抗原特異性淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合，再使用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)合有熒光標(biāo)記抗原的淋巴細(xì)胞的方法(Altman JD，Moss PA，Goulder PJ，Barouch DH，McHeyzer-Williams MG，Bell JI，McMichael AJ，Davis MM.Phenotypic analysis ofantigen-specific T lymphocytes(抗原特異性T淋巴細(xì)胞的表型分析)，Science，27494-96，1996)。該方法可以鑒定與抗原結(jié)合的1個(gè)淋巴細(xì)胞。還可以分選1個(gè)與抗原結(jié)合的淋巴細(xì)胞。
但是，上述檢測方法中，為了分選，必須有細(xì)胞分選儀這樣高價(jià)且復(fù)雜的儀器，并且還有以下的問題。
(1)用于分選的儀器條件設(shè)定較難，用于分選細(xì)胞的儀器操作必須熟練。
(2)由于背景噪聲高，抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為0.1％以下時(shí)，無法檢測抗原特異性淋巴細(xì)胞。
(3)分選細(xì)胞的效率低。
(4)分選頻度低的細(xì)胞需要時(shí)間。
(5)可以確認(rèn)有抗原結(jié)合，但難以對(duì)結(jié)合有抗原的淋巴細(xì)胞的反應(yīng)進(jìn)行分析。
作為其它的抗原特異性淋巴細(xì)胞檢測法，還開發(fā)出通過將與磁珠結(jié)合的抗原分子與淋巴細(xì)胞混合，使結(jié)合有磁珠的抗原與抗原特異性淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合，使用磁石分選抗原特異性淋巴細(xì)胞的方法(Abts H，Emmerich M，Miltenyi S，Radbruch A，Tesch H，CD20positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter(MACS)can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro.Journal ofImmunological methods 12519-28，1989.)。
該方法無需復(fù)雜的裝置，細(xì)胞分選所需的時(shí)間短，可以確認(rèn)有抗原結(jié)合。但無法對(duì)結(jié)合有抗原的淋巴細(xì)胞是否與抗原反應(yīng)(細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA合成、蛋白質(zhì)合成等細(xì)胞的代謝生理反應(yīng))進(jìn)行分析。另外，抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為0.1％以下時(shí)，無法檢測抗原特異性淋巴細(xì)胞。
而本發(fā)明人對(duì)于提供無需復(fù)雜的裝置、細(xì)胞分選時(shí)間短、可確認(rèn)有抗原結(jié)合、也可檢測頻度低的抗原特異性淋巴細(xì)胞(0.001％以上)、可以對(duì)結(jié)合有抗原的淋巴細(xì)胞是否與抗原反應(yīng)進(jìn)行分析、并且可分選抗原特異性淋巴細(xì)胞的抗原特異性淋巴細(xì)胞檢測方法進(jìn)行了各種研究。對(duì)個(gè)別檢測一個(gè)個(gè)淋巴細(xì)胞的抗原特異性、并且回收檢測出的抗原特異性淋巴細(xì)胞的方法進(jìn)行了開發(fā)。
但是，目前為止尚未知有可個(gè)別檢測一個(gè)個(gè)淋巴細(xì)胞的抗原特異性，并可回收所檢測的抗原特異性淋巴細(xì)胞的微孔陣列芯片。
因此，本發(fā)明人對(duì)于提供可利用于上述檢測法中、可將一個(gè)淋巴細(xì)胞容納在一個(gè)微孔中的微孔陣列芯片的情況進(jìn)行了各種研究。并試作了在基板表面形成可容納一個(gè)淋巴細(xì)胞左右大小的微孔的微孔陣列芯片，進(jìn)行了將淋巴細(xì)胞容納進(jìn)(捕集到)微孔中和從微孔中回收的測試。已經(jīng)清楚在該過程中，在設(shè)置有很多微細(xì)的微孔的陣列芯片上回收檢測出的抗原特異性淋巴細(xì)胞時(shí)，特別是將檢測與回收以分別的步驟進(jìn)行時(shí)，為了從已檢測的微孔中確實(shí)無誤地回收抗原特異性淋巴細(xì)胞，必須進(jìn)行微孔的定位。即，如果只是將很多微孔排列的陣列芯片，是不容易進(jìn)行特定的微孔定位的。
還清楚了上述過程中，將淋巴細(xì)胞容納入微孔中時(shí)，如果使用細(xì)胞懸浮液將淋巴細(xì)胞捕集到微孔中，然后清洗陣列芯片，則大多數(shù)細(xì)胞從微孔中流出，捕集率和填充率顯著降低。
因此，本發(fā)明的第一目的在于提供可利用上述檢測法、可將一個(gè)淋巴細(xì)胞容納入一個(gè)微孔中的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第一方案的目的特別在于提供可容易地確定多數(shù)且微細(xì)的微孔的位置的微孔陣列芯片。
本發(fā)明的第二目的在于提供捕集到微孔中的淋巴細(xì)胞等細(xì)胞在之后清洗時(shí)不易從微孔中流出的微孔陣列芯片。
本發(fā)明的第三目的在于提供可利用上述檢測法、可將一個(gè)淋巴細(xì)胞容納入一個(gè)微孔中的微孔陣列芯片。
本發(fā)明的第三方案的目的特別在于提供可容易地將容納在微孔中的一個(gè)淋巴細(xì)胞回收的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第三方案的目的在于進(jìn)一步提供不限于淋巴細(xì)胞，可將一個(gè)生物體細(xì)胞容納進(jìn)一個(gè)微孔中的微孔陣列芯片。

發(fā)明內(nèi)容
用以實(shí)現(xiàn)上述第一目的的本發(fā)明的第一方案如下。
(1)微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，在與微孔的開口相同的基板表面上具有微孔的標(biāo)記。
(2)(1)的微孔陣列芯片，其中多個(gè)微孔以相同的間隔縱橫配置，每組規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔上設(shè)有標(biāo)記。
(3)(1)或(2)的微孔陣列芯片，其中多個(gè)微孔是將規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔分成各組，設(shè)置于基板的主表面上，并設(shè)有標(biāo)記以掌握各組的位置。
(4)(3)的微孔陣列芯片，其中屬于一個(gè)組的微孔的數(shù)量在10-10000的范圍內(nèi)。
(5)(1)-(4)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中標(biāo)記含有熒光材料或反射材料。
(6)(1)-(5)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中標(biāo)記是用于定位的標(biāo)記。
(7)(1)-(6)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中基板是硅、金屬或樹脂制的。
(8)(1)-(7)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中上述微孔是圓筒形、由多個(gè)面構(gòu)成的多面體、倒圓錐形或倒角錐形、或上述兩種以上形狀的組合形狀。
(9)(1)-(8)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-2倍的范圍，且微孔的深度是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-4倍的范圍。
(10)(1)-(9)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中生物體細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，所述微孔陣列芯片用于以一個(gè)單位檢測抗原特異性淋巴細(xì)胞。
(11)(1)-(10)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中上述主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。
(12)(11)的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。
用以實(shí)現(xiàn)上述第二目的的本發(fā)明的第二方案如下。
(13)微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，上述微孔的開口部具有突起部，使開口部變狹窄。
(14)(13)的微孔陣列芯片，其中上述突起部是由設(shè)置于基板表面的膜向上述開口部突出而形成的。
(15)(13)或(14)的微孔陣列芯片，其中由上述突起部形成的開口的大小為可使要容納到微孔中的生物體細(xì)胞通過的大小。
(16)(13)-(15)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中基板是硅、金屬或樹脂制的。
(17)(14)-(16)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中設(shè)于基板表面的膜是氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層、金屬膜或樹脂膜。
(18)(13)的微孔陣列芯片的制造方法，該方法包含以下步驟在基板的至少一側(cè)主表面上形成膜的步驟；在形成的膜上涂布抗蝕劑的步驟；經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)上述抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去抗蝕劑的非硬化部分的步驟；蝕刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔陣列形狀的孔的步驟；以及除去抗蝕劑的步驟。
(19)(18)的微孔陣列芯片的制造方法，其中基板是硅、金屬或樹脂制的。
(20)(18)或(19)的微孔陣列芯片的制造方法，其中設(shè)于基板表面的膜是氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層、金屬膜或樹脂膜。
(21)(13)-(20)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中上述主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。
(22)(21)的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。
用以實(shí)現(xiàn)上述第三目的的本發(fā)明的第三方案如下。
(23)微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片具有多個(gè)微孔，是用于在各微孔中容納1個(gè)被檢生物體細(xì)胞的硅制微孔陣列芯片，上述微孔具有的每一個(gè)微孔中僅可容納1個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸。
(24)(23)的微孔陣列芯片，其中上述微孔是圓筒形、由多個(gè)面構(gòu)成的多面體、倒圓錐形或倒角錐形、或上述兩種以上形狀的組合形狀。
(25)(23)或(24)的微孔陣列芯片，其中與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-2倍的范圍，且微孔的深度是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-4倍的范圍。
(26)(23)-(25)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，所述微孔陣列芯片用于以一個(gè)單位檢測抗原特異性淋巴細(xì)胞。
(27)(23)-(26)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中微孔的內(nèi)面被氟碳膜或氧化硅膜覆蓋。
(28)(27)的微孔陣列芯片，該芯片可用于將容納到一個(gè)微孔中的一個(gè)生物體細(xì)胞從微孔中回收。
(29)(23)-(28)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中在上述具有多個(gè)微孔的面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。
(30)(29)的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。
(31)上述微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有微孔，上述主表面上具有疏水性表面區(qū)域，該疏水性表面區(qū)域設(shè)置成包圍上述微孔。
(32)(31)的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。
附圖簡述

圖1表示微孔陣列芯片1a的平面圖，其中縱橫分別設(shè)有3個(gè)10×10的微孔1b的組1c。
圖2是具有實(shí)施例1中的熒光標(biāo)記的本發(fā)明第一方案的微孔陣列芯片的制作方法說明圖。
圖3表示在硅基板3a上具有反射標(biāo)記3d的微孔陣列芯片3a的平面圖。
圖4是反射標(biāo)記的反射原理說明圖。
圖5是具有實(shí)施例2中的反射標(biāo)記的本發(fā)明第一方案的微孔陣列芯片的制作方法(前半部分)的說明圖。
圖6是具有實(shí)施例2中的反射標(biāo)記的本發(fā)明第一方案的微孔陣列芯片的制作方法(后半部分)的說明圖。
圖7(A)和(B)是具有在開口部13a不存在突起部的微孔13的陣列芯片的平面圖和側(cè)面截面圖。圖7(C)、(D)和(E)是在微孔13的開口部13a存在由膜12’的一部分形成的突起部14的陣列芯片的平面圖、側(cè)面截面圖和斜視圖。
圖8(A)、(B)和(C)是表示與圖7不同的本發(fā)明第二方案的微孔陣列芯片的平面圖、側(cè)面截面圖和斜視圖。微孔13的開口部13a處存在由膜12”的一部分形成的突起部14’，并且由突起部14’形成的開口的形狀為圓形。
圖9(A)、(B)和(C)是采用硅基板的微孔陣列芯片的制作過程說明圖(側(cè)面截面圖)，(C)的微孔是倒四角錐形。(D)的微孔是方形，(E)的微孔是半球形。
圖10表示實(shí)施例3中制作的微孔陣列芯片的各部分的尺寸。
圖11是孔內(nèi)具有氟碳膜的微孔陣列芯片的概略說明圖。
圖12是實(shí)施例4中孔內(nèi)具有氟碳膜的微孔陣列芯片的制作方法的說明圖。
圖13是實(shí)施例5中孔內(nèi)具有氧化膜(氧化硅)的微孔陣列芯片的制作方法的說明圖。
圖14是在具有多個(gè)微孔的主表面上具有疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片的概略圖，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。
圖15是圖14所示的微孔陣列芯片的制作方法的說明圖。
圖16是設(shè)置有疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片的制作方法的說明圖。
圖17是實(shí)施例6中對(duì)內(nèi)壁實(shí)施了平滑處理的微孔的放大照片。
圖18是實(shí)施例7中在開口部形成突起的微孔的放大照片。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式[第一方案]以下對(duì)本發(fā)明的第一方案進(jìn)行說明。
微孔陣列芯片本發(fā)明的第一方案的微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸。本發(fā)明的微孔陣列芯片在與微孔的開口相同的基板表面上還具有微孔的標(biāo)記。
上述被檢生物體細(xì)胞例如可以是淋巴細(xì)胞，本發(fā)明的微孔陣列芯片例如可用于以一個(gè)單位檢測抗原特異性淋巴細(xì)胞。
第一方案的微孔陣列芯片中，多個(gè)微孔以相同的間隔縱橫配置，優(yōu)選在每組規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔上設(shè)置標(biāo)記。特別是在第一方案的微孔陣列芯片中，規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔分成各組，設(shè)置于基板的主表面上，并設(shè)置有標(biāo)記，以便掌握各組的位置。
例如，圖1表示微孔陣列芯片1a的平面圖，其中縱橫分別設(shè)置了3個(gè)10×10的微孔1b的組1c。在各10×10的微孔組1c的四個(gè)角設(shè)置有標(biāo)記1d。另外，設(shè)置在微孔陣列芯片1a整體的四個(gè)角的標(biāo)記可設(shè)置為可與設(shè)置在各組的四個(gè)角的標(biāo)記區(qū)分并識(shí)別的標(biāo)記。
對(duì)構(gòu)成一個(gè)微孔組的微孔數(shù)量沒有特別限定，例如可以是10-10000的范圍。
標(biāo)記可以是只用于顯示位置的材料，也可以是數(shù)字或文字。通過使用數(shù)字或文字的標(biāo)記，不僅確定各組的位置，也可以特定各組。即，可以賦予各組以編碼。
標(biāo)記例如可通過熒光顯微鏡或圖像掃描儀來讀取，因此優(yōu)選含有熒光材料或反射材料。
熒光材料具體來說是對(duì)于由外部入射的激勵(lì)光具有特定波長的熒光發(fā)光的材料，優(yōu)選選擇可形成薄膜、可通過半導(dǎo)體集成電路制作技術(shù)之一的光蝕刻法加工的材料。例如優(yōu)選鄰萘醌二疊氮-酚醛清漆型抗蝕劑，例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的OFPR-800等。
反射材料可以選擇加工過的基板材料、還有在基板上制作的薄膜等。通過蝕刻或壓痕加工等對(duì)基板材料進(jìn)行加工，例如可以制作與表面保持傾斜的反射結(jié)構(gòu)，或可形成具有文字或信息等的識(shí)別圖案等。另外，通過在基板材料上形成薄膜，經(jīng)過蝕刻等加工制作凹凸結(jié)構(gòu)，可以通過薄膜表面的微細(xì)凹凸、薄膜端面的傾斜來形成漫反射結(jié)構(gòu)，也可得到與上述同樣的效果。
利用熒光觀察微孔內(nèi)的試樣時(shí)，不發(fā)熒光的部分完全看不見。因此為了掌握試樣在基板上的位置，必須進(jìn)行熒光標(biāo)記。
對(duì)微孔的形狀和尺寸沒有特別限定，微孔的形狀例如可以是圓筒形，除圓筒形之外，也可以是由多個(gè)面構(gòu)成的多面體(例如長方體、六棱柱、八棱柱等)、倒圓錐形、倒角錐形(倒三角錐形、倒四角錐形、倒五角錐形、倒六角錐形、七角以上的倒多角錐形)等，還可以是將兩種以上這些形狀組合得到的形狀。例如可以是一部分為圓筒形，其余部分為倒圓錐形。為倒圓錐形、倒角錐形時(shí)，底面為微孔的開口，不過也可以是從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀(此時(shí)，微孔的底部平坦)。對(duì)于圓筒形、長方形，微孔的底部通常是平坦的，不過也可以制成曲面(凸面或凹面)。可以將微孔的底部制成曲面的情形與從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀的情形同樣。
微孔的形狀或尺寸可考慮要在微孔中容納的生物體細(xì)胞的種類(生物體細(xì)胞的形狀或尺寸等)來適當(dāng)確定，以使一個(gè)微孔中可容納一個(gè)生物體細(xì)胞。
為了使一個(gè)微孔中容納一個(gè)生物體細(xì)胞，例如，與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-2倍的范圍、優(yōu)選0.8-1.9倍的范圍、更優(yōu)選0.8-1.8倍的范圍。
微孔的深度為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-4倍的范圍、優(yōu)選0.8-1.9倍的范圍、更優(yōu)選0.8-1.8倍的范圍。
微孔為圓筒形時(shí)，其尺寸例如可以是直徑3-100μm，生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選直徑為4-15μm。另外，深度例如可以是3-100μm，生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，可優(yōu)選深度為4-40μm。不過，如上所述，微孔的尺寸應(yīng)考慮要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑與微孔尺寸的恰當(dāng)比來適當(dāng)決定。
對(duì)一個(gè)微孔陣列芯片所具有的微孔數(shù)量沒有特別限定，當(dāng)生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞時(shí)，從抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為105個(gè)中至少有1個(gè)、約有500個(gè)的角度考慮，1cm2的微孔數(shù)可以是例如2,000-1,000,000個(gè)的范圍。
第一方案中，為了將細(xì)胞順利取出，優(yōu)選微孔的內(nèi)壁表面形狀是平滑的。表面的凹凸高度可以是0-1.0μm的范圍，優(yōu)選0-0.5μm的范圍，更優(yōu)選0-0.1μm的范圍。
在微孔內(nèi)壁的任意位置都可以改變凹凸高度。通過在進(jìn)行了平滑處理的孔內(nèi)壁的一部分上制作凹凸，可以使孔具有功能性。例如，在孔入口附近制作例如高度0.5-1μm的突起，則進(jìn)入孔中的細(xì)胞在清洗時(shí)難以流出。該方案相當(dāng)于后述的第二方案。通過使孔底面帶突起，可以使細(xì)胞不接觸孔底面，而由突起支撐。
微孔內(nèi)壁的平滑化可通過蝕刻進(jìn)行?？蛇m當(dāng)選擇蝕刻裝置的真空度、蝕刻氣體種類、蝕刻步驟等。例如使用STS公司的Multiplex ASE蝕刻裝置進(jìn)行微孔內(nèi)壁的平滑化時(shí)，優(yōu)選適當(dāng)設(shè)定蝕刻步驟和保護(hù)膜形成步驟的工藝周期時(shí)間。另外，微孔內(nèi)壁的平滑化也可以通過濕式蝕刻或?qū)嵫趸襟E與氧化膜蝕刻組合來進(jìn)行。
例如，使用STS公司的Multiplex ASE蝕刻裝置，在微孔內(nèi)壁的任意位置改變凹凸高度時(shí)，通過改變?cè)撗b置的工藝周期，即可在微孔內(nèi)壁所需的位置形成所需高度的凹凸。濕式蝕刻等中，可通過適當(dāng)選擇蝕刻液的種類、濃度、溫度來實(shí)現(xiàn)。
還可通過蝕刻，在孔側(cè)壁的任意位置形成突起。例如通過前述的STS公司的Multiplex ASE蝕刻裝置，在要形成突起的位置延長工藝周期時(shí)間，則可在孔側(cè)壁所需的位置形成所需高度的突起。另外，用該裝置以外的蝕刻裝置等，通過適當(dāng)選擇、改變蝕刻條件，也可以在要形成突起的位置形成突起。
第一方案的微孔陣列芯片例如可以是硅、金屬或樹脂制的。不過，如果是硅制，則可直接應(yīng)用目前半導(dǎo)體集成電路制作技術(shù)的主流——硅加工技術(shù)，特別是從精細(xì)加工性、量產(chǎn)性、將來與包括傳感器的分析電路的集成化來看，比其它材料優(yōu)異。
上述金屬例如可以是鋁、不銹鋼、銅、鎳、鉻、鈦等。
上述樹脂例如有聚酰亞胺、聚乙烯、氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯等。
微孔陣列芯片例如是硅制，標(biāo)記含有熒光材料時(shí)，對(duì)其制造方法進(jìn)行說明。
(1)將熒光物質(zhì)(例如東京應(yīng)化OFPR-800)涂布在硅基板的一側(cè)主表面上。熒光物質(zhì)也可以是東京應(yīng)化OFPR-800以外的材料，只要是具有吸收激勵(lì)光并因此由激態(tài)回復(fù)基態(tài)時(shí)釋放能量，發(fā)出熒光的特性的物質(zhì)即可，可適當(dāng)選擇，優(yōu)選可經(jīng)光蝕刻法加工的物質(zhì)。例如也可以用クラリアント公司AZPl350等代替。
(2)通過光蝕刻法，在該表面形成標(biāo)記圖案，為提高熒光物質(zhì)的耐溶劑性，在高溫(例如180℃)下進(jìn)行硬化處理。硬化處理的溫度可根據(jù)熒光物質(zhì)適當(dāng)選擇。
(3)硬化處理后，通過光蝕刻法形成微孔圖案，在低溫(100℃以下)下進(jìn)行硬化。微孔圖案可根據(jù)微孔的尺寸或排列等適當(dāng)決定。硬化溫度可根據(jù)在微孔圖案中所用的光致抗蝕劑材料適當(dāng)決定。
(4)通過干式蝕刻法等形成孔。用于形成孔的干式蝕刻法可適當(dāng)采用公知的方法。
(5)用丙酮等有機(jī)溶劑除去在孔圖案掩模中所用的光致抗蝕劑。所用有機(jī)溶劑不限于丙酮。只要是可除去光致抗蝕劑的物質(zhì)，均可適當(dāng)使用。
除去光致抗蝕劑后，只有在硅基板上形成的微孔和熒光標(biāo)記殘留在芯片上，可得到第一方案的微孔陣列芯片。
下面，當(dāng)微孔陣列芯片例如是硅制、標(biāo)記含有反射性材料時(shí)，對(duì)其制造方法進(jìn)行說明。
(1)通過光蝕刻法，在硅基板的一側(cè)主表面上形成標(biāo)記圖案。通過薄膜等制作反射結(jié)構(gòu)時(shí)，在進(jìn)行光蝕刻前需要預(yù)先在該表面上形成薄膜材料。
(2)浸泡在具有蝕刻、例如面方位各向異性蝕刻特性的堿溶液中，例如制作倒錐形的反射結(jié)構(gòu)。當(dāng)有薄膜時(shí)，可適當(dāng)選擇蝕刻方法。
(3)通過光蝕刻來形成微孔圖案。微孔圖案可根據(jù)微孔的尺寸或排列等適當(dāng)決定。
(4)通過干式蝕刻法等形成孔。用以形成孔的干式蝕刻法可適當(dāng)采用公知的方法。
(5)使用光致抗蝕劑剝離液等除去光致抗蝕劑。
除去光致抗蝕劑后，只有在硅基板上形成的微孔和反射性標(biāo)記殘留在芯片上，可得到第一方案的微孔陣列芯片。
第一方案的微孔陣列芯片中，還可以利用光致發(fā)光結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)利用以電子和空穴等載流子的阻擋現(xiàn)象等為代表的量子效果，例如載流子的密封效果。所使用的光致發(fā)光材料可根據(jù)所需波長適當(dāng)選擇?？梢栽谛酒咸砑庸庵掳l(fā)光結(jié)構(gòu)，也可以采用在芯片本身中制作進(jìn)光致發(fā)光結(jié)構(gòu)的方法。例如，可以通過量子效應(yīng)粒子、雜質(zhì)摻雜、多孔材料、薄膜層合形成的量子阱結(jié)構(gòu)或光致發(fā)光材料的成膜，在第一方案的微孔陣列芯片上設(shè)置標(biāo)記。
第一方案的微孔陣列芯片可以在具有多個(gè)微孔的主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。設(shè)置了所述區(qū)域的微孔陣列芯片的概略圖如圖14所示。如圖14所示，通過設(shè)置成包圍微孔的疏水性區(qū)域，接種于微孔陣列上的含有細(xì)胞等的溶液不會(huì)越過疏水性區(qū)域擴(kuò)散，因此可以將細(xì)胞懸浮液有效地約束在微孔上。這樣的區(qū)域可以是平面，也可以是溝槽狀。對(duì)其數(shù)量沒有特別限定，可以設(shè)置一個(gè)，也可以設(shè)置兩個(gè)以上。上述區(qū)域的寬度可根據(jù)接種液量適當(dāng)設(shè)定，例如可以是100μm-1mm。上述區(qū)域?yàn)闇喜蹱顣r(shí)，其溝槽的深度也可根據(jù)接種液量適當(dāng)設(shè)定，例如可以是5-100μm。
上述疏水性區(qū)域例如可以是具有硅表面或含氟表面的區(qū)域。
以下作為一個(gè)例子，參照?qǐng)D15，對(duì)于基板為硅制、設(shè)置有具硅表面的溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陳列芯片的制造方法進(jìn)行說明。
(1)在形成有氧化硅膜32a的硅基板32b(圖15(A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹脂系正性光致抗蝕劑OFPR-800(32c)，形成微孔圖案32d。此時(shí)，與微孔圖案同時(shí)形成用于設(shè)置溝槽狀疏水性區(qū)域的圖案32e(圖15(B))。
(2)通過氟酸等除去圖案中露出的氧化硅膜32a(圖15(C))，根據(jù)需要除去光致抗蝕劑32c。通過采用氟系氣體或離子轟擊的干式蝕刻或利用堿溶液、氟硝酸等的濕式蝕刻法，蝕刻硅。此時(shí)形成微孔32f，同時(shí)，制作了圖案32e的部分中，具有疏水性的硅表面暴露出來，形成溝槽狀疏水性區(qū)域32g(圖15(D))。
(3)除去光致抗蝕劑，可得到設(shè)置有具硅表面的溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片，該疏水性區(qū)域包圍微孔(圖15(E))。
如上所述，本發(fā)明中，通過在形成孔的同時(shí)蝕刻硅基板自身，可得到設(shè)置有溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片，通過蝕刻氧化膜，使硅表面暴露出來，可得到設(shè)置有溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片。以下，參照?qǐng)D16，對(duì)所述微孔陣列芯片的制作方法的一個(gè)例子進(jìn)行說明。
(1)在形成有氧化硅膜42a的硅基板42b(圖16(A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹脂系正性光致抗蝕劑OFPR-800(42c)，形成用于設(shè)置溝槽狀疏水性區(qū)域的圖案42e(圖16(B))。
(2)通過氟酸等除去圖案中露出的氧化硅膜42a，使硅暴露出來(圖16(C))。這里，除去一部分光致抗蝕劑。
(3)在該硅基板表面上再一次涂布光致抗蝕劑，形成微孔圖案42d(圖16(D))。通過氟酸等除去形成的圖案中暴露出的氧化硅膜。
(4)通過采用氟系氣體或離子轟擊的干式蝕刻或利用堿溶液、氟硝酸等的濕式蝕刻法，蝕刻硅(圖16(E))。
(5)除去光致抗蝕劑，可得到設(shè)置有具硅表面的溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片，該疏水性區(qū)域包圍微孔(圖16(F))。
上述疏水性區(qū)域可以是具有含氟表面的區(qū)域。含氟表面可以是氟碳表面；由碳、氟、氫等構(gòu)成的氟樹脂表面；氟硅表面等。具有含氟表面的疏水性區(qū)域可將氟系防水劑通過以下的方法設(shè)置例如通過壓印或印刷進(jìn)行涂布的方法；例如通過蝕刻在基板上設(shè)置溝槽、向該溝槽中流入氟系防水劑的方法；還可以通過噴墨法；噴涂法等設(shè)置。上述疏水性區(qū)域可以使用以聚對(duì)亞苯基二甲基(parylene)為代表的聚對(duì)二甲苯樹脂或硅樹脂來設(shè)置。由此也可以在金屬制或樹脂制的基板上設(shè)置疏水性區(qū)域。
標(biāo)記的使用方法將熒光檢測器中使用的激勵(lì)光通過反射結(jié)構(gòu)或凹凸形狀表面進(jìn)行漫反射。檢測器上安裝有去除通常目標(biāo)熒光波長以外的帶通濾波器，因此在芯片表面全反射的激勵(lì)光不會(huì)入射到檢測器中。但是漫反射的光可以經(jīng)前段具有帶通濾波器性能的反射鏡進(jìn)行反射，到達(dá)檢測器。因此，由位于后段的檢測器前的帶通濾波器在識(shí)別標(biāo)記時(shí)進(jìn)行排除，漫反射光入射到檢測器中。對(duì)于標(biāo)記圖案的形狀，凹形比凸形的識(shí)別性優(yōu)異。
以下對(duì)本發(fā)明的第二方案進(jìn)行說明。
微孔陣列芯片本發(fā)明的第二方案的微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，上述微孔的開口部具有突起部，該突起部使開口部狹窄。
上述突起部是設(shè)置在基板表面的膜向上述開口部突出而形成的。但上述突起部并不限于本方案。以下按照?qǐng)D7，對(duì)設(shè)置在基板表面的膜向上述開口部突出而形成上述突起部的方案進(jìn)行說明。
圖7的(A)和(B)是膜12設(shè)置在基板11的表面、并且具有微孔13的陣列芯片的平面圖和側(cè)面截面圖。微孔3的開口部13a不存在突起部。
而圖7的(C)、(D)和(E)是膜12’設(shè)置在基板11的表面、并且具有微孔13的陣列芯片的平面圖、側(cè)面截面圖和斜視圖。微孔13的開口部13a中存在由膜12’的一部分形成的突起部14。
圖8(A)、(B)和(C)是表示與圖7不同的第二方案的微孔陣列芯片的方案的平面圖、側(cè)面截面圖和斜視圖。圖8(A)、(B)和(C)是在基板11的表面設(shè)有膜12”、還具有微孔13的陣列芯片，微孔13的開口部13a處存在由膜12”的一部分形成的突起部14’。由突起部14’形成的開口形狀與圖7的(E)(方形)不同，為圓形。
由突起部形成的開口形狀可以是圖7的突起部14和圖8的突起部14’以外的形狀。另外，由突起部形成的開口大小為可使要容納到微孔中的生物體細(xì)胞通過的大小。
圖9表示微孔形狀不同的第二方案的微孔陣列芯片方案的側(cè)面截面圖。
圖9(C)是與上述圖7和8同樣的方案，但是相對(duì)于倒四角錐形的微孔，圖9(D)的微孔為方形，圖9(E)的微孔為半球形。不過，對(duì)微孔的形狀沒有特別限定，也可以是除此以外的形狀。
對(duì)微孔的形狀和尺寸沒有特別限定，微孔的形狀例如可以是圓筒形，除圓筒形之外，也可以是由多個(gè)面構(gòu)成的多面體(例如長方體、六棱柱、八棱柱等)、倒圓錐形、倒角錐形(倒三角錐形、倒四角錐形、倒五角錐形、倒六角錐形、七角以上的倒多角錐形)等，還可以是將兩種以上這些形狀組合得到的形狀。例如可以是一部分為圓筒形，其余部分為倒圓錐形。為倒圓錐形、倒角錐形時(shí)，底面為微孔的開口，不過也可以是從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀(此時(shí)，微孔的底部平坦)。對(duì)于圓筒形、長方體，微孔的底部通常是平坦的，不過也可以制成曲面(凸面或凹面)?？梢詫⑽⒖椎牡撞恐瞥汕鏁r(shí)，其情形與從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀的情形同樣。
微孔的形狀或尺寸可考慮要在微孔中容納的生物體細(xì)胞的種類(生物體細(xì)胞的形狀或尺寸等)來適當(dāng)確定，以使一個(gè)微孔中可容納一個(gè)生物體細(xì)胞。
為了使一個(gè)微孔中容納一個(gè)生物體細(xì)胞，例如，與開口的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-2倍的范圍、優(yōu)選0.8-1.9倍的范圍、更優(yōu)選0.8-1.8倍的范圍，其中所述開口由設(shè)在微孔的開口部的突起形成。
微孔的深度為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-4倍的范圍、優(yōu)選0.8-1.9倍的范圍、更優(yōu)選0.8-1.8倍的范圍。
微孔為圓筒形時(shí)，其尺寸例如可以是直徑3-100μm，生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選直徑為4-15μm。另外，深度例如可以是3-100μm，生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，可優(yōu)選深度為4-40μm。不過，如上所述，微孔的尺寸應(yīng)考慮要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑與微孔尺寸的恰當(dāng)比來適當(dāng)決定。
對(duì)一個(gè)微孔陣列芯片所具有的微孔數(shù)量沒有特別限定，當(dāng)生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞時(shí)，從抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為105個(gè)中至少有1個(gè)、約有500個(gè)的角度考慮，1cm2的微孔數(shù)可以是例如2,000-1,000,000個(gè)的范圍。
與上述第一方案同樣，第二方案中，為了將細(xì)胞順利取出，優(yōu)選微孔的內(nèi)壁表面形狀是平滑的。其詳細(xì)情況如之前第一方案所述。
構(gòu)成第二方案的微孔陣列芯片的基板例如可以是硅、金屬或樹脂制的。不過，如果是硅制，則可直接應(yīng)用目前半導(dǎo)體集成電路制作技術(shù)的主流——硅加工技術(shù)，特別是從精細(xì)加工性、量產(chǎn)性、將來與包括傳感器的分析電路的集成化來看，比其它材料優(yōu)異。
構(gòu)成基板的金屬例如可以是鋁、不銹鋼、銅、鎳、鉻、鈦等。
構(gòu)成基板的樹脂例如有聚酰亞胺、聚乙烯、氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯等。
設(shè)于基板表面的膜例如可以是氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層、金屬膜或樹脂膜。
氧化膜例如有氧化硅膜、氮氧化硅膜、氧化鋁膜、氧化鈦膜。
氮化膜例如有氮化硅膜、氮化鋁膜、氮化鈦膜。
雜質(zhì)擴(kuò)散層可以是在硅基板表面高濃度分布硼的層。
金屬膜例如有鋁、金、鉑、不銹鋼、銅、鎳、鉻、鈦、鍺、硅鍺等。
樹脂膜例如有聚酰亞胺、聚乙烯、氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯等。
對(duì)設(shè)置于基板表面的膜厚沒有特別限定，例如是100nm-5μm的范圍。優(yōu)選300nm-1μm的范圍。
基板為硅制時(shí)，設(shè)置于基板表面的膜的種類可以直接應(yīng)用目前主流的集成電路制造技術(shù)，從量產(chǎn)性、低成本化、可靠性等角度看，優(yōu)選為氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層。
基板為硅制時(shí)，從光蝕刻的應(yīng)用、蝕刻選擇性、量產(chǎn)性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為樹脂制。
基板為硅制時(shí)，從光蝕刻的應(yīng)用、與傳感器的一體化、膜的耐久性、量產(chǎn)性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為金屬制。
基板為金屬制時(shí)，從蝕刻選擇性、膜的耐熱性、耐久性等提高的觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為金屬制。
基板為金屬制時(shí)，從光蝕刻的應(yīng)用、蝕刻選擇性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為樹脂制。
基板為金屬制時(shí)，從成膜的容易性、膜的耐久性或貼合性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為氧化膜、氮化膜等。
基板為樹脂制時(shí)，從低成本以及可利用公知的各種成型、加工技術(shù)的觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為樹脂制。
基板為樹脂制時(shí)，從膜的功能性、加工性、耐久性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為金屬制。
微孔陣列芯片的制造方法第二方案的微孔陣列芯片例如可通過以下的方法制造，其制造方法包含以下步驟在基板的至少一側(cè)主表面上形成膜的步驟；在形成的膜上涂布抗蝕劑的步驟；經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)上述抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去抗蝕劑的非硬化部分的步驟；蝕刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔陣列形狀的孔的步驟；以及除去抗蝕劑的步驟。
以下對(duì)基板為硅制的情形進(jìn)行說明。
(1)通過熱CVD、CVD等方法，在洗凈的硅基板表面上形成氧化膜等薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布抗蝕劑。
(3)經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去抗蝕劑的非硬化部分。即，通過光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露。
(4)對(duì)膜和基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液(例如TMAH氫化四甲基銨等)進(jìn)行。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下方向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。
(5)除去抗蝕劑，得到第二方案的微孔陣列芯片。
接著，對(duì)基板為金屬制的情形進(jìn)行說明。
(1)在洗凈的金屬基板表面上形成樹脂或與基板具有蝕刻選擇性的金屬薄膜，或者對(duì)金屬基板表面進(jìn)行氧化處理、氮化處理，形成薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。
(3)經(jīng)由具有微孔圖案的光掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使基板表面暴露。
(4)通過蝕刻等方法，將基板的暴露部分打出微孔陣列形狀的孔。此時(shí)，蝕刻方法可任意選擇。
(5)這里，在向底部方向進(jìn)行蝕刻的同時(shí)也向薄膜下橫向進(jìn)行一些蝕刻，因此形成遮沿狀結(jié)構(gòu)。
(6)除去光致抗蝕劑，得到第二方案的微孔陣列芯片。
下面，對(duì)基板為樹脂制的情形進(jìn)行說明。
(1)在洗凈的樹脂基板上形成樹脂或金屬薄膜，或者進(jìn)行改性處理，以提高樹脂表面的耐性。該改性處理例如可以是UV處理或注入改性材料等。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。
(3)經(jīng)由具有微孔圖案的光掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使基板表面暴露出來。
(4)通過溶解等方法，在基板的暴露部分打出微孔陣列形狀的孔。此時(shí)，可適當(dāng)選擇用于蝕刻的溶液?；蛘呷绻遄陨砜梢怨馕g刻，則也可以例如以微孔圖案的金屬薄膜作為掩模，進(jìn)行UV曝光，除去曝光部分。此時(shí)，孔的深度可通過UV曝光量控制。
(5)這里，在向底部方向進(jìn)行溶解的同時(shí)也向薄膜下橫向進(jìn)行一些蝕刻，因此形成遮沿狀結(jié)構(gòu)。
(6)除去光致抗蝕劑，得到第二方案的微孔陣列芯片。
接著，對(duì)硅基板表面設(shè)置有氧化膜的情形進(jìn)行說明。
(1)通過熱氧化、熱CVD、等離子體CVD等方法，在洗凈的硅基板上形成氧化膜(氧化硅膜等)。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。
(3)經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露出來。除去光致抗蝕劑。
(4)對(duì)基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液(例如TMAH氫化四甲基銨等)進(jìn)行。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。
(5)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。
下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有金屬薄膜的情形進(jìn)行說明。
(1)通過CVD、電阻加熱蒸鍍、濺射蒸鍍、電子射線蒸鍍等，在硅基板上形成金屬薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。
(3)經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露出來。此時(shí)，為形成圖案而對(duì)薄膜進(jìn)行蝕刻的方法可適當(dāng)選擇。例如，當(dāng)為鋁時(shí)，使用磷酸+硝酸+乙酸+水的混合酸。這里，如果需要，可以除去光致抗蝕劑。
(4)對(duì)基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液等進(jìn)行。蝕刻溶液等可適當(dāng)選擇。例如制作由鋁薄膜構(gòu)成的結(jié)構(gòu)時(shí)，使用可蝕刻硅而不蝕刻鋁的蝕刻溶液(例如選擇水合肼。肼不侵蝕大部分的金屬)。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。
(5)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。
下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有樹脂薄膜的情形進(jìn)行說明。
(1)通過CVD、涂布、浸漬等方法，在洗凈的硅基板上形成樹脂薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露出來。此時(shí)，為形成圖案而除去樹脂薄膜的方法可適當(dāng)選擇。例如使用感光性聚酰亞胺薄膜時(shí)，涂布形成的樹脂薄膜本身具有圖案形成能力，因此可以省略光致抗蝕劑涂布步驟，只通過曝光顯影步驟即可進(jìn)行樹脂薄膜的加工。
(3)對(duì)基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液等進(jìn)行。蝕刻溶液等可適當(dāng)選擇。例如為聚酰亞胺薄膜時(shí)，可以選擇水合肼、乙二胺焦兒茶酚。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。
(4)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。
下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有氮化硅膜的情形進(jìn)行說明。
(1)通過CVD、濺射蒸鍍等方法，在洗凈的硅基板上形成氮化硅薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。
(3)經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露。除去光致抗蝕劑。
(4)對(duì)基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液(例如TMAH氫化四甲基銨等)進(jìn)行。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。
(5)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。
下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有雜質(zhì)擴(kuò)散膜的情形進(jìn)行說明。
(1)在洗凈的硅基板上涂布光致抗蝕劑。
經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使孔圖案部分以外的硅表面暴露。
(2)清洗基板，通過熱擴(kuò)散法、離子注入等方法，將硼以高濃度(-1020/cm2左右)擴(kuò)散到硅暴露的部分。擴(kuò)散源除硼以外還可以是鍺、硅鍺等?？赏ㄟ^熱處理(Drive-in)控制擴(kuò)散層厚，其中所述熱處理是為了加深擴(kuò)散。此時(shí)，向熱處理爐中導(dǎo)入氧，在表面形成氧化硅膜。
(3)孔的蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液(例如TMAH氫化四甲基銨等)進(jìn)行。此時(shí)，未擴(kuò)散有硼的硅表面容易被蝕刻，但硼高濃度擴(kuò)散的硅表面難以被蝕刻。因此蝕刻是對(duì)未擴(kuò)散硼的孔圖案部分選擇性地進(jìn)行。蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。
(4)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。
第二方案的微孔陣列芯片可以在具有多個(gè)微孔的主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。上述區(qū)域的詳細(xì)情況如之前第一方案所述。
以下對(duì)本發(fā)明的第三方案進(jìn)行說明。
微孔陣列芯片本發(fā)明的第三方案的微孔陣列芯片是具有多個(gè)微孔、用于在各微孔中容納一個(gè)被檢生物體細(xì)胞的硅制微孔陣列芯片，上述微孔具有一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸。
上述被檢生物體細(xì)胞例如可以是淋巴細(xì)胞，本發(fā)明的微孔陣列芯片例如可用于以一個(gè)單位檢測抗原特異性淋巴細(xì)胞。
對(duì)微孔的形狀和尺寸沒有特別限定，微孔的形狀例如可以是圓筒形，除圓筒形之外，也可以是由多個(gè)面構(gòu)成的多面體(例如長方體、六棱柱、八棱柱等)、倒圓錐形、倒角錐形(倒三角錐形、倒四角錐形、倒五角錐形、倒六角錐形、七角以上的倒多角錐形)等，還可以是將兩種以上這些形狀組合得到的形狀。例如可以是一部分為圓筒形，其余部分為倒圓錐形。為倒圓錐形、倒角錐形時(shí)，底面為微孔的開口，不過也可以是從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀(此時(shí)，微孔的底部平坦)。對(duì)于圓筒形、長方體，微孔的底部通常是平坦的，不過也可以制成曲面(凸面或凹面)?？梢詫⑽⒖椎牡撞恐瞥汕鏁r(shí)，其情形與從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀的情形同樣。
微孔的形狀或尺寸可考慮要在微孔中容納的生物體細(xì)胞的種類(生物體細(xì)胞的形狀或尺寸等)來適當(dāng)確定，以使一個(gè)微孔中可容納一個(gè)生物體細(xì)胞。
為了使一個(gè)微孔中容納一個(gè)生物體細(xì)胞，例如，與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-2倍的范圍、優(yōu)選0.8-1.9倍的范圍、更優(yōu)選0.8-1.8倍的范圍。
微孔的深度為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-4倍的范圍、優(yōu)選0.8-1.9倍的范圍、更優(yōu)選0.8-1.8倍的范圍。
微孔為圓筒形時(shí)，其尺寸例如可以是直徑3-100μm，生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選直徑為4-15μm。另外，深度例如可以是3-100μm，生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，可優(yōu)選深度為4-40μm。不過，如上所述，微孔的尺寸應(yīng)考慮要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑與微孔尺寸的恰當(dāng)比來適當(dāng)決定。
對(duì)一個(gè)微孔陣列芯片所具有的微孔數(shù)量沒有特別限定，當(dāng)生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞時(shí)，從抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為105個(gè)中至少有1個(gè)、約有500個(gè)的角度考慮，1cm2的微孔數(shù)可以是例如2,000-1,000,000個(gè)的范圍。
與上述第一和第二方案同樣，第三方案中，為了將細(xì)胞順利取出，優(yōu)選微孔的內(nèi)壁表面形狀是平滑的。其詳細(xì)情況如之前第一方案中所述。
本發(fā)明的第三方案的微孔陣列芯片是硅制的。通過采用硅制芯片，可直接應(yīng)用目前半導(dǎo)體集成電路制作技術(shù)的主流——硅加工技術(shù)，特別是從精細(xì)加工性、量產(chǎn)性、將來與包含傳感器的分析電路等的集成化來看，比其它材料優(yōu)異。
并且，如果第三方案的微孔陣列芯片是硅制、基板表面被氧化硅膜覆蓋，則從該芯片表面的親水性、膜的穩(wěn)定性、量產(chǎn)性角度考慮優(yōu)選。硅表面通常為疏水性，接種細(xì)胞懸浮液時(shí)，具有排斥細(xì)胞懸浮液的性質(zhì)，會(huì)妨礙生物細(xì)胞容納到微孔中。因此，從比硅具有親水性、且是穩(wěn)定的膜的觀點(diǎn)看，優(yōu)選氧化硅膜。
第三方案的微孔陣列芯片優(yōu)選微孔內(nèi)面被氟碳膜或氧化硅膜覆蓋。通過微孔的內(nèi)面形成氟碳膜或氧化硅膜等惰性且排他性的表面，可以防止生物體細(xì)胞的粘附，使生物體細(xì)胞從微孔的回收變得容易，因此優(yōu)選。
即，在微孔等中處理生物體細(xì)胞時(shí)，微孔內(nèi)部會(huì)有生物體細(xì)胞粘附的問題。特別是從微孔回收微孔內(nèi)的生物體細(xì)胞時(shí)，生物體細(xì)胞的粘附是一個(gè)大的問題。為解決該問題，本發(fā)明中，優(yōu)選生物體細(xì)胞所接觸的微孔內(nèi)部形成氟碳膜或氧化硅膜等膜。
氟碳膜是具有防水性的膜，優(yōu)選只在孔內(nèi)部形成防水性膜，如前所述，微孔陣列芯片的孔以外的表面優(yōu)選為氧化硅膜。
盡管氧化硅膜不顯示氟碳膜那樣的防水性，但具有可防止生物體細(xì)胞粘附的效果。特別是通過干燥氧進(jìn)行的高溫?zé)嵫趸ǎ稍摲椒ㄖ谱鞯难趸枘?，其膜致密，雖然不顯示象氟碳膜那樣的可形成水珠程度的防水性，但顯示親水性和斥水性之間的性質(zhì)。
通常，生物體細(xì)胞分散在溶液中進(jìn)行處理，因此，如果微孔陣列芯片整體具有防水性或疏水性的表面，則生物體細(xì)胞有難以容納到孔中的傾向。因此，本發(fā)明中，優(yōu)選孔以外的表面覆蓋氧化硅膜，只有孔內(nèi)部選擇性地形成氟碳膜或氧化硅膜。
不過，以通常的處理方法形成氟碳膜時(shí)，是在孔制作后進(jìn)行膜的形成。因此基板整體被氟碳膜覆蓋，基板表面也具有了防水性。因此本發(fā)明采用以下的方法。以使用硅基板的微孔陣列芯片為例，對(duì)該方法進(jìn)行說明。
通過光蝕刻法，在硅基板上形成微孔圖案。此時(shí)的光致抗蝕劑硬化溫度在100℃以下進(jìn)行。接著，通過干腐蝕用真空裝置形成微孔。確認(rèn)制作好微孔后，向真空裝置內(nèi)導(dǎo)入CF系氣體，進(jìn)行等離子體CVD。等離子體CVD可以直接使用蝕刻裝置，也可以用另外的CVD裝置進(jìn)行。成膜數(shù)分鐘后，從真空裝置中取出基板，浸泡到甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑中。由此，其上的氟碳膜也與微孔圖案掩模一起被移走，只有微孔內(nèi)壁殘留有氟碳膜。對(duì)于蝕刻和成膜步驟，只需改變氣體種類即可用相同的裝置應(yīng)對(duì)。
如前所述，可以用硅氧化膜代替氟碳膜覆蓋孔內(nèi)面。用硅氧化膜代替氟碳膜覆蓋孔內(nèi)面，也可以得到生物體細(xì)胞由孔回收的回收率改善效果。
以下對(duì)用硅氧化膜覆蓋孔內(nèi)面的方法進(jìn)行說明。
這種情況下，如果在形成孔圖案后除去光致抗蝕劑，然后形成熱氧化膜等，則可得到用硅氧化膜覆蓋孔內(nèi)面的微孔陣列芯片。
通過在孔內(nèi)部形成多孔硅，以此代替氟碳膜或硅氧化膜，也可得到具有抑制生物體細(xì)胞與孔內(nèi)面粘附的效果的微孔陣列芯片。多孔硅可通過陽極作用等方法制作孔內(nèi)面。
除氟碳膜、硅氧化膜、多孔硅以外，也可以對(duì)本發(fā)明的微孔陣列芯片實(shí)施抑制活性硅表面的處理，或形成膜。
第三方案的微孔陣列芯片可以在具有多個(gè)微孔的面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。上述疏水性區(qū)域的詳細(xì)情況如之前的第一方案所述。如前所述，第三方案的微孔陣列芯片中，用氟碳膜覆蓋微孔內(nèi)面時(shí)，上述區(qū)域也一并被氟碳膜覆蓋，形成疏水性區(qū)域。
實(shí)施例實(shí)施例1(熒光標(biāo)記)圖1是本發(fā)明第一方案的裝置的實(shí)施方案例。
圖1是在硅材料等的基板上面1a形成多個(gè)微孔1b的微孔陣列芯片。為了容易地進(jìn)行位置識(shí)別，微孔1b以適當(dāng)?shù)臄?shù)量單位(例如10×10100個(gè))形成群1c。該微孔陣列芯片的用途之一是向各孔中導(dǎo)入附加有熒光物的評(píng)價(jià)對(duì)象，確認(rèn)其熒光發(fā)光。此時(shí)，通過熒光顯微鏡、熒光掃描儀等進(jìn)行的觀察是按照熒光波長的規(guī)格進(jìn)行的，因此無法觀察到熒光不發(fā)光的細(xì)胞。因此，如圖1所示，各群之間形成有熒光物質(zhì)的微小的標(biāo)記1d。
該標(biāo)記的制作方法如下(圖2)。
以在硅材料等基板上形成的微孔為例，以下給出兩種制作方法。
標(biāo)記制作法(I)(1)在帶有氧化硅膜2a的硅基板2b(圖2(I)(A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹脂系正性光致抗蝕劑OFPR-800，在基板上形成標(biāo)記圖案2c(圖2(I)(B))。
(2)為了通過熱交聯(lián)等提高光致抗蝕劑的耐化學(xué)品性，在180℃、將基板進(jìn)行30分鐘的硬化等處理。
(3)再次涂布光致抗蝕劑2d，在硅基板2b上形成制作微孔所必需的開口圖案2e(圖2(I)(C)和(D))。此時(shí)，顯影后的硬化以100-110℃左右的低溫進(jìn)行。
(4)用氟酸除去開口部的氧化硅膜2a，使硅暴露。
(5)通過干式蝕刻法等蝕刻硅基板2b，制作微孔2f(圖2(I)(E))。
(6)用甲醇、丙酮等除去(3)中涂布的光致抗蝕劑2d，得到第一方案的微孔陣列芯片(圖2(I)(F))。
標(biāo)記制作法(II)(1)在帶有氧化硅膜2a的硅基板2b(圖2(II)(A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹脂系正性光致抗蝕劑OFPR-800，在基板上形成標(biāo)記圖案2c(圖2(II)(B))。
(2)為了通過熱交聯(lián)等提高光致抗蝕劑的耐化學(xué)品性，在180℃、將基板進(jìn)行30分鐘的退火等處理。
(3)再次涂布光致抗蝕劑2d，在硅基板2b上形成制作微孔所必需的開口圖案2e(圖2(II)(C)和(D))。此時(shí)，顯影后的熱處理以100-110℃左右的低溫進(jìn)行。
(4)用氟酸除去開口部的氧化硅膜2a，使硅暴露(圖2(II)(E))。
(5)在此用丙酮等有機(jī)溶劑除去形成孔圖案的光致抗蝕劑。
(6)以硅基板2b上的氧化硅膜2a作為掩模，通過干腐蝕法等方法對(duì)硅基板2b進(jìn)行蝕刻，制作微孔2f，由此得到第一方案的微孔陣列芯片(圖2(II)(F))。
根據(jù)標(biāo)記制作法(II)，在孔形成后除去光致抗蝕劑時(shí)，在干腐蝕步驟中，光致抗蝕劑改性，不會(huì)有難以除去的問題。另外，通過等離子體效果，所形成的硅基板表面以該狀態(tài)即可得到超親水性表面。
由以上的步驟，可容易地制作圖2的形狀。標(biāo)記2c的圖案可自由選擇成圖形、記號(hào)、文字等。另外，除標(biāo)記外，還可以在微芯片上表示信息等。
實(shí)施例2(反射標(biāo)記)圖3是在硅基板3a上形成凹凸，與上述同樣，其漫反射光可通過熒光顯微鏡、熒光掃描儀進(jìn)行觀察的反射標(biāo)記3d的實(shí)施方案?？捎糜谠诠杌?a上排列很多的微孔3b群的位置識(shí)別等的標(biāo)記等。通過蝕刻等，在基板上制作凹陷3e，使熒光激勵(lì)光在凹陷處漫反射，導(dǎo)入觀察裝置，由此可識(shí)別凹陷位置。
圖4表示其原理。當(dāng)光入射到象圖左側(cè)那樣的沒有任何凹凸等的基板4a表面時(shí)，由于全反射，沒有激勵(lì)光入射到觀察裝置中。但是，象右側(cè)，由于凹陷4b，使激勵(lì)光漫反射成放射狀，有反射光入射到觀察裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，可以進(jìn)行識(shí)別。
從使激勵(lì)光漫反射成放射狀的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選凹陷4b的底部為倒錐形。
基板為硅基板時(shí)，根據(jù)圖5和6，對(duì)具有反射標(biāo)記的微孔陣列芯片的制造例進(jìn)行說明。
(1)在帶有氧化硅膜5a的硅基板5b(圖5(A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹脂系正性光致抗蝕劑OFPR-800(5c)，在基板上形成標(biāo)記圖案5d(圖5(B))。
(2)用氟酸除去光致抗蝕劑5c開口處的氧化硅膜5a，使硅暴露(圖5(C))。
(3)除去光致抗蝕劑5c，將硅基板5b浸泡在氫氧化四甲基銨或氫氧化鉀等堿蝕刻液中，進(jìn)行各向異性蝕刻，制作凹陷結(jié)構(gòu)5e(圖5(D))。此時(shí)，本發(fā)明的標(biāo)記完成。然后制作微孔陣列結(jié)構(gòu)。
(4)這里，如有需要，可再次在基板5b表面追加形成氧化硅膜或氮化硅膜等掩模薄膜(圖6(A))。
(5)再次涂布光致抗蝕劑5f(圖6(B))，形成微孔圖案5g，通過蝕刻劑除去開口部的氧化硅膜或氮化硅膜等，使硅暴露(圖6(C))。
(6)如果需要，除去光致抗蝕劑5f，通過干式蝕刻、濕式蝕刻，制作微孔5h(圖6(D))。
(7)根據(jù)需要，除去光致抗蝕劑5f，得到第一方案的微孔陣列芯片(圖6(E))。
實(shí)施例3(遮沿結(jié)構(gòu)實(shí)施例)圖7表示由本發(fā)明的第二方案制作的微孔結(jié)構(gòu)。
本結(jié)構(gòu)只要是半導(dǎo)體基板、樹脂基板等與加工時(shí)上面薄膜的材料加工容易程度有選擇性，即可實(shí)現(xiàn)。在(100)面硅基板11表面上形成的微孔13的開口直徑、深度都是數(shù)微米至數(shù)十微米。未形成孔的表面被氧化膜或金屬等薄膜層12’覆蓋。在通過對(duì)基板進(jìn)行蝕刻而形成的孔的開口部13a上附有由薄膜層12’形成的遮沿狀突起部14。薄膜層12’的厚度在形成時(shí)控制在數(shù)百納米至數(shù)微米。由薄膜層12’形成的遮沿狀突起部14在蝕刻并形成微孔13時(shí)，可通過薄膜層12’不被過度蝕刻，且對(duì)基板蝕刻到薄膜層12’的下部的蝕刻方法來實(shí)現(xiàn)。
本實(shí)施例中，在圖9中例如使用代表性的半導(dǎo)體基板—硅來說明其制作過程。
(1)熱氧化(100)硅基板11，在表面形成最厚為數(shù)微米左右的薄膜層12。[圖9(A)](2)通過光蝕刻步驟，將孔圖案15轉(zhuǎn)印在硅基板11上，只有孔部分暴露硅。[圖9(B)](3)將硅在氫氧化四甲基銨水溶液(90℃、25％)中浸泡數(shù)十分鐘，進(jìn)行蝕刻。蝕刻時(shí)間根據(jù)所需孔的深度d和遮沿的大小w來決定。[圖8(B)](4)蝕刻規(guī)定的時(shí)間，將硅基板從蝕刻溶液中取出。
經(jīng)過以上的步驟，可形成圖9(C)的結(jié)構(gòu)。這里所用的氫氧化四甲基銨水溶液對(duì)氧化膜的蝕刻慢，對(duì)孔側(cè)面方向的蝕刻快，因此可形成氧化膜下的中空結(jié)構(gòu)。
第二方案的微孔陣列芯片可以是圖9(D)和(E)的結(jié)構(gòu)。具有圖9(D)和(E)結(jié)構(gòu)的微孔的陣列芯片可以將上述方法進(jìn)行以下變更來實(shí)現(xiàn)。
例如，選擇硅基板時(shí)，圖9(D)通過適當(dāng)選擇RIE干式蝕刻、基板面方位或孔圖案來實(shí)現(xiàn)。例如，基板面方位為(100)或(110)、(111)面，可選擇使與基板表面垂直的蝕刻面露出的圖案形狀。圖9(E)可通過顯示各向同性蝕刻特性的蝕刻方法來實(shí)現(xiàn)。例如，通常的干式蝕刻或通過氟酸和硝酸的混合液進(jìn)行的蝕刻中，硅被各向同性地蝕刻，因此可容易地得到本發(fā)明的第二方案的結(jié)構(gòu)。
薄膜層不限于氧化膜，可以改為有高濃度雜質(zhì)擴(kuò)散的硅、鍺、硅鍺、金屬薄膜、樹脂等。蝕刻可以是濕式蝕刻、干式蝕刻等的任何形式。濕式蝕刻中，可以將基板一并進(jìn)行處理，因此產(chǎn)品量產(chǎn)效率優(yōu)異。
將由上述方法得到的微孔陣列芯片的各尺寸(圖10所示)變更為表1的記載，評(píng)價(jià)微孔陣列芯片的陣列比率(填充率)。結(jié)果如表1所示。所接種的細(xì)胞濃度為105個(gè)細(xì)胞/μL。
細(xì)胞陣列比率(填充率)的評(píng)價(jià)方法1.由小鼠采集淋巴細(xì)胞。此時(shí)，所得細(xì)胞的濃度為1微升中含104-105個(gè)細(xì)胞(104-105個(gè)細(xì)胞/μl)。為了保存，將細(xì)胞裝入HBSS(Hank’s平衡鹽溶液)中。
2.對(duì)各細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。將各細(xì)胞用CellTracker Orange進(jìn)行染色，該染色物質(zhì)對(duì)測定中使用的熒光掃描儀的激勵(lì)波長(532nm)發(fā)出熒光。
3.將染色的細(xì)胞用微量移液器鋪于硅芯片上。重復(fù)接種3次，最后清洗除去未進(jìn)入孔中的細(xì)胞。
4.用蓋玻片覆蓋，以防芯片干燥，用微陣列掃描儀讀取熒光強(qiáng)度。
5.選擇芯片上4500個(gè)孔，計(jì)數(shù)其中發(fā)熒光的孔數(shù)。陣列比率(填充率)由以下的式子計(jì)算。
陣列比率(填充率)＝(發(fā)熒光的孔數(shù)/4500)×100表1樣品的遮沿與孔的尺寸和陣列比率(填充率)的關(guān)系

對(duì)樣品A和B研究其遮沿及孔的尺寸的不同會(huì)引起陣列(填充)比率怎樣變化。結(jié)果，細(xì)胞直徑為8μm時(shí)，樣品B的陣列(填充)比率比樣品A的陣列(填充)比率差。這可能由于樣品B的開口直徑2r過大。
陣列(填充)比率是孔越深則比率越高，但象樣品B那樣開口大，則陣列(填充)比率可見減少的傾向。因此，孔的設(shè)計(jì)優(yōu)選適當(dāng)選擇其深度、開口直徑、遮沿尺寸來進(jìn)行。
實(shí)施例4(氟碳膜形成實(shí)施例)圖11是本發(fā)明第三方案的微孔陣列芯片的概略說明圖。
硅基板21a表面上排列很多微孔圖案21b，其各微孔21b的尺寸為數(shù)微米至數(shù)十微米。形成的各孔側(cè)壁上形成由CxFy系氣體形成的氟碳膜21c，由于表面能量低的效果而成惰性狀態(tài)。顯示疏水性的氟碳膜21c在微孔內(nèi)部選擇性地成膜，不存在于硅的最表面21d。因此，進(jìn)入微孔21b的生物體細(xì)胞A難以粘附，微孔內(nèi)部設(shè)有氟碳膜的效果在微孔深時(shí)特別明顯地表現(xiàn)出來。
使用硅基板的微孔陣列芯片的制作步驟如圖12所示。
(1)在形成了氧化硅膜22a的硅基板22b上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹脂系正性光致抗蝕劑OFPR-800(22c)，形成微孔圖案22d。此時(shí)，顯影后的熱處理以比通常低的溫度(100-110℃左右)進(jìn)行。
(2)向等離子體干式蝕刻裝置中導(dǎo)入SF6等硅蝕刻氣體，蝕刻硅基板22b，形成微孔22e。
(3)向該蝕刻裝置中導(dǎo)入CxFy系氣體，進(jìn)行等離子體成膜。此時(shí)，在孔內(nèi)部、硅基板表面上形成氟碳膜22f。該步驟可以是將基板搬運(yùn)到等離子體CVD裝置等中，進(jìn)行同樣的處理。
(4)將從裝置中取出的基板浸泡在甲醇或丙酮等有機(jī)溶劑中，除去光致抗蝕劑。此時(shí)，在抗蝕劑上形成的氟碳膜也一起被移走。
(5)可得到硅基板最表面形成氧化硅膜22a、孔內(nèi)部形成惰性氟碳膜22f的微孔陣列芯片。
按照與實(shí)施例3同樣的方法，對(duì)由上述方法得到的微孔陣列芯片的陣列比率(填充率)進(jìn)行評(píng)價(jià)。收集率由下述方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表2所示。表2也給出了孔內(nèi)部未形成氟碳膜的微孔陣列芯片的評(píng)價(jià)結(jié)果。對(duì)于各樣品，選擇孔直徑和深度相同的孔。所接種的細(xì)胞濃度為105個(gè)細(xì)胞/μL。
收集率評(píng)價(jià)方法1.按照上述細(xì)胞陣列比率評(píng)價(jià)法向微孔陣列中接種細(xì)胞。
2.選出任意的多個(gè)(10-30個(gè)左右)的孔，用顯微操作器從孔中取出細(xì)胞。此時(shí)，不要主動(dòng)取出，要注意對(duì)各孔的取出條件不要有偏差。
3.以可取出細(xì)胞的孔數(shù)相對(duì)于任意選擇的孔數(shù)的比例表示為收集率。
收集率＝(可取出細(xì)胞的孔數(shù)/任意選擇的孔數(shù))×100表2

樣品規(guī)格孔徑11μm，深度30μm樣品A-C無涂膜，蝕刻時(shí)間8分鐘樣品D-F有涂膜，蝕刻時(shí)間8分鐘+涂膜時(shí)間1分鐘實(shí)施例5孔內(nèi)具有氧化膜(氧化硅)的微孔陣列芯片的制作(參照?qǐng)D13)(1)在形成了氧化硅23a的硅基板23b上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹脂系正性抗蝕劑OFPR-800，形成微孔圖案23d。
(2)向等離子體干式蝕刻裝置中導(dǎo)入SF6等硅蝕刻氣體，蝕刻硅基板23b，形成微孔23e。
(3)將從裝置中取出的基板用硫酸和過氧化氫水的混合液等抗蝕劑剝離液除去基板上的光致抗蝕劑。
(4)用所謂的RCA清洗，即氨清洗(氨+過氧化氫水+水)、鹽酸清洗(鹽酸+過氧化氫水+水)清洗基板。
(5)將基板導(dǎo)入干燥氧氣氛中的熱處理爐，在1100℃進(jìn)行30分鐘熱氧化處理。
(6)溫度降下后從熱處理爐中取出。
(7)在此硅基板表面、孔內(nèi)形成氧化膜23f，可制作孔內(nèi)具有氧化膜(氧化硅)的微孔陣列芯片。
按照與上述同樣的方法，對(duì)由上述方法得到的微孔陣列芯片的陣列比率(填充率)和收集率進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表3所示。對(duì)于各樣品，選擇孔直徑和深度相同的孔。所接種的細(xì)胞濃度為105個(gè)細(xì)胞/μL。
表3

樣品規(guī)格孔徑11μm，深度30μm樣品A-C無氧化膜。蝕刻時(shí)間8分鐘樣品D-F有氧化膜。蝕刻時(shí)間8分鐘，氧化溫度1100℃，氧化氣氛干燥氧，氧化時(shí)間30分鐘，氧化膜厚63nm(硅結(jié)晶面(100)上)實(shí)施例6(平滑化處理)在實(shí)施例4的制作中，在實(shí)施平滑化處理后，在微孔陣列芯片的內(nèi)壁形成氟碳膜。平滑化處理使用STS公司的Multiplex ASE蝕刻裝置，通過調(diào)整蝕刻步驟和保護(hù)膜形成步驟的工藝周期時(shí)間來進(jìn)行。如此，制作了內(nèi)壁具有高度0.5μm的凹凸和高度0.1μm的凹凸兩種微孔陣列芯片。內(nèi)壁具有高度0.1μm的凹凸的微孔的放大照片如圖17所示。
按照與上述同樣的方法，對(duì)由上述方法得到的微孔陣列芯片的收集率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果如表4所示。所接種的細(xì)胞濃度為105個(gè)細(xì)胞/μL。剛接種時(shí)，兩芯片的收集率沒有大的不同。但是，接種后1小時(shí)，因平滑化處理而具有高度0.5μm的凹凸的芯片中，收集率降至0％，而因平滑化處理而具有高度0.1μm的凹凸的芯片中，大致保持了剛接種時(shí)的收集率。這顯示內(nèi)壁的凹凸高度小，則隨時(shí)間的延長而發(fā)生的細(xì)胞與孔的粘附受到抑制。并且可認(rèn)為由于內(nèi)壁的平滑化，實(shí)施例4的涂布可有效地發(fā)揮功能。
表4

實(shí)施例7(開口部突起的形成)在實(shí)施例4的制作中，微孔開口部形成了高度0.6μm的突起部。使用STS公司的Multiplex ASE蝕刻裝置，通過延長蝕刻初期該裝置的工藝周期時(shí)間，可形成所需高度的突起，并且，突起形成后，通過調(diào)整工藝周期時(shí)間，可以制作只在開口部具有突起的微孔。在開口部形成突起的微孔的放大照片如圖18所示。
制作該微孔后，可在內(nèi)壁形成氟碳膜。還可在任意的位置形成突起。通過調(diào)整工藝周期時(shí)間，可以在希望形成突起的位置，例如微孔中間、底面等任意的位置制作突起。通過適當(dāng)選擇其形狀或數(shù)量，有望獲得各種效果。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明第一方案的微孔陣列芯片在目標(biāo)位置具有熒光物質(zhì)或反射結(jié)構(gòu)物等標(biāo)記，該標(biāo)記發(fā)揮定位標(biāo)記的功能，由此可輔助熒光顯微鏡進(jìn)行位置識(shí)別。第一方案的微孔陣列芯片中，例如通過熒光顯微鏡或圖像掃描儀等，可容易地確定微孔的位置，結(jié)果，可容易地特定容納在各微孔中的特定的一個(gè)被檢生物體細(xì)胞、例如抗原特異性淋巴細(xì)胞。結(jié)果，例如可取出所檢測的抗原特異性淋巴細(xì)胞，克隆抗原特異性抗體基因或T細(xì)胞受體基因。例如如果可克隆到抗原特異性抗體基因，則可使用該基因，大量生產(chǎn)人源單克隆抗體。將該抗體給予感染癥等患者，則可用于感染癥等的治療、預(yù)防。并且，通過使用第一方案的微孔陣列芯片，可進(jìn)行血液中細(xì)胞的區(qū)分。即，通過將微孔徑設(shè)定為規(guī)定的值，可以將血液中細(xì)胞區(qū)分成超過微孔徑的細(xì)胞和低于其的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的第二方案，一旦進(jìn)入孔內(nèi)的細(xì)胞被孔上面的突起(遮沿)擋住，因此清洗時(shí)不會(huì)流失到孔外，可以高概率留在孔內(nèi)。例如孔為倒錐形結(jié)構(gòu)時(shí)，通過形成遮沿，使芯片表面和孔內(nèi)部的流體分布改變，清洗等時(shí)，一旦進(jìn)入的細(xì)胞不會(huì)隨流體流出。并且，一旦進(jìn)入孔中的細(xì)胞即使要出孔外，也會(huì)被遮沿?fù)踝?，容易留在孔中?br> 另外，將進(jìn)入孔中的細(xì)胞取出時(shí)，通過對(duì)孔形狀加以改進(jìn)，可以抑制在吸引時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞與孔表面的負(fù)壓發(fā)生。即，如果將孔形狀制成倒錐形結(jié)構(gòu)，則棱線部分具有減壓功能，吸引細(xì)胞時(shí)，可以使孔與細(xì)胞之間不呈真空狀態(tài)，可容易地進(jìn)行細(xì)胞的收集。
本發(fā)明的第三方案的微孔陣列芯片中，各孔可只含有一個(gè)淋巴細(xì)胞這樣的被檢生物體細(xì)胞，因此，例如可以將抗原特異性淋巴細(xì)胞以一個(gè)一個(gè)的細(xì)胞水平進(jìn)行特定。即，通過使用第三方案的微孔陣列芯片，在抗原特異性淋巴細(xì)胞的檢測中，微孔中所含的被檢淋巴細(xì)胞為1個(gè)，因此可以將與抗原反應(yīng)的被檢淋巴細(xì)胞特定為一個(gè)細(xì)胞。
結(jié)果，例如可取出所檢測的抗原特異性淋巴細(xì)胞，克隆抗原特異性抗體基因或T細(xì)胞受體基因。例如如果可克隆到抗原特異性抗體基因，則可使用該基因，大量生產(chǎn)人源單克隆抗體。將該抗體給予感染癥等患者，則可用于感染癥等的治療、預(yù)防。
權(quán)利要求
1.一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，在與微孔的開口相同的基板表面上具有微孔的標(biāo)記。
2.權(quán)利要求1的微孔陣列芯片，其中多個(gè)微孔以相同的間隔縱橫配置，每組規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔上設(shè)有標(biāo)記。
3.權(quán)利要求1或2的微孔陣列芯片，其中多個(gè)微孔是將規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔分成各組，設(shè)置于基板的主表面上，并設(shè)有標(biāo)記以便能掌握各組的位置。
4.權(quán)利要求3的微孔陣列芯片，其中屬于一個(gè)組的微孔的數(shù)量在10-10000的范圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中標(biāo)記含有熒光材料或反射材料。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中標(biāo)記是用于定位的標(biāo)記。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中基板是硅、金屬或樹脂制的。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中上述微孔是圓筒形、由多個(gè)面構(gòu)成的多面體、倒圓錐形或倒角錐形、或上述兩種以上形狀的組合形狀。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-2倍，且微孔的深度是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-4倍。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中生物體細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，所述微孔陣列芯片用于檢測一個(gè)單位的抗原特異性淋巴細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中上述主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。
12.權(quán)利要求11的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。
13.一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，上述微孔的開口部具有使開口部變狹窄的突起部。
14.權(quán)利要求13的微孔陣列芯片，其中上述突起部是由設(shè)置于基板表面的膜向上述開口部突出而形成的。
15.權(quán)利要求13或14的微孔陣列芯片，其中由上述突起部形成的開口的大小為可使要容納到微孔中的生物體細(xì)胞通過的大小。
16.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中基板是硅、金屬或樹脂制的。
17.權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中設(shè)于基板表面的膜是氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層、金屬膜或樹脂膜。
18.權(quán)利要求13的微孔陣列芯片的制造方法，該方法包括以下步驟在基板的至少一側(cè)主表面上形成膜的步驟；在形成的膜上涂布抗蝕劑的步驟；經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)上述抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去抗蝕劑的非硬化部分的步驟；蝕刻上述膜和基板的暴露部分，開微孔陣列形狀的孔的步驟；以及除去抗蝕劑的步驟。
19.權(quán)利要求18的微孔陣列芯片的制造方法，其中基板是硅、金屬或樹脂制的。
20.權(quán)利要求18或19的微孔陣列芯片的制造方法，其中設(shè)于基板表面的膜是氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層、金屬膜或樹脂膜。
21.權(quán)利要求13-20中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中上述主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。
22.權(quán)利要求21的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。
23.一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片具有多個(gè)微孔，是用于在各微孔中容納一個(gè)被檢生物體細(xì)胞的硅制微孔陣列芯片，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸。
24.權(quán)利要求23的微孔陣列芯片，其中上述微孔是圓筒形、由多個(gè)面構(gòu)成的多面體、倒圓錐形或倒角錐形、或上述兩種以上形狀的組合形狀。
25.權(quán)利要求23或24的微孔陣列芯片，其中與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-2倍，且微孔的深度是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5-4倍。
26.權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，所述微孔陣列芯片用于檢測一個(gè)單位的抗原特異性淋巴細(xì)胞。
27.權(quán)利要求23-26中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中微孔的內(nèi)面被氟碳膜或氧化硅膜覆蓋。
28.權(quán)利要求27的微孔陣列芯片，該芯片可用于將容納到一個(gè)微孔中的一個(gè)生物體細(xì)胞從微孔中回收。
29.權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中在上述具有多個(gè)微孔的面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。
30.權(quán)利要求29的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。
31.一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有微孔，上述主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述微孔。
32.權(quán)利要求31的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，在與微孔的開口相同的基板表面上具有微孔的標(biāo)記。還涉及一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，上述微孔的開口部具有突起部，使開口部變狹窄。又涉及上述微孔陣列芯片的制造方法，該方法具有以下步驟在基板的至少一側(cè)主表面上形成膜的步驟；在形成的膜上涂布抗蝕劑的步驟；經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)上述抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去抗蝕劑的非硬化部分的步驟；蝕刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔陣列形狀的孔的步驟；以及除去抗蝕劑的步驟。還涉及一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片具有多個(gè)微孔，是用于在各微孔中容納1個(gè)被檢生物體細(xì)胞的硅制微孔陣列芯片。上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納1個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸。
文檔編號(hào)G01N37/00GK1882838SQ200480034519
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月25日
發(fā)明者村口篤, 岸裕幸, 時(shí)光善溫, 近藤佐千子, 小幡勤, 藤城敏史, 橫山義之, 鍋澤浩文, 高林外廣, 谷野克巳 申請(qǐng)人:富山縣政府, 村口篤, 岸裕幸, 時(shí)光善溫, 近藤佐千子