專利名稱：：檢測、診斷和治療肝細胞癌(hcc)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測并診斷肝細胞癌的方法以及治療和預防肝細胞癌的方法。
背景技術(shù)：
：肝細胞癌是全球性的癌癥死亡的主要原因之一。盡管近來在診斷和治療策略上有進展，患晚期癌癥的患者的預后仍很差。盡管分子學研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因和/或癌基因的改變參與了癌發(fā)生，精確的機制仍不清楚。在從全基因組(genome-wide)角度理解腫瘤進展(progression)的潛在機制的努力中，為了發(fā)現(xiàn)用于診斷的靶標分子并開發(fā)新的治療藥物，本發(fā)明人用表示23,040個基因的cDNA微陣列對基因表達圖譜進行分析(Okabe等，CancerRes612129-37(2001)；Kitahara等，CancerRes613544-9(2001)；Lin等，Oncogene214120-8(2002)；Hasegawa等，CancerRes627012-7(2002))。在這些研究過程中已經(jīng)鑒定出了包括ESTs在內(nèi)的數(shù)個基因，它們在癌組織中與相應的非癌性細胞相比呈現(xiàn)高頻率上調(diào)。因為癌發(fā)生涉及癌基因的活化和/或腫瘤抑制基因的失活，這些上調(diào)基因中至少一些的增強表達會反映致癌性質(zhì)。cDNA微陣列技術(shù)已經(jīng)使得獲得并比較在正常和異常細胞中的基因表達的綜合圖譜成為可能(Okabe等，CancerRes612129-37(2001)；Kitahara等，CancerRes613544-9(2001)；Lin等，Oncogene214120-8(2002)；Hasegawa等，CancerRes627012-7(2002))。此信息有助于理解癌細胞的復雜特性及癌發(fā)生機制。鑒定出腫瘤中下調(diào)的基因可以更精確并準確地診斷個體的癌癥，并開發(fā)出新的治療靶標(BienzandClevers，Cell103311-20(2000))。為揭示癌發(fā)生機理而設計的實驗已經(jīng)促進了特定的抗-腫瘤物質(zhì)的分子靶標的鑒定。例如，最初為抑制與Ras相關(guān)的生長-信號途徑而開發(fā)的法呢基轉(zhuǎn)移酶(farnesyltransferase)抑制劑(FTI)已經(jīng)顯示能有效治療動物模型中的Ras-依賴性腫瘤，其中Ras的活化依賴于翻譯后法呢基化(He等，Cell99335-45(1999))。類似地，為了拮抗原癌基因受體HER2/neu，使用抗癌藥物與抗-HER2單克隆抗體trastuzumab的組合在人中進行的臨床實驗改善了乳腺癌患者的臨床反應和總存活率(Lin等，CancerRes616345-9(2001))。最后，已經(jīng)開發(fā)了選擇性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑STI-571用于治療慢性骨髓性白血病(chronicmyelogenousleukemia)，其中bcr-abl酪氨酸激酶的構(gòu)成性活化(constitutiveactivation)在白細胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。這些種類的物質(zhì)被設計用于抑制具體基因產(chǎn)物的致癌活性(Fujita等，CancerRes617722-6(2001))。因此，癌性細胞中通常上調(diào)的基因產(chǎn)物明顯可用作開發(fā)新型抗癌藥物的潛在靶標。已進一步證明CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別來自I類MHC分子上呈遞的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的表位肽，并溶解腫瘤細胞。自從發(fā)現(xiàn)MAGE家族作為TAA的第一個實例，用免疫學方法已發(fā)現(xiàn)了許多其它的TAA(Boon，IntJCancer54177-80(1993)；BoonandvanderBruggen，JExpMed183725-9(1996)；vanderBruggen等，Science2541643-7(1991)；Brichard等，JExpMed178489-95(1993)；Kawakami等，JExpMed180347-52(1994))。一些新發(fā)現(xiàn)的TAA目前正處于作為免疫療法的靶標的臨床開發(fā)階段。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE(vanderBruggen等，Science2541643-7(1991))，gp100(Kawakami等，JExpMed180347-52(1994))，SART(Shichijo等，JExpMed187277-88(1998))和NY-ESO-1(Chen等，ProcNatlAcadSciUSA941914-8(1997))。另一方面，已證實在腫瘤細胞中特異地過表達的基因產(chǎn)物已顯示作為誘導細胞免疫反應的靶標而被識別。這種基因產(chǎn)物包括p53(Umano等，BritJCancer841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等，BritJCancer8494-9(2001))，CEA(Nukaya等，IntJCancer8092-7(1999))等。盡管在關(guān)于TAA的基礎和臨床研究中取得了重要的進展(Rosenbeg等，NatureMed4321-7(1998)；Mukherji等，ProcNatlAcadSciUSA928078-82(1995)；Hu等，CancerRes562479-83(1996))，目前只有有限數(shù)量的候選TAA能治療腺癌，包括肝細胞癌。在癌細胞中大量表達、但其表達限制在癌細胞內(nèi)的TAA是作為免疫治療靶標的有希望的候選物(candidate)。此外，對誘導強效且特異性抗腫瘤免疫應答的新TAA的鑒定被預期能夠促進肽接種策略在多種類型的癌中的臨床使用(BoonandcanderBruggen，JExpMed183725-9(1996)；vanderBruggen等，Science2541643-7(1991)；Brichard等，JExpMed178489-95(1993)；Kawakami等，JExpMed180347-52(1994)；Shichijo等，JExpMed187277-88(1998)；Chen等，ProcNatlAcadSciUSA941914-8(1997)；Harris，JNatlCancerInst881442-5(1996)；Butterfield等，CancerRes593134-42(1999)；Vissers等，CancerRes595554-9(1999)；vanderBurg等，JImmunol1563308-14(1996)；Tanaka等，CancerRes574465-8(1997)；Fujie等，IntJCancer80169-72(1999)；Kikuchi等，IntJCancer81459-66(1999)；Oiso等，IntJCancer81387-94(1999))。已有重復報道指出，來自某些具體健康供體的肽刺激的外周血單核細胞(PBMC)對該肽產(chǎn)生響應而產(chǎn)生顯著水平的IFN-γ，但在51Cr釋放實驗中幾乎不以HLA-A24或-A0201限制性方式發(fā)揮針對腫瘤細胞的細胞毒作用(Kawano等，CancerRes603550-8(2000)；Nishizaka等，CancerRes604830-7(2000)；Tamura等，JpnJCancerRes92762-7(2001))。但是，HLA-A24和HLA-A0201均為在日本人以及高加索人群中常見的HLA等位基因(DatecTissueAntigens4793-101(1996)；Kondo等，JImmunol1554307-12(1995)；Kubo等，JImmunol1523913-24(1994)；Imanishi等，ProceedingoftheeleventhInternationalHistocompatibilityWorkshopandConferenceOxfordUniversityPress，Oxford，1065(1992)；Williams等，TissueAntigen49129(1997))。因此，由這些HLA所呈遞的癌抗原肽特別適用于治療日本人和高加索人所患的癌癥。此外，已知在體外誘導低親和力CTL通常是使用高濃度肽的結(jié)果，所述高濃度肽的使用在抗原呈遞細胞(APC)上產(chǎn)生高水平特異性肽/MHC復合物，所述復合物將有效活化這些CTL(Alexander-Miller等，ProcNatlAcadSciUSA934102-7(1996))。因此，為揭示致肝細胞癌的機制并鑒定針對肝細胞癌(HCC)的抗癌藥物的新型診斷標記和分子靶標，用包含23,040個基因的全基因組的cDNA微陣列對20例HCC的表達圖譜進行分析。在這些在腫瘤中表達發(fā)生改變的基因中，選擇了兩種人基因MGC47816和HES6，與相應的正常組織相比它們在癌癥中高頻度上調(diào)?；騇GC47816編碼公知的391個氨基酸的蛋白，所述蛋白包含氨甲酰磷酸合酶L鏈和ATP結(jié)合區(qū)，并被定位在染色體帶1q34.1。另一基因HES6編碼公知的224個氨基酸的蛋白，所述蛋白包含螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域和桔黃(orange)結(jié)構(gòu)域，并被定位在染色體帶2q37。通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)而被抑制的MGC47816或HES6的表達抑制了肝細胞癌細胞的生長。這些結(jié)果使得對肝細胞的癌發(fā)生有了新的認識，并可能對開發(fā)診斷和治療此種癌癥的新策略起有貢獻。發(fā)明概述因此，本發(fā)明是基于與肝細胞癌(HCC)有關(guān)的MGC47816和HES6的基因表達模式的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明提供了檢測、診斷和/或確定受試者中患HCC的傾向性的方法，該方法通過測定源自患者的生物樣品(諸如組織樣品)中MGC47816或HES6的表達水平，并將其與對照的表達水平作比較來進行。MGC47816或HES6的表達水平相對于該基因正常對照水平的升高，表示所述受試者患有或易患HCC。本發(fā)明中，術(shù)語“對照水平”指在對照樣品中檢測的表達水平并包括正常對照水平和HCC對照水平。本發(fā)明中，對照水平可包含源自單個參照群體的單一表達模式或源自多個表達模式。例如，對照水平可以是源自以前試驗細胞的表達模式的數(shù)據(jù)庫?！罢φ账健敝冈谡€體或在已知未患HCC的個體的群體中檢測到的基因表達水平。正常個體是無HCC臨床癥狀的個體。正常細胞優(yōu)選從肝細胞組織獲得。另一方面，“HCC對照水平”指在已知患HCC的個體或個體的群體中檢測到的基因表達水平。在試驗樣品中檢測到的MGC47816或HES6的表達水平相對正常對照水平的下降表明所述受試者(從所述受試者獲得了所述樣品)患有或易患HCC。根據(jù)本發(fā)明，當基因表達與對照水平相比上升了至少10％，至少25％，或至少50％或更多時，認為表達水平“上升”?；蛘?，當表達水平與對照水平相比上升了至少0.1，至少0.2，至少1，至少2，至少5，或至少10或更多倍時，認為表達水平“上升”?？梢酝ㄟ^檢測雜交，例如MGC47816或HES6基因探針與從源自患者的組織樣品分離的基因轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合來確定表達。本發(fā)明中，源自患者的組織樣品可能是取自試驗受試者，例如已知或疑似患有HCC的患者的任何樣品。例如，所述組織可包含肝癌細胞。更具體地，所述組織可能是來自肝的細胞。本發(fā)明進一步地提供鑒定抑制MGC47816或HES6的表達或它們的基因產(chǎn)物的活性的物質(zhì)的方法，所述方法是通過使表達MGC47816或HES6的試驗細胞與試驗物質(zhì)接觸并分別確定所述MGC47816或HES6基因的表達水平或所述基因產(chǎn)物的活性來進行的。試驗細胞優(yōu)選是肝細胞，如來自肝細胞癌的肝細胞。MGC47816或HES6表達水平相對所述基因的正常對照水平的下降表明所述試驗物質(zhì)是MGC47816或HES6的抑制物，因此能減輕HCC的癥狀。本發(fā)明也提供了包含與MGC47816或HES6核酸序列或其編碼的基因產(chǎn)物結(jié)合的檢出藥劑的試劑盒。本發(fā)明的治療方法包括了治療或預防受試者的HCC的方法，所述方法包括給予所述受試者反義組合物的步驟。本發(fā)明中，所述反義組合物降低了具體靶基因例如MGC47816或HES6的表達。例如，所述反義組合物可包含與MGC47816或HES6的核酸序列互補的核苷酸?；蛘撸痉椒砂ńo予受試者小干擾RNA(siRNA)組合物的步驟。本發(fā)明中，所述siRNA組合物降低了MGC47816或HES6的表達。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預防受試者的HCC的方法，其包括給予受試者核酶組合物的步驟。所述核酸特異性的核酶組合物降低了MGC47816或HES6的表達。在體內(nèi)表達所需基因的適當機制在本領(lǐng)域是已知的。本發(fā)明也提供了疫苗和接種方法。例如，治療或預防受試者的HCC的方法可涉及給予所述受試者包含由MGC47816或HES6編碼的多肽或所述多肽的免疫活性片段的疫苗。本發(fā)明中，免疫活性片段是比全長的天然蛋白的長度短的多肽，但該多肽誘導的免疫應答與所述全長的蛋白所誘導的免疫應答類似。例如，免疫活性片段應該長度至少8個殘基并能刺激免疫細胞如T細胞或B細胞。免疫細胞刺激的測定可通過檢測細胞增殖、細胞因子(例如IL-2)加工(elaboration)或抗體產(chǎn)生來進行。除另有說明外，本申請所用的所有科技術(shù)語的都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的意思。盡管與本申請中描述的方法及材料類似或等同的方法及材料都可用于實施或檢驗本發(fā)明，但是下文仍還是對合適的方法和材料進行了描述。本申請中引用的全部出版物、專利申請、專利及其它參考文獻其全部內(nèi)容在此引入作為參考。如有抵觸，以本說明書包括定義為準。另外，所述材料、方法以及實施例都只是為了更好地說明，而絕無意進行限制。本文所述方法的一個優(yōu)點是在檢測明顯臨床癥狀前能鑒定出所述疾病。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點從如下具體描述及所附的權(quán)利要求是明顯可見的。附圖簡述圖1圖示了通過cDNA微陣列檢測的D4999在20例原發(fā)HCC中的相對表達比(癌/非癌)。在經(jīng)過截留過濾(Cy3和Cy5信號都超過25,000)的11例HCC中的7例中觀察到上調(diào)表達(Cy3∶Cy5強度比＞2.0)。圖2圖示了使用另外的HCC組織通過半定量RT-PCR分析D4999的表達。T指腫瘤組織；N指正常組織。GAPDH的表達被用作內(nèi)部對照。圖3圖示了MGC47816的基因組結(jié)構(gòu)和MGC47816蛋白的預測結(jié)構(gòu)。外顯子用空心方塊來表示，MGC47816cDNA的核苷酸數(shù)目顯示在圖的上部。圖4圖示了HA-標記的MGC47816蛋白的亞細胞定位。HA-標記的MGC47816蛋白的免疫印跡顯示于圖4(a)。COS7細胞中被標記蛋白的免疫組化染色顯示于圖4(b)。所述蛋白用大鼠抗-HA單克隆抗體染色并用羅丹明(RHODAMINE)-偶聯(lián)的抗-大鼠IgG第二抗體來顯示。用DAPI來復染核。圖5圖示了MGC47816-siRNA對MGC47816表達的影響[圖5(a)]以及MGC47816-siRNA對Alexander和SNU449細胞的生存力的影響[圖5(b)]。圖6(a)圖示了通過cDNA微陣列檢測的C2298在20例原發(fā)HCC中的相對表達比(癌/非癌)。在經(jīng)過截留過濾(Cy3和Cy5信號都超過25,000)的12例HCC中的11例中觀察到上調(diào)的表達(Cy3∶Cy5強度比＞2.0)。圖6(b)圖示了通過半定量RT-PCR分析，C2298在8例另外的HCC(T)和它們的相應非癌性肝組織(N)中的表達。GAPDH的表達被用作內(nèi)部對照。圖7圖示了HES6的多組織Northern印跡分析的結(jié)果。HES6的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小大約為1.4-kb。圖8圖示了HES6的基因組結(jié)構(gòu)和HES6蛋白的預測結(jié)構(gòu)。外顯子用空心方塊來表示，HES6cDNA的核苷酸數(shù)目顯示在圖上部。圖9圖示了被標記的HES6蛋白的亞細胞定位。圖9(a)圖示了HA-標記的HES6蛋白的免疫印跡結(jié)果。圖9(b)圖示了COS7細胞中被標記蛋白的免疫組化染色結(jié)果。HA-標記的HES6蛋白用大鼠抗-HA單克隆抗體染色并用羅丹明-偶聯(lián)的抗-大鼠IgG第二抗體來顯示。用DAPI來復染核。圖10圖示了HES6-siRNA對HES6表達的影響[圖10(a)]和HES6-siRNA對Alexander和HepG2細胞的生存力的影響(b)。
發(fā)明內(nèi)容除非另外具體指出，本文所用術(shù)語“一個”、“一種”和“所述”指“至少一個”。本發(fā)明部分基于MGC47816和HES6在HCC患者的肝細胞中的表達升高的發(fā)現(xiàn)。此提高的基因表達是用綜合的cDNA微陣列系統(tǒng)來鑒定的。事先使用包含23,040個基因的cDNA微陣列構(gòu)建了20個患者的綜合基因表達圖譜。在HCC患者中MGC47816和HES6以高水平表達。選擇具有患者血清或痰中與癌癥有關(guān)的蛋白的檢出能力的候選分子標記，并發(fā)現(xiàn)了開發(fā)人肝細胞癌中信號抑制策略的一些潛在靶標。具體地，MGC47816和HES6在本文被鑒定為具有診斷用處的HCC的標記及基因靶標，其表達可被改變來治療或緩解HCC的癥狀。除非另外指出，“HCC”指肝細胞癌，HCC-有關(guān)的基因或蛋白指本文公開的任何核酸或氨基酸序列(例如MGC47816或HES6)。通過測定細胞樣品中MGC47816或HES6的表達，可診斷HCC。同樣，通過測定MGC47816或HES6的表達對多種藥劑響應，可以鑒定出用于治療HCC的藥劑。本發(fā)明涉及確定(例如測定)MGC47816或HES6的表達。使用分別針對MGC47816和HES6的核苷酸和/或氨基酸序列的GeneBankTM數(shù)據(jù)庫登錄(entries)所提供的序列信息，可用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員公知的技術(shù)來檢測和測定MGC47816或HES6。例如，在對應于MGC47816或HES6的序列數(shù)據(jù)庫登錄內(nèi)的序列，可用于構(gòu)建使用例如Northern印跡雜交分析檢測MGC47816或HES6RNA序列的探針。作為另一個例子，公開的序列可用于構(gòu)建特異性擴增MGC47816或HES6的引物，所述擴增使用例如基于擴增的檢測方法，如基于逆轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈式反應。然后將試驗細胞群(例如源自患者的組織樣品)中的MGC47816或HES6的表達水平與參照群中MGC47816或HES6的表達水平進行比較。所述參照細胞群包括被比較的參數(shù)已知的一或多個細胞，即HCC細胞或非-HCC細胞。與參照細胞群相比試驗細胞群中的基因表達模式是否表示HCC或患HCC的傾向性取決于參照細胞群的組成。例如，如果所述參照細胞群由非-HCC細胞組成，那么試驗細胞群和參照細胞群之間的相似基因表達模式表示所述試驗細胞群是非-HCC型。相反，如果所述參照細胞群由HCC細胞組成，那么試驗細胞群和參照細胞群之間的相似基因表達圖譜表示所述試驗細胞群包括HCC細胞。如果HCC標記基因在試驗細胞群中的表達水平與參照細胞群相關(guān)的表達水平相比改變了超過1.2，超過1.5，超過2.0，超過5.0，或超過10.0或更多倍，那么認為它是“改變的”。試驗細胞群和參照細胞群之間的差異性基因表達可被標準化到對照核酸，例如管家基因。本發(fā)明中，對照核酸是已知其表達在細胞的癌和非-癌狀態(tài)間沒有改變的核酸。在試驗細胞群體和參照群體中，對照核酸的表達水平可用于標準化被比較群中的信號水平。對照基因的例子包括但不限于β-肌動蛋白、甘油醛3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白P1。試驗細胞群可與多個參照細胞群比較。多個參照群中的每一個的已知參數(shù)可以是不同的。因此，試驗細胞群可與已知包含例如HCC細胞的第一參照細胞群，以及已知包含例如非-HCC細胞(正常細胞)的第二參照群進行比較。所述試驗細胞是從由已知包含或疑似包含HCC細胞的受試者獲得的組織類型或細胞樣品分離的。所述試驗細胞從身體組織或體液，例如生物體液(如血液或尿液)獲得。例如，所述試驗細胞可純化自組織。優(yōu)選，所述試驗細胞群包含上皮細胞。更優(yōu)選，所述上皮細胞來自已知是或懷疑是HCC的組織。所述參照細胞群中的細胞應源自與所述試驗細胞相似的組織類型。任選地，所述參照細胞群是細胞系，例如HCC細胞系(陽性對照)或正常的非-HCC細胞系(陰性對照)。或者，所述對照細胞群可源自分析參數(shù)或條件已知的細胞的分子信息數(shù)據(jù)庫。所述受試者優(yōu)選是哺乳動物。所述哺乳動物可以是例如人、非-人靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。用本領(lǐng)域已知方法，可在蛋白或核酸水平確定MGC47816或HES6的表達。例如，使用特異性識別與MGC47816或HES6有關(guān)的RNA序列的探針，Northern雜交測定法可用于確定基因表達。或者，用基于逆轉(zhuǎn)錄的PCR分析，例如用對MGC47816或HES6特異的引物，可測定基因表達。也可確定在蛋白水平的表達，即通過測定本文所述的HCC標記基因編碼的多肽的水平或其生物活性。這種方法在本領(lǐng)域是公知的，并且其包括但不限于，例如基于抗MGC47816或HES6編碼的蛋白的抗體的免疫測定法。由各個基因編碼的蛋白的生物活性也是公知的。例如，近來的研究提示人HES6抑制和促進HES1的蛋白酶降解，支持MASH1的活性并促進細胞具體是肌原(myogenic)細胞和神經(jīng)元細胞的分化，(BaeS，等，Development.2000Jul；127(13)2933-43；GaoX等，JCellBiol.2001Sep17；154(6)1161-71)。診斷HCC本發(fā)明中，通過測定試驗細胞群(即源自患者的生物樣品)中MGC47816或HES6的表達水平來診斷HCC。優(yōu)選，所述試驗細胞群包含上皮細胞，例如從肝組織獲得的細胞。也可從血液或其他體液如尿液來測定基因表達。可用其他生物學樣品來確定蛋白水平。例如，在源自待診斷受試者的血液或血清中的蛋白水平可以通過免疫測定法或其他的常用生物測定法來測定。確定試驗細胞或生物樣品中MGC47816或HES6的表達，并與和正常對照樣品有關(guān)的表達水平進行比較。正常對照水平是通常在已知不患HCC的群中發(fā)現(xiàn)的MGC47816或HES6的表達圖譜。因此，在源自患者的組織樣品中的MGC47816或HES6表達水平的上升表明所述受試者患有或易患HCC。換言之，當與正常對照相比在試驗群中的MGC47816或HES6的表達水平發(fā)生改變，這就表明被試的受試者患有或易患HCC。鑒定抑制MGC47816或HES6表達或活性的物質(zhì)對抑制MGC47816或HES6的表達或與其有關(guān)的基因產(chǎn)物的活性的物質(zhì)的鑒定，可以通過使表達MGC47816或HES6的試驗細胞群與試驗物質(zhì)接觸，并測定MGC47816或HES6的表達水平或與其有關(guān)的基因產(chǎn)物的活性來進行的。與所述試驗物質(zhì)缺無時的水平相比所述物質(zhì)存在時表達或活性的下降，表明所述物質(zhì)是MGC47816或HES6的抑制物，因此對于抑制HCC是有用的。所述試驗細胞群可以是表達MGC47816或HES6的任何細胞。例如，所述試驗細胞群可包含上皮細胞，如分離自或源自肝的細胞。具體地，所述試驗細胞可以是源自肝細胞癌的無限增殖細胞系?；蛘?，所述試驗細胞可以是用MGC47816或HES6轉(zhuǎn)染的細胞或用來自MGC47816或HES6的、與報道基因可操作連接的調(diào)控序列(例如啟動子序列)轉(zhuǎn)染的細胞。評估受試者中的HCC治療有效性本文鑒定的差異表達的MGC47816或HES6也允許HCC的療程得以監(jiān)測。此方法中，試驗細胞群由正在接受HCC治療的受試者提供。如果需要，可在治療之前、期間、和/或之后的多個時間點從受試者取得試驗細胞群。然后測定MGC47816或HES6在細胞群中的表達并將其與參照細胞群比較，該參照細胞群包括其HCC狀況已知的細胞。本發(fā)明中，所述參照細胞未暴露于目的(ofinterest)治療。如果所述參照細胞群不包含HCC細胞，在試驗細胞群和正常對照參照細胞群之間的MGC47816或HES6表達相似性表明該治療是有效的。然而，在被試群和正常對照參照細胞群之間的MGC47816或HES6表達差異表示臨床結(jié)果或預后良好程度較低。相反，如果所述參照細胞群包含HCC細胞，那么在試驗細胞群和參照細胞群之間的HCC-相關(guān)性基因(例如MGC47816或HES6)的表達差異表明該目的治療是有效的，而在被試群和參照細胞群中的MGC47816或HES6表達相似性表示臨床結(jié)果或預后良好程度較低。另外，可對治療后獲得的在源自受試者的生物樣品中測定的一或多個HCC-相關(guān)性基因(例如MGC47816或HES6)的表達水平(即治療后水平)與治療開始前獲得的源自受試者的生物樣品中測定的所述一或多個HCC-相關(guān)性基因的表達水平(即治療前水平)進行比較。MGC47816和/或HES6在治療后樣品中表達的下降表示所述所需治療是有效的，而在治療后樣品中表達的上升或維持表示臨床結(jié)果或預后良好程度較低。本發(fā)明中，術(shù)語“有效的”是指治療導致受試者中病理性上調(diào)的基因的表達下降，或肝細胞腫瘤的大小、發(fā)生率、或轉(zhuǎn)移可能性降低。當目的治療用于預防時，術(shù)語“有效的”是指該治療延緩或阻止HCC形成、或延緩、阻止或減輕臨床HCC癥狀?？捎脴藴逝R床方案來評估肝細胞腫瘤。另外，聯(lián)合用于診斷或治療HCC的任何已知方法可對有效性進行測定。例如，可通過鑒別癥狀性異常來診斷HCC。適合于具體個體的用于治療HCC的治療物質(zhì)的選擇個體基因構(gòu)成的差異可導致其代謝多種藥物的相對能力有差異。在個體中被代謝從而作為抗HCC劑的物質(zhì)可通過如下方式使其自身得以顯現(xiàn)，即誘導受試者細胞中的特征性基因表達類型從HCC狀態(tài)改變到非HCC狀態(tài)的特征性基因表達類型。由此，本文公開的差異性表達的MGC47816或HES6基因允許在來自所選擇受試者的受試細胞群中檢測推定的HCC治療物質(zhì)或HCC預防性抑制物，以便確定該物質(zhì)是否是適于該受試者的HCC抑制物。為鑒定適于具體受試者的HCC抑制物，將來自該受試者的受試細胞群暴露于治療物質(zhì)，然后測定MGC47816或HES6的表達。本發(fā)明中，所述受試細胞群包含表達MGC47816或HES6的HCC細胞。優(yōu)選地，所述受試細胞是上皮細胞。例如，可在候選物質(zhì)存在時溫育受試細胞群。然后，測定試驗樣品中的基因表達類型并與一或多種參照圖譜進行比較，所述參照圖譜例如HCC參照表達圖譜或非-HCC參照表達圖譜。受試細胞群中MGC47816或HES6的表達相對于含HCC的參照細胞群中所述基因的表達下降表示所述物質(zhì)是治療物質(zhì)。試驗物質(zhì)可以是任何化合物或組合物。適用于本發(fā)明的合適的示例性試驗物質(zhì)包括但不限于免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。篩選鑒定治療物質(zhì)的測定法本文公開的MGC47816或HES6也可用于鑒定治療HCC的候選治療物質(zhì)。本發(fā)明方法包括如下步驟，即篩選候選治療物質(zhì)來測定是否它將HCC狀態(tài)的特征性MGC47816或HES6表達圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)橹甘痉?HCC狀態(tài)的類型。在本方法中，使細胞暴露于試驗物質(zhì)或多種試驗物質(zhì)(依次地或聯(lián)合地)開測定MGC47816或HES6在細胞中的表達。然后將試驗細胞群中MGC47816或HES6的表達水平與未暴露于試驗物質(zhì)的參照細胞群中MGC47816或HES6的表達水平相比較。能夠抑制HCC中過表達的基因(例如MGC47816或HES6)的表達的物質(zhì)具有潛在的臨床效益?？梢赃M一步檢測這些化合物預防HCC生長的能力。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了篩選是治療HCC的潛在靶標的候選物質(zhì)的方法。如上詳述，通過控制標記基因的表達水平或其基因產(chǎn)物的活性，可控制HCC的發(fā)病和進展。因此，是治療HCC的潛在靶標的候選物質(zhì)可以通過用這些表達水平和活性作為癌性或非癌性狀態(tài)指標的篩選方法來鑒定。由此，本發(fā)明中，所述篩選可包含例如以下步驟a)將試驗化合物與MGC47816或HES6編碼的多肽接觸；b)檢測所述多肽與試驗化合物的結(jié)合活性；和c)選出結(jié)合所述多肽的試驗化合物。或者，本發(fā)明的篩選方法可包含如下步驟a)將候選化合物與表達MGC47816或HES6的細胞接觸，和b)選出降低MGC47816或HES6的表達水平的候選化合物。表達標記基因的細胞包括例如，從HCC建立的細胞系；這些細胞可用于本發(fā)明的上述篩選?；蛘?，本發(fā)明的篩選方法可包含如下步驟a)使試驗化合物與MGC47816或HES6編碼的多肽接觸；b)檢測步驟a)的多肽的生物活性；和c)選出這樣的試驗化合物，所述化合物使MGC47816或HES6編碼的多肽的生物活性與沒有該試驗化合物時檢測到的所述多肽的生物活性相比受到抑制。用于本發(fā)明篩選方法的蛋白可用標記基因的核苷酸序列作為重組蛋白來得到?；谏婕皹擞浕蚝?或其編碼的蛋白的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇所述蛋白的任何生物活性作為篩選的指標以及任何合適的測定方法來分析所選定的生物活性。優(yōu)選地，MGC47816或HES6的細胞增殖活性被選作所述生物活性。細胞增殖活性可通過細胞系如NIH3T3或COS7的增殖來進行常規(guī)檢測?；蛘撸景l(fā)明的篩選方法可包含如下步驟a)將候選化合物與細胞接觸，所述細胞中已經(jīng)引入了包含MGC47816或HES6的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)及受該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制而表達的報道基因的載體；b)測定所述報道基因的表達或活性；和c)選出與對照相比降低所述報道基因的表達或活性的候選化合物。合適的報道基因和宿主細胞是本領(lǐng)域公知的。用于本發(fā)明的篩選方法的報道構(gòu)建體可通過使用HCC-相關(guān)性標記基因(例如MGC47816或HES6)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來制備。當標記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的時候，可利用前面的序列信息制備報道構(gòu)建體。在標記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是未確定的情況下，可從基于該標記基因的核苷酸序列信息的基因組文庫分離含有所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸片段。通過篩選而分離的化合物可作為藥物開發(fā)的候補物，所述藥物抑制標記基因編碼的蛋白的活性，并可用于治療或預防HCC。此外，可通過本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物中還包括抑制由標記基因所編碼蛋白的活性的化合物的部分結(jié)構(gòu)通過添加、缺失和/或置換而改變的化合物。當將由本發(fā)明方法分離的化合物作為藥物施用于人類及其他哺乳動物諸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴子、狒狒和猩猩時，該分離的化合物可被直接施用或可采用已知的藥物制備方法而被制成劑型。例如，根據(jù)需要，該藥物可作為糖衣片劑，膠囊劑，酏劑和微囊劑而口服，或以水或任何其它可藥用的液體的無菌溶液或懸浮液的注射液形式以非口服方式施用。例如，該化合物可與可藥用的載體或介質(zhì)，具體而言為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、增香劑(flavoringagent)，賦形劑、載體、防腐劑、粘合劑等，在通?？山邮艿乃幬镏苽浞椒ㄋ璧膯挝粍┬椭谢旌?。這些制劑中含有的活性成分量是所標記范圍內(nèi)的適宜劑量?？苫旌现疗瑒┖湍z囊中的添加劑的實例包括但不限于，粘合劑諸如明膠，玉米淀粉，黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑諸如微晶纖維素；溶脹劑諸如玉米淀粉，明膠和海藻酸；潤滑劑諸如硬脂酸鎂；增甜劑諸如蔗糖，乳糖或糖精；以及增香劑諸如薄荷，Gaultheriaadenothrix油和櫻桃紅(cherry)。當單位劑型是膠囊時，液體載體諸如油，也可進一步包括在上述成份中。用于注射的無菌組合物可按照標準的藥物制備方法采用載體諸如適合用于注射的蒸餾水進行配制。生理鹽水，葡萄糖，和包含佐劑諸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉的其它等張液可被用作注射用含水溶液。其可與適宜的增溶劑，諸如醇，特別是乙醇，多元醇諸如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，諸如Polysorbate80(TM)和HCO-50聯(lián)合使用。麻油或大豆油可用作油性液體，其可與用作增溶劑的苯甲酸芐酯或苯甲醇聯(lián)合使用，且可采用緩沖液諸如磷酸鹽緩沖液和醋酸鈉緩沖液進行配制；止痛藥，諸如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，諸如苯甲醇和苯酚；和/或抗氧化劑。可將制備的注射劑裝于適宜的安瓿中。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將本發(fā)明的藥物組合物施用給患者，例如以經(jīng)動脈內(nèi)、經(jīng)靜脈內(nèi)、或經(jīng)皮注射，或經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管內(nèi)、經(jīng)肌內(nèi)或口服施用的方式。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重和年齡以及施用方法而改變；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地選擇適宜的施用方法。如果所述化合物可由DNA編碼，可將該DNA插入用于基因治療的載體中，將該載體施用患者從而實施治療。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重、年齡和癥狀而改變，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能適當?shù)貙ζ溥M行選擇。例如，雖然與本發(fā)明的蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物的劑量依賴于癥狀，但口服給予正常成年人(體重60kg)時，所述化合物的劑量通常為約0.1mg-約100mg/日，優(yōu)選約1.0mg-約50mg/日，且更優(yōu)選約1.0mg-約20mg/日。當以注射劑方式經(jīng)胃腸外給予正常成年人(體重60kg)時，雖然根據(jù)患者、靶器官、癥狀和施用方法而存在一些差異，適于靜脈內(nèi)注射的劑量是約0.01mg-約30mg/日，優(yōu)選約0.1-約20mg/日，且更優(yōu)選約0.1-約10mg/日。而且，在其它動物的情況中，可以通過轉(zhuǎn)換為60kg體重來常規(guī)地計算合適的劑量。評估患HCC的受試者的預后本發(fā)明還提供了評估患HCC受試者的預后的方法，該方法包括將受試細胞群中MGC47816或HES6的表達與整個患病期間源自患者的參照細胞群中所述基因的表達進行比較的步驟。通過比較受試細胞群和參照細胞群中MGC47816或HES6的基因表達，或通過比較源自所述受試者的受試細胞群在不同時間(overtime)的基因表達圖譜，可以評估所述受試者的預后。例如，受試細胞中MGC47816或HES6的表達相對正常對照的增加表明預后良好程度較低。相反，在受試細胞和正常對照之間的MGC47816或HES6表達的相似性則表明受試者預后良好程度較高。試劑盒本發(fā)明也包括HCC-檢出藥劑，例如，特異性結(jié)合或鑒定MGC47816或HES6核酸的核酸，如與部分MGC47816或HES6核酸互補的寡核苷酸序列，或結(jié)合MGC47816或HES6核酸所編碼的蛋白的抗體。所述試劑可以試劑盒的形式包裝在一起。例如，所述試劑可以包裝在分開的容器中，例如核酸或抗體(結(jié)合于固體基質(zhì)或與將其結(jié)合于所述基質(zhì)的試劑分開包裝)在一個容器中，對照試劑(陽性和/或陰性)在另一個容器中，和/或可檢測的標記在第三個容器中。該試劑盒中也可包含實施所述測定法的說明書(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等)。使用所述試劑盒的分析模式可以是本領(lǐng)域已知的Northern雜交或夾心ELISA。例如，將HCC檢出藥劑固定在固體基質(zhì)諸如多孔帶上從而形成至少一個HCC檢測位點。多孔帶的測定或檢測區(qū)可包括多個位點，其中的每一個均含核酸。檢測帶還可包含陰性和/或陽性對照的位點。或者，對照位點可位于與檢測帶分開的帶上。任選地，不同檢測位點可包含不同量的固定的核酸，即，第一檢測位點中的量較高而隨后的位點中的量較低。加入受試樣品后，顯示可檢測信號的位點的數(shù)量提供了對樣品中存在的HCC量的定量指示。檢測位點可被設定為任何適宜的可檢測形狀，通常為跨越檢測帶寬度的條或點的形狀。抑制HCC的方法本發(fā)明還提供了通過降低HCC-相關(guān)性基因(例如MGC47816或HES6)的表達或它們的基因產(chǎn)物之一的活性來治療或減輕受試者中的HCC癥狀的方法。合適的治療化合物可被預防性地或治療性地施用給患有或可能患(或疑似)患有HCC的受試者。施用可以是全身的或局部的。這樣的受試者可用標準化臨床方法或通過檢測MGC47816或HES6的表達或它們的基因產(chǎn)物之一的活性的異常水平來鑒定。舉例的治療物質(zhì)包括但不限于細胞增殖的抑制物。本發(fā)明治療方法包括使MGC47816或HES6的表達、它們的基因產(chǎn)物之一的功能、或兩者都下降?？梢砸员绢I(lǐng)域已知的多種方式中的任一種來抑制表達。例如，可以通過向受試者施用抑制或拮抗過表達的基因的表達的核酸，例如破壞過表達的基因的表達的反義寡核苷酸或小干擾RNA來抑制表達。反義核酸如上述，與MGC47816或HES6的核苷酸序列對應的反義核酸可用于降低MGC47816或HES6的表達水平。與在HCC中被上調(diào)的基因(例如MGC47816或HES6)的核苷酸序列對應的反義核酸可用于治療HCC。具體來說，本發(fā)明的反義核酸可通過如下方式發(fā)揮作用，即通過結(jié)合MGC47816或HES6的核苷酸序列或與MGC47816或HES6相應的mRNA，由此抑制所述基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進所述mRNA的降解，和/或抑制由MGC47816或HES6核酸編碼的蛋白的表達，并最終抑制所述蛋白的功能。本文所使用的術(shù)語“反義核酸”包括與靶序列完全互補的核苷酸以及具有核苷酸錯配的那些核苷酸，只要該反義核酸能與所述靶序列特異性雜交即可。例如，本發(fā)明的反義核酸包括在至少15個連續(xù)核苷酸的長度上與參照序列具有至少70％或更高、優(yōu)選至少80％或更高、更優(yōu)選至少90％或更高、甚至更優(yōu)選至少95％或更高的同源性的多核苷酸?？蓪⒈绢I(lǐng)域已知的算法可用于測定同源性。本發(fā)明的反義核酸通過以下方式對生成HCC-相關(guān)性標記基因編碼的蛋白的細胞產(chǎn)生作用與編碼所述蛋白的DNA或mRNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進所述mRNA降解，抑制所述蛋白的表達，由此抑制該蛋白的功能。本發(fā)明的反義核酸可通過與對所述核酸無活性的適宜基質(zhì)材料混合而被制成外用制劑，諸如搽劑或泥敷劑。按照需要，該反義核酸也可通過加入賦形劑、等張劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、止痛劑等而被配制成片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、脂質(zhì)體膠囊劑、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑等。這些劑型可通過已知方法進行制備。例如，可通過將本發(fā)明的反義核酸直接施用于患病位點或注射至血管中以便到達患病位點而給予患者。反義封固的介質(zhì)也可被用于增加耐久性和膜通透性。實例包括但不限于脂質(zhì)體、聚左旋賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染素(lipofectin)或這些物質(zhì)的衍生物。本發(fā)明的反義核酸的劑量可根據(jù)患者狀況適當調(diào)整并以所需量使用。例如，可施用范圍在0.1-100mg/kg，優(yōu)選0.1-50mg/kg的劑量。本發(fā)明的反義核酸抑制本發(fā)明蛋白的表達從而可用于抑制所述蛋白的生物活性。另外，包含本發(fā)明反義核酸的表達抑制物是可用的，因為它們能抑制本發(fā)明蛋白的生物活性。本發(fā)明的反義核酸包括經(jīng)修飾的寡核苷酸。例如，硫代核苷酸(thioatednucleotide)可被用于賦予寡核苷酸對核酸酶的抗性。而且，針對標記基因的siRNA可被用于降低該標記基因的表達水平。術(shù)語“siRNA”意指可阻止靶mRNA翻譯的雙鏈siRNA分子。可以采用將siRNA導入細胞的標準技術(shù)，包括其中DNA是RNA轉(zhuǎn)錄模板的那些技術(shù)。在本發(fā)明中，siRNA包括針對上調(diào)的標記基因諸如MGC47816或HES6的有義核酸序列和反義核酸序列。本發(fā)明的反義和siRNA方法可用于改變細胞中上調(diào)的HCC基因的表達，例如由細胞惡性轉(zhuǎn)化導致的上調(diào)。siRNA與靶細胞中MGC47816或HES6的相應轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合導致細胞產(chǎn)生的蛋白的減少。寡核苷酸的長度為至少10個核苷酸，且可與天然存在的轉(zhuǎn)錄物同樣長。優(yōu)選地，所述寡核苷酸的長度為約19-25個核苷酸。最優(yōu)選地，所述寡核苷酸的長度短于75、50、25個核苷酸。抑制在Alexander和SNU449細胞中的表達的MGC47816siRNA寡核苷酸的實例包括包含SEQIDNO19的靶序列。抑制在Alexander和HepG2細胞中的表達的HES6siRNA寡核苷酸的實例包括包含SEQIDNO26的靶序列?？蓸?gòu)建siRNA使其單個轉(zhuǎn)錄物具有來自靶基因的有義和互補反義序列，例如，作為發(fā)卡結(jié)構(gòu)。HCC-相關(guān)性基因(例如MGC47816或HES6)的siRNA與靶mRNA雜交，由此降低或抑制MGC47816或HES6多肽的生成，這是通過與正常的單鏈mRNA轉(zhuǎn)錄物連接從而干擾翻譯由此影響所述蛋白的表達的結(jié)果。為了提高siRNA的抑制活性，可將核苷酸“u”添加到所述靶序列的反義鏈的3’端。要添加的“u”的數(shù)目為至少2，通常2-10，優(yōu)選2-5。添加的“u”在siRNA的反義鏈的3’端形成單鏈。MGC47816或HES6的siRNA可以能結(jié)合所述mRNA轉(zhuǎn)錄物的形式直接導入細胞?；蛘撸幋asiRNA的DNA可在載體中攜帶。例如，可通過將HCC-相關(guān)性基因靶序列以允許兩條鏈表達的方式(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)克隆到在所述序列側(cè)翼具有可操作連接的調(diào)控序列的表達載體中來制備載體(Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.)。與HCC-相關(guān)性基因的mRNA反義的RNA分子(例如MGC47816或HES6)由第一啟動子(例如所克隆DNA3’的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄，并且是HCC-相關(guān)性基因的mRNA的有義鏈的RNA分子由第二啟動子(例如所克隆DNA5’的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄。所述有義和反義鏈在體內(nèi)雜交產(chǎn)生siRNA構(gòu)建體來沉默所述HCC-相關(guān)性基因。或者，這兩個構(gòu)建體可用于產(chǎn)生siRNA構(gòu)建體的有義和反義鏈?？寺〉腍CC-相關(guān)性基因(例如MGC47816或HES6)可編碼具有二級結(jié)構(gòu)諸如發(fā)夾的構(gòu)建體，其中單個轉(zhuǎn)錄物具有來自靶基因的有義和互補反義序列。由任意核苷酸序列組成的環(huán)狀序列可位于有義和反義序列之間從而形成發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明也提供了具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]是與選自由核苷酸SEQIDNOs19，26組成的組的序列相對的核糖核苷酸序列[B]是由3-23個核苷酸組成的核糖核苷酸序列，且[A’]是由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。[A]區(qū)與[A’]雜交，然后形成由[B]區(qū)組成的環(huán)(loop)。所述環(huán)狀序列優(yōu)選長度是3-23個核苷酸。所述環(huán)狀序列，例如，可選自由如下序列組成的組(http//www.ambion.com/techlib/tb/tb506.html)。另外，由23個核苷酸組成的環(huán)狀序列也提供了活性的siRNA(Jacque，J.-M.，Triques，K.，andStevenson，M.(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature418435-438.)。CCC，CCACC或CCACACCJacque，J.M，Triques，K.，andStevenson，M(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature，Vol.418435-438.UUCGLee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-lrevtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.Fruscoloni，P.，Zamboni，M.，andTocchini-Valentini，G.P.(2003)Exonucleolyticdegradationofdouble-strandedRNAbyanactivityinXenopuslaevisgerminalvesicles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4)1639-1644.UUCAAGAGADykxhoorn，D.M.，Novina，C.D.，andSharp，P.A.(2002)KillingthemessengerShortRNAsthatsilencegeneexpression.NatureReviewsMolecularCellBiology4457-467.例如，具有本發(fā)明環(huán)狀結(jié)構(gòu)的優(yōu)選siRNAs如下所示。在下面的結(jié)構(gòu)中，環(huán)狀序列可選自由CCC，UUCG，CCACC，CCACACC和UUCAAGAGA組成的組。優(yōu)選的環(huán)狀結(jié)構(gòu)是UUCAAGAGA(DNA為“ttcaagaga”)。適用于本發(fā)明的舉例的發(fā)夾siRNA包括對于MGC47816-siRNAguguccgcugacagaacaa-[b]-uuguucugucagcggacac(對于SEQIDNO19的靶序列)對于HES6-siRNAacuuuuagggacccugcag-[b]-cugcagggucccuaaaagu(對于SEQIDNO26的靶序列)；適當?shù)膕iRNA的核苷酸序列可用在Ambion網(wǎng)站上可得到的siRNA設計計算機程序來設計(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。所述計算機程序基于如下方案選擇了siRNA合成的核苷酸序列。選擇siRNA靶位1.從目標轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始，向下游掃描AA二核苷酸序列。將每次AA和鄰近3′的19個核苷酸的出現(xiàn)記錄為潛在的siRNA靶位。Tuschl等反對針對5′和3′非翻譯區(qū)(UTRs)和鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個堿基之內(nèi))設計siRNA，因為上述區(qū)域可能較為富含調(diào)節(jié)性蛋白結(jié)合位點。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復合物可干擾與siRNA內(nèi)切核酸酶復合物的結(jié)合。2.將所述潛在靶位與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，不考慮與其它編碼序列顯著同源的任何靶序列?？刹捎肂LAST(可見于NCBI服務器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行同源性檢索3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion，優(yōu)選沿基因選擇數(shù)個靶序列進行評估。MGC47816或HES6基因側(cè)翼的調(diào)節(jié)序列可以是相同的或是不同的，從而它們的表達可以被獨立調(diào)控，或者以時間或空間的方式得以調(diào)控。siRNA在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄通過將MGC47816或HES6基因模板克隆到含有諸如來自小核RNA(snRNA)U6或人H1RNA啟動子的RNApolIII轉(zhuǎn)錄單元的載體。為了將載體導入細胞，可使用轉(zhuǎn)錄增強劑。FuGENE(Rochediagnostices)，Lipofectamin2000(Invitrogen)，Oligofectamin(Invitrogen)，和Nucleofactor(WakopureChemical)可用作轉(zhuǎn)錄增強劑。本發(fā)明的siRNA抑制本發(fā)明多肽的表達從而可用于抑制本發(fā)明多肽的生物活性。同樣，包含本發(fā)明siRNA的表達抑制物是可用的，因為它們能抑制本發(fā)明多肽的生物活性。因此，包含本發(fā)明反義寡核苷酸的組合物如siRNA可用于治療HCC?？贵w或者，抑制在HCC中過表達的基因(例如MGC47816或HES6)的基因產(chǎn)物的功能可通過施用可結(jié)合或者可抑制所述基因產(chǎn)物功能的化合物來抑制。例如，所述化合物可以是一種能與過表達的基因的產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明涉及抗體具體而言為針對上調(diào)的基因編碼的蛋白的抗體或該抗體的片段的用途。本文所用術(shù)語“抗體”是指具有特異性結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子，該結(jié)構(gòu)僅與用于合成該抗體(即，上調(diào)的標記基因產(chǎn)物)的抗原或與同其密切相關(guān)的抗原特異性相互作用(即，結(jié)合)。本發(fā)明中，抗體可以是抗體片段或修飾的抗體，只要它結(jié)合HCC-相關(guān)性標記基因編碼的蛋白。例如，所述抗體片段可以是Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或單鏈Fv(scFv)，其中來自H鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接(Huston等，ProcNatlAcadSciUSA855879-83(1988))。更具體地，抗體片段可用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體而生成?；蛘呖蓸?gòu)建編碼該抗體片段的基因，將其插入合適的表達載體，并在適合的宿主細胞中表達(參見，如Co等，JImmunol1522968-76(1994)；BetterandHorwitz，MethodsEnzymol178476-96(1989)；PluckthunandSkerra，MethodsEnzymol178497-515(1989)；Lamoyi，MethodsEnzymol121652-63(1986)；Rousseaux等，MethodsEnzymol121663-9(1986)；BirdandWalker，TrendsBiotechnol9132-7(1991))?？贵w可通過與多種分子，諸如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)而進行修飾。本發(fā)明提供了所述修飾的抗體。該修飾的抗體可通過化學方法修飾抗體而獲得。這些修飾方法在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。或者，抗體可包括嵌合抗體(具有源于非人抗體的可變區(qū)和源于人抗體的恒定區(qū))，或人源化抗體(具有源于非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、源于人抗體的框架區(qū)(FR)和恒定區(qū))。使用已知技術(shù)可制備所述抗體。針對癌細胞中出現(xiàn)的具體分子改變的癌癥治療已通過抗癌藥的臨床開發(fā)和調(diào)控性批準而被證實是有效的，所述抗癌藥諸如用于治療晚期乳癌的曲妥單抗(trastuzumab)(Herceptin)，用于治療慢性髓細胞性白血病(chronicmyeloidleukemia)的伊馬替尼甲酯(imatinibmethylate)(Gleevec)，用于治療非小細胞性肺癌(NSCLC)的吉非替尼(gefitinib)(Iressa)，和用于治療B細胞淋巴瘤和套細胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)的利妥昔單抗(rituximab)(抗CD20mAb)(CiardielloF，TortoraG.Anovelapproachinthetreatmentofcancertargetingtheepidermalgrowthfactorreceptor.ClinCancerRes.2001Oct；7(10)2958-70.Review.；SlamonDJ，Leyland-JonesB，ShakS，F(xiàn)uchsH，PatonV；BajamondeA，F(xiàn)lemingT，EiermannW；WolterJ，PegramM，BaselgaJ，NortonL.UseofchemotherapyplusamonoclonalantibodyagainstHER2formetastaticbreastcancerthatoverexpressesHER2.NEnglJMed.2001Mar15；344(11)783-92.；RehwaldU，SchulzH，ReiserM，SieberM，StaakJO，MorschhauserF，DriessenC，RudigerT，Muller-HermelinkK，DiehlV，EngertA.TreatmentofrelapsedCD20+Hodgkinlymphomawiththemonoclonalantibodyrituximabiseffectiveandwelltoleratedresultsofaphase2trialoftheGermanHodgkinLymphomaStudyGroup.Blood.2003Jan15；101(2)420-424.；FangG，KimCN，PerkinsCL，RamadeviN，WintonE，WittmannSandBhallaKN.(2000).Blood，96，2246-2253.)。這些藥物在臨床上是有效的，由于其僅靶向轉(zhuǎn)化的細胞，故其耐受性比傳統(tǒng)抗癌劑好。因此，所述藥物不僅改善了癌癥患者的存活率和生活質(zhì)量，還驗證了分子靶向的癌癥治療這一概念。此外，在與標準化學療法聯(lián)合使用時，經(jīng)靶向的藥物可增強標準化學療法的功效(GianniL.(2002).Oncology，63Suppl1，47-56.；KlejmanA，RushenL，MorrioneA，SlupianekA和SkorskiT.(2002).Oncogene，21，5868-5876.)。因此，未來的癌癥治療可涉及傳統(tǒng)藥物與靶特異性物質(zhì)的聯(lián)用，后者針對腫瘤細胞不同特性諸如血管發(fā)生及侵襲力。這些調(diào)節(jié)方法可離體或在體外實施(例如，通過在存在所述物質(zhì)的條件下培養(yǎng)細胞)或可選地在體內(nèi)實施(例如，通過將所述物質(zhì)施用于受試者)。所述方法包括施用蛋白或蛋白的組合或核酸分子或核酸分子的組合進行治療以抵消(counteract)差異性表達的基因的異常表達或它們的基因產(chǎn)物的異?；钚?。特征分別在于基因的表達水平或基因產(chǎn)物的生物活性增加(相對于未患有疾病或病癥的受試者而言)的疾病或病癥，可用拮抗(即降低或抑制)過表達的一或多種基因的活性的治療物質(zhì)來進行治療。可治療性或預防性施用具有上述拮抗活性的治療物質(zhì)。由此，本發(fā)明可使用的治療物質(zhì)包括，例如，(i)針對MGC47816或HES6蛋白的抗體；(ii)“功能障礙性(dysfunctional)”反義核酸或核酸(即由于在MGC47816或HES6基因序列的編碼序列中的異源插入)；(iii)小干擾RNA(siRNA)；或(iv)調(diào)節(jié)劑(即改變MGC47816或HES6多肽與其結(jié)合配偶體之間相互作用的抑制劑或拮抗劑)。該功能障礙性反義分子可用于通過同源重組而“敲除”多肽的內(nèi)源功能(參見，例如，Capecchi，Science2441288-12921989)。通過定量肽和/或RNA可很容易地檢測增加的水平，所述定量可通過獲取患者組織樣品(例如，來自活組織檢查組織)，在體外檢測其RNA或肽水平、表達的肽的結(jié)構(gòu)和/或活性(或其表達改變的基因的mRNA)來進行。本領(lǐng)域公知的方法包括但不限于免疫測定法(例如，通過Western印跡分析，免疫沉淀然后進行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫細胞化學等)和/或雜交測定法來檢測mRNA的表達(例如，Northern測定法，斑點印跡，原位雜交等)。預防性施用可在明顯的臨床癥狀出現(xiàn)之前進行，由此可防止疾病或病癥或可選地延遲所述疾病或病癥的進程。本發(fā)明治療方法可包括將細胞與下述物質(zhì)接觸的步驟，所述物質(zhì)調(diào)節(jié)在HCC中差異性表達的基因(例如MGC47816或HES6)的基因產(chǎn)物的一種或多種活性。調(diào)節(jié)蛋白活性的物質(zhì)的舉例包括但不限于核酸、蛋白、這些蛋白的天然存在的同源配體、肽、肽模擬物，或其它小分子。接種預防HCC本發(fā)明還涉及治療或預防受試者的HCC的方法，其包括對所述受試者施用疫苗，所述疫苗包含由MGC47816或HES6編碼的多肽、所述多肽的免疫活性片段、或編碼該多肽的多核苷酸或其片段。施用所述多肽會在受試者中誘導抗腫瘤免疫。為了誘導抗腫瘤免疫，施用MGC47816或HES6編碼的多肽、所述多肽的免疫活性片段，或編碼該多肽的多核苷酸或其片段到有需要的受試者。該多肽或其免疫活性片段可用作抗HCC的疫苗。在一些情況下，所述蛋白或其片段可以以與T細胞受體(TCR)結(jié)合或由抗原呈遞細胞(APC)呈遞的形式來施用，所述APC諸如巨噬細胞、樹突細胞(DC)或B細胞。由于DC具有強抗原呈遞能力，在所述APC中，使用DC是最優(yōu)選的。在本發(fā)明中，抗HCC的疫苗是指具有經(jīng)對動物進行免疫接種而誘導抗腫瘤免疫的能力的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，由MGC47816或HES6編碼的多肽或其片段被認為是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，其可誘導針對表達MGC47816或HES6的HCC細胞的、有效且特異的免疫反應。因此，本發(fā)明還包括使用所述多肽誘導抗腫瘤免疫的方法。一般而言，抗腫瘤免疫包括諸如以下的免疫反應-誘導抗腫瘤的細胞毒性淋巴細胞，-誘導識別腫瘤的抗體，和-誘導抗腫瘤細胞因子的產(chǎn)生。因此，當具體蛋白通過對動物進行免疫接種而誘導任何一種上述免疫應答時，該蛋白即可被認為具有抗腫瘤免疫誘導功效。由蛋白誘導的抗腫瘤免疫可通過觀察宿主免疫系統(tǒng)在體內(nèi)或體外針對該蛋白的應答而進行檢測。例如，檢測對細胞毒性T淋巴細胞的誘導的方法是公知的。具體地，進入活體的外來物質(zhì)通過抗原呈遞細胞(APC)的作用而被呈遞于T細胞和B細胞。以抗原特異性方式響應于APC所呈遞抗原的T細胞由于該抗原的刺激而分化為細胞毒性T細胞(或細胞毒性T淋巴細胞；CTL)，然后增殖(這被稱為T細胞活化)。因此，具體的肽對CTL的誘導可通過經(jīng)由APC將該肽呈遞給T細胞，并檢測CTL的誘導而進行評估。此外，APC具有激活CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、嗜酸粒細胞、和NK細胞的功效。由于CD4+T細胞和CD8+T細胞在抗腫瘤免疫中也是重要的，故該肽的抗腫瘤免疫誘導作用可采用這些細胞的活化效應作為指標進行評估。以樹突細胞(DC)作為APC而對CTL的誘導作用進行評估的方法在本領(lǐng)域中是公知的。在APC中，DC是具有最強CTL誘導作用的代表性APC。在該方法中，首先將受試多肽與DC接觸，然后將該DC與T細胞接觸。在與DC接觸后，對具有針對目的細胞的細胞毒性作用的T細胞的檢測顯示出該試驗多肽具有誘導所述細胞毒T細胞的活性。CTL抗腫瘤的活性可通過，例如，采用51Cr標記的腫瘤細胞的溶解作為指標進行檢測?；蛘?，采用3H-脫氧胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指標對腫瘤細胞損傷程度進行評價的方法也是公知的。除DC外，外周血單核細胞(PBMC)也可用作APC。已有報道指出，通過在存在GM-CSF和IL-4的情況下培養(yǎng)PBMC，可增強CTL的誘導。相似地，已經(jīng)顯示出通過在存在匙孔蟲戚血藍蛋白(KLH)和IL-7的條件下培養(yǎng)PBMC可誘導CTL。通過這些方法證實具有CTL誘導活性的試驗多肽是具有DC活化效應和隨后的CTL誘導活性的多肽。因此，誘導針對腫瘤細胞的CTL的多肽可用作抗腫瘤的疫苗。此外，通過與所述多肽接觸而獲得誘導針對腫瘤的CTL能力的APC可用作抗腫瘤的疫苗。此外，由于經(jīng)APC呈遞多肽抗原而獲得細胞毒性的CTL也可被用作抗腫瘤的疫苗。采用由APC和CTL產(chǎn)生的抗腫瘤免疫的腫瘤治療方法被稱為細胞免疫治療。一般來說，當使用多肽進行細胞免疫治療時，已知通過聯(lián)合多種具有不同結(jié)構(gòu)的多肽并使它們與DC接觸可增加CTL誘導效率。因此，當用蛋白片段刺激DC時，使用多種類型片段的混合物是有利的。或者，多肽對抗腫瘤免疫的誘導可通過觀測對抗腫瘤抗體生成的誘導而被證實。例如，當在用多肽免疫的試驗動物中誘導抗該多肽的抗體時，以及當這些抗體抑制腫瘤細胞的生長時，該多肽可被確定為具有誘導抗腫瘤免疫的能力。通過施用本發(fā)明的疫苗可誘導抗腫瘤免疫，且這種對該抗腫瘤免疫的誘導使得能夠治療和預防HCC?？拱┲委熁?qū)Π┌Y發(fā)病的預防包括任何下述步驟，諸如對癌性細胞生長的抑制、癌癥的衰退(involution)、以及對癌發(fā)生的抑制?；及┌Y個體的死亡率或病死率的降低、血液中腫瘤標記物水平的降低、癌伴發(fā)的可檢測癥狀的緩解等等也包括在癌癥的治療或預防中。這些治療性和預防性效果優(yōu)選具有統(tǒng)計學上的顯著性，諸如在顯著性水平為5％或更低的觀察中，其中將抗細胞增殖性疾病的疫苗的治療性或預防性效果與未施用疫苗的對照進行比較。例如，可將Student’st-檢驗、Mann-WhitneyU-檢驗、或ANOVA用于統(tǒng)計學分析。上述具有免疫活性的蛋白或編碼該蛋白的載體可與佐劑聯(lián)合。佐劑是指當與具有免疫活性的蛋白一起(或連續(xù))施用時能增強針對該蛋白的免疫應答的化合物。佐劑的實例包括但不限于霍亂毒素、沙門氏菌毒素、明礬、等。此外，本發(fā)明的疫苗可適宜地與可藥用的載體聯(lián)用。所述載體的實例是無菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液等。此外，所述疫苗可按需要包含穩(wěn)定劑、混懸劑、防腐劑、表面活性劑等。所述疫苗可全身或局部地進行施用。疫苗施用可通過單次施用進行，或經(jīng)多次施用而強化。當使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時，可通過，例如離體方法治療或預防腫瘤。更具體地，收集接受治療或預防的受試者的PBMC，將該細胞與所述多肽在離體條件下接觸，誘導APC或CTL后，可將該細胞施用于該受試者。APC還可通過將編碼所述多肽的載體在離體條件下導入PBMC中來誘導。離體條件下誘導的APC或CTL可在施用前進行克隆。通過克隆并使具有高靶細胞破壞活性的細胞生長，可以更有效地實施細胞免疫治療。此外，以該方式分離的APC和CTL不僅可用于對所述細胞所源自的個體進行細胞免疫治療，還可用于對來自其它個體的相似類型的腫瘤進行細胞免疫治療。此外，提供了治療或預防細胞增殖性疾病，諸如癌癥的藥物組合物，其包含藥學有效量的本發(fā)明的多肽。該藥物組合物可用于引起抗腫瘤免疫。抑制HCC的藥物組合物本發(fā)明提供了適宜的藥物配制劑，其包括那些適于口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)局部(包括經(jīng)頰和經(jīng)舌下)、經(jīng)陰道或經(jīng)腸胃外(包括經(jīng)肌內(nèi)、經(jīng)皮下和經(jīng)靜脈內(nèi))施用的配制劑，或者適于通過吸入或吹入施用的配制劑。優(yōu)選地，所述施用是經(jīng)靜脈內(nèi)施用?？扇芜x地將配制劑包裝在分離的劑量單位內(nèi)。適于口服施用的配制劑包括膠囊劑、扁囊劑(cachet)或片劑，每一種都含有預定量的活性成分。合適的配制劑還包括但不限于粉末、顆粒、溶液、懸液或乳劑。所述活性成分可選以藥糖丸(boluselectuary)或藥膏的形式施用。口服施用的片劑和膠囊劑可以包含慣用的賦形劑如粘合劑、填料、潤滑劑、崩解劑和/或潤濕劑?？扇芜x與一種或多種配制劑成分一起，通過壓制或模制制成片劑。壓制片(compressedtablet)可以通過將自由流動形式的例如粉末或顆粒的活性成分壓入合適機器里制成，所述活性成分還可任選與結(jié)合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑劑、表面活性和/或分散劑混合。模制片(moldedtablet)可以用由惰性液態(tài)稀釋劑潤濕后的粉末化合物的混合物在合適機器內(nèi)進行模制而制成。所述片劑可以用本領(lǐng)域公知的方法來包被?？诜黧w制劑的形式可以是，例如，含水或含油的懸液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑的形式，或者可以是干燥產(chǎn)物的形式，在使用前用水或其它合適載體重配。所述液體配制劑可以包含慣用的添加劑如懸浮劑、乳化劑、無水載體(包括食用油)、和/或者防腐劑?？梢匀芜x配制所述片劑使得其中的活性成分能夠緩慢或有控制地釋放。片劑的包裝可以包括每月一次的單個藥片。適于腸胃外施用的配制劑包括含水和無水的無菌注射液，其中任選含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使劑型與目的接受者的血液等張的溶質(zhì)；以及含水和無水的無菌懸液，其中可選包括懸浮劑和/或稠化劑。所述配制劑可存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以保存在冷凍干燥(凍干)條件下，在使用前只需添加無菌液態(tài)載體例如鹽水、注射用水，即配即用?？蛇x，所述配制劑可以是連續(xù)輸注的形式。即用即配的注射液和懸液可以用上述的無菌粉末、顆粒和片劑制備而成。適于直腸施用的配制劑包括帶有標準載體如可可脂(cocoabutter)或聚乙二醇的栓劑。適于局部口腔施用諸如經(jīng)頰或舌下施用的配制劑，包括糖錠(lozenges)，其中含有的活性成分存在于增香基劑(flavoredbase)如蔗糖和阿拉伯膠(acacia)或黃芪膠(tragacath)中；和軟錠劑(pastille)，其中含有的活性成分存在于基劑例如白明膠、甘油、蔗糖或阿拉伯膠中。對于鼻內(nèi)施用，本發(fā)明組合物可用作液體噴霧劑、可分散性粉劑或滴劑。滴劑可以用含水或非含水的(non-aqueous)基劑配制而成，其中還含有一種或多種分散劑、增溶劑和/或懸浮劑。對于通過吸入的施用，所述組合物要能便利地從吹入器、霧化器(nebulizer)、加壓包裝(pressuredpackage)或者遞送氣溶膠噴劑的其它便利器具中釋放出來。加壓包裝可以包括合適的推進劑如二氯二氟甲烷(dichlorodifluoromethane)、三氯氟甲烷(trichlorofluromethane)、二氯四氟乙烷(dichiorotetrafluoroethane)、二氧化碳或其它合適氣體。就加壓氣溶膠而言，可以通過提供可定量遞送的閥確定劑量單位?？蛇x，就吸入或吹入施用而言，所述組合物可以采用干粉組合物的形式，例如，活性化合物和合適的粉末基劑例如乳糖或淀粉的粉末混合物。所述粉末組合物可以單位劑型存在，例如膠囊、藥筒(cartridge)、白明膠或發(fā)泡藥包(blisterpack)中，其中所述粉末可借助于吸入器或吹入器來施用。其它劑型包括可植入用具(implantabledevice)和粘性貼片(adhesivepatch)；它釋放治療藥劑。當需要時，可以采用經(jīng)改進能持續(xù)釋放活性成分的上述配制劑。所述藥物組合物還可含有其它活性成分，如抗微生物藥劑(antimicrobialagent)、免疫抑制劑和/或防腐劑。應理解，除上面具體提及的成分之外，根據(jù)目的配制劑的類型，本發(fā)明所述配制劑可包括本領(lǐng)域其它慣用藥劑，例如，適于口服施用的配制劑可以包括增香劑。優(yōu)選的單位劑量配制劑，如下所述，含有有效劑量的活性成分或其合適部分。對于上述每種疾病，所述組合物例如多肽和有機化合物可通過口服或注射以約0.1-約250mg/kg/天的劑量施用。成人的劑量范圍通常為約5mg-約17.5g/天，優(yōu)選為約5mg-約10g/天，最優(yōu)選為約100mg-約3g/天。以分離單位提供的片劑或其它單位劑型可方便地包含這樣的量，使得在以所述劑量或所述劑量的倍數(shù)使用時所述組合物有效，例如每個單位含有約5毫克-約500毫克，通常為約100毫克-約500毫克。采用的劑量取決于許多因素，包括受試者的年齡和性別，要治療的具體病癥及其嚴重程度。另外，給藥途徑還可以隨病癥及其嚴重程度而變化。在任何情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員都能參考上述因素按常規(guī)計算合適的和最佳的劑量。本發(fā)明各個方面將在如下實施例中進一步描述。這些實施例僅為說明目的而絕非為了限制權(quán)利要求中所述的本發(fā)明范圍。實施例1材料和一般性方法患者和組織樣品所有肝細胞癌組織及相應的非癌性組織均得自同意接受實驗的已接受手術(shù)的患者的手術(shù)樣品。全基因組的cDNA微陣列此研究中使用了包含23,040個基因的全基因組的cDNA微陣列。從顯微解剖(microdissected)的組織提取的總RNA用DNaseI處理后，用AmpliscribeT7轉(zhuǎn)錄試劑盒(EpicentreTechnologies)擴增，隨后在逆轉(zhuǎn)錄過程中用Cy-染料(Amersham)標記；來自非癌性組織的RNA用Cy5，來自腫瘤的RNA用Cy3標記。如上所述進行雜交、洗滌、和檢測(Ono，K.，等，CancerRes.，605007-5011，(2000))，并用ArrayVision軟件(AmershamPharmacia)產(chǎn)生每個靶點的Cy5和Cy3熒光強度。在減去背景信號后，對每個點的一式兩份的值作平均。然后，對玻片上的所有熒光強度進行標準化來調(diào)整每個玻片上52個管家基因的平均Cy5和Cy3強度。將Cy3和Cy5的強度低于25,000個熒光單元的將那些基因從進一步的研究中排除，而剩下的那些Cy3/Cy5信號比率＞2.0的基因被選作進行進一步評價。細胞系人肝癌細胞系Alexander和HepG2和猴成纖維細胞系COS7獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。其他的肝癌細胞系Huh7獲自研究生物資源日本保藏中心(JapaneseCollectionofResearchBioresources(JCRB))，而SNU423、SNU449和SNU475獲自韓國細胞系庫(Koreacell-linebank)。所有細胞系均在合適的培養(yǎng)基中單層生長Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基用于Alexander、Huh7、HepG2和COS7；RPMI1640用于SNU423、SNU449和SNU475，基中均添加10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)。所有細胞在37℃含有5％CO2的潮濕空氣中保持(Alexander、Huh7、HepG2、SNU423、SNU449、SNU475和COS7)。RNA制備物和RT-PCR總RNA用QiagenRNeasy試劑盒(Qiagen)或Trizol試劑(LifeTechnologies，Inc.)根據(jù)廠商的方案來提取。將10微克等分(aliquot)的總RNA用多聚dT12-18引物(AmershamPharmaciaBiotech)通過SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。每個單鏈cDNA制備物被稀釋，隨后通過在12μl體積的PCR緩沖液(TAKARA)中進行的標準RT-PCR試驗來作PCR擴增。在GeneAmpPCR循環(huán)9700(Perkin-Elmer，F(xiàn)osterCity，CA)中進行擴增，其包括在94℃變性4分鐘，然后進行21輪(對于GAPDH而言)或(對于MGC47816而言)35輪的94℃30秒、60℃30秒、和72℃60秒的循環(huán)，或35輪(對于HES6而言)94℃30秒、60℃40秒、和72℃60秒的循環(huán)。引物序列如下對于GAPDH正向引物5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3’(SEQIDNO3)和反向引物為5’-GGTCCACCACTGACACGTTG-3’(SEQIDNO4)；對于MGC47816正向引物為5’-CAAATAGGCAGACTGGAAAGATG-3’(SEQIDNO5)和反向引物為5’-CTAGGGAAGCAGTAGGATTTGGT-3’(SEQIDNO6)；對于HES6正向引物為5’-GAGCTCCTGAACCATCTGCTC-3’(SEQIDNO20)和反向引物為5’-CAAGATGTACAGAGCATCACAGC-3’(SEQIDNO21)；Northern印跡分析使人多-組織印跡(Clontech，PaloAlto，CA)與MGC47816和HES6的32P標記的PCR產(chǎn)物進行雜交。根據(jù)供應商的推薦來進行預雜交、雜交和洗滌。在-80℃將所述印跡在增感屏上放射自顯影72小時。構(gòu)建表達載體MGC47816的完整編碼區(qū)用如下基因特異性引物組5’-ATTGTCGACGCTCGCCCTACTGAGCGAGCG-3’(SEQIDNO7)，和5’-AATCTCGAGAGCAGGAATTCACTTAAGTTTTAACTC-3’(SEQIDNO8)通過RT-PCR來擴增。HES6的完整編碼區(qū)用如下基因特異性引物組5’-ATTGAATTCGCATGGCGCCACCCGCGGCG-3’(SEQIDNO22)，和5’-AATGGTACCTCACCAAGGCCTCCAGACACTCC-3’(SEQIDNO23)通過RT-PCR來擴增。將PCR產(chǎn)物克隆到pCMV-HA載體(CLONTECH)的合適的克隆位點。免疫印跡pCMV-HA-MGC47816和pCMV-HA-HES6轉(zhuǎn)染的細胞用PBS洗滌兩次，然后在裂解緩沖液(150mMNaCl，1％TritonX-100，50mMTris-HClpH7.4，1mMDTT，和1×完全蛋白酶抑制劑Cocktail(Boehringer))中進行收集。將細胞均質(zhì)化并以10,000×g離心30分鐘后，通過Bradford測定法(Bio-Rad)對上清進行蛋白濃度標準化。采用10％SDS-PAGE分離蛋白，用大鼠抗HA(Roche)抗體作免疫印跡。HRP-偶聯(lián)的山羊抗大鼠IgG(SantaCruz)用作ECLDetectionSystem(Amersham)的第二抗體。免疫組織化學染色pCMV-HA-MGC47816和pCMV-HA-HES6轉(zhuǎn)染的細胞用包含4％的低聚甲醛的PBS固定15分鐘，然后在室溫用包含0.1％TritonX-100的PBS處理2.5分鐘使其具有可透過性。隨后，在4℃用PBS中的2％BSA覆蓋(cover)細胞12小時以阻斷非特異性雜交。將1∶1000稀釋度的大鼠抗HA(ROCHE)抗體用作第一抗體，在與羅丹明偶聯(lián)的抗大鼠第二抗體(LeincoandICN)一起溫育后顯示該反應。細胞核用4’，6’-二脒基-2’-苯基吲哚(phenylindoledihydrochloride)(DAPI)復染。在ECLIPSEE800顯微鏡下獲得熒光圖像。表達MGC47816-siRNA和HFS6-siRNA的質(zhì)粒的構(gòu)建及其作用為制備表達小干擾RNA(siRNA)的質(zhì)粒載體，對于H1RNA而言，含有啟動子區(qū)的H1RNA基因的基因組片段通過PCR用如下引物組5’-TGGTAGCCAAGTGCAGGTATA-3’(SEQIDNO9)和5’-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3’(SEQIDNO10)、以人胎盤DNA為模板來擴增。用TA克隆試劑盒(Invitrogen)根據(jù)供應商的方案將所得產(chǎn)物純化并克隆到pCR2.0質(zhì)粒載體中。將含有H1RNA的BamHI和XhoI片段克隆到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的核苷酸1257到56的片段，它通過PCR用5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQIDNO11)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQIDNO12)來擴增。以用于連接的DNA作為PCR擴增的模板，對于H1RNA所用的引物為5’-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’(SEQIDNO13)和5’-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3’(SEQIDNO14)。將產(chǎn)物用HindIII消化，然后自連接以產(chǎn)生psiH1BX3.0載體質(zhì)粒。對照質(zhì)粒psiH1BX-EGFP是通過將5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO15)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO16)的雙鏈寡核苷酸克隆到psiH1BX3.0載體中的BbsI位點制備的。表達MGC47816-siRNAs和HES6-siRNAs的質(zhì)粒是通過克隆雙鏈寡核苷酸到psiH1BX3.0載體中來制備的。用于MGC47816-siRNAs的寡核苷酸是5’-TCCCGTGTCCGCTGACAGAACAATTCAAGAGATTGTTCTGTCAGCGGACAC-3’(SEQIDNO17)和5’-AAAAGTGTCCGCTGACAGAACAATCTCTTGAATTGTTCTGTCAGCGGACAC-3’(SEQIDNO18)(psiH1BX-MGC47816-3)。用于HES6-siRNAs的寡核苷酸是5’-TCCCACTTTTAGGGACCCTGCAGTTCAAGAGACTGCAGGGTCCCTAAAAGT-3’(SEQIDNO24)和5’-AAAAACTTTTAGGGACCCTGCAGTCTCTTGAACTGCAGGGTCCCTAAAAGT-3’(SEQIDNO25)(psiH1BX-HES6-2)。根據(jù)供應商的推薦用FuGENE6試劑(Roche)或Nucleofector試劑(Alexa)，將質(zhì)粒psiH1BX-MGC47816-3轉(zhuǎn)染到Alexander和SNU449細胞中并將psiH1BX-HES6-2轉(zhuǎn)染到Alexander和HepG2細胞中。轉(zhuǎn)染后48小時從所述細胞提取總RNA。細胞在存在400-800μg/ml遺傳霉素(geneticin)(G418)的條件下培養(yǎng)14天并用吉姆薩溶液(MERCK，Germany)如其他處所述來染色。MTT測定法在10cm-皿中的1×106細胞用siRNA表達載體或?qū)φ蛰d體利用FuGene6(Roche)根據(jù)供應商的方案來轉(zhuǎn)染。細胞生存力在轉(zhuǎn)染后7天用MTT測定法來評估。向每個皿以1/10體積的濃度加入計數(shù)細胞(Cell-counting)的試劑盒-8(DOJINDO)，并在37℃再溫育所述平板2個小時；然后用MicroplateReader550(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)在490nm測定吸光度，并以630nm作為參照。統(tǒng)計學分析對數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)和Scheffé’sF檢驗。實施例2結(jié)果鑒定其表達在人類HCC中高頻率上調(diào)的D4999用包含23,040個基因的cDNA微陣列對20例HCC的表達圖譜與它們的相應非癌性肝組織進行比較。在HCC中高頻率上調(diào)的基因中，內(nèi)部登錄號(in-houseaccessionnumber)為D4999、與UniGene群的Hs.420244中的EST(MGC47816)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)對應的基因，在11例HCC中的7例中與相應的非癌性肝組織相比是過表達的(圖1)。為說明微陣列的結(jié)果，進行半定量RT-PCR，這表明與相應的非癌性肝組織相比，D4999的表達在另外8例HCC中的7例中是上升的(圖2)。MGC47816的鑒定、表達和結(jié)構(gòu)采用NationalCenterforBiotechnologyInformation中的BLAST程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)用D4999序列在公共數(shù)據(jù)庫中進行的同源性檢索鑒定了EST，其包括MGC47816(GenBank登錄號NM_173642)和位于染色體帶1q34.1的GenBank登錄號AA971400的基因組序列。比較MGC47816cDNA及基因組序列表明此基因由5個外顯子組成。推定的全長cDNA由1528個核苷酸組成，其中1176個核苷酸的開放閱讀框架(SEQIDNO1)編碼391個氨基酸的蛋白(SEQIDNO2)。預測的MGC47816蛋白的氨基酸序列顯示與小鼠假定(hypothetical)蛋白B930030J24具有88％的同一性。采用簡單模塊結(jié)構(gòu)研究工具(SMART，http//smart.embl-heidelberg.de)對蛋白基序的檢索表明該預測的蛋白包含氨甲酰基-磷酸合酶L鏈和ATP結(jié)合區(qū)(密碼子71-253)(圖3)。HA標記的MGC47816蛋白的亞細胞定位為了研究MGC47816蛋白的亞細胞定位，將表達HA標記的質(zhì)粒(pCMV-HA-MGC47816)瞬時轉(zhuǎn)染至COS7細胞中。采用細胞提取物以及抗HA抗體的Western印跡分析揭示了與標記的蛋白對應的50-KDa的條帶(圖4a)。隨后用這些抗體對細胞進行的免疫組織化學染色表明該蛋白主要存在于細胞質(zhì)中(圖4b)。表達MGC47816-siRNA的質(zhì)粒對HCC細胞生長的影響為了研究MGC47816蛋白在癌細胞中的功能，我們構(gòu)建了表達MGC47816-siRNA的質(zhì)粒，并檢測了它們對MGC47816表達的影響。用psiH1BX-MGC47816-3(Si-3)、psiH1BX-EGFP(EGFP)或psiH1BX-mock(Mock)轉(zhuǎn)染Alexander和SNU449細胞表明，與psiH1BX-EGFP(EGFP)或psiH1BX-mock(Mock)相比，psiH1BX-MGC47816-3(Si-3)顯著抑制細胞中的MGC47816表達(圖5a)。為了檢測抑制MGC47816是否可以導致肝細胞癌細胞的生長抑制，我們用psiH1BX-MGC47816-3(Si-3)、psiH1BX-EGFP(EGFP)或psiH1BX-mock(Mock)轉(zhuǎn)染了Alexander和SNU449細胞。轉(zhuǎn)染了psiH1BX-MGC47816-3(Si-3)的存活細胞與轉(zhuǎn)染了psiH1BX-EGFP(EGFP)或psiH1BX-mock(Mock)的那些細胞相比顯著減少，這提示MGC47816表達的降低抑制了肝細胞癌細胞的生長(圖5b)。鑒定其表達在HCC中高頻率發(fā)生上調(diào)的C2298用包含23,040個基因的cDNA微陣列對20例HCC的表達圖譜以及相應非癌性肝組織進行分析。在HCC中高頻率上調(diào)的基因中，內(nèi)部登錄號為C2298、與HES6(在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/的UniGene群的Hs.42949)對應的基因，在12例HCC中的11例中與相應的非癌性肝組織相比是過表達的(圖6a)。為說明微陣列的結(jié)果，進行半定量RT-PCR，這表明與相應的非癌性肝組織相比，HES6的表達在另外8例HCC中的7例中是上升的(圖6b)。HES6的鑒定、表達和結(jié)構(gòu)采用NationalCenterforBiotechnologyInformation中的BLAST程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)用C2298序列在公共數(shù)據(jù)庫中進行的同源性檢索鑒定了cDNA序列，其包括對應于HES6的GenBank登錄號BC007939和位于染色體帶2q37、GenBank登錄號AA357675的基因組序列。HES6的cDNA序列由1375個核苷酸組成，其包含編碼推定的224個氨基酸的蛋白(SEQIDNO28)的675個核苷酸的開放閱讀框架(SEQIDNO27)(GenBank登錄號BC007939)。第一個ATG側(cè)接與在真核生物生物中啟動翻譯的共有序列一致的序列(GGCATGG)。比較HES6cDNA及基因組序列表明此基因由4個外顯子組成。另外，用HES6的PCR產(chǎn)物作為探針實施多-組織Northern-印跡分析，檢測出在睪丸、脊髓(spinalcode)和骨骼肌中表達的1.4kb的轉(zhuǎn)錄物(圖7)。采用簡單模塊結(jié)構(gòu)研究工具(SMART，http//smart.embl-heidelberg.de)對蛋白基序的檢索表明該預測的蛋白包含螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域和桔黃結(jié)構(gòu)域(密碼子31-80，94-135)(圖8)。HA標記的HES6蛋白的亞細胞定位為了研究HES6蛋白的亞細胞定位，將表達HA標記(pCMV-HA-HES6)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至COS7細胞中。采用細胞提取物以及抗HA抗體的Western印跡分析揭示了與標記蛋白對應的30-KDa的條帶(圖9a)。隨后用這些抗體對細胞進行的免疫組織化學染色表明該蛋白主要存在于細胞核中(圖9b)。表達HES6-siRNA的質(zhì)粒對肝細胞癌細胞生長的影響。為了研究HES6蛋白在癌細胞中的功能，我們構(gòu)建了表達HES6-siRNA的質(zhì)粒，并檢測了它們對HES6表達的影響。用psiH1BX-HES6-2、psiH1BX-EGFP或psiH1BX-mock轉(zhuǎn)染Alexander和HepG2細胞表明，與psiH1BX-EGFP或psiH1BX-mock相比，psiH1BX-HES6-2顯著抑制細胞中的HES6表達(圖10a)。為了檢測抑制HES6是否可以導致HCC細胞的生長抑制，我們用psiH1BX-HES6-2、psiH1BX-EGFP或psiH1BX-mock轉(zhuǎn)染了Alexander和HepG2細胞。轉(zhuǎn)染了psiH1BX-HES6-2的存活細胞與轉(zhuǎn)染了psiH1BX-EGFP或psiH1BX-mock的那些細胞相比顯著減少，這提示HES6表達的降低抑制了肝細胞癌細胞的生長(圖10b)。實施例3討論cDNA微陣列技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在多種人類腫瘤中的基因表達綜合圖譜。此方法揭示了癌細胞的復雜特性，并且使得能夠?qū)Π┌l(fā)生有更深入的理解。另外，該方法利于鑒定出在腫瘤中表達水平失調(diào)的基因，從而可以更精確地診斷腫瘤并開發(fā)出新的治療策略。為揭示癌發(fā)生機理而設計的實驗已經(jīng)鑒定了數(shù)個抗-腫瘤劑的分子靶標。例如，最初為抑制與Ras相關(guān)的生長-信號途徑而開發(fā)的法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)已經(jīng)顯示能有效治療動物模型中的Ras-依賴性腫瘤，其中Ras的活化依賴于翻譯后法呢基化(SunJ.等，Oncogene161467-73，(1998))。在人類中，已使用抗癌藥物與用以拮抗原癌基因受體HER2/neu的抗-HER2單克隆抗體trastuzumab的組合對人進行臨床實驗，其改善了乳腺癌患者亞組的臨床反應和總存活率(MolinaMA，等，CancerRes614744-9.(2001))。已經(jīng)開發(fā)了選擇性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑STI-571用于治療慢性骨髓性白血病，其中bcr-abl酪氨酸激酶的構(gòu)成性活化在白細胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。這種物質(zhì)被設計用于抑制具體基因產(chǎn)物的致癌活性(O′DwyerME，等，CurrOpinOncol12594-7，(2000))。從藥物動力學角度，抑制致癌信號比活化腫瘤抑制效果更易于操作。因此，通常上調(diào)的基因產(chǎn)物如MGC47816和HES6蛋白明顯代表了用于設計新型抗癌藥物的有希望的潛在靶標。如上所述，用小干擾RNA(siRNA)抑制MGC47816和HES6的表達顯著降低了癌細胞的生長。盡管小干擾RNA(siRNA)抑制生長的精確分子機理仍需要弄清楚，本文的數(shù)據(jù)清楚地表明上述基因是HCC的良好候選診斷標記，并可代表用于開發(fā)治療這些頑固性腫瘤的有效藥物的分子靶標。工業(yè)實用性全基因組水平的cDNA微陣列的前述基因表達分析將MGC47816和HES6鑒定為特異性上調(diào)的基因。本發(fā)明認為MGC47816和HES6也可作為癌癥預防和治療的靶標。基于MGC47816和/或HES6的表達，本發(fā)明提供了鑒定或檢測HCC的分子診斷標記。本文描述的方法還可用于鑒定預防、診斷和治療HCC的其他分子靶標。本申請報道的數(shù)據(jù)使得對HCC的理解更全面，有利于開發(fā)新的診斷策略，并有助于鑒定治療藥物和預防藥劑的分子靶標。這些信息使得對肝細胞腫瘤發(fā)生有了更深入的認識，并為開發(fā)診斷、治療并最終預防HCC的新策略提供了啟示。所有本文引用的專利、專利申請及文獻都全文引入本文作為參考。進一步地，雖已參照具體實施方案對本發(fā)明進行了詳細描述，應理解上述說明書是為了舉例和說明，它應該說明本發(fā)明及其優(yōu)選的實施方案。通過常規(guī)的試驗，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對說明書進行各種變動和修改是顯而易見的。因此，本發(fā)明不應受上述說明書及如下權(quán)利要求書及其等效物的限制。序列表<110>腫瘤療法科學股份有限公司(ONCOTHERAPYSCIENCE，INC.)東京大學(THEUNIVERSITYOFTOKYO)<120>診斷肝細胞癌的方法<130>ONC-A0305P<150>US60/505,632<151>2003-09-24<160>28<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1528<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(133)..(1308)<223><400>1ccacgcgtccgcgggagcggagccgtggcgcgctcgccccggacgccggccgcccctccg60ctcgccctactgagcgagcggcccggggcgccgaggggtccgcgccgcgcggggcgcacc120gccctggccgccatgtgctcccagctctggttcctgacggaccggcgcatc171MetCysSerGlnLeuTrpPheLeuThrAspArgArgIle1510cgcgaggactacccgcaggtgcagatcctgcgcgccctccggcagcgc219ArgGluAspTyrProGlnValGlnIleLeuArgAlaLeuArgGlnArg152025tgctccgagcaggacgtgcgcttccgggcggtgcttatggaccagatc267CysSerGluGlnAspValArgPheArgAlaValLeuMetAspGlnIle30354045gccgtcaccatcgtcggcggccacctcggcctccagctaaaccagaag315AlaValThrIleValGlyGlyHisLeuGlyLeuGlnLeuAsnGlnLys505560gccctcaccactttcccggatgtggtgcttgtacgggtacccacaccc363AlaLeuThrThrPheProAspValValLeuValArgValProThrPro657075tcagtgcagtcagacagtgacatcactgtcctgcgacacctggagaag411SerValGlnSerAspSerAspIleThrValLeuArgHisLeuGluLys808590ctgggctgccggttggtcaatcgcccacagagcatcttaaattgcatc459LeuGlyCysArgLeuValAsnArgProGlnSerIleLeuAsnCysIle95100105aacaaattctggacgttccaagaactggctggacatggggtccccatg507AsnLysPheTrpThrPheGlnGluLeuAlaGlyHisGlyValProMet110115120125ccagacaccttctcctatggtgggcatgaagacttttcaaaaatgatt555ProAspThrPheSerTyrGlyGlyHisGluAspPheSerLysMetIle130135140gatgaagctgagcccctgggctacccagtcgtggtgaagagcacacga603AspGluAlaGluProLeuGlyTyrProValValValLysSerThrArg145150155ggccaccggggaaaagctgtttttctggcaagagataaacatcacctc651GlyHisArgGlyLysAlaValPheLeuAlaArgAspLysHisHisLeu160165170tctgacatctgccatctgatccgccacgatgtgccctacctgttccag699SerAspIleCysHisLeuIleArgHisAspValProTyrLeuPheGln175180185aagtacgtgaaggagtcccatggaaaggacatccgggtggtggtggta747LysTyrValLysGluSerHisGlyLysAspIleArgValValValVal190195200205gggggccaggtcataggctctatgcttcgctgctccactgatggacgg795GlyGlyGlnValIleGlySerMetLeuArgCysSerThrAspGlyArg210215220atgcagagcaactgctctctcggtggcgtgggcgtcaagtgtccgctg843MetGlnSerAsnCysSerLeuGlyGlyValGlyValLysCysProLeu225230235acagaacaaggcaagcagttggctattcaggtgtccaacatcctaggc891ThrGluGlnGlyLysGlnLeuAlaIleGlnValSerAsnIleLeuGly240245250atggacttctgtggcattgatctccttatcatggacgatggctccttt939MetAspPheCysGlyIleAspLeuLeuIleMetAspAspGlySerPhe255260265gtggtgtgtgaggcaaatgctaatgttggcttcctagcctttgaccag987ValValCysGluAlaAsnAlaAsnValGlyPheLeuAlaPheAspGln270275280285gcatgcaacttagatgtgggtgggatcattgcagactataccatgtcc1035AlaCysAsnLeuAspValGlyGlyIleIleAlaAspTyrThrMetSer290295300ttgctgccaaataggcagactggaaagatggctgtcctcccaggactg1083LeuLeuProAsnArgGlnThrGlyLysMetAlaValLeuProGlyLeu305310315tcgagtccaagggagaagaacgagccggatggctgtgcttcagctcag1131SerSerProArgGluLysAsnGluProAspGlyCysAlaSerAlaGln320325330ggagttgcagagagcgtctataccatcaacagtgggtctacctctagc1179GlyValAlaGluSerValTyrThrIleAsnSerGlySerThrSerSer335340345gaaagtgagcctgaactgggagagatccgggattcctcagcaagcaca1227GluSerGluProGluLeuGlyGluIleArgAspSerSerAlaSerThr350355360365atgggggccccaccctccatgctgcccgaacctggctacaacattaac1275MetGlyAlaProProSerMetLeuProGluProGlyTyrAsnIleAsn370375380aacaggattgcttctgagttaaaacttaagtgaattcctgctttttggcagca1328AsnArgIleAlaSerGluLeuLysLeuLys385390tttaaaccaaatcctactgcttccctagtagttttgagtgaataaaatctggactaatgt1388gatttcatttgcacagaaactagaaatcccatctgggcactcagcattttttctaacgat1448gatttaagcaaatggcctagctttgtggtttttacaaagacaaatataaaaacactcaca1508agaacaaaaaaaaaaaaaaa1528<210>2<211>391<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>2MetCysSerGlnLeuTrpPheLeuThrAspArgArgIleArgGluAsp151015TyrProGlnValGlnIleLeuArgAlaLeuArgGlnArgCysSerGlu202530GlnAspValArgPheArgAlaValLeuMetAspGlnIleAlaValThr354045IleValGlyGlyHisLeuGlyLeuGlnLeuAsnGlnLysAlaLeuThr505560ThrPheProAspValValLeuValArgValProThrProSerValGln65707580SerAspSerAspIleThrValLeuArgHisLeuGluLysLeuGlyCys859095ArgLeuValAsnArgProGlnSerIleLeuAsnCysIleAsnLysPhe100105110TrpThrPheGlnGluLeuAlaGlyHisGlyValProMetProAspThr115120125PheSerTyrGlyGlyHisGluAspPheSerLysMetIleAspGluAla130135140GluProLeuGlyTyrProValValValLysSerThrArgGlyHisArg145150155160GlyLysAlaValPheLeuAlaArgAspLysHisHisLeuSerAspIle165170175CysHisLeuIleArgHisAspValProTyrLeuPheGlnLysTyrVal180185190LysGluSerHisGlyLysAspIleArgValValValValGlyGlyGln195200205ValIleGlySerMetLeuArgCysSerThrAspGlyArgMetGlnSer210215220AsnCysSerLeuGlyGlyValGlyValLysCysProLeuThrGluGln225230235240GlyLysGlnLeuAlaIleGlnValSerAsnIleLeuGlyMetAspPhe245250255CysGlyIleAspLeuLeuIleMetAspAspGlySerPheValValCys260265270GluAlaAsnAlaAsnValGlyPheLeuAlaPheAspGlnAlaCysAsn275280285LeuAspValGlyGlyIleIleAlaAspTyrThrMetSerLeuLeuPro290295300AsnArgGlnThrGlyLysMetAlaValLeuProGlyLeuSerSerPro305310315320ArgGluLysAsnGluProAspGlyCysAlaSerAlaGlnGlyValAla325330335GluSerValTyrThrIleAsnSerGlySerThrSerSerGluSetGlu340345350ProGluLeuGlyGluIleArgAspSerSerAlaSerThrMetGlyAla355360365ProProSerMetLeuProGluProGlyTyrAsnIleAsnAsnArgIle370375380AlaSerGluLeuLysLeuLys385390<210>3<211>22<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>3acaacagcctcaagatcatcag22<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>4ggtccaccactgacacgttg20<210>5<211>23<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>5caaataggcagactggaaagatg23<210>6<211>23<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>6ctagggaagcagtaggatttggt23<210>7<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>7attgtcgacgctcgccctactgagcgagcg30<210>8<211>36<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>8aatctcgagagcaggaattcacttaagttttaactc36<210>9<211>22<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>9tggtagccaagtgcaggttata22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>10ccaaagggtttctgcagtttca22<210>11<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>11tgcggatccagagcagattgtactgagagt30<210>12<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>12ctctatctcgagtgaggcggaaagaacca29<210>13<211>47<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>13tttaagcttgaagaccatttttggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaac47<210>14<211>34<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>14tttaagcttgaagacatgggaaagagtggtctca34<210>15<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>對于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>15caccgaagcagcacgacttcttcttcaagagagaagaagtcgtgctgcttc51<210>16<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>對于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>16aaaagaagcagcacgacttcttctctcttgaagaagaagtcgtgctgcttc51<210>17<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>對于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>17tcccgtgtccgctgacagaacaattcaagagattgttctgtcagcggacac51<210>18<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>對于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>18aaaagtgtccgctgacagaacaatctcttgaattgttctgtcagcggacac51<210>19<211>19<212>DNA<213>人工的<220><223>對于siRNA的人工合成靶序列<400>19gtgtccgctgacagaacaa19<210>20<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>20gagctcctgaaccatctgctc21<210>21<211>23<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>21caagatgtacagagcatcacagc23<210>22<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>22attgaattcgcatggcgccacccgcggcg29<210>23<211>32<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>23aatggtacctcaccaaggcctccagacactcc32<210>24<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>對于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>24tcccacttttagggaccctgcagttcaagagactgcagggtccctaaaagt51<210>25<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>對于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>25aaaaacttttagggaccctgcagtctcttgaactgcagggtccctaaaagt51<210>26<211>19<212>DNA<213>人工的<220><223>對于siRNA的人工合成靶序列<400>26acttttagggaccctgcag19<210>27<211>1375<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(125)..(799)<223><400>27ggagcgcggacggctgggctgctgctgggcggccgcggggcagcggagggcgccggcact60ccggtccccgccgctccccgtccccgctgctcctagcccctgccgcgtccccggcggagc120gggcatggcgccacccgcggcgcctggccgggaccgtgtgggccgtgag169MetAlaProProAlaAlaProGlyArgAspArgValGlyArgGlu151015gatgaggacggctgggagacgcgaggggaccgcaaggcccggaagccc217AspGluAspGlyTrpGluThrArgGlyAspArgLysAlaArgLysPro202530ctggtggagaagaagcggcgcgcgcggatcaacgagagcctgcaggag265LeuValGluLysLysArgArgAlaArgIleAsnGluSerLeuGlnGlu354045ctgcggctgctgctggcgggcgccgaggtgcaggccaagctggagaac313LeuArgLeuLeuLeuAlaGlyAlaGluValGlnAlaLysLeuGluAsn505560gccgaagtgctggagctgacggtg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