專利名稱：金屬離子介導(dǎo)的熒光超猝滅分析、試劑盒以及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)通常涉及用于檢測(cè)生物分子的試劑、試劑盒和分析方法，特別涉及將金屬離子結(jié)合與熒光聚合物超猝滅組合的用于檢測(cè)生物分子的試劑、試劑盒和分析方法。
背景技術(shù)：
酶聯(lián)免疫吸附分析(即ELISA)是最廣泛應(yīng)用且公認(rèn)的，用于對(duì)廣泛的蛋白質(zhì)、抗體、細(xì)胞、病毒等等的存在和生物活性進(jìn)行鑒別的技術(shù)。ELISA是一個(gè)多步驟的“三明治分析”，其中分析物生物分子首先與附著在表面上的抗體結(jié)合。然后第二抗體結(jié)合該生物分子。在一些情況下，第二抗體附著在催化酶上，該催化酶隨后“發(fā)展”放大反應(yīng)。在其它情況下，第二抗體被生物素化以結(jié)合第三蛋白(例如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素)。此蛋白質(zhì)或者附著在引起化學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)而放大比色變化的酶上，或者附著在用于熒光標(biāo)記的熒光團(tuán)上。
盡管其被廣泛應(yīng)用，但ELISA仍存在許多缺點(diǎn)。例如，由于該多步法要求精確的控制試劑和發(fā)展時(shí)間，因此其費(fèi)時(shí)且具有“假陽(yáng)性”傾向。另外，必須要求仔細(xì)的清洗以除去非特異性的吸附試劑。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(即FRET)技術(shù)用于基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基因序列分析和免疫分析。FRET應(yīng)用分析物生物分子的同種(homogeneous)結(jié)合以活化染料的熒光，該熒光在基態(tài)(off-state)時(shí)猝滅。在FRET技術(shù)的常規(guī)例子中，熒光染料連接到抗體上(F-Ab)，此二聯(lián)體(diad)結(jié)合到與猝滅劑偶聯(lián)的抗原(Ag-Q)。該結(jié)合復(fù)合物(F-Ab:Ag-Q)通過(guò)能量轉(zhuǎn)移來(lái)猝滅(即非熒光性)。在同樣的未束縛至Q的分析物抗原(Ag)存在的情況下，該Ag-Q二聯(lián)體被定量置換，該置換通過(guò)由相對(duì)濃度[Ag-Q]/[Ag]確定的平衡結(jié)合可能性來(lái)測(cè)定。這限制了FRET應(yīng)用于抗原已被充分表征(well-characterized)的定量分析，而且對(duì)每一種新情況，必須解決將抗原連接至Q的化學(xué)方法。
其它FRET底物及分析在美國(guó)專利第6,291,201號(hào)，以及下列文章中公開(kāi)Anne等人“用于測(cè)定肉毒桿菌B型神經(jīng)毒素蛋白酶活性的高通量熒光分析”(High Throughput Fluorogenic Assay for Determination ofBotulinum Type B Neurotoxin Protease Activity)，Analytical Biochemistry(分析生物化學(xué))，291，253-261(2001)；Cummings等人“用于炭疽桿菌致死因子蛋白酶的基于肽的熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析”(A Peptide BasedFluorescence Resonance Energy Transfer Assay for Bacillus Anthracis LethalFactor Protease)，Proc.Natl.Acad.Scie.99，6603-6606；Mock等人“炭疽桿菌致死活性因子的快速篩選進(jìn)展”(Progress in Rapid Screening of BacillusAnthracis Lethal Activity Factor)，Proc.Natl.Acad.Sci.，99，6527-6529(2002)；Sportsman等人Assay Drug Dev.Technol.，2004，2，205；和Rodems等人Assay Drug Dev.Technol.，2002，9。
其它應(yīng)用分子內(nèi)猝滅的熒光底物的分析方法在以下文章中公開(kāi)Zhong等人“用于大腸桿菌前導(dǎo)肽酶的內(nèi)部猝滅的熒光底物的發(fā)展”(Development of an Internally Quenched Fluorescent Substrate forEscherichia Coli Leader Peptidase)。Analytical Biochemistry 255，66-73(1998)；Rosse等人“應(yīng)用組合多肽庫(kù)的新蛋白酶底物的快速鑒別”(RapidIdentification of Substrates for Novel Proteases Using a CombinatorialPeptide Library)，Comb.Chem.，2，461-466(2000)以及Thompson等人“用于測(cè)定鈣蛋白酶及其它蛋白酶活性的BODIPY熒光微板分析”(ABODIPY Fluorescent Microplate Assay for Measuring Activity of Calpainsand Other Proteases)，Analytical Biochemistry，279，(2000)。
分析方法也得到了發(fā)展，其中熒光偏振已被測(cè)量并用于定量分析分析物的量。參見(jiàn)，例如Levine等人“應(yīng)用熒光偏振測(cè)定特異性蛋白酶活性”(Measurement of Specific Protease Activity Utilizing FluorescencePolarization)，Analytical Biochemistry 247，83-88。也見(jiàn)Schade等人“BODIPY-a-酪蛋白，用于使用熒光偏振的蛋白酶分析的不依賴于pH的蛋白底物”(BODIPY-a-Casein，a pH-Independent Protein Substrate forProtease Assays Using Fluorescence Polarization)，Analytical Biochemistry243，1-7(1996)。
然而，仍然需要以高靈敏度、快速并準(zhǔn)確地檢測(cè)和定量諸如酶和核酸的生物學(xué)相關(guān)分子。
發(fā)明概述根據(jù)第一實(shí)施方案，提供了復(fù)合物，其包含生物素化的多肽，其中該多肽包含一個(gè)或多個(gè)磷酸基；及與該多肽的磷酸基結(jié)合的金屬陽(yáng)離子。
根據(jù)第二實(shí)施方案，提供了檢測(cè)樣品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或數(shù)量的方法。此實(shí)施方案的方法包括a)將樣品與生物素化的多肽孵育，其中，對(duì)于激酶分析物，所述多肽包含一個(gè)和多個(gè)可被該分析物磷酸化的基團(tuán)，或者，對(duì)于磷酸酯酶分析物，所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被該分析物脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所述樣品加入金屬陽(yáng)離子，其中或者該金屬陽(yáng)離子是猝滅劑，或者該方法還包括向該樣品加入可與該金屬陽(yáng)離子結(jié)合的猝滅劑；c)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅(superquenching)，其中該熒光劑結(jié)合到生物素結(jié)合蛋白；以及d)檢測(cè)熒光，其中所檢測(cè)的熒光表示該樣品中分析物的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第三實(shí)施方案，提供了篩選作為激酶或磷酸酯酶活性抑制劑的化合物的方法。此實(shí)施方案的所述方法包括a)在所述化合物的存在下，在樣品中將生物素化的多肽與激酶或磷酸酯酶孵育，其中，對(duì)于激酶分析，該多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被所述分析物磷酸化的基團(tuán)，且對(duì)于磷酸酯酶分析，該多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被所述分析物脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所述樣品加入金屬陽(yáng)離子，其中或者該金屬陽(yáng)離子是猝滅劑，或者所述方法還包括向所述樣品加入可與該金屬陽(yáng)離子結(jié)合的猝滅劑；c)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中所述熒光劑結(jié)合到生物素結(jié)合蛋白；以及d)在所述化合物的存在下，檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中在該化合物的存在下，所檢測(cè)的熒光量表示該化合物對(duì)激酶和磷酸酯酶活性的抑制作用。
根據(jù)第四實(shí)施方案，提供了生物軛合物，其包含含有一個(gè)或多個(gè)可磷酸化或可脫磷酸化基團(tuán)的多肽；及與該多肽軛合的猝滅部分。該猝滅部分可以是若丹明(rhodamine)或其它具有相似光譜特性的染料。
根據(jù)第五實(shí)施方案，上述的生物軛合物還可包含一個(gè)或多個(gè)磷酸基和剪切位點(diǎn)，其中所述猝滅部分和所述磷酸基位于所述剪切位點(diǎn)的相反側(cè)。優(yōu)選地，在該剪切位點(diǎn)的與該猝滅部分軛合的一側(cè)不存在磷酸基。
根據(jù)第六實(shí)施方案，提供了檢測(cè)樣品中蛋白酶存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括a)將所述樣品與上述包含剪切位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)磷酸基的生物軛合物孵育，其中所述蛋白酶在該剪切位點(diǎn)剪切該多肽；b)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅部分與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅部分能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光表示該樣品中蛋白酶的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第七實(shí)施方案，提供了用于檢測(cè)樣品中激酶或蛋白酶分析物的存在和/或數(shù)量的試劑盒，該試劑盒包括包含上述生物軛合物的第一組分；和包含熒光劑的第二組分，該熒光劑包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)，使得當(dāng)所述生物軛合物的猝滅部分與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅部分能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基相結(jié)合。
根據(jù)第八實(shí)施方案，提供了檢測(cè)樣品中酶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括a)將所述樣品與上述生物軛合物孵育，其中該生物軛合物的多肽包含可被所述酶分析物磷酸化或脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅部分與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅部分能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基相結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光表示該樣品中分析物的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第九實(shí)施方案，提供了用于檢測(cè)樣品中分析物存在的試劑盒，該試劑盒包括包含猝滅劑的第一組分，和包含生物素化的多肽的第二組分，其中該多肽可被所述分析物修飾，且由該分析物修飾的多肽與該猝滅劑結(jié)合。
根據(jù)第十實(shí)施方案，提供了檢測(cè)樣品中磷酸二酯酶的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括a)將所述樣品與包含與環(huán)AMP(磷腺苷)或環(huán)GMP(磷鳥(niǎo)苷)軛合的猝滅劑的生物軛合物孵育；b)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基相結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光表示該樣品中磷酸二酯酶的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第十一實(shí)施方案，提供了檢測(cè)多肽底物的激酶活性的方法，該方法包括a)將所述多肽底物和猝滅劑標(biāo)記的包含一個(gè)或多個(gè)磷酸基的多肽與包含激酶的樣品孵育；b)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基相結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中該多肽底物的磷酸化導(dǎo)致熒光的增加；以及其中所檢測(cè)的熒光量表示該多肽底物的激酶活性的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第十二實(shí)施方案，提供了檢測(cè)樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括a)將所述樣品與包含猝滅劑的多核苷酸(polynucleotide)孵育，該猝滅劑與該多核苷酸第一末端區(qū)的多肽及該多核苷酸第二末端區(qū)的磷酸基軛合，其中至少部分該多核苷酸的第一末端區(qū)和第二末端區(qū)可雜交在一起形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且位于所述末端區(qū)之間的該多核苷酸的中央?yún)^(qū)包含核酸序列，該核酸序列可雜交至該核酸分析物，從而破壞該發(fā)夾結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致所述猝滅劑與該多核苷酸的磷酸基分離；b)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基相結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光表示該樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第十三實(shí)施方案，提供了檢測(cè)樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括a)用猝滅劑標(biāo)記樣品中的核酸；b)將該樣品與多核苷酸孵育，該多核苷酸第一末端區(qū)包含磷酸基，其中該多核苷酸包含可雜交至該核酸分析物的核酸序列；c)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基相結(jié)合；以及d)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中該核酸分析物與該多核苷酸的雜交導(dǎo)致熒光的減少；且其中減少的熒光表示該樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第十四實(shí)施方案，提供了檢測(cè)樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括a)將所述樣品與在末端區(qū)包含磷酸基的第一多核苷酸和包含軛合在其末端區(qū)的猝滅劑的第二多核苷酸孵育，其中該第二多核苷酸和所述核酸分析物可雜交該第一多核苷酸；b)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中該核酸分析物與所述第一多核苷酸的雜交導(dǎo)致熒光的增加；且其中檢測(cè)的熒光量表示該樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第十五實(shí)施方案，提供了檢測(cè)樣品中多肽分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括a)將所述樣品與在末端區(qū)包含磷酸基的核酸適體和包含猝滅劑的多核苷酸孵育，其中該核酸適體可結(jié)合到所述多肽分析物；且該多核苷酸可雜交至該核酸適體；b)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中該多肽分析物與該核酸適體的結(jié)合導(dǎo)致熒光的增加；且其中檢測(cè)的熒光量表示該樣品中多肽分析物的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第十六實(shí)施方案，提供了復(fù)合物，該復(fù)合物包括包含生物素部分的多肽，其中該多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可磷酸化或脫磷酸化；及軛合到猝滅部分的生物素結(jié)合蛋白；其中該多肽的生物素部分通過(guò)蛋白-蛋白相互作用與該生物素結(jié)合蛋白結(jié)合；且其中當(dāng)與熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅部分能夠放大該熒光劑的超猝滅。
根據(jù)第十七方案，提供了檢測(cè)樣品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括a)將所述樣品與上述復(fù)合物孵育，其中對(duì)于激酶分析物，所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被該分析物磷酸化的基團(tuán)，且對(duì)于磷酸酯酶分析物，所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被該分析物脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基相結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中檢測(cè)的熒光量表示該樣品中分析物的存在和/或數(shù)量。
根據(jù)第十八實(shí)施方案，提供了檢測(cè)樣品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括a)將所述樣品與生物素化的多肽孵育，對(duì)于激酶分析物分析，該多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被該分析物磷酸化的基團(tuán)，或者對(duì)于磷酸酯酶分析物分析，該多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被該分析物脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所孵育的樣品加入與猝滅部分軛合的生物素結(jié)合蛋白；c)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅部分與該熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅部分能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基相結(jié)合；以及d)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光表示該樣品中分析物的存在和/或數(shù)量。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A和1B表示可用于金屬離子介導(dǎo)的熒光超猝滅分析的聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2是基于金屬離子介導(dǎo)的熒光超猝滅的，酶介導(dǎo)的磷酸化或脫磷酸化活性分析的示意圖。
圖3是若丹明標(biāo)記的磷酸化肽猝滅鎵傳感器的Stern-Volmer圖。
圖4A和4B是顯示蛋白激酶A(PKA)分析終點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)分析的曲線圖。
圖5是顯示在抑制劑的存在下，蛋白激酶A(PKA)分析反應(yīng)的曲線圖。
圖6是表示蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTB-1B)磷酸酯酶分析的EC50值和檢測(cè)限的曲線圖。
圖7是顯示蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTB-1B)活性抑制的曲線圖。
圖8是基于金屬離子介導(dǎo)的熒光超猝滅的蛋白酶分析的示意圖。
圖9是基于金屬離子介導(dǎo)的超猝滅的，應(yīng)用蛋白和多肽底物阻斷激酶分析的示意圖。
圖10是顯示作為例子的使用PKCα的熒光開(kāi)啟(fluorescence turn-on)阻斷激酶分析的曲線圖。
圖11是應(yīng)用金屬離子介導(dǎo)的超猝滅的磷酸二酯酶分析的示意圖。
圖12是顯示以實(shí)時(shí)或動(dòng)力學(xué)分析模式監(jiān)測(cè)胰蛋白酶活性的結(jié)果的曲線圖。
圖13表示一個(gè)實(shí)施方案的磷酸化多肽的檢測(cè)。
圖14是顯示根據(jù)一實(shí)施方案，在使用生物素化肽底物(BT)的分析中，作為蛋白激酶A(PKA)濃度的函數(shù)的相對(duì)熒光(relative fluorescence)的圖。
圖15是顯示對(duì)磷酸化和非磷酸化組蛋白的相對(duì)熒光反應(yīng)的圖表。
圖16是顯示根據(jù)另一實(shí)施方案，在應(yīng)用生物素化的肽底物(BT)的分析中，作為蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)濃度的函數(shù)的相對(duì)熒光的圖。
圖17表示的分析中，猝滅劑-連接軛合物(QT)與金屬離子和熒光聚合物的整體結(jié)合，導(dǎo)致放大的熒光聚合物的超猝滅。
圖18是顯示用于金屬離子介導(dǎo)的超猝滅分析的磷酸肽校準(zhǔn)曲線圖。
圖19顯示得自金屬離子介導(dǎo)的超猝滅分析的蛋白激酶A濃度曲線。
圖20是基于金屬離子介導(dǎo)的熒光超猝滅的激酶活性傳感器的示意圖，該超猝滅通過(guò)在第二步驟中加入的鏈霉抗生物素猝滅劑分子與激酶反應(yīng)的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。
圖21A和21B是比較采用兩步法的、使用生物素化的底物和猝滅劑(即，若丹明)標(biāo)記的底物的PKA終點(diǎn)分析的圖，其中圖21A顯示作為PKA濃度的函數(shù)的RFU，及圖21B顯示作為PKA濃度的函數(shù)的磷酸化％。
圖22顯示用7種不同的生物素化肽底物進(jìn)行篩選的結(jié)果的棒狀圖，該生物素化肽底物每個(gè)均與3種不同的酶反應(yīng)(即，PTP-1B、PKCα和PKA)。
詳細(xì)說(shuō)明生物傳感的猝滅劑-連接-配體(quencher-tether-ligand)(QTL)途徑通過(guò)電子和能量傳遞猝滅劑來(lái)利用熒光聚合電解質(zhì)的超猝滅。所述QTL分析平臺(tái)利用共軛聚合物的集光能力及其高度離域的激發(fā)態(tài)，以提供響應(yīng)極少量電子和能量傳遞物質(zhì)存在的放大的熒光信號(hào)調(diào)節(jié)。該新技術(shù)通過(guò)將該信號(hào)調(diào)節(jié)現(xiàn)象與抗原受體、底物-酶和寡核苷酸-寡核苷酸結(jié)合相互作用相聯(lián)系，應(yīng)用于蛋白、小分子、肽、蛋白酶和寡核苷酸的高靈敏度檢測(cè)[1-9]。
在一種方法中，所述熒光聚合物，P，與生物素結(jié)合蛋白協(xié)同定位于溶液中或固體載體上，并通過(guò)生物素-生物素結(jié)合蛋白相互作用與猝滅劑-連接-生物素(QTB)生物軛合物形成關(guān)聯(lián)復(fù)合物。該QTB生物絡(luò)合物包括通過(guò)反應(yīng)性鏈(reactive tether)與生物素偶聯(lián)的猝滅劑Q，該猝滅劑強(qiáng)烈地結(jié)合與所述聚合物P協(xié)同定位的生物素結(jié)合蛋白。該QTB生物軛合物與靶分析物的反應(yīng)以易檢測(cè)的方式修飾該聚合物的熒光。
如本發(fā)明所述，開(kāi)發(fā)了將所述QTL生物軛合物與熒光聚合物結(jié)合的可選擇方式，該方式利用作為溶液中的個(gè)體分子或載體上的組件的熒光聚合電解質(zhì)的自我組織能力來(lái)與金屬離子絡(luò)合。因此所絡(luò)合的金屬離子可選擇性地與結(jié)合在所述QTL生物軛合物內(nèi)的配位基團(tuán)(例如，磷酸基)結(jié)合，因而提供了選擇性檢測(cè)，例如，蛋白、小分子、肽、蛋白酶、激酶、磷酸酯酶和寡核苷酸的基礎(chǔ)[10-11]。
受體分子(即，猝滅劑)可猝滅供體分子效力的有效性依賴于兩個(gè)實(shí)體分開(kāi)的距離。在構(gòu)建分析(constructing assay)中，分子鏈接(tethering)(將受體和供體結(jié)合)可通過(guò)諸如共價(jià)鍵的常規(guī)策略和生物素-親和素的相互作用來(lái)完成。因?yàn)楣矁r(jià)鍵直接將所述猝滅劑置于所述受體上使其形成一個(gè)分子，所以是用于共振能量轉(zhuǎn)移的良好途徑。因此兩者之間的距離可小至單鍵的長(zhǎng)度。另一方面，因?yàn)閹缀跞魏蔚姆肿泳晒矁r(jià)連接到生物素，所以生物素和諸如抗生物素蛋白的生物素結(jié)合蛋白(BBP)的相互作用提供廣泛的多樣性。但是，生物素結(jié)合蛋白通常大于60千道爾頓，因此當(dāng)所述受體和供體通過(guò)生物素-BBP相互作用結(jié)合時(shí)，該受體和供體間的距離是明顯的。
作為生物素-BBP相互作用的常規(guī)置換，我們提出了用于在超猝滅分析中將受體和供體協(xié)同定位的金屬離子磷酸鹽相互作用。因?yàn)樵S多分子可被磷酸化，因而作為生物素-BBP相互作用的置換，該策略通常是可應(yīng)用的。另外，因?yàn)樗鲦湹亩它c(diǎn)到端點(diǎn)的距離(即，金屬離子與磷酸鹽間的配對(duì)距離(coordination distance))明顯較短，所以該策略改進(jìn)了生物素-抗生物素蛋白相互作用。金屬離子對(duì)諸如磷酸基的配體的親合性顯著低于生物素-BBP相互作用(Ka＝105-7對(duì)1013-15)。
根據(jù)第一實(shí)施方案，提供了包含與金屬離子絡(luò)合的熒光聚合電解質(zhì)的新傳感器，該熒光聚合電解質(zhì)或者作為溶液中的個(gè)體分子或者作為載體上的組件。該傳感器的金屬離子還可選擇性地與結(jié)合在QTL生物軛合物內(nèi)的配體(例如，磷酸基)結(jié)合，并為上述同類分子(例如，蛋白、小分子、肽、蛋白酶、激酶、磷酸酯酶和寡核苷酸)的選擇性檢測(cè)提供了基礎(chǔ)，該選擇性檢測(cè)包括但不限于終點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)方式。如下文所述，對(duì)于一些分析，所述配位基-金屬離子結(jié)合提供了生物素-生物素結(jié)合蛋白結(jié)合的替代方法。在其它實(shí)施例中，該配位基附著在QTL的猝滅部分上或被從其中除去，從而提供傳感器熒光的猝滅或恢復(fù)(或兩者)。
本發(fā)明所述的各種實(shí)施方案應(yīng)用熒光聚合物-QTL超猝滅和金屬離子-磷酸配體特異性結(jié)合來(lái)提供改進(jìn)的激酶、磷酸酯酶和蛋白酶活性分析。金屬離子介導(dǎo)的熒光聚合物超猝滅提供了應(yīng)用肽和蛋白底物來(lái)測(cè)定激酶、磷酸酯酶和蛋白酶活性的通用平臺(tái)，及用于實(shí)施基于DNA雜交的分析和應(yīng)用適體、抗體和其它配體的蛋白分析的更通用的途徑。
聚(苯撐亞乙炔)(poly(phenylene-ethynylene))(PPE)家族的共軛的聚合物可制備成在芳環(huán)上附加有各種官能團(tuán)。合成的具有側(cè)鏈(pendant)陰離子基的聚合物如圖1A和1B中所示。圖1A顯示了磺基(sulfo)聚對(duì)苯撐乙炔(PPE-Di-COOH)共軛聚合物的分子結(jié)構(gòu)。圖1B顯示了磺基聚對(duì)苯撐乙炔(PPE)共軛聚合物的分子結(jié)構(gòu)。在水中，這些聚合物均可與陽(yáng)離子微球結(jié)合形成穩(wěn)定的聚合物包衣。該聚合物包被的微球顯示強(qiáng)烈的熒光。該聚合物包被的微球上的全部電荷可通過(guò)聚合物裝載程度的變化及聚合物結(jié)構(gòu)的改變來(lái)調(diào)節(jié)。
已發(fā)現(xiàn)，熒光聚合物包被的微球可與金屬陽(yáng)離子結(jié)合，以及金屬離子的負(fù)載可能依賴于該微球上所述聚合物的負(fù)載水平。某些諸如Fe3+和Cu2+的金屬離子可猝滅該聚合物的熒光，而其它諸如Ga3+的金屬離子不猝滅。在一些實(shí)施方案中，在不含該金屬離子則極少或無(wú)猝滅發(fā)生的條件下，Ga3+用于介導(dǎo)微球結(jié)合的聚合物熒光的超猝滅。
例如，包含染料的磷酸化肽若丹明-LRRA(pS)LG SEQ ID NO1其中pS指磷酸化的絲氨酸，該磷酸化肽應(yīng)為所述聚合物的良好的能量轉(zhuǎn)移猝滅劑，但發(fā)現(xiàn)其極少或不猝滅聚合物包被的微球的熒光。在該聚合物包被的微球通過(guò)Ga3+的添加被“裝載(charged)”后，但是，向該懸浮液加入相同的肽導(dǎo)致該聚合物熒光的顯著猝滅。相反，只包含磷酸化殘基或所述猝滅劑染料的肽，例如如下所示的肽若丹明-LRRASLGSEQ ID NO2在相同的條件下，對(duì)該聚合物熒光產(chǎn)生很小的作用。磷酸化生物分子與所述金屬離子荷電的聚合物間的特異結(jié)合是下述多種分析的基礎(chǔ)。
圖2示意性地顯示了基于金屬離子介導(dǎo)的超猝滅的傳感器，該傳感器可用于激酶或磷酸酯酶活性分析。圖2顯示了如何通過(guò)加入所述QTL傳感器來(lái)檢測(cè)靶酶(target enzymes)對(duì)若丹明肽底物的磷酸化或脫磷酸化。用若丹明猝滅劑來(lái)標(biāo)記所述肽產(chǎn)物，并利用結(jié)合到Ga3+金屬離子的特異性磷酸鹽將其帶至所述聚合物表面。所發(fā)生的聚合物熒光猝滅伴隨著該多肽底物的磷酸化或脫磷酸化。這類分析可用于緩和生物底物的磷酸化或脫磷酸化的酶，該生物底物包括，但不限于肽、蛋白、類脂、碳水化合物和核苷或小分子。
激酶/磷酸酯酶分析蛋白的磷酸化和脫磷酸化介導(dǎo)了細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。酶功能的畸變可導(dǎo)致諸如癌癥和炎癥的疾病。超過(guò)500個(gè)激酶和磷酸酯酶被認(rèn)為參與了細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)，許多激酶和磷酸酯酶是用于藥物治療的靶標(biāo)。
蛋白激酶A(PKA)是cAMP依賴的蛋白激酶，且作為諸如激素和神經(jīng)遞質(zhì)的眾多cAMP-升高(elevating)第一信使的效應(yīng)器發(fā)揮功能。PKA的普遍分布及其靈活的底物識(shí)別特性使PKA在活細(xì)胞的許多過(guò)程中成為重要因素，例如淋巴細(xì)胞增殖和免疫應(yīng)答的抑制、在海馬和感覺(jué)神經(jīng)傳遞中長(zhǎng)期抑制的介導(dǎo)。蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)最近發(fā)現(xiàn)為胰島素信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)物，這表明PTP-1B的抑制劑可有益于2型糖尿病的治療。
在激酶中，存在著90％磷酸化絲氨酸殘基、10％磷酸化蘇氨酸殘基和0.1％磷酸化酪氨酸殘基。雖然可能開(kāi)發(fā)出抗磷酸酪氨酸的抗體、但是抗磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸殘基的抗體具有低親合性，且通常僅對(duì)一種激酶有特異性。目前，基于非抗體的高通量篩選(HTS)分析基于諸如時(shí)間分辨熒光(time-resolved fluorescence)(TRF)、熒光偏振分析(FP)，或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的方法。這些分析需要專門的設(shè)備和/或需要忍受作為酶活性函數(shù)的低熒光強(qiáng)度變化。
我們尋求通過(guò)應(yīng)用上述超猝滅來(lái)放大熒光信號(hào)以增強(qiáng)酶活性測(cè)量法的靈敏度。所述傳感器平臺(tái)可包含諸如圖1A所示聚(苯撐乙炔)(PPE)衍生物的改良的陰離子聚電解質(zhì)熒光劑。該P(yáng)PE熒光劑可通過(guò)吸附在荷正電的微球上來(lái)固定。該聚合物顯示具有高量子效率的光致發(fā)光，并用于蛋白酶活性的檢測(cè)[9]。在該平臺(tái)中，使用反應(yīng)性肽序列，該肽序列與N-末端猝滅劑及C-末端生物素側(cè)接(flank)。該肽結(jié)合與生物素結(jié)合蛋白協(xié)同定位的PPE包被的微球，導(dǎo)致近全部的PPE熒光的猝滅。酶介導(dǎo)的所述肽的剪切導(dǎo)致與酶活性成線性關(guān)系的熒光猝滅的逆轉(zhuǎn)。已證實(shí)單一的能量受體染料可大約猝滅49重復(fù)單位/猝滅劑的光致發(fā)光[9]。
如圖2所示，熒光聚合物超猝滅可適用于激酶/磷酸酯酶活性的生物檢測(cè)。如圖2所示，多價(jià)金屬離子可強(qiáng)烈地與溶液中的陰離子軛合聚合物結(jié)合，導(dǎo)致聚合物熒光的改變和/或猝滅。因?yàn)榫酆衔?微球整體(ensemble)上的總電荷可被調(diào)諧，因而這些整體可提供平臺(tái)，由此金屬離子與該聚合物結(jié)合，而未強(qiáng)烈地猝滅所述該聚合物熒光，同時(shí)保留與特異性配體絡(luò)合的能力。該途徑類似于在固定化金屬離子親和色譜法(IMAC)中應(yīng)用的途徑，因此在低pH值下，金屬離子可通過(guò)與磷酸鹽中的氧配位來(lái)特異地捕獲磷酸化的化合物。參見(jiàn)，例如，Morgan等人，AssayDrug Dev.Technol.，2004，2，171。
如本發(fā)明所述，鎵可與熒光劑(包括，但不限于，諸如圖1A和1B所示的那些陰離子軛合聚合物和其它包含多種熒光物質(zhì)的熒光劑)相結(jié)合，而不猝滅所述聚合物發(fā)光。該鎵可以單體Ga3+或諸如聚氧類(polyoxospecies)的多聚整體形式存在。熒光劑結(jié)合的鎵也可與磷酸化的肽結(jié)合，從而當(dāng)所述肽包含諸如若丹明的染料時(shí)，發(fā)生金屬離子介導(dǎo)的聚合物超猝滅。該熒光劑可與諸如微球的固體載體的表面結(jié)合。如圖2所示，該途徑為靈敏和選擇性的激酶/磷酸酯酶分析提供了基礎(chǔ)。
對(duì)于熒光猝滅(關(guān)閉)激酶分析，聚合物熒光的猝滅與酶活性成線性關(guān)系。如以下實(shí)施例所述，該分析可在近生理pH值下完成，并具有構(gòu)建實(shí)時(shí)分析或終點(diǎn)分析的靈活性。該分析是瞬時(shí)的，“混合并讀數(shù)”且無(wú)需洗滌步驟或制備復(fù)雜樣品。
以下實(shí)施例1顯示了蛋白激酶A(PKA)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTB-1B)酶活性的粗略分析。在底物轉(zhuǎn)化10-20％時(shí)，該分析常規(guī)地輸送大于0.9的Z′值。在如下所示的實(shí)施例中，該激酶分析提供作為酶活性函數(shù)的熒光信號(hào)衰減，而該磷酸酯酶分析提供隨酶活性增加而增強(qiáng)的信號(hào)。因?yàn)?，?duì)于諸如SEQ ID NO1的肽，作為聚合物熒光猝滅的結(jié)果，所述猝滅劑可顯示敏化熒光，所以該分析可顯示相同樣品中的信號(hào)增強(qiáng)或減少，這依賴于檢測(cè)的波長(zhǎng)度。因此，可產(chǎn)生比率(ratiometric)測(cè)量方法。此外，檢測(cè)可通過(guò)監(jiān)測(cè)所述肽的猝滅劑中的熒光偏振來(lái)完成。對(duì)于基于金屬離子介導(dǎo)的超猝滅的蛋白激酶、磷酸酯酶和蛋白酶分析，可完成終點(diǎn)分析和動(dòng)力學(xué)分析。
實(shí)施例1蛋白激酶A(PKA)和酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)的活性分析以下肽用作酶底物及用作磷酸肽的校準(zhǔn)物。
對(duì)PKA活性檢測(cè)若丹明-LRRASLG SEQ ID NO2和校準(zhǔn)物肽若丹明-LRRA(pS)LGSEQ ID NO1均由Anaspec合成。
對(duì)磷酸酯酶活性檢測(cè)若丹明-KVEKIGEGT(pY)GVVYKSEQ ID NO3和校準(zhǔn)物肽若丹明-KVEKIGEGTYGVVYK SEQ ID NO4均由美國(guó)肽公司合成的。
重組PKA購(gòu)自Promega。酶PTP-1B和抑制劑PK682購(gòu)自Biomol。PKA的十字孢堿抑制劑購(gòu)自Sigma。聚苯乙烯胺功能化的小珠(bead)得自界面動(dòng)力學(xué)公司(Interfacial Dynamics)。
傳感器珠的性能通過(guò)將15μl位于分析緩沖液中的1μM肽溶液(若丹明-磷酸肽或者若丹明-非磷酸化肽)加入到15μl位于檢測(cè)緩沖液中的傳感器中來(lái)確定。該混合物的熒光應(yīng)用SpectraMax Gemini XS平板讀數(shù)器(分子儀器有限公司(Molecular Devices，Inc.))，借助450nm激發(fā)、475nm截止濾光片和490nm發(fā)射以孔掃描模式來(lái)測(cè)定。
基于在溶液中，二價(jià)或三價(jià)金屬離子可強(qiáng)烈地與諸如圖1A和1B所示的陰離子聚合物結(jié)合這一發(fā)現(xiàn)，選擇結(jié)構(gòu)如圖1A所示的聚合物作為用于激酶/磷酸酯酶分析的傳感器。當(dāng)GaCl3以340μM濃度加入到包含PPE-Di-COOH包被的微球的溶液中時(shí)，未觀察到發(fā)射的猝滅。在更高的GaCl3濃度觀察到熒光發(fā)射的猝滅。但是，當(dāng)使用最佳濃度的Ga3+時(shí)，發(fā)現(xiàn)若丹明標(biāo)記的磷酸肽提供強(qiáng)烈的聚合物熒光猝滅，而當(dāng)使用未磷酸化若丹明標(biāo)記的肽時(shí)，觀察到很少的熒光調(diào)節(jié)。
圖3顯示得自若丹明標(biāo)記的PTP-1B磷酸肽底物的Stern Volmer圖。該Stern Volmer常數(shù)(Ksv)提供了猝滅的定量測(cè)定，其中Fo是無(wú)猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度，以及F是猝滅劑存在時(shí)的熒光強(qiáng)度。
本發(fā)明所測(cè)定的Ksv相對(duì)較大(即，2×107M-1)。50％猝滅劑提供(PRU/Q)50＝50，這證明超猝滅的發(fā)生。
如上所示，通過(guò)應(yīng)用猝滅劑標(biāo)記的底物開(kāi)發(fā)了分析方法。所述底物磷酸化時(shí)，所述肽通過(guò)磷酸基與所述傳感器結(jié)合并猝滅熒光。因?yàn)樗鼋饘匐x子配位基特異性地結(jié)合磷酸鹽、所以可檢測(cè)磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸或磷酸酪氨酸殘基。
下文描述了基于熒光超猝滅的，用于絲氨酸和酪氨酸酶，即蛋白激酶A(PKA)和蛋白酪氨酸磷酸酶1-B(PTP-1B)的分析方法。
圖4A顯示PKA酶活性的終點(diǎn)測(cè)定，在該終點(diǎn)測(cè)定中聚合物猝滅的增加與酶濃度相關(guān)。不同于需要非常低pH值的Fe3+配位分析，該平臺(tái)在近生理學(xué)pH值時(shí)具有功能，因此允許研究者靈活地選擇進(jìn)行實(shí)時(shí)分析或終點(diǎn)分析。與圖4B所示的終點(diǎn)分析相比，包括作為酶反應(yīng)混合物一部分的檢測(cè)器混合物的實(shí)時(shí)分析對(duì)50％底物磷酸化需要高近10倍的酶濃度。
所述分析的靈敏度通過(guò)使用公知的PKA活性抑制劑，十字孢堿來(lái)測(cè)定。圖5顯示了所得結(jié)果。如圖5所示，在與6.5μM ATP和200mU PKA的反應(yīng)中，應(yīng)用1μM底物獲得的IC50為59mU，并與公開(kāi)的值(18.4mU)相符。
與用于PKA的模式相比，對(duì)用于檢測(cè)蛋白酪氨酸磷脂酶1B(PTP-1B)對(duì)不同長(zhǎng)度和序列組成的肽底物的活性的模式進(jìn)行了測(cè)試。圖6顯示了作為終點(diǎn)分析測(cè)定的或?qū)?25nM底物使用PTP-1B而實(shí)時(shí)測(cè)定的EC50和酶濃度曲線的優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)(LOD)的結(jié)果。應(yīng)用公知的抑制劑RK-682的抑制劑曲線產(chǎn)生了26.4nM的良好IC50值。
可用此分析傳遞(delivered)的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)通過(guò)在8次重復(fù)中評(píng)估公知量的磷酸肽校準(zhǔn)肽來(lái)確定(圖6)。所述數(shù)據(jù)是良好的，且顯示該分析適用于測(cè)定少至5-10％的底物轉(zhuǎn)化，Z′因子分別為0.8和0.9。
該P(yáng)KA分析的性能與商業(yè)可用的FRET分析、ATP消耗分析和基于IMAC的分析進(jìn)行比較。實(shí)施所有的分析以產(chǎn)生酶濃度曲線中的最佳性能，并且如果可能，在所有分析中使用相同的肽。該基于IMAC的分析傳遞了酶濃度曲線中最低的靈敏度(1ng比20pg)。相對(duì)于當(dāng)前模式中的1∶50，在原理上最接近于所述QTL光速TM(QTL LightspeedTM)分析的本發(fā)明所述分析中，傳感器對(duì)檢測(cè)器的比為1∶1。這些結(jié)果清楚證明用超猝滅可獲得增加的靈敏度。
開(kāi)發(fā)了應(yīng)用對(duì)Akt-1和PKCα的底物的其它分析。當(dāng)使用這些不同的底物時(shí)，未觀察到明顯的熒光猝滅對(duì)底物長(zhǎng)度或肽序列含量的依賴性。在這點(diǎn)上，所述金屬離子介導(dǎo)的超猝滅分析可視為具有普遍性，并對(duì)FRET肽具有主要優(yōu)勢(shì)，在FPET肽中，猝滅高度地依賴于所述供體和受體間的距離。
蛋白酶分析蛋白酶剪切其底物上的酰胺鍵。肽或蛋白底物及金屬離子-熒光聚合物整體的應(yīng)用使得開(kāi)發(fā)了檢測(cè)蛋白酶活性的高靈敏度的分析方法，該肽或蛋白底物包含在剪切位點(diǎn)任一側(cè)的猝滅劑和磷酸基。
蛋白酶分析的一個(gè)實(shí)施方案顯示于圖8中。如圖8所示，當(dāng)完整的底物結(jié)合所述傳感器時(shí)，該傳感器的熒光被猝滅劑染料的promixity猝滅。所述酶將該底物剪切成片段，將該猝滅劑與該磷酸基分離，導(dǎo)致該猝滅劑和聚合物的分離。在酶活性的存在下，該分離減少了聚合物熒光的猝滅(即，增強(qiáng)了來(lái)自該傳感器的信號(hào))。
蛋白酶活性可以同種(homogeneous)或異種(hegerogeneous)的方式來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)或在終點(diǎn)監(jiān)測(cè)。在同種的實(shí)時(shí)分析中，所述底物可位于所述聚合物-微球整體的表面。在同種的終點(diǎn)分析中，所述底物和所述酶可在溶液中反應(yīng)，并在特定孵育期的末尾，可將所述傳感器加入該樣品中以停止該反應(yīng)。當(dāng)熒光染料用作所述猝滅劑時(shí)，可比率(ratiometrically)地監(jiān)測(cè)蛋白酶活性。在異種的終點(diǎn)方式中，可使用生物素化的底物，其在剪切位點(diǎn)同一側(cè)包含磷酸基和猝滅劑。剪切后，所述肽物質(zhì)通過(guò)與生物素類的結(jié)合來(lái)分離，而猝滅劑標(biāo)記的部分被轉(zhuǎn)移，因而可猝滅該熒光劑。
實(shí)施例2基于金屬離子介導(dǎo)的熒光超猝滅的蛋白酶分析在此分析中，胰島素的肽底物為若丹明-LRRApSLG(SEQ ID NO1)。
胰島素在兩個(gè)精氨酸處剪切該肽。本實(shí)施例中實(shí)施的分析使用以下參數(shù)微球-熒光劑-鎵整體(QTL傳感器)；3μM最終的Rh-LRRApSLG(SEQ ID NO1)；1U/μL胰島素；40×106微球(MS)/15μL；λex430；λm490；和λco475nm。
該分析在約22℃下，在384孔的白色平板中進(jìn)行1小時(shí)。分析結(jié)果如以下表1所示。
表1 基于金屬離子介導(dǎo)的熒光超猝滅的蛋白酶分析結(jié)果

圖12的曲線圖顯示了以“實(shí)時(shí)”(即，動(dòng)力學(xué))分析方式對(duì)胰島素活性進(jìn)行監(jiān)測(cè)的結(jié)果。如圖12所示，胰島素活性存在時(shí)間依賴的上升。因此，隨時(shí)間推移發(fā)生熒光信號(hào)的增強(qiáng)。
應(yīng)用未標(biāo)記的肽和蛋白的阻斷分析用于圖2所示的上述分析的基礎(chǔ)可適用于阻斷分析，在該阻斷分析中，在不含另外的磷酸化底物時(shí)，“一般的”磷酸化染料標(biāo)記的肽，或者其它包含染料和結(jié)合磷酸鹽的金屬離子(例如，鎵)的底物猝滅包含熒光聚合物和金屬離子的聚合物珠，但是當(dāng)肽或蛋白底物被磷酸化時(shí)，其被“阻斷”。
所述分析的原理如圖9所示，圖9示意性地闡明基于金屬離子介導(dǎo)的超猝滅的阻斷激酶分析(blocking kinase assay)。該分析可方便地通過(guò)將所述傳感器加入孵育后的酶和分析物的混合物中發(fā)生反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。如圖9所證實(shí)，任何磷酸化的分析物與該傳感器相結(jié)合，而不猝滅所述聚合物熒光。加入所述“一般的”磷酸化染料標(biāo)記的肽可導(dǎo)致該聚合物熒光的猝滅，其受到所述“阻斷”的微球上的“游離”磷酸鹽結(jié)合位點(diǎn)的范圍的限制。該分析用作熒光“開(kāi)啟”分析，并具有其它優(yōu)點(diǎn)在開(kāi)發(fā)該分析中，無(wú)需先進(jìn)行所述底物的衍生化。圖10顯示了利用髓磷脂堿性蛋白(MBP)對(duì)PKCα進(jìn)行阻斷分析(“熒光開(kāi)啟”)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
與使用如下所述的肽底物相比，激酶對(duì)天然蛋白底物的活性檢測(cè)具有數(shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)。
·在518個(gè)公知的人類激酶(或2500個(gè)亞型)中，僅對(duì)約50個(gè)激酶建立了肽底物，但是所述靶蛋白在多數(shù)情況下均可被識(shí)別。一些酶可能需要靶的不連續(xù)氨基酸來(lái)進(jìn)行有效的底物識(shí)別，結(jié)合和磷酸化，在此情況中，人工肽序列難以被構(gòu)建，即使相關(guān)的氨基酸已鑒定。
·認(rèn)為天然靶蛋白的磷酸化比肽底物的磷酸化更有效。這不僅對(duì)(肽底物的)成本很重要，而且使HTS中抑制劑的鑒別更準(zhǔn)確。
·天然靶蛋白的磷酸化比人工底物的磷酸化更具有特異性。將來(lái)對(duì)剖析細(xì)胞中的激酶活性的嘗試會(huì)被肽底物的交叉識(shí)別所阻礙，但是對(duì)蛋白底物起作用。
·目前用于檢測(cè)蛋白磷酸化的非放射性和不基于抗體的分析是基于第二酶熒光素酶對(duì)ATP的消耗。由于對(duì)該第二酶(熒光素酶)的抑制作用，所以在抑制劑篩選中這類分析易于形成假陰性結(jié)果。FP分析需要大的分子運(yùn)動(dòng)變化以獲得信號(hào)，因此僅可以檢測(cè)到小分子量的蛋白。
實(shí)施例3激酶PKCα對(duì)髓磷脂堿性蛋白(MBP)的磷酸化可在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中進(jìn)行，并加入以上實(shí)施例2中所述的QTL傳感器。憑借特異性磷酸鹽結(jié)合金屬配位離子，磷酸化的MBP結(jié)合該QTL傳感器，且以濃度依賴性方式抑制染料標(biāo)記的磷酸肽(示蹤器)的結(jié)合。所產(chǎn)生的熒光與mbp磷酸化的程度相關(guān)。
該原理在以下實(shí)施例中所證實(shí)。在室溫下，在白色384孔的透明平板中，用系列稀釋的激酶PKCα酶對(duì)1μg濃度的mbp進(jìn)行磷酸化1小時(shí)。孵育后，在約22℃時(shí)，加入50×106QTL傳感器珠10分鐘，隨后加入1μM染料標(biāo)記的肽示蹤器。在約22℃時(shí)，將平板孵育30分鐘，并在雙子星XS平板閱讀器上(Gemini XS Plate reader，Molecular Devices，Inc.)應(yīng)用450nm激發(fā)，490nm發(fā)射和475nm截止濾光片來(lái)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。所述熒光“開(kāi)啟”示意性地顯示在圖9中。
通過(guò)金屬離子介導(dǎo)的熒光超猝滅監(jiān)測(cè)的磷酸酯酶活性3’，5’-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(PDEs)包括金屬磷酸水解酶家族，該金屬磷酸水解酶特異性地裂解環(huán)磷酰苷(cAMP)和/或環(huán)磷鳥(niǎo)苷(cGMP)的3’鍵以產(chǎn)生相應(yīng)的5’-核苷。在哺乳動(dòng)物組織中已鑒定了對(duì)cAMP和cGMP具有不同選擇性的11個(gè)PDEs家族。
PDEs是細(xì)胞cAMP和/或cGMP水平的基本調(diào)節(jié)劑。環(huán)磷酰苷或環(huán)磷鳥(niǎo)苷是細(xì)胞內(nèi)第二信使，其在參與重要的細(xì)胞過(guò)程的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。PDEs是治療各種疾病的藥物開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)。例如，西地那非(Sidenafil)，PDE5的選擇性抑制劑，已商品化為藥物(即，偉哥，輝瑞公司注冊(cè)的商標(biāo))。數(shù)個(gè)PDE4抑制劑作為治療諸如哮喘疾病的抗炎藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。
如上所述，QTL傳感器對(duì)磷酸基顯示出高親合力，這在所述激酶和磷酸酯酶分析中證實(shí)。所述PDE分析使用染料標(biāo)記的cAMP或cGMP為底物以分析磷酸二酯酶的活性。染料包括但不限于若丹明、偶氮或熒光素，該熒光素可偶聯(lián)cAMP或cGMP而不抑制對(duì)PDEs的反應(yīng)性。由于cAMP或cGMP以磷酸二酯形式存在，其并不強(qiáng)烈地結(jié)合在鎵聚合物的表面上，所以很少有聚合物熒光的初始猝滅。在由PDE催化的水解中，在這些底物上的磷酸二酯被轉(zhuǎn)化為磷酸基。所述染料因而通過(guò)鎵-磷酸鹽的特異性相互作用被帶至微球表面附近，導(dǎo)致該聚合物熒光的猝滅。圖11描述了磷酸二酯酶分析。
核酸分析金屬磷酸鹽介導(dǎo)的結(jié)合可用于產(chǎn)生用于DNA和RNA檢測(cè)的超猝滅分析。可使用眾多不同的基于核酸類與靶核酸類的雜交的方法，該靶核酸類可以在溶液中或固定在固體載體上。第一種途徑使用在其一個(gè)末端處被磷酸化的寡核苷酸。所述磷酸鹽允許金屬磷酸鹽介導(dǎo)的、DNA鏈(strand)與軛合的熒光聚合物的協(xié)同定位。如果磷酸基附著在該寡核苷酸的5’-端，在3’-端上互補(bǔ)的含猝滅劑的靶可雜交該磷酸化的鏈。該末端也可被逆轉(zhuǎn)而保留功能性系統(tǒng)。在該雜交構(gòu)象中，所述猝滅劑可被定向于該軛合的聚合物以促進(jìn)超猝滅。因此，在所述猝滅劑標(biāo)記的靶存在下，該聚合物的熒光被猝滅。通過(guò)允許未標(biāo)記的和標(biāo)記的DNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其磷酸化的互補(bǔ)鏈，這類系統(tǒng)很容易聯(lián)想到作為對(duì)未標(biāo)記的DNA的分析。
第二種方法的策略類似于分子指示標(biāo)使用的途徑?？稍O(shè)計(jì)一端為磷酸鹽另一端為猝滅劑的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，使得該寡核苷酸的末端區(qū)互補(bǔ)，并形成雜交莖(hybridized stem)，而該寡核苷酸的中央?yún)^(qū)與靶寡核苷酸互補(bǔ)，而當(dāng)不存在靶時(shí)，形成單鏈環(huán)。這樣的寡核苷酸形成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)利用莖雜交，將所述磷酸鹽和猝滅劑帶至鄰近處。當(dāng)通過(guò)磷酸鹽與金屬的相互作用將所磷酸化的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸與所述金屬-聚合物復(fù)合物結(jié)合時(shí)，因?yàn)樗鲡鐒┒ㄏ驗(yàn)槌蛟摼酆衔?，所以誘導(dǎo)猝滅。如果該磷酸鹽/猝滅劑功能化的寡核苷酸與結(jié)合該發(fā)夾結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的靶雜交，則該環(huán)區(qū)變成可破壞該莖區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的剛性棒。這使所述受體和供體對(duì)被迫分開(kāi)，從而減少所述聚合物的猝滅。
對(duì)蛋白和其它靶的直接分析也可通過(guò)眾多應(yīng)用DAN適體結(jié)合特性的途徑來(lái)進(jìn)行。磷酸化的DNA適體可結(jié)合至金屬包被的軛合的聚合物表面。在所述靶分子的存在下(小尺寸的分子，最多為蛋白大小)，所述寡核苷酸的適體構(gòu)象應(yīng)被穩(wěn)定化(較低的ΔG)。在其選擇的靶不存在的情況下，該適體鏈可具有差的自我結(jié)構(gòu)(self-structure)。如果該適體的自我結(jié)構(gòu)可由猝滅劑標(biāo)記的互補(bǔ)寡核苷酸穿透，則可產(chǎn)生分析。在這樣的分析中，當(dāng)所述適體的靶不存在時(shí)，該互補(bǔ)的寡核苷酸-猝滅劑可雜交該適體。此雜化物可具有上文所列的形式(即，5’-端為磷酸鹽，和3’-端為猝滅劑，或反之亦然)，因此該猝滅劑被定向以猝滅所述軛合的聚合物。在所述適體的靶存在的情況下，該適體的自我結(jié)構(gòu)被穩(wěn)定化，且該寡核苷酸猝滅劑不能夠雜交該適體。因此，在所述適體的靶存在的情況下，所述聚合物發(fā)熒光，而該適體的靶不存在時(shí)，該熒光猝滅。
常規(guī)的磷酸鹽修飾或消耗在任何的包含通過(guò)任一方法與猝滅劑鏈接的磷酸鹽的系統(tǒng)中，通過(guò)化學(xué)方法對(duì)該磷酸鹽進(jìn)行的修飾可將該磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪还δ苄裕虼俗柚沽肆姿猁}-金屬介導(dǎo)的對(duì)金屬-聚合物復(fù)合物的結(jié)合。同樣，該磷酸鹽與其它元素的結(jié)合可阻止該磷酸鹽與金屬聚合物的結(jié)合。在這些情況中，所述猝滅劑不與所述軛合的聚合物協(xié)同定位，并存在熒光。作為一般例子，復(fù)合物A，其包含通過(guò)任一方法與猝滅劑鏈接的磷酸鹽，可猝滅所述金屬聚合物復(fù)合物。如果與分子B共同存在時(shí)，則復(fù)合物A不能夠結(jié)合并猝滅所述金屬聚合物復(fù)合物，其中該分子B對(duì)復(fù)合物A具有親和性，且包含或者化學(xué)修飾或者結(jié)合復(fù)合物A中所包含的磷酸鹽的元素。
應(yīng)用生物素-鏈(BT)軛合物的分析、試劑和試劑盒根據(jù)實(shí)施方案，提供了用于對(duì)靶分析物進(jìn)行分析的試劑盒。該試劑盒包含兩個(gè)分離的組分猝滅劑(Q)和生物素-鏈軛合物(BT)。該BT軛合物的鏈(T)可包括，例如，蛋白或多肽底物。根據(jù)此實(shí)施方案，該鏈通過(guò)與所述靶分析物相互作用并被其修飾獲得了與該猝滅劑結(jié)合的能力，以形成修飾的鏈(T’)。在該鏈的修飾后，由于該BT軛合物與該靶分析物相互作用，接著所修飾的BT軛合物(BT’)與該猝滅劑(Q)結(jié)合，所以形成QT’B生物軛合物。所述試劑盒也可包含熒光劑組分(P)。該熒光劑組分包含多個(gè)結(jié)合的熒光物質(zhì)，該結(jié)合方式使得當(dāng)猝滅劑與熒光劑結(jié)合時(shí)，該猝滅劑能夠擴(kuò)大該熒光劑的超猝滅。該熒光劑可與諸如微球、珠或納米顆粒的固體載體結(jié)合。該固體載體也可包含生物素結(jié)合蛋白，使得該QT’B復(fù)合物上的生物素部分與該固體載體上的生物素結(jié)合蛋白相互作用，導(dǎo)致熒光的超猝滅。
如上所述，所述BT軛合物的鏈可通過(guò)與所述靶分析物的結(jié)合或反應(yīng)被識(shí)別和修飾，而形成所述BT’軛合物。該鏈的修飾使所修飾的BT軛合物(BT’)能夠結(jié)合所述猝滅劑(Q)以形成QT’B復(fù)合物。這一事件序列之后可進(jìn)行所述聚合物熒光的調(diào)節(jié)。特別地，熒光變化可用于指示樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量。此外，在所述BT軛合物與酶或其它靶分析物的特異性結(jié)合或反應(yīng)不存在的情況下，P的熒光不受與該BT軛合物結(jié)合的影響。因此，也提供了應(yīng)用上述猝滅劑(Q)和生物素-鏈軛合物(BT)來(lái)測(cè)定樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法。
根據(jù)實(shí)施方案，所述BT軛合物的鏈(T)與靶分析物的相互作用可導(dǎo)致該鏈上猝滅劑-結(jié)合組分的除去。在此實(shí)施方案中，由于與該分析物的相互作用，該BT軛合物結(jié)合該猝滅劑(Q)的能力被消除以形成修飾的軛合物(BT’)。此外，該事件序列之后可進(jìn)行定量的聚合物熒光的調(diào)節(jié)。在某些實(shí)施方案中，BT與所述靶分析物的反應(yīng)可被催化，導(dǎo)致放大的聚合物熒光調(diào)節(jié)。
根據(jù)另一實(shí)施方案，聚合物超猝滅可通過(guò)金屬離子來(lái)介導(dǎo)。根據(jù)此實(shí)施方案，QT軛合物(其中Q為電子或能量轉(zhuǎn)移猝滅劑及T是反應(yīng)性鏈)可與靶分析物反應(yīng)以引入、修飾或除去該鏈上的功能基。該功能基可以是能夠與金屬離子結(jié)合的功能基，該金屬離子與熒光聚合物結(jié)合或協(xié)同定位(例如，在固體載體的表面)。因此所修飾的QT軛合物(QT’)能夠與包含該熒光聚合物和該金屬離子的整體相結(jié)合。因此，該鏈的修飾導(dǎo)致聚合物熒光的變化。該方法可用于以激酶、磷酸酯酶和其它酶為靶分析物的高靈敏度分析中。
用于翻譯后修飾事件的生物檢測(cè)的基于可修飾鏈的QTB途徑該途徑應(yīng)用合成的生物素化的肽底物或鏈(下文稱為“BT軛合物”)該鏈與靶分析物相互作用后被修飾以形成BT’軛合物。在一實(shí)施方案中，所述BT軛合物不能夠與非熒光的猝滅劑(Q)絡(luò)合，而修飾的軛合物(BT’)易結(jié)合該猝滅劑。這類的相互作用產(chǎn)生熒光“關(guān)閉”分析，在該分析中，所述聚合物熒光隨底物轉(zhuǎn)化的增加而減少。
在另一實(shí)施方案中，所述BT軛合物可易與所述暗猝滅劑(dstkquencher)結(jié)合。但是，在與所述靶分析物相互作用以形成所述修飾的軛合物(BT’)后，該BT軛合物失去結(jié)合的能力。這類相互作用導(dǎo)致熒光“開(kāi)啟”分析。
在另一實(shí)施方案中，上述實(shí)施方案中的猝滅劑也可以是熒光部分。將熒光部分用作猝滅劑可提供熒光的敏化發(fā)射。在所有這些實(shí)施方案中，所述QTB生物軛合物可與聚合物-受體整體形成復(fù)合物，以通過(guò)所述超猝滅過(guò)程有效地調(diào)節(jié)所述聚合物熒光。
在用于翻譯后修飾相互作用的分析中使用的猝滅劑部分包含與所述功能基結(jié)合的特性，當(dāng)非常靠近時(shí)，該功能基在所述底物上被修飾并放大所述軛合聚合物的熒光超猝滅。在一實(shí)施方案中，所述猝滅劑可以是過(guò)渡金屬或諸如鐵(III)亞氨二醋酸(IDA)型螯合物的有機(jī)金屬類，其中該三價(jià)鐵不僅可強(qiáng)烈地與磷酸肽結(jié)合而且通過(guò)電子轉(zhuǎn)移超猝滅所述熒光聚合物。在另一實(shí)施方案中，所述猝滅劑可由兩個(gè)截然不同的部分組成，一個(gè)促進(jìn)該猝滅劑與所修飾的功能基的結(jié)合，另一個(gè)通過(guò)能量轉(zhuǎn)移引起聚合物猝滅。
所述傳感器可包含與固體載體上或溶液中的生物素結(jié)合蛋白協(xié)同定位的軛合的熒光聚合物。該聚合物可以是帶電荷的聚合物、中性聚合物或“虛擬”聚合物，該“虛擬”聚合物包含裝配在非軛合骨架上或諸如珠或納米顆粒的固體載體的帶相反電荷的表面上的熒光染料。
用于激酶和磷酸酯酶的生物檢測(cè)和生物分析的基于可修飾鏈(QT’B)的途徑所述QT’B模式可用于檢測(cè)和定量樣品中的激酶或磷酸酯酶活性。例如，該分析可用于監(jiān)測(cè)諸如PKA的激酶和諸如PTP-1B的磷酸酯酶分別對(duì)生物素化的肽底物的磷酸化和脫磷酸化。QTB模式在激酶或磷酸酯酶活性篩選中的應(yīng)用如圖13所示。
所述QTL傳感器可包含與生物素結(jié)合蛋白協(xié)同定位的、高度熒光的軛合聚合電解質(zhì)，該聚合電解質(zhì)或者包被在如圖13所示的固體載體(例如，微球)表面，或者作為復(fù)合物存在于溶液中。生物素化的肽或公知的由靶激酶(例如，PKA)特異性磷酸化或由靶磷酸酯酶(例如，PTP-1B)特異性脫磷酸化的蛋白底物可用適當(dāng)?shù)拿阜跤囟ǖ臅r(shí)間。
如圖13所示，可將未磷酸化的BT軛合物加入樣品中，并與樣品孵育以監(jiān)測(cè)激酶活性。該軛合物與該樣品孵育后，向該樣品中加入所述聚合物傳感器和猝滅劑，導(dǎo)致聚合物熒光的猝滅。熒光的減少是酶活性的線性函數(shù)。
圖14是應(yīng)用QT’B分析的蛋白激酶A(PKA)活性測(cè)量圖。在圖14中，熒光(RFU)作為PKA濃度(mU/孔)函數(shù)來(lái)繪圖。如圖14所見(jiàn)，PKA濃度的增加導(dǎo)致熒光的減少。
圖15是應(yīng)用全蛋白底物，組蛋白1的蛋白激酶C活性檢測(cè)圖。如圖15所見(jiàn)，與磷酸化的組蛋白底物(1)相比，對(duì)于未磷酸化的組蛋白底物(2)觀察到較低水平的聚合物熒光。
如圖13所示，樣品中磷酸酯酶的活性可通過(guò)將該樣品與磷酸化的BT軛合物孵育來(lái)監(jiān)測(cè)。向所孵育的樣品中加入所述聚合物傳感器和猝滅劑可導(dǎo)致作為PTP-1B活性函數(shù)的聚合物熒光的增加。
圖16是應(yīng)用QT’B分析的蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)活性檢測(cè)圖。在圖16中，熒光(RFU)作為PTP-1B濃度(mU/孔)的函數(shù)來(lái)繪圖。如圖16所見(jiàn)，PTP-1B濃度的增加導(dǎo)致熒光的減少。
對(duì)于PKA激酶活性檢測(cè)，可使用肯普肽肽底物。該底物包含位于N-末端的生物素和可被PKA磷酸化的絲氨酸。
對(duì)于PTP-1B磷酸酯酶活性的檢測(cè)，可使用N-末端有生物素的磷酸化底物。該底物通過(guò)與PTP-1B相互作用發(fā)生脫磷酸化。
不同于FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)分析，在該分析中所述猝滅劑是供體和受體間的等摩爾物。上述QTL激酶和磷酸酯酶分析應(yīng)用出眾的功能性平臺(tái)，該平臺(tái)將已確立的磷酸鹽-金屬絡(luò)合相互作用與電子和能量轉(zhuǎn)移猝滅劑對(duì)軛合聚合物的超猝滅現(xiàn)象組合，導(dǎo)致該熒光信號(hào)的放大，并增強(qiáng)了酶活性測(cè)定的靈敏度。
基于金屬離子介導(dǎo)的聚合物超猝滅的生物分析先前已顯示陰離子軛合的聚合物強(qiáng)烈地與金屬陽(yáng)離子和有機(jī)陽(yáng)離子結(jié)合，有時(shí)會(huì)同時(shí)發(fā)生所述聚合物熒光的猝滅[1，4]。該結(jié)合為庫(kù)侖與疏水性相互作用的結(jié)果。早期的研究表明聚合物和抗衡離子間的結(jié)合可通過(guò)該聚合物與諸如聚苯乙烯微球、硅石和粘土的荷電載體或與其它荷電聚合物的前結(jié)合來(lái)調(diào)控或調(diào)諧[4-6]。
陰離子聚合物，其例子如圖1A所示，可在引起所述聚合物熒光少量改變的方法中，與金屬離子結(jié)合。作為該途徑的例子，具有圖1A所示結(jié)構(gòu)的聚合物首先包被在陽(yáng)離子聚苯乙烯微球上，隨后用Ga3+處理。該過(guò)程如圖17所示。如圖17所見(jiàn)，Ga3+與該聚合物結(jié)合但不猝滅其熒光。由所述固體載體(例如，珠)、所述聚合物和金屬離子(例如Ga3+)組成的整體提供新的傳感器平臺(tái)，該平臺(tái)利用先前證實(shí)的金屬離子結(jié)合有機(jī)磷酸鹽的能力。
金屬離子親和色譜法(IMAC)是磷酸化物質(zhì)純化中的常規(guī)技術(shù)。金屬離子，例如Fe(III)、Ga(III)、Al(III)、Zr(IV)、Sc(III)和Lu(III)(硬路易斯酸)，通過(guò)與共價(jià)連接的亞氨二醋酸(IDA)或次氨基三乙酸(NTA)或其它配體相結(jié)合，可固定在諸如瓊脂糖、瓊脂糖凝膠等等的樹(shù)脂珠表面。結(jié)合的金屬離子可隨后結(jié)合到諸如蛋白或肽的磷酸化物質(zhì)。除IMAC在蛋白分離中的應(yīng)用之外，通過(guò)磷酸化后形成所述磷酸鹽金屬?gòu)?fù)合物來(lái)監(jiān)測(cè)熒光標(biāo)記底物的熒光偏振變化，可將IMAC相關(guān)技術(shù)用作蛋白激酶的傳感模式。
如圖17所示，所述固體載體結(jié)合Ga3+保留了與激酶產(chǎn)生的磷酸化底物(或者由磷酸酯酶脫磷酸化)絡(luò)合的能力。因此該固體載體結(jié)合的Ga3+可用于提供QTL分析的基礎(chǔ)。在所示的實(shí)施例中，所述底物已用猝滅劑來(lái)功能化，當(dāng)該猝滅劑通過(guò)與所述金屬離子的結(jié)合(例如，Ga3+)被帶至所述聚合物鄰近時(shí)，其可通過(guò)能量或電子轉(zhuǎn)移猝滅來(lái)減少所述熒光聚合物的熒光。
示例性傳感模式應(yīng)用具有圖1A所示結(jié)構(gòu)的陰離子聚合電解質(zhì)(下文稱為“PPE”)、0.55μm陽(yáng)離子聚苯乙烯微球、氯化鎵和若丹明標(biāo)記的磷酸肽。圖17中示意性地描述了該傳感模式。
首先通過(guò)水中的沉積作用，將所述陰離子PPE聚合物固定在所述固體載體上(即，0.55μm陽(yáng)離子聚苯乙烯微球)。然后在pH為5.5的水溶液中，用氯化鎵處理該聚合物包被的微球。隨后洗去過(guò)量的Ga3+。
從酶磷酸化反應(yīng)(例如，激酶)、蛋白酶剪切反應(yīng)、或單一的DNA/RAN序列中產(chǎn)生的、或通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)產(chǎn)生的染料標(biāo)記的磷酸化底物可與所述鎵聚合物傳感器結(jié)合并調(diào)節(jié)來(lái)自該聚合物的熒光。
圖18顯示了作為肽底物的磷酸化程度函數(shù)的鎵聚合物傳感器的熒光。在圖18中，相對(duì)熒光作為磷酸化程度(磷酸肽％)的函數(shù)來(lái)繪圖。
圖19顯示了樣品中蛋白激酶A酶水平的實(shí)際動(dòng)力學(xué)分析，在該樣品中，在所述鎵聚合物傳感器的存在下，發(fā)生該酶介導(dǎo)的所述底物磷酸化。圖19中，相對(duì)熒光作為蛋白激酶A(PKA)濃度(mU/Rx)的函數(shù)來(lái)繪圖。
所述熒光變化可以各種方式來(lái)監(jiān)測(cè)。如動(dòng)力學(xué)分析和終點(diǎn)分析，常規(guī)的分析可用于監(jiān)測(cè)酶介導(dǎo)的對(duì)各種底物的反應(yīng)。
QT’B傳感途徑在用于藥物開(kāi)發(fā)的抑制劑篩選中的應(yīng)用在激酶和磷酸酯酶活性分析中，在電子或能量轉(zhuǎn)移猝滅劑存在下，顯示超猝滅的軛合聚合物的應(yīng)用可適用于篩選大化合物庫(kù)，尋找可緩解藥理學(xué)相關(guān)的酶和其它生物分子的作用的藥物。添加公知的酶活性抑制劑將干擾酶與底物的反應(yīng)，因而調(diào)節(jié)在不存在該抑制劑的情況下所見(jiàn)的信號(hào)反應(yīng)。在給定濃度的抑制劑的條件下觀察到的信號(hào)調(diào)節(jié)的范圍，是對(duì)抑制劑的強(qiáng)度的衡量。
該給予QT’B的分析可再各種孔密度的微滴定板上進(jìn)行以加速藥物的開(kāi)發(fā)進(jìn)程。在一實(shí)施方案中，可分別在激酶或磷酸酯酶分析中，對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行篩選，以尋找磷酸化反應(yīng)或脫磷酸化反應(yīng)的抑制。
應(yīng)用生物素化的連接物(BT)和猝滅劑與生物素結(jié)合蛋白的軛合物的分析、試劑和試劑盒如上所述，已開(kāi)發(fā)了與熒光聚合物結(jié)合的QTL生物軛合物，該QTL生物軛合物利用了熒光聚合電解質(zhì)的自我組織能力來(lái)與金屬離子絡(luò)合，其中該熒光聚合電解質(zhì)為溶液中的個(gè)體分子或載體上的組件。因此所絡(luò)合的金屬離子可選擇性地與在包含猝滅劑(Q)的生物軛合物上的配位基(例如，磷酸基)結(jié)合，因而為蛋白、小分子、肽、蛋白酶和寡核苷酸的選擇性檢測(cè)提供了基礎(chǔ)[10-11]。
上述途徑應(yīng)用猝滅劑標(biāo)記的生物軛合物。但是，該生物軛合物，也可以兩步法來(lái)組裝，其中在第一步驟中使生物素化的底物發(fā)生酶學(xué)反應(yīng)，并在第二步驟中，加入包含與猝滅劑連接的生物素結(jié)合蛋白分子(例如，鏈霉抗生物素蛋白)的檢測(cè)分子。加入傳感器時(shí)，發(fā)生磷酸鹽與金屬離子的結(jié)合，且生物素結(jié)合蛋白/猝滅劑軛合物的結(jié)合介導(dǎo)猝滅的發(fā)生。
該“插入式(snap-on)”途徑也可通過(guò)將所述生物素化的底物與鏈霉抗生物素蛋白猝滅劑預(yù)結(jié)合，并使用所裝配的生物軛合物直接與所述酶反應(yīng)來(lái)用于一步分析。但是，該一步插入式分析途徑的用途可折衷分析速度和/和靈敏度。
金屬離子介導(dǎo)的超猝滅聚(苯撐乙炔)(PPE)家族中的軛合聚合物可用附加在芳環(huán)上的各種功能基來(lái)制備。在所用的側(cè)鏈陰離子基中，那些陰離子基示意性地顯示于圖1A中，圖1A顯示了磺酸基聚對(duì)-苯撐乙炔(PPE-Di-COOH)軛合聚合物的分子結(jié)構(gòu)。該聚合物可與水中的陽(yáng)離子微球結(jié)合形成穩(wěn)定的聚合物包衣。所包被的微粒顯示強(qiáng)烈的熒光。在聚合物包被的微球上的總電荷可通過(guò)聚合物的裝填程度和通過(guò)變化該聚合物的結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)諧。
已發(fā)現(xiàn)所述聚合物包被的微球可與金屬陽(yáng)離子結(jié)合，以及金屬陽(yáng)離子的裝填可依賴于該聚合物在該微球上的裝填水平。某些諸如Fe3+和Cu2+的金屬離子可猝滅該聚合物熒光，而其它+諸如Ga3的金屬離子不猝滅熒光。在很少的或無(wú)猝滅發(fā)生的情況下，或金屬離子不存在，非猝滅金屬離子介導(dǎo)微球結(jié)合的聚合物熒光的超猝滅。在所述聚合物包被的微球通過(guò)Ga3+的添加而荷電后，向該懸濁液中加入所述磷酸化的肽，導(dǎo)致該聚合物熒光的顯著猝滅。顯而易見(jiàn)的是所述肽上的磷酸鹽與Ga3+的結(jié)合將所述猝滅劑帶至非常接近所述聚合物處，并介導(dǎo)熒光猝滅。
如下所述，利用所述金屬離子荷電的聚合物對(duì)磷酸化生物分子進(jìn)行聚合物猝滅可在兩步法中完成。圖20示意性地顯示金屬離子介導(dǎo)的超猝滅，以及用于激酶分析的例子，該超猝滅通過(guò)將猝滅劑加入酶反應(yīng)的生物素化底物中來(lái)完成。圖20示意性地表明，可通過(guò)加入QTL傳感器、隨后加入鏈霉抗生物素蛋白-猝滅劑，來(lái)檢測(cè)靶酶對(duì)生物素肽底物的磷酸化或脫磷酸化。所述肽產(chǎn)物可通過(guò)磷酸鹽與Ga3+金屬離子的特異性結(jié)合被帶至所述聚合物的表面。所產(chǎn)生的聚合物熒光的猝滅伴隨著磷酸化或脫磷酸化。
基于金屬離子介導(dǎo)的超猝滅的生物分析-激酶磷酸酯酶分析蛋白質(zhì)的磷酸化和脫磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、分化及細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。酶功能的失?？蓪?dǎo)致諸如癌癥和炎癥的疾病，。超過(guò)500種激酶和磷酸酯酶被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，并成為可能的藥物治療靶點(diǎn)。
已公開(kāi)了通過(guò)使用超猝滅放大熒光信號(hào)從而在酶活性的測(cè)定中顯示出增強(qiáng)的靈敏度的分析方法[10-11]。在這些分析中使用的傳感器平臺(tái)包含修飾的陰離子聚合電解質(zhì)衍生物，其通過(guò)吸附在正電荷微球上來(lái)固定。示例性的修飾的陰離子聚合電解質(zhì)是如圖1A所示的聚(苯撐乙炔)(PPE)的衍生物。如圖示20所示，熒光聚合物超猝滅已適用于激酶/磷酸酯酶活性的檢測(cè)。在溶液中二價(jià)或三價(jià)金屬離子可強(qiáng)烈地與陰離子共軛聚合物結(jié)合，導(dǎo)致聚合物熒光的改變和/或猝滅。由于聚合物-微球整體的總電荷可被調(diào)諧，構(gòu)建整體以提供平臺(tái)，籍此金屬離子可與所述聚合物結(jié)合，而不強(qiáng)烈地猝滅該聚合物熒光，同時(shí)保留與特異性配體絡(luò)合的能力。例如，發(fā)現(xiàn)PPE-結(jié)合的Ga3+也可與磷酸化的肽結(jié)合，因此當(dāng)所述肽包含諸如若丹明的染料時(shí)，發(fā)生金屬離子介導(dǎo)的聚合物超猝滅。在此我們描述了用于檢測(cè)生物素化的肽底物的平臺(tái)的應(yīng)用。
在使用例如閃爍迫近分析(scintillation proximity)(SPA)或鏈霉抗生物素膜載體(SAMs)的應(yīng)用中，需要洗滌步驟來(lái)分離來(lái)自所述反應(yīng)混合物的未結(jié)合的放射性ATP或未結(jié)合的抗磷抗體。為了保留轉(zhuǎn)化的底物，使用生物素化的肽，并通過(guò)鏈霉抗生物素或其它生物素-結(jié)合蛋白來(lái)將其固定在各種基質(zhì)上。如下所述，金屬離子介導(dǎo)的超猝滅可用于篩選激酶對(duì)個(gè)體底物或生物素-肽庫(kù)的活性。此途徑使研究者能夠1)測(cè)試酶突變體的底物特異性；
2)通過(guò)比較磷酸化模式，評(píng)價(jià)專有酶的酶純度；3)監(jiān)測(cè)提供用于激酶的熒光開(kāi)啟(turn-on)分析的增強(qiáng)的發(fā)射；以及4)因此用適當(dāng)?shù)娜玖镶鐒?，使用增?qiáng)的發(fā)射使檢測(cè)紅移以改進(jìn)庫(kù)中可見(jiàn)自發(fā)熒光化合物的篩選。
例如，可將鏈霉抗生物素偶聯(lián)的熒光素猝滅劑加入酶反應(yīng)的生物素化的肽底物中。該途徑為如圖20所示的靈敏的且選擇性的激酶/磷酸酯酶分析提供了基礎(chǔ)。檢測(cè)是瞬間的“混合并讀取”分析，其不需要洗滌步驟或復(fù)雜樣品的制備。
在將生物素化的肽底物與樣品中的酶孵育后，加入猝滅劑和生物素結(jié)合蛋白(例如鏈霉抗生物素)的軛合物，使得其與所孵育的樣品結(jié)合(例如在室溫下15分鐘)。
以下實(shí)施例4表明蛋白激酶A(PKA)的粗略分析方法，以及一步法和兩步法步驟的性能比較。在實(shí)施例4中，激酶分析作為熒光關(guān)閉(turn off)分析。由于作為聚合物熒光猝滅的結(jié)果，猝滅劑可能顯示出敏化熒光，該分析可作用開(kāi)啟(turn on)或關(guān)閉(turn off)分析，這依賴于所監(jiān)測(cè)的波長(zhǎng)。此外，同時(shí)監(jiān)測(cè)所述聚合物和猝滅劑的熒光以提供靈敏的比率分析。
實(shí)施例4-蛋白激酶A(PKA)活性分析以下描述了用作酶底物及磷酸肽校準(zhǔn)物的肽。對(duì)于一步模式的PKA活性檢測(cè)若丹明-LRRASLG SEQ ID NO2及校準(zhǔn)肽若丹明-LRRA(pS)LG SEQ ID NO1是由Anaspec合成的。
對(duì)于兩步模式的PKA活性檢測(cè)，生物素-LRRASLG SEQ ID NO5以及生物素-LRRA(pS)LG SEQ ID NO6購(gòu)自Anaspec。重組PKA購(gòu)自Promega。鏈霉抗生物素-偶合的熒光素得自分子探針(Molecular Probes)。聚苯乙烯功能化的珠得自InterfacialDynarmics。
與兩步法相比，一步法的性能是通過(guò)位于分析緩沖液中的1μM肽(若丹明-肽或生物素-肽)在CRT中反應(yīng)60分鐘來(lái)確定的。對(duì)于兩步法，則是在CRT中加入5μL鏈霉抗生物素-熒光素并孵育15分鐘。最后，加入位于檢測(cè)緩沖液中的15μL傳感器?；旌衔锏臒晒馐褂肧pectraMax GeminiXS平板閱讀器(Molecular Devices，Inc.)在450nm激發(fā)、475nm截止濾光片和490nm發(fā)射以孔掃描模式來(lái)測(cè)定。
如圖示21A及21B所示，分析是通過(guò)使用合成的帶有N端猝滅劑的合成底物，或者使用加入鏈霉抗生物素-熒光素軛合物的生物素化底物來(lái)實(shí)施的。所述所述底物磷酸化時(shí)，肽通過(guò)磷酸基與傳感器結(jié)合并猝滅熒光。
圖21A和21B是在兩步法中，使用若丹明標(biāo)記的底物或生物素化底物的PKA的酶濃度曲線圖。所述分析中產(chǎn)生的RFU如圖21A所示，隨后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得出的磷酸化％如圖21B所示。在圖21A及21B中，在室溫下，在白色384孔透明平板中，1μM濃度的底物用連續(xù)稀釋的激酶PKA酶磷酸化1小時(shí)。孵育后，加入5pmol鏈霉抗生物素-若丹明軛合物并在大約22℃時(shí)孵育15分鐘，隨后加入約100×106QTL傳感器珠，并在22℃時(shí)孵育10分鐘。在22℃時(shí)將所述平板孵育30分鐘，并使用Gemini XS平板閱讀器(Molecular Devices，Inc.)在450nm激發(fā)、490nm發(fā)射和475nm截止濾光片來(lái)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。
實(shí)施例5-用于篩選PKA，PKCα或PTB-IB底物的分析對(duì)于底物篩選，22℃時(shí)將1μM生物素-肽在分析緩沖液中反應(yīng)60分鐘。對(duì)照反應(yīng)不含酶。隨后，加入5μL鏈霉抗生物素-熒光素共軛物，并在約22℃孵育15分鐘。最后，加入15μL位于檢測(cè)緩沖液中的傳感器。所述混合物的熒光使用SpectraMax Gemini XS平板閱讀器(MolecularDevices，Inc.)以孔掃描模式在450nm激發(fā)、475nm截止濾光片和490nm發(fā)射來(lái)測(cè)定。
圖22是表示使用酶PTP-1B、PKCcα和PKA對(duì)用于激酶或者磷酸酯酶的7種不同的生物素化底物進(jìn)行篩選的柱狀圖。反應(yīng)在存在或不存在酶的情況下進(jìn)行，計(jì)算RFU的差別并繪圖。如圖22所示，磷酸化依賴的熒光猝滅只有在包含適當(dāng)?shù)孜锏姆磻?yīng)中被檢測(cè)到，在含有非特異性底物的反應(yīng)中未檢測(cè)出。
根據(jù)實(shí)施方案，用Stern-Volmer猝滅常數(shù)測(cè)定的放大超猝滅的猝滅靈敏度至少為500。根據(jù)另一實(shí)施方案，用Stern-Volmer猝滅常數(shù)測(cè)定的放大超猝滅的猝滅敏感性至少為1000、2000、5000、10,000、100,000或1×106。
示例性熒光劑包括熒光聚合物。示例性熒光聚合物包括發(fā)冷光的軛合材料，例如，諸如聚(對(duì)苯撐乙烯)(PPV)的聚(苯撐乙烯)、聚噻吩、聚苯撐、聚丁二炔(polydiacetylene)(PDA)、聚乙炔(polyacetylene)、聚(對(duì)萘乙烯)、聚(2，5-吡啶乙烯)以及其衍生物，諸如聚(2，5-甲氧基丙基磺酸酯苯乙烯)(MPS-PPV)，聚(2，5-甲氧基丁基磺酸酯苯乙烯)(MBS-PPV)等等。至于水溶性，衍生物可包括一個(gè)或多個(gè)諸如磺酸(酯)鹽以及甲銨的側(cè)離子基。示例性側(cè)基包括-O-(CH2)n-OSO3-(M+)，其中n是整數(shù)(例如，n＝3或4)及M+是陽(yáng)離子(例如，Na+或Li+)；-(CH2)n-OSO3-(M+)，其中n是整數(shù)(例如，n＝3或4)及M+是陽(yáng)離子(例如，Na+或Li+)；-O-(CH2)n-N+(CH3)3(X-)，其中n是整數(shù)(例如，n＝3或4)及X-是陰離子(例如，Cl-)；以及-(CH2)n-N+(CH3)3(X-)其中n是整數(shù)(例如，n＝3或4)及X-是陰離子(例如，Cl-)。
上述說(shuō)明書利用為說(shuō)明目的提供的實(shí)施例，描述了本申請(qǐng)的原理，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)，應(yīng)理解在不偏離本公開(kāi)的實(shí)際范圍的情況下，可作出各種形式和細(xì)節(jié)上的改變。
引用文獻(xiàn)[1]Chen，L.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.1999，96，12287. Chen，L.et al，Chem.Phys.Lett.2000，330，27. Chen，L.et al，J.Am.Chem.Soc.2000，122，9302. Jones，R.M.et al，Langmuir 2000，17，2568. Jones，R.M.et al，J.Am.Chem.Soc.2001，123，6726. Jones，R.M.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.2001，98，14769. Kushon，S.A.et al，Langmuir 2002，18，7245. Lu，L.et al，J.Am.Chem.Soc.2002，124，483. Kumaraswamy，S.etal，Proc.Natl.Acad.Sci.2004，101，7511. Xia，W.etal，Assay and Drug Dev.Techn.，2004，2，183[11]Xia，W.etal，American Laboratory，2004，36，15.
其它文獻(xiàn)Zhou，W.etal，J.Am.Soc.Mass Spectrom 2000，273.
Breuer，W.etal，J.Biol.Chem.1995 270，24209.
Rininsland et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.2004，101，15295.
權(quán)利要求
1.復(fù)合物包含生物素化的多肽，其中所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)磷酸基；以及與所述多肽的磷酸基結(jié)合的金屬陽(yáng)離子。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其中所述金屬陽(yáng)離子是Ga3+。
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其還包含熒光劑；其中所述熒光劑包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基和多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)，使得當(dāng)猝滅劑與所述熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大所述熒光劑的超猝滅，其中所述熒光劑與生物素結(jié)合蛋白結(jié)合；以及其中所述熒光劑的陰離子基與所述金屬陽(yáng)離子結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其中所述熒光劑為熒光聚合物。
5.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其中所述熒光劑為聚(對(duì)-苯撐乙炔)聚合物。
6.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其中所述熒光劑與固體載體的表面相結(jié)合。
7.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合物，其中所述固體載體為微球。
8.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合物，其中所述固體載體包含帶正電荷的表面，且其中所述熒光劑的陰離子基與所述帶正電荷的表面結(jié)合。
9.權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其還包含猝滅劑，其中當(dāng)所述猝滅劑與所述熒光劑結(jié)合時(shí)能夠放大所述熒光劑的超猝滅，且其中所述猝滅劑與所述多肽的磷酸基結(jié)合。
10.如權(quán)利要求9所述的復(fù)合物，其中所述猝滅劑為有機(jī)金屬化合物。
11.如權(quán)利要求10所述的復(fù)合物，其中所述猝滅劑為鐵(III)亞氨二醋酸螯合物。
12.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其中所述熒光劑和所述生物素結(jié)合蛋白與所述固體載體的表面結(jié)合。
13.檢測(cè)樣品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，所述方法包括a)將所述樣品與生物素化的多肽孵育，其中，對(duì)于激酶分析物，所述多肽包含一個(gè)和多個(gè)被所述分析物磷酸化的基團(tuán)，或者，對(duì)于磷酸酯酶分析物，所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)被所述分析物脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所述樣品中加入金屬陽(yáng)離子，其中或者所述金屬陽(yáng)離子是猝滅劑，或者所述方法還包括向所述樣品中加入能與所述金屬陽(yáng)離子結(jié)合的猝滅劑；c)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑與生物素結(jié)合蛋白結(jié)合；d)檢測(cè)熒光，其中所檢測(cè)的熒光表示該樣品中分析物的存在和/或數(shù)量。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述猝滅劑與所述磷酸化的多肽結(jié)合。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多肽包含可被所述分析物磷酸化的基團(tuán)；且其中所述可磷酸化的基團(tuán)的磷酸化導(dǎo)致了熒光的減少。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多肽包含可被所述分析物脫磷酸化的基團(tuán)；且其中所述基團(tuán)的脫磷酸化導(dǎo)致熒光的增加。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述金屬陽(yáng)離子是Ga3+。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述熒光劑為熒光聚合物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述熒光劑為聚(對(duì)-苯撐乙炔)聚合物。
20.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述熒光劑與固體載體的表面結(jié)合。
21.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述熒光劑和所述生物素結(jié)合蛋白與所述固體載體的表面結(jié)合。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述固體載體為微球。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述固體載體包含帶正電荷的表面；其中所述熒光劑包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基團(tuán)；且其中所述熒光劑的陰離子基團(tuán)與所述帶正電荷的表面結(jié)合。
24.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述猝滅劑為有機(jī)金屬化合物。
25.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述猝滅劑為鐵(III)亞氨二醋酸螯合物。
26.如權(quán)利要求13所述的方法，其中在孵育后及檢測(cè)熒光前，將所述熒光劑、所述猝滅劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中。
27.如權(quán)利要求13所述的方法，其中在孵育前或孵育過(guò)程中，將所述熒光劑、所述猝滅劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中，且其中檢測(cè)熒光包括在孵育過(guò)程中檢測(cè)熒光。
28.篩選作為激酶或磷酸酯酶酶活性抑制劑的化合物的方法，所述方法包括a)在所述化合物存在下，在樣品中將生物素化的多肽與激酶或磷酸酯酶孵育，其中，對(duì)于激酶分析，所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被所述分析物磷酸化的基團(tuán)，以及對(duì)于磷酸酯酶分析，所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被所述分析物脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所述樣品中加入金屬陽(yáng)離子，其中或者該金屬陽(yáng)離子是猝滅劑，或者所述方法還包括向所述樣品中加入能與該金屬陽(yáng)離子結(jié)合的猝滅劑；c)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中所述熒光劑與生物素結(jié)合蛋白結(jié)合；以及d)在所述化合物的存在下，檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中在所述化合物的存在下檢測(cè)的熒光量指示了該化合物對(duì)激酶或磷酸酯酶酶活性的抑制作用。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，還包括a)在第二化合物存在下，在第二樣品中將所述生物素化的多肽與所述激酶或磷酸酯酶孵育；b)向所述第二樣品中加入所述熒光劑、所述猝滅劑和所述金屬陽(yáng)離子；c)在所述第二化合物存在下，檢測(cè)來(lái)自所述第二樣品的熒光；其中從所述第二樣品檢測(cè)的熒光量指示所述第二化合物對(duì)激酶或磷酸酯酶酶活性的抑制作用。
30.權(quán)利要求28所述的方法，還包括a)在第二樣品中將所述生物素化的多肽與所述激酶或磷酸酯酶孵育，其中所述第二樣品不含所述化合物；b)向所述第二樣品中加入所述熒光劑、所述猝滅劑和所述金屬陽(yáng)離子；以及c)在所述化合物不存在的情況下，檢測(cè)來(lái)自所述第二樣品的熒光；其中在所述化合物不存在的情況下，所檢測(cè)的來(lái)自所述第二樣品的熒光量為基線熒光。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，還包括將所述化合物存在時(shí)所檢測(cè)的熒光與所述化合物不存在時(shí)所檢測(cè)的基線熒光進(jìn)行比較；其中所述化合物存在時(shí)所檢測(cè)的熒光與所述基線熒光的差別指示所述化合物對(duì)激酶或磷酸酯酶酶活性的抑制作用。
32.生物軛合物，其包含包含一個(gè)或多個(gè)可磷酸化或可脫磷酸化的基團(tuán)的多肽；以及與所述多肽軛合的猝滅部分，其中當(dāng)所述猝滅部分與熒光聚合物結(jié)合時(shí)，所述猝滅部分能夠放大所述熒光聚合物的超猝滅。
33.如權(quán)利要求32所述的生物軛合物，其中所述猝滅部分為若丹明。
34.如權(quán)利要求32所述的生物軛合物，其中所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)。
35.如權(quán)利要求34所述的生物軛合物，其中所述多肽還包含剪切位點(diǎn)，且其中所述猝滅部分和所述磷酸基位于所述剪切位點(diǎn)的相對(duì)側(cè)，且其中在所述剪切位點(diǎn)的與所述猝滅部分軛合的那一側(cè)不存在磷酸基。
36.如權(quán)利要求34所述的生物軛合物，其中所述多肽還包含剪切位點(diǎn)，且其中所述猝滅部分和所述磷酸基位于所述剪切位點(diǎn)的同側(cè)，且其中在所述剪切位點(diǎn)的與所述猝滅部分軛合一側(cè)的相對(duì)側(cè)不存在磷酸基。
37.檢測(cè)樣品中蛋白酶存在和/或數(shù)量的方法，所述方法包括a)將所述樣品與權(quán)利要求35所述的生物軛合物孵育，其中所述蛋白酶在所述剪切位點(diǎn)剪切所述多肽；b)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅部分與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅部分能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光指示所述樣品中蛋白酶的存在和/或數(shù)量。
38.檢測(cè)樣品中激酶或蛋白酶分析物的存在和/或數(shù)量的試劑盒，該試劑盒包括包含權(quán)利要求32所述的生物軛合物的第一組分；和包含熒光劑的第二組分，該熒光劑包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)，使得當(dāng)所述猝滅部分與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述生物軛合物的猝滅部分能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合。
39.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述熒光劑為熒光聚合物。
40.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述熒光劑為聚(對(duì)-苯撐乙炔)聚合物。
41.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述熒光劑與固體載體的表面相結(jié)合。
42.如權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述固體載體為微球。
43.如權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述固體載體包含帶正電荷的表面，且其中所述熒光劑的一個(gè)或多個(gè)陰離子基與所述帶正電荷的表面結(jié)合。
44.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述猝滅部分為若丹明。
45.檢測(cè)樣品中酶分析物存在和/或數(shù)量的方法，所述方法包括a)將所述樣品與權(quán)利要求32所述的生物軛合物孵育，其中所述生物軛合物的多肽包含可被所述酶分析物磷酸化或脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅部分與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅部分能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光指示所述樣品中分析物的存在和/或數(shù)量。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述多肽包含可被所述分析物磷酸化的基團(tuán)，且其中所述多肽的可磷酸化基團(tuán)的磷酸化導(dǎo)致熒光的減少。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述多肽包含可被所述分析物脫磷酸化的基團(tuán)，且其中所述多肽的可脫磷酸化基團(tuán)的脫磷酸化導(dǎo)致熒光的增加。
48.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述金屬陽(yáng)離子是Ga3+。
49.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述熒光劑為熒光聚合物。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述熒光劑為包含陰離子基的聚(對(duì)-苯撐乙炔)聚合物。
51.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述熒光劑與固體載體的表面結(jié)合。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述固體載體為微球。
53.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述固體載體包含帶正電荷的表面，且其中所述熒光聚合物的陰離子基與所述帶正電荷的表面結(jié)合。
54.如權(quán)利要求45所述的方法，其中在孵育后及檢測(cè)熒光前將所述熒光劑加入所述樣品中。
55.如權(quán)利要求45所述的方法，其中在孵育前或孵育過(guò)程中將所述熒光劑加入所述樣品中，且其中檢測(cè)熒光包括在孵育過(guò)程中檢測(cè)熒光。
56.檢測(cè)樣品中分析物存在的試劑盒，其包括包含猝滅劑的第一組分，和包含生物素化的多肽的第二組分，其中該多肽可被所述分析物修飾，且其中被所述分析物修飾的多肽與所述猝滅劑結(jié)合。
57.如權(quán)利要求56所述的試劑盒，其還包含熒光劑，所述熒光劑包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)，使得當(dāng)所述猝滅劑與所述熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大所述熒光劑的超猝滅。
58.如權(quán)利要求57所述的試劑盒，其中所述熒光劑為熒光聚合物。
59.如權(quán)利要求57所述的試劑盒，其中所述熒光聚合物為聚(對(duì)-苯撐乙炔)聚合物。
60.如權(quán)利要求57所述的試劑盒，其中所述熒光劑與固體載體的表面結(jié)合。
61.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述固體載體為微球。
62.如權(quán)利要求56所述的試劑盒，其中所述分析物為酶。
63.如權(quán)利要求62所述的試劑盒，其中所述酶為激酶或磷酸酯酶。
64.如權(quán)利要求62所述的試劑盒，其中所述酶能磷酸化所述多肽底物，且其中所磷酸化的肽底物與所述猝滅劑結(jié)合。
65.如權(quán)利要求56所述的試劑盒，其中所述猝滅劑為有機(jī)金屬化合物。
66.如權(quán)利要求56所述的試劑盒，其中所述猝滅劑為鐵(III)亞氨基二醋酸螯合物。
67.檢測(cè)樣品中磷酸酯酶存在和/或數(shù)量的方法，所述方法包括a)將所述樣品與生物軛合物孵育，該生物軛合物包含與環(huán)磷腺苷或環(huán)磷鳥(niǎo)苷軛合的猝滅劑；b)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光指示所述樣品中磷酸酯酶的存在和/或數(shù)量。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中在孵育后及檢測(cè)熒光前將所述熒光劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中。
69.如權(quán)利要求67所述的方法，其中在孵育前或孵育過(guò)程中將所述熒光劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中，且其中檢測(cè)熒光包括在孵育過(guò)程中檢測(cè)熒光。
70.檢測(cè)多肽底物的激酶酶活性的方法，所述方法包括a)將所述多肽底物和猝滅劑標(biāo)記的包含一個(gè)或多個(gè)可磷酸化基團(tuán)的多肽與包含激酶的樣品孵育；b)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自該樣品的熒光；其中該多肽底物的磷酸化導(dǎo)致熒光的增加；以及其中所檢測(cè)的熒光量指示該多肽底物的激酶活性的存在和/或數(shù)量。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中所述多肽底物為天然蛋白。
72.如權(quán)利要求70所述的方法，其中在孵育后及檢測(cè)熒光前將所述熒光劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中。
73.如權(quán)利要求70所述的方法，其中在孵育前或孵育過(guò)程中將所述熒光劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中，且其中檢測(cè)熒光包括在孵育過(guò)程中檢測(cè)熒光。
74.檢測(cè)樣品中核酸分析物存在和/或數(shù)量的方法，所述分析包括a)將所述樣品與多核苷酸孵育，該多核苷酸包括與位于其第一末端區(qū)的多肽及位于其第二末端區(qū)的磷酸基軛合的猝滅劑，其中至少部分所述多核苷酸的第一末端區(qū)和第二末端區(qū)雜交在一起形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以及其中位于所述末端區(qū)之間的該多核苷酸的中央?yún)^(qū)包含核酸序列，該核酸序列可雜交所述核酸分析物，從而破壞所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致所述猝滅劑與所述多核苷酸的磷酸基的分離；b)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光指示所述樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量。
75.檢測(cè)樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量的方法，所述分析包括a)用猝滅劑標(biāo)記所述樣品中的核酸；b)將所述樣品與多核苷酸孵育，該多核苷酸第一末端區(qū)包含磷酸基，其中該多核苷酸包含可雜交所述核酸分析物的核酸序列；c)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠擴(kuò)大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及d)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所述核酸分析物與所述多核苷酸的雜交導(dǎo)致熒光的減少；且其中所減少的熒光指示所述樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量。
76.檢測(cè)樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量的方法，所述方法包括a)將所述樣品與末端區(qū)包含磷酸基的第一多核苷酸和第二多核苷酸孵育，該第二多核苷酸包含與其末端區(qū)軛合的猝滅劑，其中該第二多核苷酸與所述核酸分析物能雜交所述第一多核苷酸；b)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所述核酸分析物與所述第一多核苷酸的雜交導(dǎo)致熒光的增加；且其中所檢測(cè)的熒光量指示所述樣品中核酸分析物的存在和/或數(shù)量。
77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中所述磷酸基位于所述第一多核苷酸的3’-末端區(qū)，且所述猝滅劑位于所述第二多核苷酸的5’-末端區(qū)，或者所述磷酸基位于所述第一多核苷酸的5’-末端區(qū)，且所述猝滅劑位于所述第二多核苷酸的3’-末端區(qū)。
78.檢測(cè)樣品中多肽分析物的存在和/或數(shù)量的方法，所述分析包括a)將所述樣品與末端區(qū)包含磷酸基的核酸適體和包含猝滅劑的多核苷酸孵育，其中該核酸適體可結(jié)合所述多肽分析物；且其中所述多核苷酸可雜交至所述核酸適體；b)向所述樣品加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基相結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所述多肽分析物與所述核酸適體的結(jié)合導(dǎo)致熒光的增加；且其中所檢測(cè)的熒光量指示所述樣品中多肽分析物的存在和/或數(shù)量。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述磷酸基位于所述核酸適體的3’-末端區(qū)，且所述猝滅劑位于所述多核苷酸的5’-末端區(qū)，或者所述磷酸基位于所述核酸適體的5’-末端區(qū)，且所述猝滅劑位于所述多核苷酸的3’-末端區(qū)。
80.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述多肽分析物為天然蛋白。
81.復(fù)合物，所述復(fù)合物包括包含生物素部分的多肽，其中該多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是可磷酸化或脫磷酸化的；以及與猝滅部分軛合的生物素結(jié)合蛋白；其中所述多肽的生物素部分通過(guò)蛋白-蛋白相互作用與所述生物素結(jié)合蛋白結(jié)合；且其中當(dāng)所述猝滅部分與熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅部分能夠放大所述熒光劑的超猝滅。
82.如權(quán)利要求81所述的復(fù)合物，其中所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)。
83.權(quán)利要求82所述的復(fù)合物，其還包含與所述多肽的磷酸基結(jié)合的金屬陽(yáng)離子。
84.如權(quán)利要求83所述的復(fù)合物，其中所述金屬陽(yáng)離子為Ga3+。
85.權(quán)利要求83所述的復(fù)合物，其還包含熒光劑；其中所述熒光劑包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基和多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)，使得當(dāng)所述猝滅劑與所述熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大所述熒光劑的超猝滅；且其中所述熒光劑的陰離子基與所述金屬陽(yáng)離子結(jié)合。
86.如權(quán)利要求85所述的復(fù)合物，其中所述熒光劑為熒光聚合物。
87.如權(quán)利要求85所述的復(fù)合物，其中所述熒光劑為聚(對(duì)-苯撐乙炔)聚合物。
88.如權(quán)利要求85所述的復(fù)合物，其中所述熒光劑與固體載體的表面結(jié)合。
89.如權(quán)利要求88所述的復(fù)合物，其中所述固體載體為微球。
90.如權(quán)利要求88所述的復(fù)合物，其中所述固體載體包含帶正電荷的表面，且其中所述熒光劑的陰離子基與所述帶正電荷的表面結(jié)合。
91.如權(quán)利要求81所述的復(fù)合物，其中所述生物素結(jié)合蛋白為鏈霉抗生物素蛋白。
92.如權(quán)利要求81所述的復(fù)合物，其中所述猝滅部分為熒光素。
93.檢測(cè)樣品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，所述方法包括a)將所述樣品與權(quán)利要求81所述的復(fù)合物孵育，其中對(duì)于激酶分析物，所述多肽包含一個(gè)和多個(gè)可被所述分析物磷酸化的基團(tuán)，以及，對(duì)于磷酸酯酶分析物，所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被所述分析物脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠放大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及c)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光量指示所述樣品中分析物的存在和/或數(shù)量。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其中在孵育后及檢測(cè)熒光前將所述熒光劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中。
95.如權(quán)利要求93所述的方法，其中在孵育前或孵育過(guò)程中將所述熒光劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中，且其中檢測(cè)熒光包括在孵育過(guò)程中檢測(cè)熒光。
96.檢測(cè)樣品中激酶或磷酸酯酶分析物存在和/或數(shù)量的方法，所述方法包括a)將所述樣品與生物素化的多肽孵育，該多肽包含一個(gè)或多個(gè)可被用于激酶分析物分析的分析物磷酸化的基團(tuán)，或者包含一個(gè)或多個(gè)可被用于磷酸酯酶分析物分析的分析物脫磷酸化的基團(tuán)；b)向所孵育的樣品中加入與猝滅部分軛合的生物素結(jié)合蛋白；c)向所述樣品中加入包含多種彼此結(jié)合的熒光物質(zhì)的熒光劑，使得當(dāng)所述猝滅劑與該熒光劑結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑能夠擴(kuò)大該熒光劑的超猝滅，其中該熒光劑還包含一個(gè)或多個(gè)陰離子基，且其中至少一個(gè)金屬陽(yáng)離子與該熒光劑的陰離子基結(jié)合；以及d)檢測(cè)來(lái)自所述樣品的熒光；其中所檢測(cè)的熒光指示所述樣品中分析物的存在和/或數(shù)量。
97.如權(quán)利要求96所述的方法，其中在孵育后及檢測(cè)熒光前將所述熒光劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中。
98.如權(quán)利要求96所述的方法，其中在孵育前或孵育過(guò)程中將所述熒光劑和所述金屬陽(yáng)離子加入所述樣品中，且其中檢測(cè)熒光包括在孵育過(guò)程中檢測(cè)熒光。
全文摘要
描述了用于激酶、磷酸酯酶和蛋白酶酶活性的試劑和分析，該試劑和分析使用金屬離子－磷酸鹽配體的特異性結(jié)合和熒光聚合物的超猝滅。該分析應(yīng)用肽和蛋白底物，為激酶、磷酸酯酶和蛋白酶酶活性測(cè)定提供了普遍性平臺(tái)。也描述了基于DNA雜交的試劑和分析以及應(yīng)用適體、抗體和其它配體的用于蛋白的試劑和分析。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1894582SQ200480037075
公開(kāi)日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者夏文勝, 弗勞克·里尼斯蘭德, 西瑞蘭姆·庫(kù)馬爾阿斯萬(wàn), 斯圖爾特·庫(kù)順, 盧良德 申請(qǐng)人:Qtl生物系統(tǒng)有限公司