專利名稱：治療哮喘的方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2003年12月24日提交的美國臨時申請序號no.60/532,525以及2004年7月20日提交的美國臨時申請序號no.60/589,415的權(quán)益，通過引用將每個申請的完整內(nèi)容引入這里。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。特別地，發(fā)明涉及哮喘和治療哮喘的方法。哮喘是慢性的呼吸道炎性疾病，特征在于可逆的呼吸道阻塞以及呼吸道過敏(AHR)的反復(fù)發(fā)作?；枷幕颊叩暮粑李l繁過敏并發(fā)炎。當(dāng)哮喘患者與過敏原或者刺激其呼吸道的物質(zhì)接觸時，呼吸道就收縮(即呼吸道壁周圍的肌肉繃緊)，使患者難于呼吸。呼吸道內(nèi)壁開始發(fā)炎，引起粘痰和過敏的其它臨床表現(xiàn)的產(chǎn)生。哮喘的其它臨床表現(xiàn)包括氣短、喘息、咳嗽以及胸緊，可能成為生命威脅或者在某些情形下是致命的。盡管存在聚焦于減少癥狀性支氣管痙攣和肺部炎癥的治療方法，不過人們逐漸認(rèn)識到了長期的呼吸道重塑在加速哮喘患者肺惡化中的作用。呼吸道重塑是指許多病理特征，包括上皮平滑肌和肌成纖維細(xì)胞增生和/或化生、上皮下纖維化以及基質(zhì)沉積。這些過程共同導(dǎo)致致命哮喘情形下最高達(dá)約300％的呼吸道增厚。盡管在闡明哮喘病理生理方面已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，然而這種疾病的流行程度、發(fā)病率和死亡率在過去的二十年間已經(jīng)增加了。最新獲得的數(shù)據(jù)表明在美國有大約2千萬人、全世界有超過1.5億人患有哮喘。在這個十年的前期，在年度基礎(chǔ)上直接歸因于哮喘的，僅僅在美國就有近190萬人急診就診、454,000人住院以及超過4000人死亡。哮喘是由對空氣傳播中的過敏原不適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)而引起的，這是普遍承認(rèn)的。哮喘患者的肺證實了淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、特別是嗜酸性細(xì)胞的強(qiáng)烈浸潤。盡管當(dāng)前的研究已經(jīng)揭示了一些造成在哮喘中觀察到的炎癥的復(fù)雜的細(xì)胞和分子相互作用，不過仍然存在重大的知識缺口。作為研究哮喘原因的結(jié)果，已經(jīng)可以獲得大范圍的各種藥物來治療哮喘癥狀。然而，許多藥物具有各種缺點，使得它們用于治療哮喘并不理想。例如，許多藥物諸如腎上腺素和異丙基腎上腺素僅僅是很短的一段時間內(nèi)減輕哮喘癥狀。其它治療在使用了一段時間后就失效了。此外，一些藥物象皮質(zhì)類固醇具有嚴(yán)重副作用，限制了它們的長期使用。很明顯，既需要對哮喘更多的分子水平的認(rèn)識，也需要更有益的哮喘治療方法。本發(fā)明解決這些需求。
發(fā)明概述本發(fā)明至少部分是基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了蛋白激酶Cθ(PKC-θ)在包括哮喘的呼吸道疾病狀態(tài)中的作用。因此，本發(fā)明提供了用于鑒別對于治療哮喘有用的試劑的方法，用于治療患有哮喘或哮喘樣癥狀的患者的方法，以及不表達(dá)內(nèi)源PKC-θ蛋白的分離的肥大細(xì)胞。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了用于鑒別PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑的方法。該方法包括將PKC-θ蛋白或其功能性片段與測試試劑接觸；并確定測試試劑是否調(diào)節(jié)PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性，其中在存在測試試劑時，PKC-θ蛋白或其功能性片段激酶活性的變化表明是PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑。在某些實施方案中，確定步驟包括比較測試試劑相對于沒有測試試劑的條件下的激酶活性。在一些實施方案中，降低激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制劑。在一些實施方案中，增加激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活劑。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑使PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性降低至少兩倍。在某些實施方案中，PKC-θ蛋白是全長PKC-θ蛋白。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白是全長PKC-θ蛋白的功能性變體。在特定的實施方案中，功能性片段是PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，接觸步驟是通過提供PKC-θ蛋白或其功能性片段與測試試劑的反應(yīng)混合物而實現(xiàn)的。在某些實施方案中，反應(yīng)混合物是在含有選自50mM-100mM、100-150mM、150-200mM和200-250mM以及250-300mM的濃度的NaCl的緩沖液中。在特定的實施方案中，NaCl濃度是250mM。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑對于治療哺乳動物諸如人哮喘是有用的。在一些實施方案中，哮喘是IgE-介導(dǎo)的哮喘。在特定的實施方案中，該方法進(jìn)一步包括在體外或體內(nèi)哮喘模型中評估測試試劑的效力，其中在體外或體內(nèi)哮喘模型中顯示出相對于對照試劑效力增加的測試試劑就被鑒別為對于治療哮喘是有用的。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白或其片段是從原核細(xì)胞諸如細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)獲得的。在一些實施方案中，接觸步驟是在細(xì)胞中實現(xiàn)的。在某些實施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性是PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1選自695位絲氨酸殘基、685位絲氨酸殘基、538位蘇氨酸殘基和536位蘇氨酸殘基的氨基酸殘基上。在特定的實施方案中，自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1的538位蘇氨酸殘基上。在一些實施方案中，該方法包括將PKC-θ蛋白或其功能性片段與測試試劑以及PKC-θ底物相接觸。在某些實施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性是PKC-θ底物的磷酸化。在一些實施方案中，PKC-θ底物含有R-X-X-S基序或者R-X-X-T基序，其中R是精氨酸，X可以是未知氨基酸或者可以是任何氨基酸，S是絲氨酸，T是蘇氨酸。例如，PKC-θ底物可以具有選自如下的氨基酸序列(基于通用的單字母氨基酸代碼)KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)，F(xiàn)ARKGSLRQ(SEQ ID NO15)，KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO16)，QKRPSQRSKYL(SEQ IDNO17)，KIQASFRGHMA(SEQ ID NO18)，LSRTLSVAAKK(SEQID NO19)，AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)，VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)，KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)，PKRPGSVHRTP(SEQ ID NO23)，ATFKKTFKHLL(SEQ IDNO24)，SPLRHSFQKQQ(SEQ ID NO25)，KFRTPSFLKKS(SEQID NO26)，IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)，KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)，RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)，MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)，QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)，RGFLRSASLGR(SEQ ID NO32)，ETKKQSFKQTG(SEQ IDNO33)，DIKRLTPRFTL(SEQ ID NO34)，APKRGSILSKP(SEQID NO35)，MYHNSSQKRH(SEQ ID NO36)，MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)，TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)，LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)，ITRKRSGEAAV(SEQ IDNO40)，EEPVLTLVDEA(SEQ ID NO41)，SQKRPSQRHGS(SEQID NO42)，KPFKLSGLSFK(SEQ ID NO43)，AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)，ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)，VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)，KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)，WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)，GTFRSSIRRLS(SEQ IDNO49)，RVVGGSLRGAQ(SEQ ID NO50)，LRQLRSPRRTQ(SEQID NO51)，KTRKISQSAQT(SEQ ID NO52)，NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)，SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)，NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)，RLRRLTAREAA(SEQ IDNO56)，NKRRGSVPILR(SEQ ID NO57)，GKRRPSRLVAL(SEQID NO58)，QKKRVSMILQS(SEQ ID NO59)，和RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段在細(xì)胞中，諸如肥大細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞中。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于鑒別PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑的方法，包括將表達(dá)PKC-θ蛋白或其功能性片段的細(xì)胞與測試試劑接觸并確定測試試劑是否減少細(xì)胞中的功能性PKC-θ蛋白的量，其中減少細(xì)胞中的功能性PKC-θ蛋白的量的測試試劑就被鑒別為PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑對于治療哺乳動物諸如人哮喘是有用的。在一些實施方案中，哮喘是IgE-介導(dǎo)的哮喘。在特定的實施方案中，該方法進(jìn)一步包括在體外或體內(nèi)哮喘模型中評估測試試劑的效力，其中在體外或體內(nèi)哮喘模型中顯示出相對于對照試劑效力增加的測試試劑就被鑒別為對于治療哮喘是有用的。在一些實施方案中，試劑減少了編碼功能性PKC-θ蛋白的核酸分子在細(xì)胞中的表達(dá)。在特定實施方案中，哮喘是IgE-介導(dǎo)的哮喘。在一些實施方案中，哺乳動物是人。在某些實施方案中，功能性PKC-θ蛋白在細(xì)胞中，諸如肥大細(xì)胞或者CD4+T細(xì)胞(如TH2T細(xì)胞)中。在某些實施方案中，試劑減少了編碼功能性PKC-θ蛋白的RNA的量。在一些實施方案中，試劑抑制了編碼功能性PKC-θ蛋白的RNA的翻譯。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于鑒別對于治療哺乳動物哮喘有用的試劑的方法，包括將可操作地連接到PKC-θ啟動子的編碼報道基因產(chǎn)物的核苷酸序列與測試試劑接觸，并確定測試試劑是否減少了報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，其中減少報道基因產(chǎn)物產(chǎn)生的試劑就被鑒別為對于治療哮喘有用的試劑。在某些實施方案中，可操作地連接到PKC-θ啟動子的編碼報道基因產(chǎn)物的核苷酸序列是在細(xì)胞(如肥大細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞)中的。在一些實施方案中，肥大細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)源PKC-θ蛋白。在某些實施方案中，報道基因產(chǎn)物是熒光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、堿性磷酸酶或者綠色熒光蛋白。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于鑒別PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑的方法。該方法包括將表達(dá)PKC-θ蛋白或其功能性片段的細(xì)胞與測試試劑相接觸；確定測試試劑是否減少了PKC-θ蛋白或其功能性片段在細(xì)胞中的自身磷酸化，其中減少了PKC-θ蛋白或其功能性片段自身磷酸化的測試試劑就被鑒別為PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑。在一些實施方案中，確定步驟包括比較測試試劑相對于沒有測試試劑的條件下的激酶活性。在一些實施方案中，降低激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制劑。在一些實施方案中，增加激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活劑。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑使PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性降低至少兩倍。在某些實施方案中，PKC-θ蛋白是全長PKC-θ蛋白。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白是全長PKC-θ蛋白的功能性變體。在一些實施方案中，功能性片段是PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑對于治療哺乳動物諸如人哮喘是有用的。在一些實施方案中，哮喘是IgE-介導(dǎo)的哮喘。在特定實施方案中，該方法進(jìn)一步包括在體外或體內(nèi)哮喘模型中評估測試試劑的效力，其中在體外或體內(nèi)哮喘模型中顯示出相對于對照試劑效力增加的測試試劑就被鑒別為對于治療哮喘是有用的。在一些實施方案中，細(xì)胞是原核細(xì)胞，諸如細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1選自695位絲氨酸殘基、685位絲氨酸殘基、538位蘇氨酸殘基和536位蘇氨酸殘基的氨基酸殘基上。還有另一方面，發(fā)明公開了用于治療哮喘的方法，包括給患有哮喘或患有哮喘癥狀的哺乳動物施用降低PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性或者減少功能性PKC-θ蛋白產(chǎn)生的試劑。在一些實施方案中，試劑是與藥學(xué)可接受的載體一起施用的。在一些實施方案中，載體是氣霧劑形式。在發(fā)明方法的某些實施方案中，試劑是通過靜脈內(nèi)、口服、經(jīng)皮和/或肌肉內(nèi)途徑施用的。在特定實施方案中，試劑是經(jīng)吸入施用的。在一些實施方案中，哮喘是IgE-介導(dǎo)的哮喘。在一些實施方案中，試劑是與藥物共施用的，藥物可以是β-腎上腺素能試劑、茶堿化合物、皮質(zhì)類固醇、抗膽堿能劑、抗組胺劑、鈣通道阻斷劑、色甘酸鈉、或者它們的組合。在特定實施方案中，試劑是特異性結(jié)合PKC-θ蛋白或其片段的抗體。在一些實施方案中，抗體是多克隆抗體。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，測試試劑是核酸分子。在某些實施方案中，核酸分子是核糖核酸分子。在一些實施方案中，核糖核酸分子包括與SEQ ID NO3所述核苷酸序列的部分互補(bǔ)的核苷酸序列。在某些實施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性是PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1選自695位絲氨酸殘基、685位絲氨酸殘基、538位蘇氨酸殘基和536位蘇氨酸殘基的氨基酸殘基上。在某些實施方案中，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性是PKC-θ底物的磷酸化。在一些實施方案中，PKC-θ底物含有R-X-X-S基序或者R-X-X-T基序，其中R是精氨酸，X是未知的或任何已知的氨基酸，S是絲氨酸，T是蘇氨酸。例如，PKC-θ底物可以具有選自如下的氨基酸序列(基于通用的單字母氨基酸代碼)KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)，F(xiàn)ARKGSLRQ(SEQ ID NO15)，KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO16)，QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)，KIQASFRGHMA(SEQ IDNO18)，LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)，AKIQASFRGHM(SEQID NO20)，VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)，KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)，PKRPGSVHRTP(SEQ ID NO23)，ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)，SPLRHSFQKQQ(SEQ IDNO25)，KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)，IYRASYYRKGG(SEQID NO27)，KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)，RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)，MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)，QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)，RGFLRSASLGR(SEQ ID NO32)，ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)，DIKRLTPRFTL(SEQ IDNO34)，APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)，MYHNSSQKRH(SEQID NO36)，MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)，TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)，LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)，ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)，EEPVLTLVDEA(SEQ IDNO41)，SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)，KPFKLSGLSFK(SEQID NO43)，AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)，ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)，VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)，KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)，WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)，GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)，RVVGGSLRGAQ(SEQ IDNO50)，LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)，KTRKISQSAQT(SEQID NO52)，NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)，SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)，NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)，RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)，NKRRGSVPILR(SEQ IDNO57)，GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)，QKKRVSMILQS(SEQID NO59)，和RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)。在進(jìn)一步的方面，發(fā)明提供了不表達(dá)內(nèi)源PKC-θ蛋白的分離的肥大細(xì)胞。在一些實施方案中，細(xì)胞表達(dá)外源PKC-θ蛋白或其片段。本發(fā)明的這些以及其它的方面、實施方案以及優(yōu)點從這里的描述來看將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1A-1C是Western印跡分析的照片圖，圖示了TCR共刺激人T細(xì)胞時的PKC-θ膜易位以及可誘導(dǎo)的激活環(huán)磷酸化。圖2A-2C是照片(圖2A和2C)和圖片(圖2B)，顯示了PKC-θ激活環(huán)的自身磷酸化是細(xì)胞中的激酶活性所必需的。圖3A-3D是顯示PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域(PKC-θKD)自身磷酸化特征的示意圖(圖3A)，如通過質(zhì)譜分析所確定的，肽NFpSFMNPGMER(SEQ ID NO64；其中pS表示絲氨酸是被磷酸化的；跨越位置693-703)的產(chǎn)物離子譜在m/z 705.52(圖3B)，肽ALINpSMDQNMFR(SEQ ID NO65；跨越位置681-692)在m/z 760.48(圖3C)，肽TNTFCGTPDYIAPEILLGQK(SEQ ID NO66；跨越位置536-555)在m/z 1159.71(圖3D)。注意在圖3D中，被碘乙酰胺烷基化的半胱氨酸用#表示。圖4A-4C是用抗-pT538PKC-θ免疫印跡(圖4A)以及抗His免疫印跡(圖4B)，對所示PKC-θKD蛋白和突變體的大腸桿菌裂解產(chǎn)物的Western印跡分析以證實等效表達(dá)，以及顯示所示PKC-θKD蛋白和突變體的體外裂解活性的圖表(圖4C)。圖5A-5D為系列圖表，顯示了在100mM NaCl時截距對1/[肽1]重作圖(圖5A)；在100mM NaCl時斜率對1/[肽1]重作圖(圖5B)；在625mM NaCl時截距對1/[肽1]重作圖(圖5C)；在625mMNaCl時斜率對1/[肽1]重作圖(圖5D)。圖6A-6C是顯示PKC-θKD的動力學(xué)表現(xiàn)可能的各種機(jī)制的系列示意圖。圖6A顯示了順序有序機(jī)制，由此ADP是最后釋放的產(chǎn)物；圖6B顯示了動力學(xué)機(jī)制，由此ADP是最后釋放的產(chǎn)物；圖6C顯示了隨機(jī)機(jī)制。在圖6A-6C中，“E”代表酶，“A”代表底物A，“B”代表底物B，“P”代表產(chǎn)物P，“Q”代表產(chǎn)物Q。圖7A-7D顯示了溶劑粘度對PKC-θKD的kcat(圖7A和7C)以及kcat/Km(圖7B和7D)的影響。圖7A顯示了在ATP保持在2.0mM時用不同的肽1影響kcat。圖7B顯示了ATP保持在0.125mM時，肽1的kcat/Km。圖7C顯示了在ATP保持在2.0mM時用不同的肽3影響kcat。圖7D顯示了在ATP保持在2.0mM時肽3的kcat/Km。空心圓符號(○)表示在增加的蔗糖中的100mM NaCl；空心倒三角符號()表示在增加的蔗糖中的250mM NaCl；實心圓符號(●)表示在增加的Ficoll 400中的100mM NaCl；實心倒三角符號()表示在增加的Ficoll 400中的250mM NaCl。圖7A-7D中的虛線表示斜率1。圖8是顯示抑制性底物可能干擾PKC-θKD催化活性的不同機(jī)制的示意圖。在圖8中，“E”代表酶，“A”代表底物A，“B”代表底物B，“P”代表產(chǎn)物P，“Q”代表產(chǎn)物Q。圖9A-9B圖示了能夠鑒別PKC-θ的幾種肽底物序列的肽陣列(圖9A)以及鑒別出被PKC-θ磷酸化的肽(圖9B)。圖10A-10B是Western印跡分析的照片圖，顯示PKC-θ激活環(huán)在IgE受體交聯(lián)到骨髓衍生的肥大細(xì)胞(BMMC)上時被可誘導(dǎo)地磷酸化。圖11A-11C是IgE受體交聯(lián)的BMMC的膜級分(圖11A)、去污劑不溶級分(DI)(圖11B)以及完整細(xì)胞提取物(WCE)(圖11C)的Western印跡分析的照片圖，證明在IgE受體刺激的BMMC中的PKC-θ膜易位。圖12A-12B是Western印跡分析的照片圖，證實了在IgE受體交聯(lián)到BMMC上時，PKC-δ(圖12A)和PKC-β(圖12B)的分布沒有被明顯改變。圖13A-13B是組織學(xué)(圖13A)和圖解(圖13B)圖，例證了PKC-θ敲除小鼠的BMMC含有比野生型小鼠的BMMC更少的顆粒。圖13B顯示了細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(MFI)作為時間的函數(shù)或者作為DNP-BSA濃度的函數(shù)。圖14A-14B是圖解圖，證實了PKC-θ敲除小鼠的腹膜肥大細(xì)胞具有比野生型小鼠更低水平的細(xì)胞表面IgE(圖14A)，但是具有類似水平的細(xì)胞表面ckit(圖14B)。p值由t-檢驗確定。圖15A-15C是圖解圖，證實了PKC-θ敲除小鼠與野生型小鼠相比具有降低水平的血清IgE(圖15A)和IgG1(圖15B)，但是具有增加水平的IgA(圖15C)。p值由t-檢驗確定。圖16A-16C是圖解圖，表明在IgE受體交聯(lián)后，源自PKC-θ敲除小鼠的BMMC中下列細(xì)胞因子的產(chǎn)生不足TNF-α(圖16A)、IL-13(圖16B)和IL-6(圖16C)。圖17A-17B是圖解圖，顯示出PKC-θ敲除小鼠的靜息CD4+T細(xì)胞、TH1細(xì)胞和TH2細(xì)胞在缺少IL-2以及存在0.5μg/ml抗-CD3的條件下培養(yǎng)后顯示了降低水平的IL-4(圖17A)和IL-5(圖17B)。圖18是圖解圖，證明PKC-θ敲除小鼠在下面實施例7描述的對抗-IgE應(yīng)答的被動皮膚過敏反應(yīng)(PCA)模型中沒有耳腫的增加。耳腫表示為自基線的Δ變化。統(tǒng)計分析是使用斯氏不配對t檢驗來確定的。顯示的P值將野生型與PKC-θ敲除動物相比較。圖19是圖解圖，證明PKC-θ敲除小鼠在下面描述的存在外源IgE的被動皮膚過敏反應(yīng)(PCA)模型中沒有耳腫的增加。耳腫表達(dá)為自基線的Δ變化。統(tǒng)計分析是使用斯氏不配對t檢驗來確定的。顯示的p值將野生型與PKC-θ敲除動物相比較。圖20A-20D是直方圖，顯示出PKC-θ敲除小鼠的TH1和TH2T細(xì)胞都顯示了與PKC-θ野生型小鼠的TH1和TH2T細(xì)胞相比對抗-CD3刺激(0.5μg/ml)的增殖降低。PKC-θ野生型小鼠(淺灰條)或者PKC-θ敲除小鼠(深灰條)的TH0、TH1或TH2細(xì)胞另外用抗-CD28(圖20A)、抗-CD28加上IL-2(圖20B)、不用抗-CD28且不用IL-2(圖20C)以及在沒有抗-CD28時用IL-2(圖20D)刺激。圖21A-21D是直方圖，顯示出PKC-θ敲除小鼠的TH1和TH2T細(xì)胞都顯示了與PKC-θ野生型小鼠的TH1和TH2T細(xì)胞相比對抗-CD3刺激(0.05μg/ml)的增殖降低。PKC-θ野生型小鼠(淺灰條)或者PKC-θ敲除小鼠(深灰條)的TH0、TH1或TH2細(xì)胞另外用抗-CD28(圖21A)、抗-CD28加上IL-2(圖21B)、不用抗-CD28且不用IL-2(圖21C)以及在沒有抗-CD28時用IL-2(圖21D)刺激。
優(yōu)選實施方案的描述發(fā)明是基于調(diào)節(jié)蛋白激酶Cθ(PKC-θ)的試劑或調(diào)節(jié)功能性PKC-θ蛋白的量的試劑對于治療哮喘有用的發(fā)現(xiàn)。這里提出的新發(fā)現(xiàn)支持了將降低PKC-θ催化活性或降低功能性PKC-θ蛋白的量的試劑作為靶向過敏和哮喘的肥大細(xì)胞的用途。為了增進(jìn)對發(fā)明原理的理解，現(xiàn)在將提及優(yōu)選實施方案，并將使用具體語言來描述它們。不過要明白的是，并不因此打算限制發(fā)明范圍，發(fā)明的這些改變和進(jìn)一步的修正、以及如這里所圖解的發(fā)明原理的這些進(jìn)一步應(yīng)用，對于發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將被預(yù)期為是正常發(fā)生的。這里引用的專利和科學(xué)文獻(xiàn)確立了本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的知識。這里引用的已授權(quán)美國專利、允許授權(quán)的申請、公布的申請(美國和外國)以及參考文獻(xiàn)包括GenBank數(shù)據(jù)庫序列通過引用而引入，如同每種都具體并單獨顯示通過引用而被引入的同樣程度。PKC-θ是不依賴Ca+2的PKCs新類別的成員。它在T細(xì)胞和肌肉中高表達(dá)。如這里所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PKC-θ蛋白在呼吸道疾病諸如哮喘中起作用，并與例如誘導(dǎo)與哮喘有關(guān)的癥狀和/或并發(fā)癥有關(guān)，包括例如包括IgE-介導(dǎo)哮喘的過敏性哮喘；非過敏性哮喘、職業(yè)性哮喘以及藥物誘導(dǎo)的哮喘?；谶@里提出的發(fā)現(xiàn)，發(fā)明提供了鑒別治療哮喘的試劑的方法，以及提供了通過給哺乳動物施用治療有效量的調(diào)節(jié)(如通過抑制或增強(qiáng))PKC-θ產(chǎn)生和/或激酶活性的試劑來治療哮喘的方法。此外，發(fā)明提供了缺少內(nèi)源PKC-θ蛋白表達(dá)的分離的肥大細(xì)胞。一方面，發(fā)明提供了用于鑒別PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑的方法。該方法包括將PKC-θ蛋白或其功能性片段與測試試劑相接觸；并確定測試試劑是否抑制PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性。降低PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性的測試試劑就被鑒別為PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑。如這里所使用的，“測試試劑”是化學(xué)品(如有機(jī)物或無機(jī)物)、小分子化合物、核酸分子、肽或蛋白質(zhì)，諸如激素、抗體，和/或它們的部分。由“PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑”表示的是能夠調(diào)節(jié)——要么增加要么降低——PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性的試劑，或者能夠調(diào)節(jié)功能性PKC-θ蛋白的量(如通過轉(zhuǎn)錄或翻譯)的試劑。在一些實施方案中，降低激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制劑。在一些實施方案中，增加激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活劑。在發(fā)明的一種形式中，用于鑒別PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑的方法包括將PKC-θ蛋白或其功能性片段與測試試劑相接觸，并檢測PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化變化(如SEQ ID NO1中下列殘基的磷酸化的變化695位的絲氨酸，685位的絲氨酸，538位的蘇氨酸，536位的蘇氨酸)。在替代形式中，該方法包括將PKC-θ蛋白或其功能性片段與測試試劑和PKC-θ底物相接觸，并檢測PKC-θ底物的磷酸化變化。測試試劑是一種被認(rèn)為有效調(diào)節(jié)(即抑制或增加)PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性、或者功能性PKC-θ蛋白的量(例如通過改變編碼功能性PKC-θ蛋白的RNA或DNA的量)的試劑。在某些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑使PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性降低至少兩倍。在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑使PKC-θ蛋白或其功能性片段的PKC-θ蛋白激酶活性降低至少四倍或至少十倍。在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑消除了PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性。PKC-θ蛋白激酶活性可被定量，例如使用下面描述的諸如體外激酶分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在發(fā)明的另一種非限制性實施方案中，功能性PKC-θ蛋白的量被PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑降低。如這里使用的，“功能性”的意思是正常起作用的PKC-θ蛋白或其片段(例如具有與野生型PKC-θ蛋白同樣的激酶活性)。確定PKC-θ蛋白或其片段是否是功能性的，可由普通熟練的生物學(xué)家很容易進(jìn)行。用于確定所述PKC-θ蛋白或其片段是否是功能性的一種非限制性的方法是，在標(biāo)準(zhǔn)蛋白激酶分析(參見例如Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork，New York(1995，到2003年為止加入了隨后的更新))中比較所述PKC-θ蛋白或其片段與野生型PKC-θ蛋白或野生型PKC-θ片段，激酶分析在下面的實施例中描述。PKC-θ蛋白功能性片段的一種非限制性例子是PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域。如下面實施例(特別是實施例3)中所述，PKC-θ蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域(也稱為“PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域”或者簡稱“PKC-θKD”)令人驚訝地能夠自身磷酸化。這是令人驚訝的，因為已知該類別中的其它酶不會自身磷酸化。如所使用的，術(shù)語“PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域”是指PKC-θ蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域，其包括跨越大約氨基酸殘基362到大約氨基酸殘基706的蛋白質(zhì)部分。在一些實施方案中，發(fā)明的PKC-θKD具有SEQID NO61中提供的氨基酸序列。在一些實施方案中，發(fā)明的PKC-θKD具有SEQ ID NO62中提供的氨基酸序列(注意SEQ ID NO62的頭兩個N-末端氨基酸殘基甲硫氨酸和甘氨酸是為了便于PKC-θKD片段的表達(dá)，但是并不出現(xiàn)在全長PKC-θ蛋白中)。在一些實施方案中，發(fā)明的PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域是在原核細(xì)胞中表達(dá)的，諸如細(xì)菌，諸如大腸桿菌。在一些實施方案中，PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域在下列一個或多個氨基酸殘基上被磷酸化(例如通過自身磷酸化)SEQ ID NO1的695位的絲氨酸，685位的絲氨酸，538位的蘇氨酸和536位的蘇氨酸。在某些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑使功能性PKC-θ蛋白的量降低至少兩倍。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑使功能性PKC-θ蛋白的量降低了至少四倍。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑使功能性PKC-θ蛋白的量降低了至少十倍。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑消除了功能性PKC-θ蛋白的量。功能性PKC-θ蛋白的水平可被定量，例如使用下面描述的諸如Western印跡分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在進(jìn)一步的方面，發(fā)明提供了另一種用于鑒別PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑的方法，包括將含有功能性PKC-θ蛋白或其功能性片段的細(xì)胞與測試試劑相接觸，確定測試試劑是否降低了功能性PKC-θ蛋白或其功能性片段在細(xì)胞中的量，其中降低功能性PKC-θ蛋白或其功能性片段在細(xì)胞中的量的測試試劑就被鑒別為PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑。這些PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑可以在例如轉(zhuǎn)錄或翻譯水平起作用。在某些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑對于治療哺乳動物諸如人呼吸系統(tǒng)疾病是有用的。呼吸系統(tǒng)疾病包括但不限于哮喘(如過敏性哮喘或非過敏性哮喘)；支氣管炎(如慢性支氣管炎)；慢性阻塞性肺病(COPD)(如肺氣腫)；涉及呼吸道炎癥、嗜酸性細(xì)胞增多、纖維化和過量粘液產(chǎn)生、例如囊性纖維化、肺纖維化以及過敏性鼻炎的狀況。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑對于治療特應(yīng)性疾病是有用的?！疤貞?yīng)性”是指經(jīng)常具有發(fā)生過敏反應(yīng)遺傳傾向的一組疾病。特應(yīng)性病癥的非限制性例子包括過敏、過敏性鼻炎(枯草熱，其癥狀包括發(fā)癢、流鼻涕、打噴嚏、或者鼻塞、以及眼發(fā)癢)、特應(yīng)性皮炎(通常也稱為濕疹；影響皮膚的慢性病)、哮喘以及枯草熱。在特定實施方案中，PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑對于治療哺乳動物諸如人哮喘是有用的。如這里使用的“哮喘”是指以持續(xù)性的或者陣發(fā)性的困難呼吸為標(biāo)志的病癥，伴隨著喘息、胸緊的感覺、以及經(jīng)常的咳嗽或喘息的發(fā)作。任何的或所有的這些癥狀被包括為“哮喘癥狀”。如這里使用的，“哮喘”包括但不限于非過敏性哮喘(也稱為內(nèi)因性的或非特應(yīng)性的哮喘)、過敏性哮喘(也稱為外因性的或特應(yīng)性的哮喘)、非過敏性和過敏性哮喘的結(jié)合、運動誘發(fā)性哮喘(也稱為混合哮喘)、藥物誘導(dǎo)的哮喘、職業(yè)性哮喘、以及晚期哮喘。外因性的或過敏性的哮喘包括由例如過敏原、諸如花粉、孢子、草或野草、寵物毛屑、灰塵、螨等引起的或者與之相關(guān)的事件。由于過敏原和其它刺激物在全年的不同點出現(xiàn)，這些類型的事件也被稱為季節(jié)性哮喘。外因性哮喘類也包括支氣管哮喘和過敏性支氣管肺曲霉病。哮喘是與間歇性呼吸道疾病癥狀諸如支氣管過敏和可逆轉(zhuǎn)的氣流阻塞有關(guān)的表型異質(zhì)性病癥。哮喘的免疫組織病理學(xué)特征包括例如呼吸道上皮裸露、基底膜下的膠原沉積；水腫；肥大細(xì)胞激活；以及炎性細(xì)胞浸潤(例如通過中性白細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞)。呼吸道炎癥可能進(jìn)一步歸因于呼吸道過敏、氣流受限、急性支氣管收縮、粘液堵塞的形成、呼吸道壁重塑、以及其它呼吸道疾病癥狀。可由本方法治療或減輕的哮喘包括由傳染劑引起的那些，所述傳染劑諸如病毒(如感冒和流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副粘病毒、鼻病毒和流感病毒。RSV、鼻病毒和流感病毒感染在兒童中很普遍，是嬰兒和少年兒童呼吸道疾病的一種最主要原因?；疾《拘约?xì)支氣管炎的兒童可能發(fā)展為慢性喘息和哮喘，其能夠使用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。也包括可能在一些哮喘患者中由鍛煉和/或冷空氣引起的哮喘狀況。本發(fā)明的方法對于與煙暴露(如香煙誘導(dǎo)的或工業(yè)煙霧)以及工業(yè)和職業(yè)暴露，諸如煙、臭氧、毒氣、二氧化硫、氧化亞氮、煙塵，包括來自涂料、塑料、聚氨酯、清漆等的異氰酸鹽，木頭、植物或其它有機(jī)灰塵等相關(guān)的哮喘是有用的。該方法對于與食品添加劑、防腐劑或藥理劑相關(guān)的哮喘事件也是有用的。本發(fā)明的方法對于治療、抑制或減輕各種被稱為沉默哮喘或咳嗽變異型哮喘的哮喘也是有用的。此外，本發(fā)明的方法對于治療和減輕與能夠刺激支氣管收縮的胃食管反流(GERD)相關(guān)的哮喘是有用的。在一些實施方案中，哮喘是IgE-介導(dǎo)的哮喘。在特定實施方案中，該方法進(jìn)一步包括在體外或體內(nèi)哮喘模型中評估測試試劑的效力，其中在體外或體內(nèi)哮喘模型中顯示出相對于對照試劑效力增加的測試試劑就被鑒別為對于治療哮喘是有用的。各種哮喘模型是現(xiàn)有技術(shù)已知的。例如Soler et al.，J.Appl.Physiol.70(2)617-23(1991)以及Long et al.，J.Appl.Physiol.69(2)584-590(1990)描述了用于綿羊支氣管收縮的模型。綿羊?qū)紫x寄生蟲豬蛔蟲(Ascaris suum)是天然致敏的。在用豬蛔蟲抗原吸入攻擊后，動物經(jīng)受了早期和晚期支氣管收縮反應(yīng)，類似于哮喘患者暴露于致敏過敏原時的反應(yīng)?；紫x攻擊也誘導(dǎo)了綿羊的呼吸道過敏，其在用膽堿能激動劑碳酰膽堿攻擊后作為肺阻力的增加而被測定。碳酰膽堿的劑量需要引起蛔蟲在攻擊后24小時降低的特定應(yīng)答，這是呼吸道過敏的標(biāo)志。Bischof et al.(Clin.Exp.Allergy 33(3)367-75(2003))描述了用于綿羊過敏性哮喘的模型，其中皮下免疫了溶解的屋塵螨提取物的綿羊隨后用屋塵螨進(jìn)行單次支氣管攻擊。在該模型中，收集屋塵螨支氣管攻擊前后的支氣管肺泡灌洗(BAL)和外周血液淋巴細(xì)胞用于流式細(xì)胞分析，在攻擊后48小時取組織樣本用于組織學(xué)和免疫組化分析(Bischof et al.，見上文)。被認(rèn)為是PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑的測試試劑，特別是被認(rèn)為是PKC-θ蛋白抑制劑的測試試劑可以施用給綿羊，以評估攻擊后與沒有施用發(fā)明的測試試劑的綿羊中BAL淋巴細(xì)胞的數(shù)目相比之下降低BAL淋巴細(xì)胞的數(shù)目的能力。還有另一公知的哮喘模型是蛔蟲-誘導(dǎo)的呼吸道炎癥的非人靈長類模型(參見例如Gundel et al.，Clin.Exp.Allergy 22(1)51-57(1992))。恒河猴對蛔蟲寄生蟲豬蛔蟲是天然致敏的，其通過誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IgE應(yīng)答而作為過敏原起作用。在用抗原在氣管內(nèi)攻擊時，動物顯示了主要由嗜酸性細(xì)胞組成的呼吸道炎癥。這可以通過肺段過敏原攻擊后24小時計數(shù)流入支氣管肺泡灌洗液中的淋巴細(xì)胞而進(jìn)行測定。還有另一種非限制性的哮喘模型是在小鼠中卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的呼吸道過敏(參見例如Kips et al.，Eur.Respir.J.22(2)374-382(2003)；Taube et al.，Int.Arch.Allergy Immunol.135(2)173-186(2004)；以及Reader et al.，Am.J.Pathol.162(6)2069-2078(2003))。在該模型中，用明礬佐劑中的卵清蛋白(OVA)免疫小鼠，加強(qiáng)，然后用OVA給予氣霧劑攻擊。當(dāng)攻擊時，動物顯示出增加的呼吸道阻力，并且淋巴細(xì)胞浸潤到支氣管肺泡灌洗(BAL)液中。此外，血清細(xì)胞因子水平增加，肺組織學(xué)顯示了組織炎癥和粘液產(chǎn)生。現(xiàn)有技術(shù)中已知的其它非限制性哮喘模型包括在狗和猴中豬蛔蟲抗原-誘導(dǎo)的哮喘模型(參見例如Hirshman et al.，J.Appl.Physiol.49953-957(1980)；Mauser et al.，Am.J.Respir.Crit.CareMed.152(2)467-472(1995))。體外哮喘模型也是普通熟練的生物學(xué)家所已知的。例如，對于T細(xì)胞靶向治療來說，一種非限制性的例子是對TH2細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制。T細(xì)胞可在體外刺激CD3和CD28的抗體，以模擬TCR-介導(dǎo)的激活。這將誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，其可在48小時后的上清液中分析。關(guān)鍵細(xì)胞因子是IL-4和IL-13。IL-13尤其是動物模型中哮喘發(fā)病的主要誘導(dǎo)物(參見例如Wills-Karp M.，Immunol Rev.202175-190(2004))。用于評估PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑對哮喘的效果的另一種非限制性體外方法是在應(yīng)答抗-CD3和抗-CD28時T細(xì)胞增殖的抑制或者核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB或NFAT的誘導(dǎo)。T細(xì)胞增殖可通過例如3H-胸苷攝取進(jìn)行分析(參見方法，例如在Ausubel et al.，見上文)。在應(yīng)答T細(xì)胞激活中，NFAT或NF-kB經(jīng)歷了激活和核轉(zhuǎn)移，其可通過細(xì)胞裂解產(chǎn)物的Western印跡進(jìn)行分析。PKC-θ蛋白抑制劑應(yīng)該也減少卵清蛋白免疫的小鼠中的TH2應(yīng)答，其可由于卵清蛋白特異性IgG1或總IgE的減少產(chǎn)生進(jìn)行分析。這些抗體的水平可通過小鼠血清的ELISA進(jìn)行分析。如這里使用的，發(fā)明的PKC-θ蛋白可以來自人，并可具有SEQ ID NO1(GenBank Accession NoNM_006257)中所示氨基酸序列。在另一實施方案中，發(fā)明的PKC-θ蛋白可以來自小鼠，并可具有SEQ ID NO2(GenBank Accession NoNM_008859)中所示氨基酸序列。發(fā)明中有用的PKC-θ蛋白也可由SEQ ID NO3(人)(GenBankAccession NoNM_006257)或者SEQ ID NO4(鼠)(GenBank AccessionNoNM_008859)中所示核苷酸序列編碼。編碼這些蛋白的另外的PKC-θ蛋白序列和核苷酸序列可在GenBank Accession NoNM_178075(Niino et al.，J.Biol.Chem.276(39)36711-36717(2001)；(小鼠))；GenBank Accession No.AF473820(Nonneman和Rohrer，Anim.Genet.34(1)42-46(2003)；豬))得到。如這里使用的，核苷酸序列打算意指核苷酸和/或核苷的天然的或合成的線性或連續(xù)陣列，以及它們的衍生物。術(shù)語“編碼(encoding)”和“編碼(coding)”是指這樣的過程，通過轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，核苷酸序列通過該過程提供給細(xì)胞以信息，一系列氨基酸可由此被組裝成特定氨基酸序列以產(chǎn)生多肽。編碼特定氨基酸序列的過程可涉及具有一個或多個堿基改變(即插入、缺失、取代)而不引起編碼的氨基酸改變的DNA序列，或者其涉及可能改變一個或多個氨基酸、但不消除由DNA序列編碼的多肽的功能性的堿基改變。PKC-θ與哮喘癥狀和/或并發(fā)癥的誘導(dǎo)有關(guān)的這一發(fā)現(xiàn)使得PKC-θ序列在鑒別發(fā)明的試劑的方法中有用。這些方法包括分析對于調(diào)節(jié)(如抑制或增強(qiáng))PKC-θ激酶活性的能力的潛在試劑。在發(fā)明的分析中有用的PKC-θ核酸分子(如PKC-θ啟動子序列)和蛋白不但包括這里公開的基因和編碼的蛋白，也包括與野生型基因和多肽具有基本上同樣活性的它們的變體。如這里使用的“變體”，包括含有一個或多個缺失、插入或取代的多核苷酸或多肽，只要變體保持與野生型多核苷酸或多肽基本上同樣的活性。就多肽來說，缺失變體預(yù)期包括缺少對于生物活性不必要的多肽部分的片段，插入變體預(yù)期包括野生型多肽或其片段融合到另一多肽的融合多肽。因此，在某些實施方案中，發(fā)明的PKC-θ蛋白是全長PKC-θ蛋白的功能性變體。因此可以理解的是，PKC-θ蛋白不限于由SEQ IDNO3或SEQ ID NO4所示核苷酸序列編碼。例如，如上文所討論的，編碼變體氨基酸序列的核苷酸序列在編碼PKC-θ的核苷酸序列的范圍之內(nèi)。產(chǎn)生基本上不影響PKC-θ蛋白功能特性的“沉默”改變的序列修飾，諸如序列缺失、插入或取代，是這里特意預(yù)期的。例如，可以理解的是，反映遺傳密碼簡并性、或者在特定位點導(dǎo)致化學(xué)等價氨基酸產(chǎn)生的核苷酸序列改變是預(yù)期中的。因此，疏水氨基酸丙氨酸的密碼子可以被編碼另一較不疏水殘基的密碼子諸如甘氨酸取代，或者被更疏水的殘基諸如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸取代。同樣的，導(dǎo)致一個負(fù)電荷殘基取代為另一個的變化，諸如用天冬氨酸取代谷氨酸，或者一個正電荷殘基取代為另一個的變化，諸如用賴氨酸取代精氨酸，也可期望產(chǎn)生生物學(xué)等價PKC-θ蛋白。就這里所述分析中的使用來說，PKC-θ蛋白可以從各個供應(yīng)商處商業(yè)購買，諸如Panvera(Madison，WI)，或者可通過熟練技術(shù)人員已知的遺傳工程和蛋白純化方法來生產(chǎn)。例如，可將編碼哺乳動物PKC-θ蛋白的核苷酸序列引入期望的宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)、分離并純化?？墒紫葘⑦@些核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)幕蛘咂渌谕闹亟M表達(dá)載體中。例如，可將編碼哺乳動物PKC-θ蛋白的核苷酸序列亞克隆到pcDNA3表達(dá)載體中并在人293細(xì)胞中表達(dá)，如下面實施例中所描述的。PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域在原核細(xì)胞中的表達(dá)也是預(yù)期中的。例如，如下面實施例中所描述的，可將PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域亞克隆到細(xì)菌表達(dá)載體諸如pET16b(例如商業(yè)獲自EMDBiosciences/Merck Biosciences.San Diego，CA)中，并在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)。如這里使用的以及如現(xiàn)有技術(shù)已知的，“載體”是指包括了設(shè)計來指導(dǎo)靶細(xì)胞轉(zhuǎn)化的遺傳材料的構(gòu)建體。載體可含有多種定位的且順序定向的遺傳元件，即可操作地與其它必需的或期望的元件連接，以便核酸盒中的核酸能夠被轉(zhuǎn)錄，以及如果期望，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中翻譯。重組表達(dá)載體可通過將上述核苷酸序列插入載體中而構(gòu)建，其根據(jù)熟練技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行，例如如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Springs HarborLaboratory，2nded.，Cold Springs Harbor，New York(1989)中所描述的。描述分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的其它參考文獻(xiàn)也進(jìn)一步說明于例如DNA Cloning 1Core Techniques，(D.N.Giover et al.，eds.，IRL Press，1995)；DNA Cloning 2Expression Systems，(B.D.Hameset al.，eds.，IRL Press，1995)；DNA Cloning 3A Practical Approach，(D.N.Glover et al.，eds.，IRL Press，1995)；DNA Cloning 4Mammalian Systems，(D.N.Glover et al.，eds.，IRL Press，1995)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，IRL Press，1992)；NucleicAcid HybridizationA Practical Approach，(S.J.Higgins and B.D.Hames，eds.，IRL Press，1991)；Transcription and TranslationAPractical Approach，(S.J.Higgins & B.D.Hames，eds.，IRL Press，1996)；R.I.Freshney，Culture of Animal CellsA Manual of BasicTechnique，4th Edition(Wiley-Liss，1986)；and B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning，2nd Edition，(John Wiley & Sons，1988)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，JohnWiley & Sons)，它們是規(guī)律性和周期性更新的。在發(fā)明中有用的多種載體是已知的。合適的載體包括質(zhì)粒載體、病毒載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如參見Miller et al.，Methodsof Enzymology 217581-599(1993))、腺病毒載體(例如參見Erzurumet al.Nucleic Acids Res.211607-1612(1993)；Zabner et al.，NatureGenetics 675-83(1994)；以及Davidson et al.，Nature Genetics 3219-223(1993))、腺伴隨病毒載體(例如參見Flotte et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010613-10617(1993))以及皰疹病毒載體(例如參見Anderson et al.，Cell Mol.Neurobiol.13503-515(1993))。載體可包括對核酸在特定宿主細(xì)胞中有效表達(dá)所必需或期望的其它已知遺傳元件，包括調(diào)節(jié)元件。例如，載體可包括啟動子和任何必需的與啟動子協(xié)同實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子序列?！霸鰪?qiáng)子”意指能夠刺激細(xì)胞諸如真核宿主細(xì)胞中的啟動子活性的核苷酸序列元件。如這里所定義的，當(dāng)核苷酸序列被置于與另一核苷酸序列功能性關(guān)系中時，核苷酸序列就是“可操作地連接”到另一核苷酸序列的。例如，如果編碼序列可操作地連接到啟動子序列時，這一般意味著啟動子可以促進(jìn)編碼序列的轉(zhuǎn)錄?？刹僮鞯剡B接意指被連接的DNA序列典型地是鄰接的，必要時加入兩個蛋白編碼區(qū)，其鄰接并且在讀碼框中。然而，由于增強(qiáng)子在與啟動子相隔幾千個堿基時也可起作用，內(nèi)含子序列可以是可變長度，因此一些核苷酸序列可以是可操作地連接的，但是并不鄰接。對于將編碼PKC-θ蛋白的核苷酸序列引入宿主細(xì)胞來說，許多現(xiàn)有技術(shù)已知的方法是可用的，所述核苷酸序列可以被包括在重組表達(dá)載體中。這些方法包括但不限于機(jī)械方法、化學(xué)方法、親脂性方法以及電穿孔。代表性的機(jī)械方法包括例如微注射以及基因槍的使用，用例如金微粒作為要引入DNA的基質(zhì)。代表性的化學(xué)方法包括例如使用磷酸鈣或DEAE-Dextran。代表性的親脂性方法包括使用脂質(zhì)體和其它陽離子試劑進(jìn)行脂介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。這些方法是現(xiàn)有技術(shù)公知的，許多這樣的方法描述在例如Gene Transfer MethodsIntroducing DNAinto Living Cells and Organisms，(P.A.Norton and L.F.Steel，eds.，Biotechniques Press，2000)；以及Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons)，它們是規(guī)律性和周期性更新的。在本發(fā)明中可以利用廣范圍的各種宿主細(xì)胞以產(chǎn)生期望的量的PKC-θ蛋白或其功能性片段，用于例如這里描述的篩選分析中。這些細(xì)胞包括真核和原核細(xì)胞，包括現(xiàn)有技術(shù)已知的哺乳動物和細(xì)菌細(xì)胞。許多宿主細(xì)胞可商業(yè)獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA。PKC-θ蛋白或其功能性片段可通過熟練技術(shù)人員公知的技術(shù)分離和純化，包括色譜、電泳以及離心技術(shù)。這些方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的，可在例如Current Protocols in Protein Science，J.Wiley andSons，New York，NY，Coligan et al.(Eds.)(2002)；以及Harris，E.L.V.，and S.Angal in Protein Purification ApplicationsA PracticalApproach，Oxford University Press，New York，NY(1990)中找到。為幫助重組生產(chǎn)的PKC-θ蛋白或其功能性片段的純化和檢測，可對PKC-θ蛋白或其功能性片段工程化以使它被“標(biāo)記”。在下面的一些實施方案中，PKC-θ蛋白和PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域(PKC-θ蛋白功能性片段的非限制性例子)用組氨酸標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。這可以使his-標(biāo)記的蛋白結(jié)合到鎳-NTA上，從而被純化。在下面的其它實施例中，PKC-θ蛋白用紅細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記并在293細(xì)胞中表達(dá)。其它非限制性的、可用于幫助純化和/或檢測PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的商業(yè)可獲得標(biāo)記包括但不限于myc標(biāo)記(結(jié)合到抗-myc標(biāo)記抗體)、GST標(biāo)記(結(jié)合到谷胱苷肽-Sepharose)以及flu標(biāo)記(結(jié)合到抗-flu標(biāo)記抗體)。為確定測試試劑是否抑制PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性，可以采用的一種非限制性分析是將PKC-θ蛋白(或其功能性片段)與測試試劑接觸足夠抑制PKC-θ蛋白激酶活性的時間段。這個時間段可根據(jù)所選抑制劑和PKC-θ蛋白或其功能性片段的性質(zhì)而變化。這樣的時間可由熟練技術(shù)人員不經(jīng)過度實驗而容易地確定。非限制性的發(fā)明測試試劑是減少PKC-θ(或其功能性片段)激酶活性的試劑，盡管通過例如結(jié)合到PKC-θ底物而抑制PKC-θ或者通過一些其它機(jī)制抑制PKC-θ激酶活性的測試試劑也是預(yù)期中的。如下面描述的，在IgE受體交聯(lián)時，在BMMC中的PKC-θ在至少一個下面的殘基上被誘導(dǎo)磷酸化SEQ ID NO1的695位絲氨酸、685位絲氨酸、538位蘇氨酸或536位絲氨酸。因此，在特定實施方案中，測試試劑可通過它抑制PKC-θ蛋白自身磷酸化的能力而被確定為能夠抑制PKC-θ激酶活性的試劑(從而對于治療哮喘是有用的)。在一些實施方案中，PKC-θ蛋白激活環(huán)的氨基酸殘基的自身磷酸化被抑制?？梢岳迷S多分析來確定測試試劑是否抑制PKC-θ蛋白的激酶活性。由于PKC-θ蛋白是激酶，這些分析包括在存在一種磷酸形式諸如三磷酸(ATP)腺苷或者可轉(zhuǎn)移到PKC-θ底物的其它磷酸形式時，測定測試試劑對PKC-θ在538位蘇氨酸殘基上自身磷酸化它自身的能力的影響。同樣的，這些分析可在磷酸形式存在時測定測試試劑對PKC-θ磷酸化PKC-θ底物能力的影響?？梢岳没诜派湫缘姆治龊突诜欠派湫缘姆治?，包括基于熒光的分析。基于放射性的分析測定例如[γ-32P]-ATP摻入PKC-θ底物中并通過液體閃爍計數(shù)測量。采用體外底物磷酸化和基于抗體的比色檢測或者其它檢測方法的其它分析是從各種來源容易地商業(yè)獲得的，包括Promega(Madison，WI；CatalogNos.V7470和V5330)、Calbiochem(San Diego，CA；Catalog Nos.539484，539490，539491)、Panvera Discovery Screening(Madison，WI；Catalog Nos.P2747和P2748；它是Invitrogen，Carlsbad，CA的子公司)。非放射性分析包括由Panvera(Madison，WI)所出售的那些，其包括具有R-X-X-S/T共有基序的底物的磷酸化以及通過熒光偏振測定磷酸化的底物。在一個非限制性實例中，可用抗-IgE受體抗體刺激暴露于測試試劑和32P-ATP的BMMC以交聯(lián)IgE受體。交聯(lián)十五分鐘后，然后可將細(xì)胞裂解。接下來，可用商業(yè)獲得的抗體免疫沉淀內(nèi)源PKC-θ(例如用Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)商業(yè)提供的抗-PKC-θ抗體，它在下面的實施例中描述)，通過SDS-PAGE分析進(jìn)行分辨。用抑制PKC-θ自身磷酸化的測試試劑處理的BMMC的PKC-θ將顯示出與未處理細(xì)胞的PKC-θ相比的磷酸化減少(即32P-ATP摻入減少)。在該實例的替代中，在沒有32P-ATP時將BMMC暴露于測試試劑。在抗-IgE受體交聯(lián)十五分鐘后，將細(xì)胞裂解，免疫沉淀內(nèi)源PKC-θ并通過SDS-PAGE分辨。然后將SDS-PAGE凝膠用抗-磷酸蘇氨酸抗體(商業(yè)獲自例如Zymed Laboratories Inc.，San Francisco，CA)進(jìn)行Western印跡分析。用抑制PKC-θ自身磷酸化的測試試劑處理的BMMC的PKC-θ將顯示出與未處理細(xì)胞的PKC-θ相比的磷酸化減少(即32P-ATP摻入減少)。PKC-θ激酶活性也可通過它磷酸化底物的能力來確定。因此，可以將廣泛的各種寡肽和多肽底物利用于分析中以測定PKC-θ激酶活性。在發(fā)明中有用的肽具有共有的R-X-X-S/T基序(其中R是精氨酸，X是未知的或任何已知的氨基酸；S是絲氨酸以及T是蘇氨酸)。其它蛋白底物包括但不限于肉豆蔻?；母缓彼岬腃-激酶底物(MARCKS)(氨基酸序列KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，其中加下劃線的絲氨酸殘基被磷酸化)、PKC-α擬底物(氨基酸序列FARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)，其中加下劃線的絲氨酸被磷酸化。使用肽陣列技術(shù)，已經(jīng)鑒別出了幾種潛在的PKC-θ底物，它們可含有PKC-θ生理性底物獨特的序列，可能是與PKC-θ具有同樣應(yīng)用的治療目標(biāo)(見圖9B和下面的實施例4)。底物可具有各種修飾，只要底物參與由PKC-θ催化的反應(yīng)。還有另一種測定PKC-θ激酶活性的方法是測定它的自身磷酸化能力。在下面描述的實施例中，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時被磷酸化。該磷酸化是由于自身磷酸化，因為細(xì)菌細(xì)胞不會磷酸化蛋白質(zhì)。因此，發(fā)明也提供了用于鑒別對治療哺乳動物中的免疫病癥有用的試劑的方法，該方法是通過將表達(dá)PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的細(xì)胞與測試試劑接觸；確定測試試劑是否減少了PKC-θ蛋白(或其功能性片段)在細(xì)胞中的自身磷酸化，其中減少PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的測試試劑就被鑒別為治療免疫病癥有用的試劑。在一些實施方案中，細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)。在一些實施方案中，免疫病癥是哮喘。根據(jù)發(fā)明，可通過將編碼PKC-θ蛋白或其功能性片段的核苷酸序列引入細(xì)胞中來使細(xì)胞表達(dá)PKC-θ蛋白或其功能性片段。如上所述，核苷酸序列可操作地連接到允許細(xì)胞表達(dá)PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的調(diào)節(jié)序列(如啟動子序列和增強(qiáng)子)。普通熟練技術(shù)人員將明白，實現(xiàn)編碼PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的核苷酸序列表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列類型將根據(jù)編碼PKC-θ蛋白(或其功能性片段)的核苷酸序列被引入的細(xì)胞的類型而變化。例如，如果細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，那么優(yōu)選使用細(xì)菌細(xì)胞的調(diào)節(jié)序列。用于許多不同類型細(xì)胞(如昆蟲、哺乳動物和細(xì)菌)的調(diào)節(jié)序列是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(參見例如Ausubelet al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，其是規(guī)律性和周期性更新的)。還有另一方面，發(fā)明提供了用于鑒別對治療哺乳動物中免疫病癥諸如哮喘有用的試劑的方法，通過將功能性PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域與測試試劑接觸；并且確定測試試劑是否降低功能性PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域的自身磷酸化，其中降低功能性PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域自身磷酸化的測試試劑就被鑒別為治療免疫病癥有用的試劑。在一些實施方案中，接觸是在體外進(jìn)行的。在一些實施方案中，功能性PKC-θ或PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域與測試試劑的接觸是在緩沖液中進(jìn)行的。在一些實施方案中，緩沖液具有相對于細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的離子強(qiáng)度(大約100mM NaCl)的高總離子強(qiáng)度。例如，在一些實施方案中，緩沖液具有至少100mM的離子強(qiáng)度。在一些實施方案中，緩沖液具有至少200mM或至少250mM的離子強(qiáng)度。在某些實施方案中，功能性PKC-θ蛋白或PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域與測試試劑相接觸的緩沖液中含有NaCl。例如，緩沖液可含有至少50mM NaCl(注意，另外的鹽(即除NaCl之外的)可存在于緩沖液中)。在一些實施方案中，緩沖液含有至少100mM NaCl、或至少150mMNaCl、或至少200mM NaCl。在一些實施方案中，緩沖液含有至少250mM NaCl。當(dāng)然，普通熟練技術(shù)人員將明白，不同于或除了NaCl之外的鹽可用來獲得高離子強(qiáng)度的緩沖液。這些鹽的一些非限制性例子包括乙酸銨、乙酸鈉和氯化鉀。根據(jù)發(fā)明，“免疫病癥”意指其中的免疫系統(tǒng)細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)不正常起作用的病癥。在一些實施方案中，免疫病癥是哮喘。其它免疫病癥包括但不限于自身免疫疾病(諸如I型糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、移植排斥以及呼吸道疾病，諸如過敏，免疫細(xì)胞在其中起作用。因此，發(fā)明提供了用于鑒別對治療免疫病癥諸如哮喘有用的試劑的方法，其通過鑒別調(diào)節(jié)(如降低)功能性PKC-θ蛋白水平的試劑或者調(diào)節(jié)(如降低)PKC-θ激酶活性的試劑。調(diào)節(jié)(如減少)功能性PKC-θ蛋白產(chǎn)生或PKC-θ激酶活性的試劑包括但不限于小分子化合物、化學(xué)品、核酸分子、肽和蛋白質(zhì)，諸如激素和抗體。試劑也包括例如寡核苷酸或多核苷酸，諸如反義核糖核酸和小干擾RNAs(siRNA)。反義核苷酸序列和siRNAs典型地包括與靶核苷酸序列的部分互補(bǔ)的、或者與靶核苷酸序列的部分能夠雜交的核苷酸序列。在一種非限制性例子中，反義核苷酸序列和/或siRNA雜交到核苷酸序列CAGAATATGTTCAGGAACTTTTCCTTCATGAACCCCG(SEQ IDNO7)，其編碼氨基酸序列QNMFRNFSFMNP(SEQ ID NO8)，相應(yīng)于氨基酸殘基688到699，在695位含有絲氨酸殘基，這是T538自身磷酸化所需的。在另一非限制性例子中，反義RNA和/或siRNA雜交到核苷酸序列GGAGATGCCAAGACGAATACCTTCTGTGGGACACCT(SEQ ID NO9)，其編碼氨基酸序列GDAKTNTFCGTP(SEQ IDNO10)，相應(yīng)于氨基酸殘基532到543，在536和538位含有蘇氨酸，至少其一是激酶活性所需的(參見例如圖2B和2C)。反義核苷酸序列可具有大約20個核苷酸的長度，但是可以在大約20個到大約200個核苷酸的長度范圍，或者可以是全長基因靶。熟練技術(shù)人員通過現(xiàn)有技術(shù)已知的標(biāo)準(zhǔn)程序能夠選擇適當(dāng)?shù)陌泻瓦m當(dāng)長度的反義核酸，以具有期望的療效，例如在Methods in Enzymology，AntisenseTechnology，Parts A and B(Volumes 313 and 314)(M.Phillips，ed.，Academic Press，1999)中所描述的。本發(fā)明中有用的反義分子的非限制性例子是描述于Bennett et al.，美國專利No.6,190,869(2001年2月20日頒發(fā))中的那些，由此通過引用并入。RNA干擾涉及序列特異性的、轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，是由與被沉默的基因靶同源的小的干擾雙鏈RNA片段導(dǎo)致的(Lee，N.S.etal.，Nature Biotech.19500-505(2002))。這些siRNA能夠特異性地靶向并除去天然mRNA分子。利用siRNAs抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)生的方法是現(xiàn)有技術(shù)公知的，披露于例如PCT國際申請?zhí)柎aWO 01/75164；WO00/63364；WO 01/92513；WO 00/44895；以及WO 99/32619?？捎糜谡{(diào)節(jié)(如減少)功能性PKC-θ蛋白產(chǎn)生或調(diào)節(jié)(如減少)PKC-θ激酶活性的其它試劑包括但不限于阻斷PKC-θ轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面的試劑。可被利用的其它試劑包括在這里描述的篩選分析中發(fā)現(xiàn)的那些。另外的試劑，或者PKC-θ的抑制劑或拮抗劑包括例如特異性結(jié)合到PKC-θ蛋白或PKC-θ蛋白部分的抗體和小分子?！疤禺愋越Y(jié)合”意指發(fā)明的抗體以至少10-5M的解離常數(shù)(KD)、或至少10-6M的KD、或至少10-7M的KD、或至少10-8M的KD、或至少10-10M的KD識別并結(jié)合到PKC-θ蛋白(或其部分)。用于確定結(jié)合和結(jié)合親和性的標(biāo)準(zhǔn)方法是公知的。因此，這里提供了特異性結(jié)合到PKC-θ蛋白的抗體。這里使用的特異性結(jié)合到PKC-θ蛋白的抗體可以是，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、遺傳工程化抗體、雙特異性抗體、抗體片段(包括但不限于“Fv”、“F(ab’)2”、“F(ab)”和“Dab”)以及表現(xiàn)抗體活性部分的單鏈。產(chǎn)生每一種上述抗體形式的方法是現(xiàn)有技術(shù)公知的。例如，多克隆抗體可通過將純化的酸性哺乳動物PKC-θ蛋白注入各種動物并分離血清中產(chǎn)生的抗體而獲得，更充分的描述于例如Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，其是規(guī)律性和周期性更新的。抗體可以是單克隆抗體，其生產(chǎn)方法是現(xiàn)有技術(shù)公知的。特定的單克隆抗體可商業(yè)獲得，或者另外可以通過Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6511-519(1976)的技術(shù)及其改進(jìn)或改變來制備。簡要地說，這些方法包括制備能夠產(chǎn)生期望抗體的無限增殖細(xì)胞系。無限增殖細(xì)胞系的產(chǎn)生可通過將選擇的抗原注入動物諸如小鼠中、從動物的脾收獲B細(xì)胞并將細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤?？赏ㄟ^現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)程序選擇單一集落并測試它們分泌期望表位的高親和性抗體的能力。替代性地，可通過現(xiàn)有技術(shù)已知的各種方法從表達(dá)文庫中重組生產(chǎn)抗體。例如，可從分離自淋巴細(xì)胞、優(yōu)選分離自B淋巴細(xì)胞以及更優(yōu)選分離自注射了期望抗原的動物的核糖核酸(RNA)生產(chǎn)cDNA。諸如編碼各種免疫球蛋白基因的cDNA可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)被擴(kuò)增并克隆到適當(dāng)載體中，諸如噬菌體展示載體。這些載體可被加入細(xì)菌懸浮液中，優(yōu)選包括大腸桿菌的懸浮液中，可產(chǎn)生噬菌體或噬菌體顆粒，其展示了連接到噬菌體顆粒表面的相應(yīng)抗體片段。可通過篩選包括期望抗體的噬菌體顆粒來構(gòu)建亞文庫，其通過現(xiàn)有技術(shù)已知的方法例如親和純化技術(shù)，諸如淘選。然后可利用亞文庫來從期望的細(xì)胞類型，諸如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中分離抗體。如這里描述的生產(chǎn)重組抗體的方法及其改進(jìn)可以在例如Griffiths，W.G.et al.，Ann.Rev.Immunol.12433-455(1994)；Marks，J.D.et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Winter，G.and Milstein，C.，Nature 349293-299(1991)；Hoogenboom，H.R.and Winter，G.，J.Mol.Biol.227381-388(1992)中找到。為了用于本發(fā)明中，在用于產(chǎn)生抗體之前，首先可通過這里前面討論的熟練的技術(shù)人員公知的技術(shù)純化PKC-θ蛋白。發(fā)明進(jìn)一步的實施方案提供了通過預(yù)篩選測試試劑減少測試試劑的量的非限制性方式。例如只有那些具有結(jié)合到PKC-θ蛋白能力的測試試劑或者指導(dǎo)PKC-θ基因表達(dá)的啟動子才可以被用于發(fā)明的功能性分析中。在非限制性的實例中，首先篩選測試試劑結(jié)合到PKC-θ蛋白的能力，可分離純化的PKC-θ蛋白并用于篩選測試試劑。例如，可將純化的PKC-θ蛋白固定在固相表面上(例如瓊脂糖珠或塑料上)，使測試試劑與純化的固定化PKC-θ蛋白進(jìn)行接觸。在替代性實施例中，在PKC-θ暴露于測試試劑之后，可加入針對PKC-θ蛋白的抗體并用于免疫沉淀PKC-θ蛋白，以確定測試試劑是否與PKC-θ蛋白共免疫沉淀。只有那些能夠結(jié)合到PKC-θ蛋白的測試試劑才在下一步被用于功能分析，以確定它們是否能調(diào)節(jié)(如降低)PKC-θ激酶活性或者調(diào)節(jié)(如降低)細(xì)胞，諸如肥大細(xì)胞或T細(xì)胞(如TH1或TH2輔助T細(xì)胞)中功能性PKC-θ蛋白的量。在非限制性實例中，首先篩選測試試劑結(jié)合到PKC-θ啟動子的能力，可將PKC-θ啟動子序列固定化，如在DNA微芯片陣列中那樣。然后可篩選不同測試試劑結(jié)合到啟動子的能力。只有那些能夠結(jié)合到PKC-θ啟動子的測試試劑才被用于功能分析中，以確定它們是否能調(diào)節(jié)(如降低)細(xì)胞，諸如肥大細(xì)胞或T細(xì)胞(如TH1或TH2輔助性T細(xì)胞)中功能性PKC-θ蛋白的量。在進(jìn)一步的方面，發(fā)明提供了用于鑒別對治療哺乳動物(如人)哮喘有用的試劑的方法，包括將可操作地連接到PKC-θ啟動子的編碼報道基因產(chǎn)物的核苷酸序列與測試試劑相接觸，確定測試試劑是否降低報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，其中降低報道基因產(chǎn)物產(chǎn)生的測試試劑就被鑒別為對于治療哮喘有用的試劑。在某些實施方案中，可操作地連接到PKC-θ啟動子的編碼報道基因產(chǎn)物的核苷酸序列是在細(xì)胞(如肥大細(xì)胞或者T細(xì)胞，諸如TH1或TH2輔助性T細(xì)胞)中的。PKC-θ啟動子的核苷酸序列通過本領(lǐng)域公知的方法確定。這些方法的一個非限制性例子是使用PKC-θ的核苷酸序列作為探針篩選感興趣的啟動子序列的基因組文庫(如YAC人基因組文庫)，然后分離探針?biāo)Y(jié)合的核苷酸序列5′的核苷酸序列。確定適當(dāng)啟動子序列的方法的另一非限制性例子是進(jìn)行人基因組DNA的Southern印跡分析，這是通過用探針(例如包括了編碼人PKC-θ蛋白的核苷酸序列或其部分的探針)電泳探查分辨的人基因組DNA，然后確定cDNA探針雜交的位置。一旦確定探針雜交的帶，就可將帶分離(如將凝膠切掉)并進(jìn)行序列分析。這樣就允許了核苷酸ATG(即轉(zhuǎn)錄位點的起始)5′的核苷酸片段的檢測。該核苷酸片段是PKC-θ的啟動子，可以進(jìn)行序列分析。該核苷酸片段可在大約500到1000個核苷酸的長度。本發(fā)明也包括與這些序列具有至少大約70％、至少大約80％或至少大約90％同一性并作為啟動子起作用例如指導(dǎo)編碼這里描述的PKC-θ蛋白的基因表達(dá)的核苷酸序列。廣泛的各種報道基因可被可操作地連接到上述PKC-θ啟動子上。這些基因可編碼例如熒光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、堿性磷酸酶、以及綠色熒光蛋白、或者現(xiàn)有技術(shù)已知的其它報道基因產(chǎn)物。在發(fā)明的一種形式中，將可操作地連接到PKC-θ啟動子的編碼報道基因的核苷酸序列引入宿主細(xì)胞中。如上所述，在發(fā)明中可采用許多宿主細(xì)胞。首先可將這些核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)幕蛘咂谕闹亟M表達(dá)載體中，如這里前面描述的那樣。發(fā)明這種形式的載體可包括其它已知的對于從PKC-θ啟動子表達(dá)報道基因必需的或期望的遺傳元件，包括哺乳動物細(xì)胞中的調(diào)節(jié)元件。例如，載體可包括與啟動子在體內(nèi)協(xié)同的任何必需增強(qiáng)子序列，例如在體內(nèi)實現(xiàn)報道基因轉(zhuǎn)錄。將核苷酸序列引入宿主細(xì)胞的方法與前面描述的用于生產(chǎn)PKC-θ蛋白的一樣。將可操作地連接到PKC-θ啟動子的編碼報道基因的核苷酸序列與測試試劑接觸之后，確定測試試劑是否抑制報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。該終點可通過定量報道基因產(chǎn)物的量或活性來確定。定量方法將依賴于所使用的報道基因，但是可以涉及用抗報道基因產(chǎn)物的抗體進(jìn)行的酶聯(lián)免疫分析的使用。此外，分析可以測定化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性衰變、等等。如果測試試劑抑制報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，它就被歸類為治療哮喘的試劑。用于確定這里描述的報道基因產(chǎn)物的活性或量的方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的，論述于例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons)，其是規(guī)律性和周期性更新的。對這里論述的報道基因產(chǎn)物進(jìn)行分析的進(jìn)一步描述可在例如下列出版物中發(fā)現(xiàn)對于熒光素酶，參見Nguyen，V.T.et al.，Anal.Biochem.171404-408(1988)；對于β-半乳糖苷酶，參見例如Martin，C.S.et al.，Bioluminescence and ChemiluminescenceMolecularReporting with Photons pp.525-528(J.W.Hastings et al.，eds.，JohnWiley & Sons，1997)；Jain，V.K.and Magrath，I.T.，Anal.Biochem.199119-124(1991)；對于β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和堿性磷酸酶，參見例如Bronstein，I.et al.Bioluminescence andChemiluminescenceFundamentals and Applied Aspects，pp.20-23，(A.K.Campbell et al.，eds.，John Wiley & Sons，1994)；對于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，參見Cullen，B.，Methods.Enzymol.152684(1987)；Gorman，C.et al.Mol.Cell.Biol.21044(1982)；Miner，J.N.et al.，J.Virol.62297-304(1988)；Sleigh，M.J.，Anal.Biochem.156251-256(1986)；Hruby，D.E.and Wilson，E.M.，Methods Enzymol.216369-376(1992)。選擇性抑制PKC-θ活性的小分子也是治療哮喘的治療劑。選擇性可被限定為通過比其它PKC-θ同工型抑制PKC-θ超過大約20倍的IC50。(IC50被定義為產(chǎn)生50％的抑制劑靶活性的抑制劑濃度)。在發(fā)明的另一方面，發(fā)明提供了治療哮喘的方法，包括給患有哮喘或患有哮喘癥狀的哺乳動物(如人)施用治療有效量的降低PKC-θ催化活性或降低功能性PKC-θ蛋白產(chǎn)生的試劑。在一個實施方案中，哺乳動物是人。在一些實施方案中，哮喘是IgE-介導(dǎo)的哮喘。這里使用的“治療”意指預(yù)防、降低或消除至少一種哮喘癥狀或并發(fā)癥?！爸委熡行Я俊北硎驹噭┑牧磕軌蛞种苹驕p少功能性PKC-θ蛋白的產(chǎn)生或者能夠抑制或減少PKC-θ蛋白的激酶活性，并引起臨床上顯著的反應(yīng)。臨床上顯著的反應(yīng)包括但不限于被治療狀況的改善或者狀況的預(yù)防。根據(jù)本發(fā)明所施用試劑的特定劑量當(dāng)然將由病例相關(guān)的特定情況來確定，包括所施用的試劑、被治療中的特定哮喘以及類似狀況。哮喘的治療可通過例如減少呼吸道過敏、減少粘液過量產(chǎn)生、減少血清IgE水平或者減少呼吸道嗜酸性細(xì)胞增多。試劑可通過廣泛的各種途徑施用給哺乳動物，包括經(jīng)腸內(nèi)、腸胃外以及經(jīng)表面施用。例如試劑可經(jīng)口服、鼻內(nèi)、經(jīng)吸入、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、血管內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、或者它們?nèi)我獾慕M合來施用。試劑可在藥學(xué)可接受的載體中被施用。藥學(xué)可接受的載體和它們的劑型是公知的，一般描述于例如RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy(20th Edition，ed.A.Gennaro(ed.)，Lippincott，Williams & Wilkins，2000)。在一些實施方案中，藥學(xué)可接受的載體是氣霧劑形式?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的任何合適的藥學(xué)可接受的載體都可以使用。載體可以是固體、液體、或者固體和液體的混合物。當(dāng)以液體或者固體和液體的混合物存在時，有效溶解試劑的載體是優(yōu)選的。載體可采取膠囊、片劑、丸劑、粉劑、錠劑、懸浮液、乳狀液或糖漿的形式或者其它已知形式。載體可包括作為芳香劑、潤滑劑、增溶劑、助懸劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、片劑崩解劑和包封材料的物質(zhì)。固體或液體載體可采取氣霧劑形式以將試劑輸送到它們期望的位置，諸如當(dāng)用在吸入試劑的噴霧器中時。全身或口服施用的片劑可包括賦形劑，如現(xiàn)有技術(shù)中已知的，諸如碳酸鈣、碳酸鈉、糖類(如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇)、纖維素(如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉)、樹膠(如阿拉伯樹膠、黃蓍膠)，以及崩解劑諸如玉米、淀粉或藻酸，粘合劑諸如明膠、膠原或阿拉伯膠，以及潤滑劑諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。在粉劑中，載體是精細(xì)分割的固體，其與有效量的精細(xì)分割的抑制劑混合。在溶液、懸浮液或糖漿中，將有效量的抑制劑溶解并懸浮在載體諸如無菌水、鹽水或有機(jī)溶劑諸如液態(tài)丙二醇中。其它組合物可通過將抑制劑分散在淀粉或羧甲基纖維素鈉水溶液或者現(xiàn)有技術(shù)已知的合適的油中。試劑以治療有效量施用給哺乳動物。這樣的量在治療哮喘或減輕哮喘癥狀中是有效的。這個量可根據(jù)所利用試劑的活性、是否有任何其它的抗哮喘試劑共施用以及這種抗哮喘試劑的性質(zhì)、哮喘性質(zhì)和患者健康狀況而改變。盡管這些量可由熟練技術(shù)人員確定，不過典型的治療有效量包括大約10mg/kg/天到大約100mg/kg/天。當(dāng)然，根據(jù)具體病例可能需要更低或更高的劑量。當(dāng)試劑與載體組合時，它們可以以大約1％重量百分比到大約99％重量百分比的量存在，其余由藥學(xué)可接受的載體組成。在某些實施方案中，試劑或者PKC-θ產(chǎn)生或催化活性的抑制劑可在例如包括一種或多種抗哮喘試劑的組合物中共施用。這些試劑是現(xiàn)有技術(shù)已知的，包括例如β-類腎上腺素能試劑，包括異丙腎上腺素、腎上腺素、二羥苯基異丙氨基乙醇和間羥叔丁腎上腺素；甲基黃嘌呤，包括茶堿、氨茶堿和膽茶堿；皮質(zhì)類固醇，包括倍氯米松、倍他米松、氫化可的松和強(qiáng)的松；抗膽堿能藥，包括阿托品和異丙托溴銨；抗組胺劑，包括特非那定和阿司咪唑；鈣通道阻斷劑，包括維拉帕米、硝苯吡啶；以及肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑，包括色甘酸鈉和nedocromilsodium。在一些實施方案中，試劑是核酸分子。在某些實施方案中，核酸分子是核糖核酸分子。在一些實施方案中，核糖核酸分子包括與SEQ ID NO3中所示核苷酸序列的部分互補(bǔ)的核苷酸序列。在某些實施方案中，試劑降低編碼PKC-θ蛋白的RNA的量。在一些實施方案中，試劑抑制編碼PKC-θ蛋白的RNA的翻譯。在特定實施方案中，試劑是特異性結(jié)合PKC-θ蛋白或其部分的抗體(如多克隆、單克隆、人源化或嵌合抗體)。在進(jìn)一步的方面，發(fā)明公開了不表達(dá)內(nèi)源PKC-θ的細(xì)胞。在某些實施方案中，細(xì)胞是肥大細(xì)胞。這種細(xì)胞可從例如下面描述的PKC-θ敲除的小鼠中分離(也參見Sun et al.，Nature 404402-407(2000))。分離肥大細(xì)胞的方法是公知的(參見例如下面描述的方法)。不表達(dá)內(nèi)源PKC-θ蛋白的這種細(xì)胞也可以是人細(xì)胞，其中編碼PKC-θ的基因被缺失或突變，以便細(xì)胞不再表達(dá)內(nèi)源PKC-θ。不表達(dá)內(nèi)源PKC-θ蛋白的肥大細(xì)胞是有用的，例如對于檢測測試試劑是否是對治療哮喘有用的試劑。如下面實施例中描述的，紅細(xì)胞凝集素(HA)-標(biāo)記的PKC-θ在293細(xì)胞中表達(dá)。HA-標(biāo)記的PKC-θ可在肥大細(xì)胞中表達(dá)，HA-標(biāo)記的PKC-θ蛋白的活性和/或量在測試試劑存在下測定。然而，由于肥大細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源PKC-θ，一些測試試劑可能影響內(nèi)源PKC-θ蛋白，因此屏蔽了它對HA-標(biāo)記蛋白的影響。這種屏蔽不會發(fā)生在缺少內(nèi)源PKC-θ表達(dá)、而表達(dá)HA-標(biāo)記的PKC-θ蛋白的肥大細(xì)胞中。而且，這些細(xì)胞對于篩選那些影響HA-標(biāo)記的PKC-θ與它們影響野生型PKC-θ不同的測試試劑是有用的。在一些實施方案中，細(xì)胞表達(dá)外源PKC-θ或其片段?，F(xiàn)在將提及具體實施例來例證上述組合物和方法。要明白的是，實施例是提供來例證優(yōu)選實施方案的，并不打算因此而限制發(fā)明的范圍。
實施例1當(dāng)TCR共刺激人T細(xì)胞時的PKC-θ膜易位和激活環(huán)磷酸化沒有PKC-θ(即PKC-θ敲除)的小鼠是能存活的，但是成熟T細(xì)胞在增殖、IL-2產(chǎn)生和NF-κB激活上是有缺陷的(Sun et al.，Nature404402-407(2000))。在培養(yǎng)的人肥大細(xì)胞(HCMC)中證實了在IgE受體交聯(lián)后PKC激酶活性迅速(＜5min)定位于膜上(Kimata etal.，BBRC 3895-900(1999))。因為PKC-θ在TCR-介導(dǎo)的信號傳遞中起著中心作用并且在大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病細(xì)胞系RBL-2H3細(xì)胞中具有證實的效應(yīng)(Liu et al.，J.Leukocyte Biol.69831-840(2001))，故檢測了PKC-θ在BMMC、腹膜肥大細(xì)胞和T細(xì)胞中的激活和功能。在TCR刺激之后，PKC-θ迅速易位到超分子激活復(fù)合物的中心區(qū)，在那里保持最多達(dá)四小時(Huang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 999369-9373(2002))。為確定該易位是否與PKC-θ蛋白的磷酸化變化相應(yīng)，將人T細(xì)胞純化并分析PKC-θ易位和自身磷酸化。為純化T細(xì)胞，從Biological Specialties(Colmar，PA)獲得單核細(xì)胞制劑。將細(xì)胞在Ficoll-Histopaque(可商業(yè)獲自例如SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)上分層，在離心后收集血塊黃層。將細(xì)胞在PBS中漂洗數(shù)次，以106/ml的密度培養(yǎng)在RPMI/10％FCS中。經(jīng)陰性選擇純化T細(xì)胞(Dynal Biotech，Oslo，Norway)。用可溶的抗-CD3ε(5μg/ml，與10μg/ml抗-mIgG交聯(lián))和可溶的抗-CD28(5μg/ml)刺激純化的T細(xì)胞0、2、10、45和60分鐘(抗-CD3ε和抗-CD28均商業(yè)獲自BD Biosciences，San Jose，CA)。就分析來說，經(jīng)離心收集受刺激的細(xì)胞，在冰冷PBS中漂洗一次。通過將細(xì)胞沉淀重懸浮在100μl低滲裂解緩沖液[20mMTris-HCl，pH 7.5，2mM EDTA，5mM乙二醇雙-(B-氨基-乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，每mL中亮抑酶肽和抑酶肽各10μg，蛋白酶混合物和磷酸酶抑制劑]中制備全細(xì)胞裂解液。將細(xì)胞懸浮液通過25號針頭30次進(jìn)行剪切，然后在280xg離心7分鐘以沉淀細(xì)胞核。在保存一小份用于分析之后，將全細(xì)胞提取物經(jīng)高速離心(16,000xg)澄清。收集胞質(zhì)溶膠提取物，將膜沉淀在低滲裂解緩沖液中漂洗一次，然后重懸浮在同樣的緩沖液中，加入1％NP-40去污劑在冰上裂解30分鐘。經(jīng)另一次高速離心步驟獲得去污劑可溶的膜級分，剩下的顆粒級分是去污劑不溶的含有膜微結(jié)構(gòu)域的膜級分(DI級分)。將該DI級分在SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸進(jìn)行分析。亞細(xì)胞蛋白質(zhì)級分經(jīng)4-20％SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，用抗-磷酸T538PKC-θ特異性抗體(商業(yè)獲自Cell Signaling Technology，Inc.(Beverly，MA))在5％blotto/TBS-Tween.05％中免疫印跡(見圖1A)。接下來，將硝酸纖維素印跡剝離，用抗-PKC-θE7(SantaCruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)再探查(見圖1B)。最后，如圖1C所示，為在所有泳道顯示等量加樣，再次將印跡剝離，然后用抗-肌動蛋白(商業(yè)獲自Santa Cruz Biotechnology，Inc.)探查。如圖1A所示，在TCR刺激(經(jīng)CD3和CD28刺激)后，PKC-θ在激酶激活環(huán)中538位蘇氨酸殘基上自身磷酸化。自身磷酸化事件與PKC-θ易位到超分子激活復(fù)合物中心區(qū)相一致(見圖1B)。如圖1C所示，在所有的時間處理中發(fā)現(xiàn)了近似等量的肌動蛋白。因此，這些結(jié)果表明PKC-θ易位到超分子激活復(fù)合物中心區(qū)是與激酶激活環(huán)在氨基酸殘基蘇氨酸538上的伴隨可誘導(dǎo)性磷酸化相一致的。
實施例2PKC-θ激活環(huán)自身磷酸化是激酶活性所需的如實施例1所述，在T細(xì)胞受體共刺激人T細(xì)胞時，PKC-θ膜易位是與激酶激活環(huán)在氨基酸殘基蘇氨酸538上的伴隨的可誘導(dǎo)磷酸化相應(yīng)的。該激活環(huán)磷酸化被報道為是激酶功能所需的(Liu et al.，Biochemical Journal，2002，361-255-265)。為證實該報道，用C末端紅細(xì)胞凝集素(HA)表位標(biāo)記將PKC-θ全長cDNA亞克隆到質(zhì)粒pcDNA3(商業(yè)獲自Invitrogen)中，產(chǎn)生C末端HA表位標(biāo)記的全長(WT)PKC-θ(核苷酸序列SEQ ID NO11；氨基酸序列SEQ IDNO12)。HA-標(biāo)記的激酶失活的PKC-θ也通過將氨基酸409位賴氨酸突變?yōu)樯彼醽懋a(chǎn)生。該激酶失活的K409W突變通過亞克隆PCR產(chǎn)物而產(chǎn)生，并經(jīng)測序證實(核苷酸序列SEQ ID NO13；氨基酸序列SEQID NO14)，亞克隆到pcDNA3表達(dá)載體中。使用脂(使用MirusTransIT-LT1試劑，商業(yè)獲自Mirus Corporation，Madison WI)用這些表達(dá)構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞(商業(yè)獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)雙份。在轉(zhuǎn)染24或72小時后收集細(xì)胞用于Western印跡分析和活性。將收獲的細(xì)胞在低滲裂解條件下裂解，離心除去細(xì)胞核(參見實施例1中更詳細(xì)的方法)。將一份平行測定的全細(xì)胞提取物在SDS-PAGE上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，首先用抗-磷酸T538PKC-θ特異性抗體(Cell Signaling Technology)探查，然后剝離，用抗-HA抗體(Santa Cruz)再探查。如圖2A所示，存在激酶失活的全長PKC-θ蛋白(如通過它的抗-HA抗體染色所確定的)，但是在538位蘇氨酸殘基上未被磷酸化(如通過它缺少抗-pT538PKC-θ抗體染色所確定的)。因此，如圖2A轉(zhuǎn)染實驗中所示，雖然野生型激酶激活環(huán)被有效磷酸化，激酶失活型(通過突變蛋白質(zhì)中409位的催化性賴氨酸為色氨酸而產(chǎn)生，因此名為K409W)未被磷酸化。盡管其它PKC同工型的證據(jù)顯示激活環(huán)(即538位蘇氨酸)的磷酸化可能被歸因于PDK-1激酶(其基于其它PKC同種型的證據(jù))，然而這里出現(xiàn)的結(jié)果顯示人胚293腎細(xì)胞中存在的內(nèi)源PDK-1沒有磷酸化PKC-θ激活環(huán)。也通過細(xì)菌表達(dá)的活性激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸印跡分析和純化激酶結(jié)構(gòu)域的分析證明了激活環(huán)的自身磷酸化(數(shù)據(jù)未示出)。接下來，使用肽底物分析了同一平行測定的細(xì)胞液提取物(即圖2A中使用的那些)的體外激酶活性。在96孔板中分析了胞質(zhì)溶膠提取物的體外激酶活性，每孔5μg蛋白、終濃度為83μM的生物素化肽底物(氨基酸序列FARKGSLRQ；SEQ ID NO15)、166μMATP、0.5μl P33ATP(比活性3000Ci/mmol，10mCi/ml)、84ng/μl磷脂酰絲氨酸、8.4ng/μl二酰甘油，于ADBII緩沖液(20mM MOPS pH7.2，25mMβ-甘油醛，1mM原釩酸鈉，1mM DTT，1mM CaCl2)中終體積30μl，室溫30分鐘。用含有EDTA的緩沖液終止激酶分析，轉(zhuǎn)移到鏈霉抗生物素蛋白包覆的閃爍板上漂洗，在板讀數(shù)儀中檢測放射性。從終計數(shù)中減去作為背景的只有肽和只有激酶的反應(yīng)。如圖2B所示，與野生型PKC-θ蛋白相比，激酶失活的全長PKC-θ蛋白在轉(zhuǎn)染到人胚腎293細(xì)胞后24和72小時時具有顯著更低的激酶活性。最后，確定了野生型和激酶失活的PKC-θ引起內(nèi)源底物IKK(IκBα激酶)磷酸化的能力。為此，將平行測定組的細(xì)胞在1％NP-40裂解緩沖液中裂解，將去污劑不溶的膜級分轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。首先用抗-pIKKα/β探查硝酸纖維素印跡，然后剝離，用抗-IKKα再探查，最后剝離并用抗-IKKβ再探查(所有抗體來自Cell SignalingTechnology)。如圖2C所示，野生型PKC-θ，而不是激酶失活的PKC-θ，引起了IKK-β的磷酸化。圖2B和2C顯示的結(jié)果證實激活環(huán)自身磷酸化(即在538位的蘇氨酸)是PKC-θ活性和信號傳遞所需的，如通過使用合成底物的體外細(xì)胞裂解液激酶活性(圖2B)以及內(nèi)源IKK的磷酸化(圖2C)所顯示的。這些結(jié)果顯示野生型激酶誘導(dǎo)了IKK磷酸化，而激酶失活型無法這樣做。這些結(jié)果將PKC-θ激活環(huán)自身磷酸化確定為治療性調(diào)節(jié)的獨特而新穎的機(jī)制。
實施例3PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域的催化機(jī)制接下來進(jìn)行研究以闡明新的磷酸化PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域(PKC-θKD)的催化機(jī)制。為此，表達(dá)并純化催化活性的PKC-θKD用于磷酸化位點分析。對于這些研究，首先表達(dá)和純化PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域(PKC-θKD；氨基酸殘基362到706)。為此，將PKC-θKD(氨基酸殘基362到706)克隆到pET16b表達(dá)載體中，引入六-組氨酸標(biāo)記到C末端。His-標(biāo)記的PKC-θKD的氨基酸序列提供在SEQ ID NO63(注意SEQ ID NO63中的N末端甲硫氨酸和甘氨酸殘基不出現(xiàn)在全長PKC-θ中)。將質(zhì)粒用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-DE3株以過量表達(dá)。用0.1mM IPTG將10升的在37℃光密度0.4的細(xì)胞培養(yǎng)物在25℃誘導(dǎo)3小時，然后收獲它們并重懸浮在緩沖液(25mM Tris pH 8.0，25mMNaCl，5mM 2-巰基乙醇，5mM咪唑，50μM ATP以及蛋白酶抑制劑)中，用微流化器裂解。將裂解液加到20mL的鎳-NTA樹脂上，4℃1小時。隨后將樹脂傾倒作為層析柱，用包括25mM咪唑的同樣緩沖液徹底漂洗。用200mM咪唑緩沖液洗脫結(jié)合到樹脂上的蛋白質(zhì)。立即將蛋白質(zhì)加樣到陰離子交換器HQ上，用25mM Tris pH 8.0、25mM NaCl、5mMDTT、50μM ATP漂洗柱子，然后通過應(yīng)用25mM到500mM NaCl線性梯度進(jìn)行分辨。含有PKC-θKD的級分的選擇通過SDS-PAGE，匯集，用25mM Tris pH 8.0、5mM DTT稀釋兩倍，加樣到肝素層析柱上。立即流過羥磷灰石柱，用25mM Tris pH 8.0、50mM NaCl、5mMDTT徹底漂洗。0到100mM的磷酸鈉線性梯度洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)。然后將蛋白質(zhì)在Superdex 200大小排阻層析柱上作為單體進(jìn)行大小分級，用25mM Tris pH 8.0、50mM NaCl、5mM DTT在4℃透析過夜，濃縮。接下來，進(jìn)行質(zhì)譜分析。為進(jìn)行該分析，將PKC-θKD(在50mM Hepes pH 7.5、5mM MgCl2、5mM DTT、10％甘油和0.0025％Brij-35中，0.25μg/μl)在10％Tricine凝膠上電泳(Invitrogen)，考馬斯亮藍(lán)染色。切下條帶，在ProGest Investigator自動機(jī)(GenomicsSolutions，Ann Arbor，MI)中用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)進(jìn)行膠內(nèi)消化。經(jīng)SpeedVac減少樣品體積，用0.1M乙酸復(fù)原到大約30μl的終體積。然后將肽進(jìn)行nanoLC/MS/MS分析。簡要的說，將樣品注入到75μm×10cm IntegraFrit柱(New Objectives，Woburn，MA)上，柱是用10μm C18珠(YMC，Wilmington，NC)裝填的。HPLC梯度經(jīng)過45min以250nL/min的流速線性地由4％增加到60％溶劑B(溶劑A，0.1M乙酸/1％CAN；溶劑B，0.1M乙酸/90％ACN)。用LCQ DECA XP離子阱質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan，San Jose，CA)收集質(zhì)譜。使用Sequest算法(ThermoFinnigan，San Jose，CA)檢索MS/MS數(shù)據(jù)，以得到PKC-θ在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上的差異性磷酸化修飾。為幫助分析PKC-θKD的催化機(jī)制，使用定點誘變(使用商業(yè)獲自Stratagene，La Jolla，CA的試劑盒)在PKC-θKD表達(dá)構(gòu)建體中進(jìn)行各種突變。經(jīng)測序驗證這些突變的序列。如上所述表達(dá)構(gòu)建體來表達(dá)野生型PKC-θKD，在通過Bradford分析(商業(yè)獲自BioRad，Hercules，CA)估測蛋白質(zhì)后，通過免疫印跡和激酶分析來分析等量的大腸桿菌裂解液。簡要的說，通過4-20％SDS-PAGE分析裂解液，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，用商業(yè)獲自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)的抗-pT538PKC-θ抗體或者商業(yè)獲自Invitrogen(Carlsbad，CA)的抗-His抗體在5％blotto/TBS-Tween 0.05％中進(jìn)行免疫印跡。質(zhì)譜研究顯示PKC-θKD被磷酸化。由于PKC-θKD表達(dá)是在大腸桿菌中進(jìn)行的，其中是沒有絲氨酸-蘇氨酸激酶的，因此質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)就是所表達(dá)激酶自身磷酸化的結(jié)果?；诎被嵝蛄械念A(yù)測分子量是41,615道爾頓，然而，經(jīng)ESI-MS確定的分子量是42,092道爾頓和42,173道爾頓(每種50％)，這表明5或6個氨基酸在大腸桿菌中自身磷酸化了。圖3A-3D是顯示PKC-θKD自身磷酸化特征的示意圖。如圖3A所示，新的C2結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)的氨基末端，接著是兩個結(jié)合輔因子的C1結(jié)構(gòu)域，然后是羧基末端激酶結(jié)構(gòu)域。在示意圖3A上面顯示了保守的磷酸化位點(即538位蘇氨酸，676位絲氨酸，685位絲氨酸，以及695位絲氨酸)，而在示意圖下面顯示了PKC-θKD N末端和C末端氨基酸殘基(分別在362和706位)。在質(zhì)譜分析中，m/z比是肽的質(zhì)量/電荷比，z(電荷)是1。因此，m/z比給出了肽片段的質(zhì)量。質(zhì)譜產(chǎn)物離子譜分析顯示Ser695是磷酸化位點。這樣，圖3B顯示了肽NFpSFMNPGMER(跨越位置693-703)的產(chǎn)物離子譜在m/z 705.52，這證實Ser695是磷酸化位點。圖3C顯示了肽ALINpSMDQNMFR(跨越位置681-692)的產(chǎn)物離子譜在m/z 760.48，表明Ser685是磷酸化位點。圖3D顯示了肽TNTFCGTPDYIAPEILLGQK(跨越位置536-555)的產(chǎn)物離子譜在m/z 1159.71。圖3D的產(chǎn)物離子譜表明該肽上的一個磷酸，也表明磷酸化位點是Thr536或Thr538。注意540位的半胱氨酸殘基(在圖3D中用#表示)是被碘乙酰胺所烷基化的。因此，疏水基序Ser695和轉(zhuǎn)角基序Ser685就被鑒別為自身磷酸化位點(分別見圖3B和3C)。質(zhì)譜沒有檢測到Ser662和Ser657轉(zhuǎn)角基序殘基的任何磷酸化。根據(jù)與其它PKC轉(zhuǎn)角基序的同源性，Ser676可能是自身磷酸化的，但是這在這些研究中不是明確的，因為沒有在胰蛋白酶處理的肽中檢測到Ser676。這些研究進(jìn)一步揭示了激活環(huán)中的Thr536或Thr538也是自身磷酸化的(見圖3D)。細(xì)菌中表達(dá)的PKC-θKD的X-射線結(jié)構(gòu)測定證實Thr538殘基是磷酸化的(Xu et al.，J.Biol.Chem.279(48)50401-50409(2004))。這個結(jié)果是令人驚訝的，因為它與以前的意見即激活環(huán)被PDK-1磷酸化(Balendran et al.，F(xiàn)EBS Lett.484217-223(2000)；LeGood et al.，Science 2812042-2045(1998))是相反的。實際上，激酶失活的全長PKC-θ突變體K409W的早先研究已經(jīng)顯示該分子在Thr538未被磷酸化(Liu et al.，Biochem.J.361255-265(2002))。使用上面實施例2中描述的HEK293細(xì)胞異源表達(dá)系統(tǒng)，也觀察到了細(xì)胞中的K409W PKC-θ突變體缺少Thr538磷酸化(數(shù)據(jù)未顯示)。這個發(fā)現(xiàn)意味著Thr538未磷酸化是由于K409W激酶突變體不能自身磷酸化。而且，K409W PKC-θ分子的Thr538未磷酸化與缺少體外細(xì)胞裂解液激酶活性以及內(nèi)源IKKα/β磷酸化相關(guān)聯(lián)(數(shù)據(jù)未顯示)。因為以前已經(jīng)提出過，PKC-θ激活環(huán)是被PDK-1磷酸化的(Balendran et al.，F(xiàn)EBS Lett.484217-223(2000)；LeGood et al.，Science 2812042-2045(1998))，表明了細(xì)菌中表達(dá)的PKC-θKD的Thr536或Thr538被自身磷酸化的質(zhì)譜分析結(jié)果是令人驚訝的(見圖3B-3D)。這部分地通過x-射線結(jié)構(gòu)來解釋，其揭示了磷酸化的Thr538與前面的Thr536側(cè)鏈?zhǔn)菤滏I相互作用的(Xu et al.，J.Biol.Chem.279(48)50401-50409(2004))。這個相互作用可能進(jìn)一步穩(wěn)定了激活環(huán)內(nèi)的以及與αC-螺旋的相互作用，這兩者都與催化作用相關(guān)(Johnson et al.，Cell 85149-158(1996))。以前的研究已經(jīng)提出了PKC-θ有催化能力的構(gòu)象，其中激活環(huán)被組成型磷酸化(Newton，A.C.，Biochemical Journal.370361-371(2003))。PDK-1在激酶結(jié)構(gòu)域激活環(huán)磷酸化PKCs和其它AGC家族激酶，作為發(fā)生在疏水和轉(zhuǎn)角基序上的保守位點處的自身磷酸化之前所需的修飾(Newton，A.C.，Biochemical Journal.370361-371(2003)；Balendran et al.，F(xiàn)EBS Lett.484217-223(2000))。這里出現(xiàn)的結(jié)果揭示，與流行的假說相反，PKC-θ能夠獨特地自身磷酸化。這里提出的關(guān)于PKC-θKD特征的發(fā)現(xiàn)提出了證據(jù)來支持除了激酶結(jié)構(gòu)域中的疏水和轉(zhuǎn)角基序之外，激活環(huán)也被自身磷酸化(見圖3B-3D)。這些研究也排除了PDK-1在細(xì)胞中能夠磷酸化PKC-θ激活環(huán)的可能性。然而，與細(xì)菌中表達(dá)的PKC-θ相反(Smith et al.，J.Biol.Chem.27745866-45873(2002))，本實施例中呈現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)顯示PKC-θKD能夠在PKC-θ激活環(huán)處自身磷酸化，因此PDK-1磷酸化需求就不是必須的了。質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示細(xì)菌中表達(dá)的PKC-θKD在5或6個氨基酸殘基處被自身磷酸化。在這些實驗中鑒別的磷酸化位點包括疏水基序Ser695、轉(zhuǎn)角基序Ser685、激活環(huán)Thr538或Thr536。在胰蛋白酶處理的肽中沒有檢測到轉(zhuǎn)角基序Ser676，盡管根據(jù)序列同源性它也可能被磷酸化。Ser685是新鑒別的轉(zhuǎn)角基序自身磷酸化位點。最后，除了上述鑒別到的磷酸化位點之外，至少另外2個氨基酸殘基被自身磷酸化，但是沒有被這些技術(shù)檢測到。激活環(huán)中的氨基酸殘基Thr538是激酶活性所需的(Liu etal.，Biochem.J.361255-265(2002))。因此，檢查了激酶結(jié)構(gòu)域中幾個磷酸化位點的點突變對激活環(huán)Thr538自身磷酸化的影響。為此，使用抗-pT538PKC-θ抗體通過Western印跡分析來分析PKC-θKD蛋白和各種突變體的大腸桿菌裂解液。如圖4A所示，只有野生型PKC-θKD蛋白和三個測試的突變片段在538位酪氨酸上被磷酸化。通過剝離印跡并用抗-His抗體染色的再探查來確定泳道的等量加樣(見圖4B)。也進(jìn)行這些大腸桿菌裂解液級分的裂解液激酶分析。這些激酶分析用30μl的終濃度83μM生物素化肽底物(FARKGSLFQ)、166μM ATP、0.5μl of P33ATP(比活性3000Ci/mmol，10mCi/ml)、84ng/μl磷脂酰絲氨酸、8.4ng/μl二酰甘油在20mM MOPS pH 7.2中、25mM β-磷酸甘油、1mM DTT、1mM CaCl2在室溫進(jìn)行30分鐘。五到十μl的反應(yīng)液點樣在磷酸纖維素紙上，然后在0.75％磷酸中漂洗三次、在丙酮中漂洗一次。將閃爍混合物加到磷酸纖維素上，用閃爍計數(shù)器檢測結(jié)合的放射性。如圖4C所示，在測試的各種PKC-θKD突變體中，只有野生型PKC-θKD蛋白和三種突變片段在蘇氨酸538上被磷酸化，顯示了在體外裂解液激酶活性分析中的活性。實際上，裂解液激酶活性與每種表達(dá)的突變體裂解液中檢測到的磷酸化蘇氨酸538(pThr538)的程度相關(guān)聯(lián)(比較圖4A和4C)。PKC-θKD的C末端疏水基序的695位絲氨酸(Ser695)對于最佳激活環(huán)自身磷酸化也是必需的，如通過抗-pT538Western印跡圖中明顯減少的信號所證明的(見圖4A中的S695A突變體(即695位絲氨酸突變?yōu)楸彼?)。因此，695位絲氨酸對PKC-θKD激酶活性是必需的，如S695A突變體激酶活性缺失所證實的(見圖4C中的S695A突變體)，分別與失活的和激酶失活突變體T538A和K409W非常類似(見圖4A和4C)。相反，轉(zhuǎn)角基序殘基Ser662對活性和Thr538自身磷酸化都不是必要的(見圖4A中的S662A突變體)，而轉(zhuǎn)角基序殘基Ser676和Ser685有部分影響(見圖4A中的S676A和S685A突變體)。因此，突變分析證實了保守轉(zhuǎn)角基序中的Ser676和Ser685部分影響PKC-θKD的激酶功能(見圖4A和4C)。以前已經(jīng)報道過，全長激酶中的S676A突變不影響激酶活性，而全長分子中的S695A突變使激酶活性降低了80％(Liu et al.，Biochem.J.361255-265(2002))。全長PKC-θ中報道的S695A殘基活性與中度的磷酸-Thr538信號相一致，這是這里對激酶結(jié)構(gòu)域中的S695A所觀察到的(見圖4C，S695A突變體)。這暗示了Ser695突變導(dǎo)致了最佳Thr538自身磷酸化的喪失，從而導(dǎo)致激酶活性的減弱。這個特性也是PKC-θ在其它PKC同工型中所獨有的。至于PKC-θ，Ser695和Thr538自身磷酸化有某種程度的相互依賴是可能的。在激活環(huán)處被磷酸化的PKC分子被稱作存在于輔因子結(jié)合、自身磷酸化和底物催化步驟之前的“有催化能力的構(gòu)象”(Newton，A.C.，Biochemical Journal.370361-371(2003))。為優(yōu)化PKC-θKD激酶功能，激活環(huán)和疏水基序都自身磷酸化來提供PKC-θ“有催化能力的構(gòu)象”是可能的。已經(jīng)確定了表達(dá)的活性PKC-θKD的磷酸化位點關(guān)系，接下來進(jìn)行詳細(xì)的酶機(jī)制研究以檢查激酶催化反應(yīng)。用于確定PKC-θ動力學(xué)機(jī)制的所研究肽底物示于表I。
表I用于PKC-θKD分析的肽 肽1和肽2是源自PKC-α擬底物區(qū)的底物。肽3和肽4分別源自血清反應(yīng)因子(Heidenreich et al.，J.Biol.Chem.27414434-14443(1999))中的磷酸化位點以及淋巴細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)-1中的磷酸化位點(Huang et al.，J.Biol.Chem.27217-19(1997)).就酶動力學(xué)分析來說，ATP、ATPγS、Ficoll-400、蔗糖、ATP、ADP、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、NADH、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、AMP-PNP、乙腈、以及緩沖液HEPES購自SigmaChemical Co.(St.Louis，MO)。肽底物、抑制劑和磷酸化的底物肽購自AnaSpec(San Jose，CA)、SynPep(Dublin，CA)或者OpenBiosystems(Huntsville，AL)。在25℃使用偶聯(lián)的PK/LDH分析確定酶活性，接著在Molecular Devices板讀數(shù)儀上于340nm進(jìn)行分光光度分析。除非另外指出，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)在25mM HEPES pH 7.5、10mMMgCl2、2mM DTT、0.008％TritonX100、100mM NaCl、20單位PK、30單位LDH、0.25mM NADH和2mM PEP中進(jìn)行，終體積0.080mL。PKC-θKD濃度在0.156μg/ml到0.312μg/ml之間變化。接下來，進(jìn)行溶劑粘度分析。穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)在上述用于酶動力學(xué)分析的緩沖液中確定，其中含有可變的蔗糖(0-35％)或Ficoll400(0-8％)。相對溶劑粘度(ηrel)使用OstWald粘度計相對于25mMHEPES pH 7.5、10mM MgCl2、2mM DTT和100mM NaCl在25℃平行測定三次。沒有粘精(viscogen)的緩沖液用上標(biāo)0表示。偶聯(lián)酶系統(tǒng)不受這些粘精存在的影響。用ATPγS進(jìn)行的硫效應(yīng)研究和用ADP進(jìn)行的產(chǎn)物抑制研究在Hewlett Packard系列1100HPLC上分析，使用Phenomenex Auga 5m C18124 A050mm×4.60mM柱(00B-4299-E0)。使用0％到100％的20mM磷酸鹽pH 8.8/乙腈(50/50)梯度將未磷酸化的肽與磷酸化的肽分開。通過在485nm激發(fā)并在530nm監(jiān)測熒光發(fā)射來檢測熒光標(biāo)記的肽。接下來確定底物動力學(xué)。為此，將數(shù)據(jù)代入方程1以得到標(biāo)準(zhǔn)Michaelis-Menten動力學(xué)，或者對代入方程2以得到底物抑制v=Vmax[S]Km+[S]---(1)]]>v=Vmax[S]Km+[S]+[S]2Ki---(2)]]>其中S是底物，Vmax是最大酶反應(yīng)速度，Km是Michaelis常數(shù)，Ki是底物抑制的抑制常數(shù)(Adams，J.A.，Biochemistry 42601-607(2003))。在各種固定濃度肽和ATP下獲得初速度并代入下列方程v=Vmax[A][B]KiaKb+Kb[A]+Ka[B]+[A][B]---(3)]]>v=Vmax[A][B]Kb[A]+Ka[B]+[A][B]---(4)]]>在上面的方程中，[A]和[B]分別是ATP和肽的濃度；Ka和Kb分別是ATP和肽的Km；Kia是A從EA復(fù)合物上解離的常數(shù)。初始反應(yīng)速度作為產(chǎn)物抑制(ADP或磷酸肽)的函數(shù)或者作為失活末端抑制(AMP-PNP)的函數(shù)而獲得。在這些研究中，一種底物保持恒定，而另一種隨增加的抑制劑濃度而變化。在產(chǎn)物抑制情況下，不變底物保持在飽和或非飽和水平，而在失活末端抑制中，不變底物保持在飽和水平。將數(shù)據(jù)代入競爭性抑制模型(方程5)、非競爭性抑制模型(方程6)或者反競爭性抑制模型(方程7)
v=Vmax[S]Km(1+[I]Kis)+[S]---(5)]]>v=Vmax[S]Km(1+[I]Kis)+[S](1+[I]Kii)---(6)]]>v=Vmax[S]Km+[S](1+[I]Kii)---(7)]]>p其中Kii和Kis是截距和斜率抑制常數(shù)。使用SPSS Science(Richmond，CA)的Sigma Plot 2000 Enzyme Kinetics Module分析數(shù)據(jù)。表II提供了肽1-4、ATP以及沒有肽的ATP的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)匯總。
表II穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)匯總
a肽1和肽2代入方程(2)；肽3、肽4和ATP代入方程(1)b肽1在該分析中存在c在分析中沒有肽存在如表II所示，在沒有肽底物時，PKC-θKD水解ATP(0.16sec-1)比存在肽時(18sec-1)慢110倍。ATP的Km是59μM(沒有肽)和49μM(飽和的肽1)，這表明ATP結(jié)合在肽底物存在時沒有顯著性差異。飽和ATP時的PKC-θ穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)列在表II中。肽3和肽4顯示了最高的PKC-θKm，分別是420μM和240μM。相比之下肽1和肽2的Km值分別是6.5μM和4.3μM，在高濃度時引起酶抑制(表II)。更堿性的肽1和肽2更低的Km值，意味著堿性氨基酸底物肽是PKC-θ優(yōu)選的。有趣的是，在更長的更堿性的肽2中觀察到的底物抑制比更短的肽1更為顯著(表II)。因此，在增加的NaCl濃度下檢查了PKC-θ(肽1和ATP)的動力學(xué)參數(shù)。這些研究的結(jié)果示于表III。
表IIINaCl對PCK-θKD穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)的影響
a0.2mM肽1b代入方程(1)c代入方程(2)如表III所示，當(dāng)NaCl濃度增加，ATP的Km和酶轉(zhuǎn)換增加，而肽1的Km仍然相對恒定。也研究了離子強(qiáng)度對PKC-θ的影響，這是通過在非產(chǎn)物性的或失活末端的復(fù)合物中當(dāng)?shù)孜锱c酶結(jié)合時，檢查所發(fā)生的NaCl對底物抑制的影響而實現(xiàn)的。在優(yōu)選的堿性肽1和2中觀察到了底物抑制，但是在非最佳的肽3和4中沒有觀察到(見表II)。而且，也發(fā)現(xiàn)底物抑制依賴于緩沖液的離子強(qiáng)度。當(dāng)NaCl濃度增加到250mM時，肽1的底物抑制就減少了(見表III)。因此，表III顯示緩沖液NaCl濃度的增加就增加了ATP的PKC-θKD Km以及酶更新。也觀察到了離子強(qiáng)度對肽1底物抑制的影響。當(dāng)NaCl濃度增加，觀察到了肽1底物抑制的減少(見表III)。鹽(NaCl)的性質(zhì)和它對離子對形成的影響能夠理解這些觀察結(jié)果。根據(jù)陽離子和陰離子的Hofmeister序列，NaCl落在低離液序列和高離液序列中間(Cacace et al.，Quarterly Reviews of Biophysics 30241-277，1997)。因此，NaCl應(yīng)該不會鹽析酶，也不會使酶變性。然而，緩沖液離子強(qiáng)度的增加將對離子對的形成有影響(Park C.R.R.，J.Am.Chem.Soc.12311472-11479(2001))。就酪氨酸激酶Csk來說，50mM NaCl的加入具有增加負(fù)電荷底物聚(Gly，Tyr)的Km的效果；然而，對于ATP的Km或者酶轉(zhuǎn)換沒有影響(Cole et al.，J.Biol.Chem.26930880-30887，1994)。在PKC-θKD的情況下，ATP的Km的增加可能是兩種可能性的結(jié)果1)在250mM NaCl時，肽1對酶-ATP二元復(fù)合物的產(chǎn)物性結(jié)合更多，所觀察到的Km是ATP的真實Km的反映；或者2)離子強(qiáng)度的增加以與肽1同樣的方式影響帶電底物ATP。所觀察到的Km增加可能是上述兩種可能性的結(jié)合。就肽1底物來說，離子對形成(Columbic相互作用)可能在該底物對酶的結(jié)合中是重要的。在pH 7.5時，諸如肽1這樣的堿性肽將具有凈正電荷。因此，NaCl濃度的增加將產(chǎn)生對離子對形成更不利的環(huán)境(Park C，R.R.，J.Am.Chem.Soc.12311472-11479(2001))。如果離子對形成是肽1抑制的原因，那么隨NaCl增加而減少的底物抑制是與Columbic相互作用的減弱相一致的。在確定PKC-θ的動力學(xué)機(jī)制中，對固定變化的肽底物濃度在100mM NaCl時確定了不同ATP的反應(yīng)初速度。分析首先用肽1進(jìn)行，然而由于肽1的底物抑制，很難解釋所得到的Lineweaver-Burk曲線(數(shù)據(jù)未顯示)。接著進(jìn)行了Lineweaver-Burk曲線(未顯示)的截距和斜率對肽1的重作圖。如圖5A和5B所示，截距和斜率重作圖分別對100mM NaCl的肽1是非線性的。也進(jìn)行了初速度分析，使用肽3在同樣的條件下進(jìn)行。不同ATP濃度對固定變化的肽3濃度的曲線在Lineweaver-Burk曲線上產(chǎn)生了交叉模式(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明了順序動力學(xué)機(jī)制。ATP的Kia值是61±22μM，ATP的Ka是118±17μM。然后在625nMNaCl下確定了肽1的初速度模式，因為增加的鹽濃度減少了肽1的底物抑制(見表III)。所得到的Lineweaver-Burk曲線也產(chǎn)生了交叉模式(數(shù)據(jù)未顯示)，與肽1是底物時的順序動力學(xué)機(jī)制一致。在高NaCl濃度下，Lineweaver-Burk曲線(未顯示)的截距和斜率重作圖對肽1是線性的(見圖5C和5D)。在高NaCl下獲得的ATP的Kia值是66±32μM，發(fā)現(xiàn)與肽3在100mM NaCl下的ATP的Kia值61±22μM是相似的。這表明增加的離子強(qiáng)度不會影響ATP從酶-ATP復(fù)合物解離的常數(shù)。在625mM NaCl下獲得的ATP的Ka是321±19μM，與在100mMNaCl下的ATP的Ka118±17μM不同。這與離子強(qiáng)度增加時ATP的Km增加是一致的(見表III)。失活末端抑制研究將ATP鑒別為結(jié)合PKC-θKD的第一底物。這樣，接著確定順序催化機(jī)制中的底物結(jié)合次序。將ATP的不可水解類似物AMP-PNP以及將肽1的絲氨酸變?yōu)楸彼岬碾?(見表I)用于抑制研究。抑制研究結(jié)果示于表IV。
表IV抑制模式和常數(shù)a
aNaCl濃度保持在100mMbc，競爭性；nc，非競爭性；uc，反競爭性；-，未觀察到抑制c數(shù)據(jù)代入的方程號dATP保持在0.1mMe肽3保持在0.5mM，由于肽1較低的Km而使用肽3f由于用肽1觀察到了底物抑制而使用肽3如表IV所示，發(fā)現(xiàn)AMP-PNP是ATP的競爭性抑制劑，Ki值為228μM。在飽和ATP時用AMP-PNP對肽沒有觀察到抑制。肽抑制劑肽5顯示為肽1及肽3的競爭性抑制劑，Kis值分別為10μM和4.4μM(表IV)。肽5進(jìn)一步顯示為ATP的反競爭性抑制劑，Kii值為1100μM(見表IV)。這些結(jié)果與PKC-θ底物的有序順序加入是一致性的，其中ATP首先與酶締合，接著是肽。因為PK/LDH偶聯(lián)的激酶分析消耗了催化產(chǎn)物ADP，所以使用HPLC分析來確定ADP的抑制模式(見表IV)。發(fā)現(xiàn)ADP在飽和的肽1時是ATP的競爭性抑制劑，Kis為291μM。當(dāng)在飽和ATP時分析ADP，沒有觀察到對肽1的抑制。當(dāng)在未飽和ATP(0.1mM)下進(jìn)行分析時，觀察到了非競爭性模式，Kis為494μM，Kii為200μM(見表IV)。ADP的這些結(jié)果排除了如圖6C中所示意性描述的隨機(jī)機(jī)制，但是與順序有序(如圖6A所示意性描述)或者Theorell-Chance(如圖6B所示意性描述)動力學(xué)機(jī)制是一致性的，其中ADP是釋放的終產(chǎn)物。為進(jìn)一步闡明動力學(xué)機(jī)制，用磷酸肽1進(jìn)行了產(chǎn)物抑制分析。由于用肽1觀察到了底物抑制，所以用肽3進(jìn)行產(chǎn)物抑制分析。磷酸肽1是肽3的非競爭性抑制劑，在飽和ATP濃度下Kis為1700μM，Kii為1200μM(表IV)。在未飽和ATP下，觀察到了反競爭性模式，Kii為2000μM。在未飽和的肽3(0.5mM)時，磷酸肽1是ATP的反競爭性抑制劑，Kii為1600μM。上述結(jié)果與順序有序Bi-Bi機(jī)制更為一致，ADP為釋放的終產(chǎn)物(見圖6A)。使用ATP的硫類似物ATPγS來研究催化中的磷酸轉(zhuǎn)移步驟的速率，這些研究的結(jié)果示于表V。
表V硫?qū)KC-θKD的影響
a分析中使用的肽1b速率峰值區(qū)域/(反應(yīng)時間，分鐘)([酶]nM)如表V所示，ATPγS對ATP的替代產(chǎn)生了反應(yīng)的kcat的大變化。與ATP的反應(yīng)相比，ATPγS反應(yīng)在100mM NaCl和250mM NaCl中分別慢112倍和146倍。然而，使用HPLC獲得的ATP和ATPγS的Km僅僅相差兩倍(表V)。為確定化學(xué)步驟是否是反應(yīng)速度的唯一貢獻(xiàn)者，確定了溶劑粘度對PKC-θ穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)的影響。在該研究中采用了兩種類型的粘精，微粘精蔗糖和大粘精Ficoll-400。微粘精直接影響小分子的擴(kuò)散，同時產(chǎn)生粘度計觀察到的粘度效應(yīng)(Blacklow et al.，Biochemistry 271158-1167(1988))。大粘精產(chǎn)生粘度計可見的粘度效應(yīng)，但是并不明顯影響小分子的擴(kuò)散速度，因而用作分析中觀察到的微粘度效應(yīng)的對照(Cole et al.，J.Biol.Chem.26930880-30887(1994))。在增加的溶劑粘度和兩種不同的離子強(qiáng)度下確定了肽1、肽3和ATP的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)。溶劑粘度對動力學(xué)參數(shù)kcat和kcat/Km，的相對效應(yīng)對緩沖液的相對粘度作圖，進(jìn)行線性回歸擬合。圖7A-7D顯示了溶劑粘度對PKC-θKD的kcat和kcat/Km的影響。圖7A顯示了使用變化的肽1，ATP保持在2.0mM時的kcat效應(yīng)。圖7B顯示ATP在0.125mM肽1的kcat/Km。圖7C顯示了用變化的肽3、ATP保持在2.0mM時的kcat效應(yīng)。圖7D顯示了肽3在2.0mMATP時的kcat/Km。就圖7A-7D來說，空心圓符號(○)表示100mM NaCl在增加的蔗糖中；空心倒三角符號()表示250mM NaCl在增加的蔗糖中；實心圓符號(●)表示100mM NaCl在增加的Ficoll 400中；實心倒三角符號()表示250mM NaCl在增加的Ficoll 400中。圖7A-7D中的虛線表示斜率1。斜率1表示微粘精對動力學(xué)參數(shù)的最大效應(yīng)。大粘精的存在對酶速率影響很小。隨著溶劑微粘度的增加，可見對(kcat)η值的適度影響。所有的三種底物在100mM NaCl和250mMNaCl中的研究都可見所觀察到的酶速率的線性降低。在所有條件下獲得的斜率[(kcat)η]在0.38到0.54之間變化，意味著產(chǎn)物釋放是部分限速的(圖7A和7C)。0.8到1的值表明產(chǎn)物釋放是催化限速步驟(Adams，J.A.，Biochemistry 42601-607(2003))。底物粘度可通過粘度分析確定。簡要的說，對于粘性底物，產(chǎn)物形成速率比底物解離速率快，而非粘性底物將比產(chǎn)物形成速率更快地從酶上解離(Cleland，W.W.(1986)Investigations of Rates andMechanisms of Reactions，Vol.6，Wiley-Interscience Publications，JohnWiley & Sons，New York，NY)。增加的溶劑微粘度對kcat/Km的相對影響對相對溶劑粘度作圖(圖7B和7D)。當(dāng)微粘度影響對相對溶劑粘度作圖時，對肽1來說，在250mM NaCl中的斜率具有0.86的(kcat/Km)η值(數(shù)據(jù)未顯示)。肽1在100mM NaCl時沒有獲得數(shù)據(jù)，因為在低離子強(qiáng)度所觀察到的底物抑制。另一方面，肽3在任一離子強(qiáng)度下都沒有顯示出溶劑粘度效應(yīng)(圖7D)。這些研究意味著肽1是粘性底物，而肽3是非粘性的。已經(jīng)報道了幾種激酶的動力學(xué)機(jī)制(參見例如Wu et al.，Biochemistry 411129-1139(2003)；Trauger et al.，Biochemistry 418948-8953(2003)；Chen et al.，Biochemistry 392079-2087(2000))。兩種肽底物在高和低的離子強(qiáng)度下，PKC-θKD初速度曲線都在圖中產(chǎn)生了在坐標(biāo)左邊和下邊相交的線。這個模式清晰表明是順序機(jī)制，其保持不受緩沖液離子強(qiáng)度影響。此外，ATP Kia值沒有什么差別，肽3在100mM NaCl時為61μM，肽1在625mM NaCl時為66μM，進(jìn)一步表明ATP從酶-ATP復(fù)合物上解離不受離子強(qiáng)度影響。在兩種條件下都發(fā)現(xiàn)Kia值小于分別是118μM和321μM的Ka值，排除了快速平衡機(jī)制。失活末端抑制和產(chǎn)物抑制研究(見表IV)與順序有序機(jī)制是一致性的，其中ATP是結(jié)合的第一底物。肽抑制劑(表I中的肽5)對兩種肽底物是競爭性的，對ATP是反競爭性的。盡管發(fā)現(xiàn)了ATP類似物AMP-PNP對ATP是競爭性的，在飽和ATP下最高達(dá)2.0mM的AMP-PNP沒有觀察到對肽1的抑制。在飽和ATP時，盡管ATP對ADP變化時觀察到了競爭性模式，肽1對ADP變化時沒有觀察到抑制。在未飽和的ATP時，當(dāng)肽1對ADP變化時，觀察到了非競爭性模式。這些抑制研究排除了PKC-θKD的隨機(jī)機(jī)制，證明ADP是釋放的最后產(chǎn)物，如圖6A所示。肽1在100mM NaCl下的初速度實驗對觀察到的底物抑制類型給出了一些理解。簡要的說，在圖8所示的有序雙反應(yīng)物體系(Segel，I.H.Enzyme KineticsBehavior and Analysis of RapidEquilibrium and Steady-State Enzyme Systems，Whiely-Interscience，1975)中，觀察到有三種類型的底物抑制。兩種是這樣的底物抑制，其中底物B形成失活末端EB復(fù)合物，或者底物A形成EAA失活末端復(fù)合物。第三種是這樣的底物抑制，其中B形成EBQ失活末端復(fù)合物。EAA失活末端復(fù)合物的形成被排除了，因為締合的第一底物是ATP，沒有觀察到ATP的底物抑制。圖5A-5D顯示了肽1在100mM NaCl和625mM NaCl下的初速度數(shù)據(jù)的重作圖。如圖5A和5B所示，抑制效應(yīng)在100mM NaCl下的斜率和截距重作圖上都發(fā)現(xiàn)了(即重作的曲線圖是非線性的)。然而，在625mM NaCl下(如圖5C和5D所示)，重作圖成為線性了，表明在高離子強(qiáng)度下最高達(dá)0.5mM肽1的抑制都被消除了。在斜率和截距重作圖上的底物抑制效應(yīng)是與非競爭性底物抑制相一致的(Cleland，W.W.，Methods Enzymol.63500-513(1979))。在有序順序機(jī)制中的非競爭性底物抑制表明形成了下面類型的非產(chǎn)物性酶復(fù)合物。兩種示于圖8中，EB和EBQ復(fù)合物。第三種可能性將是非產(chǎn)物性的EAB復(fù)合物。這明顯是可能的，因為在0mM NaCl時，底物抑制是有效的(0.129mM)，ATP濃度是約80x Km(0.025mM，在0mM NaCl下)。在順序有序機(jī)制中，ATP首先結(jié)合，就很少存在自由酶來形成EB失活末端復(fù)合物。使用硫代磷酸酯來研究不同類型的酶促磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)。在Csk激酶(Cole et al.，J.Biol.Chem.26930880-30887(1994))的情況下，ATPγS反應(yīng)速率比ATP反應(yīng)慢15到20倍。類似地，在磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PLC)的酶促機(jī)制研究中，當(dāng)未成鍵氧被硫取代時，反應(yīng)減慢105倍(Kravchuk et al.，Biochemistry 405433-5439(2001))。無論使用哪種ATP類似物，ATP或ATPγS，產(chǎn)物ADP是相同的。因此，催化速率將保持不受產(chǎn)物釋放的影響。對于PKC-θKD所觀察到的硫效應(yīng)，意味著磷酸轉(zhuǎn)移化學(xué)對酶促反應(yīng)總速率的貢獻(xiàn)。此外，以PKC-θ觀察到的很大的硫效應(yīng)反駁了圖6B中描述的Theorell-Chance有序順序動力學(xué)機(jī)制(McKay et al.，Biochemistry 358680-8685(1996))。就Theorell-Chance動力學(xué)機(jī)制來說，三元復(fù)合物是短暫的，因此意味著化學(xué)步驟非?？?。溶劑粘度效應(yīng)在確定酶促反應(yīng)限速步驟中是有價值的工具。在非化學(xué)步驟上諸如產(chǎn)物由酶擴(kuò)散以及底物擴(kuò)散到酶活性部位，發(fā)現(xiàn)了增加的溶劑粘度效應(yīng)(Blacklow et al.，Biochemistry 27，1158-1167(1988))，在單分子步驟上諸如磷酸轉(zhuǎn)移步驟沒有發(fā)現(xiàn)(Adams，J.A.，Biochemistry 42601-607(2003))。這里報道的PKC-θ溶劑粘度效應(yīng)研究表明，產(chǎn)物抑制是催化作用中的部分限速步驟。這里進(jìn)行的研究例證了PKC酶催化特征和動力學(xué)機(jī)制，從而提供了對高度類似于PKC的PKC同工型和/或AGC家族激酶的理解。所給出的結(jié)果是與順序有序機(jī)制相一致的，其中ATP首先結(jié)合，ADP最后釋放。磷酸肽釋放和磷酸轉(zhuǎn)移對限速步驟作出了貢獻(xiàn)。重要的是，在這里給出的激酶結(jié)構(gòu)域研究中，揭示了PKC-θ潛在的獨特特征。一并考慮PKC-θ的結(jié)構(gòu)特征.see Xu et al.，J.Biol.Chem.279(48)50401-50409(2004))，這些發(fā)現(xiàn)在推進(jìn)該激酶用于疾病治療的選擇性靶向中具有重要暗示。
實施例4PKC-θ底物的鑒別接著進(jìn)行肽掃描陣列以鑒別PKC-θ的肽底物。為此，如實施例3中所述，將PKC-θ從殘基362到殘基706的催化激酶結(jié)構(gòu)域克隆到pET-16b表達(dá)載體中。該載體框內(nèi)引入C末端六-組氨酸標(biāo)記到表達(dá)克隆。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21-DE3大腸桿菌株中過量表達(dá)。將10升細(xì)胞培養(yǎng)物初始生長在37℃直到O.D.為0.4，然后將溫度降到25℃，然后用0.1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在收獲前將細(xì)胞再生長3小時。將細(xì)胞重懸浮，使用微流化器在Tris 25mM pH 8.0、NaCl 25mM、2-巰基乙醇5mM、咪唑5mM、ATP 50μM和蛋白酶抑制劑中裂解。將裂解液在4℃通過批處理方法加到20ml(床)的鎳-NTA樹脂上1小時。隨后將樹脂傾倒作為層析柱，用帶有增加到25mM的咪唑的同樣緩沖液大量漂洗。洗脫步驟用200mM咪唑緩沖液實現(xiàn)。然后將蛋白質(zhì)立即加樣到陰離子交換器HQ上，用Tris 25mM pH 8.0、NaCl 25mM、DTT 5mM、ATP 50μM漂洗，然后應(yīng)用最高達(dá)500mM的NaCl線性梯度進(jìn)行分辨。合并SDS-PAGE選擇的級分，用Tris 25mM pH 8.0、DTT 5mM進(jìn)行兩倍洗脫，加樣到肝素層析柱上。將流出的蛋白質(zhì)級分立即加到羥磷灰石柱上，用Tris 25mM pH 8.0、NaCl 50mM、DTT 5mM大量漂洗。用0到100mM的磷酸鈉線性梯度洗脫目標(biāo)蛋白。然后將蛋白質(zhì)在Superdex 200大小排阻層析柱上作為單體進(jìn)行大小分級，對Tris 25mM pH 8.0、NaCl 50mM、DTT 5mM透析過夜，濃縮。就肽的點合成來說，用聚乙二醇和Fmoc-保護(hù)的氨基酸修飾的纖維素膜購自Intavis。Fmoc-保護(hù)的丙氨酸購自Chem-Impex(WoodDale，IL)。通過偶聯(lián)β-丙氨酸間隔基將陣列限定在膜上，使用標(biāo)準(zhǔn)DIC/HOBt(二異丙基碳化二亞胺/羥基苯并三唑)偶聯(lián)化學(xué)如之前所述(參見例如Molina et al.，Peptide Research 9151-155(1996)；andFrank，R.，Tetrahedron 489217-9232(1992))合成肽。使用AbimedASP 222自動機(jī)點樣活化的氨基酸。手動進(jìn)行漂洗和脫保護(hù)步驟，在最后的合成循環(huán)之后將肽N末端乙?；?。肽合成和側(cè)鏈脫保護(hù)之后，進(jìn)行激酶分析。就這些分析來說，將膜在甲醇中漂洗10分鐘，在分析緩沖液(20mM HEPESpH＝7.5，10mM MgCl2，2mM DTT，100mM NaCl和20μM ATP)中漂洗10分鐘。然后將膜用50nM PKC-θ(激酶結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基362-706)C-末端His-標(biāo)記的、在大腸桿菌中表達(dá)并純化的)在含有0.33Ci/mMolγ-32P-ATP的分析緩沖液中溫育1小時。然后將膜用含有0.1％Triton-X和100μM冷ATP的200mM磷酸鈉漂洗5次，用乙醇漂洗3次。接下來將膜干燥，用Biorad Fx成像。使用這些方法，測試了384個肽序列。這些肽的磷酸化示于圖9A。在這384個肽序列中，下面的被顯示出是PKC-θ的底物。
FARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO16)QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)KIQASFRGHMA(SEQ ID NO18)
LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)PKRPGSVHRTP(SEQ ID NO23)ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)SPLRHSFQKQQ(SEQ ID NO25)KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)RGFLRSASLGR(SEQ ID NO32)ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)DIKRLTPRFTL(SEQ ID NO34)APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)MYHNSSQKRH(SEQ ID NO36)MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)EEPVLTLVDEA(SEQ ID NO41)SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)KPFKLSGLSFK(SEQ ID NO43)AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)RVVGGSLRGAQ(SEQ ID NO50)
LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)KTRKISQSAQT(SEQ ID NO52)NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)NKRRGSVPILR(SEQ ID NO57)GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)QKKRVSMILQS(SEQ ID NO59)RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)這些肽中的一些示于圖9B，被PKC-θ磷酸化的絲氨酸以粗體表示。這些被PKC-θ磷酸化的肽序列可被包含在PKC-θ的生理底物之中，同樣地可能是通過在細(xì)胞中或體內(nèi)測試底物磷酸化的抑制而測試抑制劑生理活性的方法。此外，由于PKC-θ信號傳遞途徑中的機(jī)制，含有任意這些氨基酸殘基的生理底物可能是潛在的用于哮喘治療中的抑制或調(diào)節(jié)的治療靶。
實施例5當(dāng)IgE受體交聯(lián)到BMMC上時，發(fā)生PKC-θ激活環(huán)的可誘導(dǎo)性磷酸化和PKC-θ膜易位為考察PKC-θ激活環(huán)中的自身磷酸化(即538位蘇氨酸上)在哮喘和過敏反應(yīng)中的作用，在IgE受體在BMMC中交聯(lián)后確定了PKC-θ激活環(huán)中的自身磷酸化。為了這些研究，分離了BMMC。為此，從C57Bl/6J小鼠(商業(yè)獲自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)的骨(股骨和脛骨)提取骨髓，然后以5×105細(xì)胞/ml置于DMEM中的10％HI FCS+PS/gln和50μM βME+20ng/ml重組鼠IL-3和50ng/ml重組鼠SCF(商業(yè)獲自R&D Systems，Minneapolis，MN)中。每3-7天將細(xì)胞傳代。4周后，培養(yǎng)物就是＞95％的肥大細(xì)胞(如通過IgE受體表達(dá)和c-kit表達(dá)所確定的)。此時，將細(xì)胞培養(yǎng)在鼠IL-3僅僅為50ng/ml的上述培養(yǎng)基中。將分離的BMMC用抗-DNP(二硝基苯基)IgE處理，培養(yǎng)過夜(大約16小時)。第二天，加入DNP-BSA到培養(yǎng)物中0、2、5、30和90分鐘來觸發(fā)IgE受體交聯(lián)。接著，將處理過的BMMC在1％NP-40裂解緩沖液中裂解，將胞質(zhì)溶膠提取物(按實施例1中描述所制備的)在SDS-PAGE上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。首先用抗-磷酸T538 PKC-θ特異性抗體(Cell Signaling Technology)探查硝酸纖維素印跡，然后剝離，再用抗-PKC-θ(商業(yè)獲自Santa Cruz)探查。如圖10A所示，在過敏和哮喘的肥大細(xì)胞效應(yīng)物功能中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)IgE受體交聯(lián)時，PKC-θ的538位蘇氨酸在骨髓衍生的粘膜肥大細(xì)胞中迅速被磷酸化(圖9A)。注意到所有BMMC表達(dá)近似等量的PKC-θ，與處理方式無關(guān)(見圖10B)。不象在T細(xì)胞中觀察到的持續(xù)磷酸化(見圖1A-1C)，發(fā)現(xiàn)在肥大細(xì)胞中該位點的磷酸化是迅速而短暫的(圖10A)。如圖10A所示，發(fā)現(xiàn)激活環(huán)磷酸化發(fā)生在早至IgE受體交聯(lián)后2分鐘，交聯(lián)后30分鐘恢復(fù)到基線水平。為確定IgE受體在BMMC中交聯(lián)時是否發(fā)生PKC-θ膜易位，用抗-DNP IgE處理BMMC(如上所述分離的)培養(yǎng)過夜，加入DNP-BSA刺激0分鐘、2分鐘、5分鐘或30分鐘。然后如上面實施例1中所述將細(xì)胞裂解并分級。通過SDS-PAGE分辨膜級分、去污劑不溶的級分(DI)以及全細(xì)胞提取物(WCE)，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。然后首先用抗-PKC-θ(Santa Cruz)探查硝酸纖維素印跡，然后剝離，再用抗-FcεRIγ亞基探查膜級分和DI級分，用抗-肌動蛋白(SantaCruz)探查WCE，以證實IgE受體(即FcεR1γ亞基)在膜和DI級分上的等量表達(dá)，并證實細(xì)胞蛋白肌動蛋白在WCE中的等量表達(dá)。如圖11A所示，在交聯(lián)IgE受體2分鐘后可在膜級分中發(fā)現(xiàn)PKC-θ，在交聯(lián)30分鐘后就是清楚明顯的了。類似地，如圖11B所示，盡管在未被刺激的BMMC中(即圖11B中0分鐘)可觀察到DI級分中低水平的PKC-θ，不過在IgE受體交聯(lián)后存在的蛋白質(zhì)的量就增加了。注意到在圖11A和11B中顯示的所有泳道中都存在等量的IgE受體。因此，類似于T細(xì)胞中的信號傳遞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)IgE受體在肥大細(xì)胞中交聯(lián)時，PKC-θ迅速易位到膜的去污劑不溶的級分上。圖11C證實了這個結(jié)果并不是完全因為在不同泳道中PKC-θ量的差別，因為BMMC所有泳道在它們的全細(xì)胞提取物中都具有等量的PKC-θ。
實施例6當(dāng)IgE受體在BMMCs上交聯(lián)時，PKC-δ和PKC-β分布并未顯著改變。在IgE受體交聯(lián)后，兩種另外的PKC家族成員PKC-δ和PKC-β涉及肥大細(xì)胞功能的介導(dǎo)(Nechushtan et al.，Blood 951752-1757(2000)；Kalesnikoff et al.，J.Immunol.1684737-4746(2002)。為確定在IgE受體交聯(lián)后其它PKC家族成員是否易位到BMMC膜上，將結(jié)果示于圖11A-11C的實施例5中描述的實驗的級分(即膜、DI和WCE級分)進(jìn)行Western印跡分析，使用抗-PKC-δ(圖12A)和抗-PKC-βI/βII(圖12B)(兩者均來自Santa Cruz Biotechnology Inc.)探查印跡的PKC-δ和PKC-β(而不是PKC-θ)。如圖12A和12B所示，沒有檢測到PKC-β(圖12A)和PKC-δ(圖12B)可誘導(dǎo)的膜易位，因為在刺激(即IgE受體交聯(lián))之前和之后兩者都等量存在于細(xì)胞液、膜和去污劑不溶的級分中。這些結(jié)果證明了PKC-θ與PKC-β和PKC-δ兩者在調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞中IgE受體信號中的重要差別。
實施例7PKC-θ敲除小鼠的肥大細(xì)胞與野生型小鼠的肥大細(xì)胞不同PKC-θ敲除小鼠的研究已經(jīng)顯示PKC-θ對于TCR-介導(dǎo)的T細(xì)胞激活是必需的(Sun et al.，Nature 404402-407(2000))。關(guān)于PKC-θ敲除小鼠的BMMC是否不同于野生型小鼠的BMMC，進(jìn)行了確定。為此，根據(jù)Sun et al.，Nature 404402-407(2000)中描述的方法，獲得PKC-θ敲除小鼠，證實了T細(xì)胞增殖缺陷(數(shù)據(jù)未顯示)。在粘膜肥大細(xì)胞(MMC)和結(jié)締組織肥大細(xì)胞(CTMC)兩者中檢查了PKC-θ缺乏的效果。這些截然不同的肥大細(xì)胞表型，顆粒體成分和介質(zhì)含量、以及它們的解剖學(xué)分布都不同(參見Beil et al.，HistolHistopathol.15937-946(2000))。MMC是在肺和腸粘膜中發(fā)現(xiàn)的，含有高水平的蛋白酶類胰蛋白酶。它們的顆粒體富含蛋白聚糖硫酸軟骨素，使得細(xì)胞能夠用阿爾新藍(lán)染色。相反，在腸、皮膚和腹膜腔中發(fā)現(xiàn)的CTMC表達(dá)高水平的類胰蛋白酶和糜蛋白酶兩者，比MMC釋放相對更高水平的組胺。它們的顆粒體含有蛋白聚糖硫酸乙酰肝素，使得它們能夠用甲苯胺藍(lán)染色，但是不能用阿爾新藍(lán)。這兩種表型上截然不同的肥大細(xì)胞亞組可能在它們的體內(nèi)功能和調(diào)節(jié)方面不同(參見例如Miller and Pemberton，Immunology 105375-90(2002))，但是這些差異的確切本質(zhì)仍然在研究中。為充分研究PKC-θ對肥大細(xì)胞的影響，在PKC-θ敲除小鼠中檢查了每種肥大細(xì)胞亞組。MMC體外源自骨髓祖細(xì)胞。相反，CTMC能夠從小鼠腹膜腔以成熟形式回收。首先，在表型上比較了野生型和PKC-θ敲除小鼠的CTMC和BMMC。為此，經(jīng)腹腔灌洗分離CTMC，使用cytospin旋轉(zhuǎn)到顯微鏡載片上，用甲苯胺藍(lán)染色，然后用番紅復(fù)染?？商娲?，細(xì)胞用Wright′s-Geimsa染色。任一種染色方案都將鑒別出肥大細(xì)胞顆粒體。在腹膜肥大細(xì)胞的數(shù)量或百分比方面，或者在每個細(xì)胞的顆粒體密度或分布方面，野生型和PKC-θ敲除小鼠之間沒有明顯差別(數(shù)據(jù)未顯示)。如實施例5所述分離野生型和PKC-θ敲除小鼠的BMMC，使用Cytospin旋轉(zhuǎn)到顯微鏡載片上，然后用3％乙酸中的1％阿爾新藍(lán)染色5分鐘以染色顆粒體。細(xì)胞用番紅復(fù)染。如圖13A所示，野生型小鼠的BMMC顯示出比PKC-θ敲除小鼠的BMMC更多的顆?；?。接下來，為定量IgE受體交聯(lián)后BMMC中的顆粒化差異，采取了細(xì)胞表面膜聯(lián)蛋白染色。細(xì)胞表面膜聯(lián)蛋白染色隨脫粒而增加，與顆粒體膜融合和磷脂酰絲氨酸暴露在質(zhì)膜表面是一致的。為分析細(xì)胞表面膜聯(lián)蛋白表達(dá)，通過用0.2μg/ml IgE抗-DNP處理過夜，將源自野生型或PKC-θ敲除小鼠的BMMC與IgE抗-DNP一起加樣。第二天，收獲細(xì)胞并漂洗到PACM緩沖液中。加入FITC-膜聯(lián)蛋白，在37℃與細(xì)胞溫育3分鐘。基于時間的數(shù)據(jù)采集在配備有37℃樣品室的FACScan上開始，中斷以加入指定濃度的DNP-BSA誘導(dǎo)脫粒，然后每個樣品再繼續(xù)10分鐘。這樣，細(xì)胞在FITC-標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白存在下被誘導(dǎo)脫粒。膜聯(lián)蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)是脫粒時顆粒膜與細(xì)胞膜融合的標(biāo)志。平均熒光密度作為時間的函數(shù)作圖(圖13B)。如圖13B所示，與野生型相比，PKC-θ敲除小鼠的BMMC顯示出脫粒時更少的細(xì)胞表面膜聯(lián)蛋白染色，這與它們通過阿爾新藍(lán)染色檢驗出更低的顆粒體含量是一致的(見圖13A)。
實施例8PKC-θ敲除小鼠具有降低的IgE水平接著比較了CTMC上野生型和PKC-θ敲除小鼠的IgE受體的水平。為此，將野生型和PKC-θ敲除小鼠的腹膜腔用PIPES-EDTA緩沖液灌洗。將個體小鼠的未分級腹膜灌洗細(xì)胞漂洗到含有1％BSA的PBS(PBS-BSA)中，在冰上與5μg/ml IgE抗-DNP或者沒有抗體溫育30分鐘。將細(xì)胞在PBS-BSA中漂洗，然后用FITC-標(biāo)記的抗-小鼠IgE和PE-標(biāo)記的抗-ckit(BD-Pharmingen)染色。平均熒光密度經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)定量。如圖14A所示，與野生型相比，PKC-θ敲除小鼠具有顯著降低水平的IgE結(jié)合到CTMC表面上。相反，ckit表達(dá)水平上沒有什么差別(圖14B)。結(jié)合到CTMC的表面IgE受體上的IgE水平與動物中的循環(huán)IgE水平相關(guān)。CTMC上肥大細(xì)胞結(jié)合的IgE的降低表明PKC-θ敲除小鼠可能具有低水平的血清IgE。此外，在野生型小鼠和PKC-θ敲除小鼠的血清抗體水平之間觀察到了顯著差異。就這些研究來說，分析了野生型和PKC-θ敲除小鼠的血清樣品的IgE、IgG1和IgA含量。為此，用抗-小鼠IgE(商業(yè)獲自Pharmingen，San Diego，CA)、抗-小鼠κ輕鏈(商業(yè)獲自Sigma，St.Louis，MO)的IgA、或者抗-小鼠IgG(Fab-特異性的；Sigma)的IgG1包被Maxi-Sorp ELISA板(商業(yè)獲自Nunc，Rochester，NY)。用含有0.05％Tween-20(PBS-Tween)的PBS漂洗板，然后用含0.5％明膠的PBS室溫封閉2小時。將血清稀釋液加入PBS-Tween中，室溫溫育2到6小時。結(jié)合的檢測使用針對小鼠IgE或IgA(商業(yè)獲自Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)、或者IgG1(Pharmingen)的特異性生物素化抗體，接著使用HRP-鏈霉抗生物素蛋白(Southern Biotechnology Associates)和Sure-Blue過氧化物酶底物(商業(yè)獲自Kirkegaard and Perry Labs)。使用純化的適當(dāng)同種型的標(biāo)準(zhǔn)(Pharmingen)來定量Ig水平。這樣，使用特異性ELISAs分析個體小鼠的血清樣品的適當(dāng)抗體同種型的水平，并通過與純化的標(biāo)準(zhǔn)對照而定量。如圖15A所示，IgE水平在PKC-θ敲除小鼠中顯著降低。經(jīng)常與IgE協(xié)同調(diào)節(jié)的IgG1也被降低了。相反，與野生型相比，PKC-θ敲除小鼠中的IgA水平更高(圖15C)。實際上，發(fā)現(xiàn)了PKC-θ敲除小鼠的CTMCs具有更少的帶抗-IgE的體外脫粒(數(shù)據(jù)未顯示)，與降低水平的循環(huán)IgE和減少的肥大細(xì)胞結(jié)合的IgE相一致(見圖14A和15A)。與PKC-θ敲除小鼠中報道的T細(xì)胞激活缺陷不同，PKC-θ敲除小鼠的BMMC中沒有觀察到顯著的體外肥大細(xì)胞功能缺陷(數(shù)據(jù)未顯示)。因為這些細(xì)胞是體外源自骨髓祖細(xì)胞的，它們不受體內(nèi)IgE水平的影響，可與外源的體外IgE抗-DNP一起加樣。接著進(jìn)行研究以確定當(dāng)IgE受體與DNP-BSA交聯(lián)時，PKC-θ敲除小鼠的BMMC是否脫粒，是否產(chǎn)生白三烯，以及產(chǎn)生的細(xì)胞因子與野生型小鼠的BMMC所產(chǎn)生的細(xì)胞因子是否在類似水平。就這些研究來說，用下面的方法，將肥大細(xì)胞置于DMEM中的10％HI FCS+PS/gln和50μM βME+50ng/ml重組鼠IL-3+0.1μg/ml抗-DNP-IgE(Sigma)中過夜。將細(xì)胞在PACM(25mM PIPES，pH 7.2，含有110mM NaCl、5mM KCl、5mMCaCl2、2mM MgCl2和0.05％BSA)中漂洗，以終濃度2.5×105細(xì)胞/ml置于DNP-BSA滴定板(商業(yè)獲自Calbiochem，San Diego，CA)上以交聯(lián)IgE受體或離子霉素。就組胺、B-氨基己糖苷酶和白三烯產(chǎn)生的研究來說，將細(xì)胞在DNP-BSA或離子霉素存在下于37℃培養(yǎng)30min，然后收獲上清液，立即測試或者冷凍。脫粒和白三烯產(chǎn)生實驗的結(jié)果顯示PKC-θ敲除小鼠的BMMC具有正常水平的脫粒和白三烯產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)。最大脫粒通過用0.1％Triton X-100裂解一份細(xì)胞來確定。就β-氨基己糖苷酶來說，將上清液與0.08M檸檬酸鈉pH 4.5中的對-硝基苯基N-乙酰B-D氨基葡糖苷(Sigma)在37℃溫育過夜。12-18小時后，加入1N NaOH終止反應(yīng)，通過在分光光度計中讀取405nm的吸收來定量β-氨基己糖苷酶。在最大脫粒時沒有觀察到顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。就細(xì)胞因子產(chǎn)生分析來說，將在抗-DNP-IgE中培養(yǎng)過夜的細(xì)胞與DNP-BSA溫育以觸發(fā)IgE受體交聯(lián)6小時，然后收獲上清。使用特異于LT(C4/D4/E4)(商業(yè)獲自ALPCO(Windham，NH)的ELISA分析上清液中的白三烯，或者使用特異性ELISA分析(R&DSystems，Minneapolis，MN)來分析IL-6、IL-13或GM-CSF。如圖16A-16C所示，PKC-θ敲除小鼠的BMMC始終比野生型小鼠的BMMC產(chǎn)生更低水平的細(xì)胞因子TNF-α(圖16A)、IL-13(圖16B)和IL-6(圖16C)。接下來，將C57BL/6小鼠(The Jackson Laboratory，BarHarbor，ME)脾制成單細(xì)胞懸液，通過抗-CD4磁珠、然后通過Detach-A-bead(Dynal Biotech)分離CD4+細(xì)胞，按照廠商用法說明進(jìn)行。將細(xì)胞作為靜息T細(xì)胞分析，或者激活產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生是通過將補(bǔ)充了10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、5×10-5M 2-巰基乙醇、青霉素、鏈霉素、丙酮酸鈉和非必需氨基酸(均Gibco LifeTechnologies，Invitrogen，Carlsbad，CA的子公司)的DMEM培養(yǎng)基中的6×105CD4+細(xì)胞/ml鋪板到包被了1μg/ml抗-CD3和4μg/ml抗-CD28抗體的24-孔板中。將富含Th1的T細(xì)胞在30ng/ml rmIL-12(Wyeth，Cambridge，MA)、10U/ml rhIL-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)和5μg/ml抗-小鼠IL-4抗體的存在下培養(yǎng)。將富含TH-2的T細(xì)胞在40ng/ml rmIL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN)、10U/mlrhIL-2(Invitrogen)和5μg/ml抗-小鼠IFN-γ抗體的存在下培養(yǎng)。在刺激三天后，將細(xì)胞在缺少IL-2(5U/ml)下擴(kuò)增另外的3-4天。將靜息CD4+T細(xì)胞或者Th1或Th2效應(yīng)細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔鋪板到包被了0.5μg/ml抗-CD3(2C11)的96-孔平底板中。所有抗體均來自B-DPharMingen，San Jose，CA。3天后收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)細(xì)胞因子珠分析(FACS)分析IL-4和IL-5。如圖17A和17B所示，PKC-θ敲除小鼠的T細(xì)胞細(xì)胞因子數(shù)據(jù)顯示，這些小鼠產(chǎn)生了降低水平的兩種這些細(xì)胞因子。這些結(jié)果顯示，幼稚PKC-θ敲除小鼠缺乏循環(huán)IgE和IgG1水平，這與PKC-θ維持體內(nèi)IL-4恒定水平的作用相一致。IL-4是Th2細(xì)胞因子，在導(dǎo)致IgE和IgG1合成的Ig(免疫球蛋白)基因轉(zhuǎn)換中具有作用(參見Bacharier and Geha，J.Allergy Clin.Immunol.105(2Pt2)S547-58(2000)；以及Bergstedt-Lindqvist et al.，Eur.J.Immunol.181073-1077(1988))。顯性失活基因構(gòu)建體的T細(xì)胞表達(dá)證明PKC-θ激活了IL-4基因轉(zhuǎn)錄，這是與GDP/GTP交換因子Vav協(xié)同作用的(參見Hehner et al.，J.Immunol.1643829-3836(2000))。
實施例9PKC-θ敲除小鼠反應(yīng)于抗-IgE、或者在存在外源IgE的PCA模型中沒有耳腫的增加為確定PKC-θ是否參與IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞激活，在呼吸道疾病小鼠模型中考察被動皮膚過敏反應(yīng)(PCA)來評估PKC-θ敲除小鼠。因此，為確定PKC-θ是否與IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞激活有關(guān)，用抗-IgE(Pharmingen；0.5μg/kg，在20μl PBS中)在左耳皮內(nèi)攻擊PKC-θ-/-(即PKC-θ敲除)小鼠和C57BL/6野生型對照。作為對照，動物在對側(cè)的右耳接受20μl的PBS。在抗-IgE攻擊前，使用工程測微器確定基線耳厚度，Upright Dial Gauge(商業(yè)獲自Mitutoyo(日本))測量可低至.0001”。攻擊之后，在1小時、2小時、4小時和6小時收集耳厚度測定值，表示為基線讀數(shù)之上的增加。如圖18所示，PKC-θ敲除小鼠反應(yīng)于抗-IgE沒有耳腫增加。實際上，在抗-IgE攻擊之后，與PKC-θ敲除動物相比，野生型動物在1小時時間點的耳腫大約大2.5倍(Fig.18)。這些小鼠中降低的耳腫反應(yīng)是與細(xì)胞表面和循環(huán)IgE水平相一致的。如上所述，PKC-θ缺乏導(dǎo)致了更少的肥大細(xì)胞顆粒(圖13A-13B)和更低的IgE水平(圖14A)。這些結(jié)果可能部分地是由于對調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞功能的減弱的T細(xì)胞依賴性影響(Boyce，J.Allergy Clin.Immunol.11124-32(2003))。為提供PKC-θ是否參與IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞信號傳遞，用源自PKC-θ敲除小鼠或野生型小鼠的肥大細(xì)胞選擇性修復(fù)肥大細(xì)胞缺乏的KitW/KitW-v小鼠(商業(yè)獲自the Jackson Laboratory)的肥大細(xì)胞缺乏。換句話說，將PKC-θ敲除小鼠或正常野生型小鼠的肥大細(xì)胞轉(zhuǎn)移到KitW/KitW-v小鼠中(這種過繼轉(zhuǎn)移技術(shù)評述于Galli and Lantz，Allergy.InFundamental Immunology，W.E.Paul(ed.).pp.1137-1184.Lippincott-Raven Press，Philadelphia PA 1999；and William and Galli，J.Allergy Clin.Immunol.105(5)847-859(2000))。簡要的說，將1×106PKC-θ敲除小鼠或野生型小鼠的BMMC重懸浮在20μlDMEM中，注入7周齡的肥大細(xì)胞缺乏的KitW/KitW-v小鼠(10只動物/組)的左右耳中(1×106BMCMC/耳)。十二周之后(使得過繼轉(zhuǎn)移的肥大細(xì)胞能夠在結(jié)締組織中成熟的適當(dāng)時間周期)，通過皮內(nèi)注射IgE抗-DNP(5μg/kg)到左耳中致敏小鼠。作為對照，動物在右耳中接受0.9％鹽水。二十四小時后，靜脈內(nèi)用DNP-HSA(10mg/kg)攻擊動物。在攻擊之前以及攻擊后1小時、2小時、4小時和6小時收集基線耳測定值。結(jié)果顯示，用缺少PKC-θ的肥大細(xì)胞重構(gòu)的KitW/KitW-v小鼠在耳腫方面，與以野生型肥大細(xì)胞重構(gòu)的同樣處理的KitW/KitW-v小鼠相比，沒有顯示出差別(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明PKC-θ小鼠中的耳腫缺乏很可能是由于T細(xì)胞依賴的效應(yīng)物直接和/或間接作用于其它免疫細(xì)胞類型上。一些被抑制的并影響免疫細(xì)胞功能的T細(xì)胞細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5、TNF-α(圖17A，17B，以及未顯示的數(shù)據(jù))。然而，肥大細(xì)胞數(shù)據(jù)表明PKC-θ的抑制可能直接調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞應(yīng)答。如上所探討的，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)IgE受體交聯(lián)時PKC-θ迅速在激活環(huán)上被磷酸化(見圖10A-10B)。當(dāng)IgE受體交聯(lián)時，PKC-θ的亞細(xì)胞分布被改變了，而PKC-δ或PKC-βI/βII沒有改變(見圖11A-12B)。最重要的是，反應(yīng)于IgE，由PKC-θ敲除的BMMC產(chǎn)生了減少的細(xì)胞因子(圖16A-16C)。這些細(xì)胞是體外源自骨髓祖細(xì)胞的，不受IgE體內(nèi)水平的影響。在另一實驗中，在攻擊前24小時，通過用單克隆IgE抗-DNP(Sigma；5μg/kg，在20μl 0.9％鹽水中)皮內(nèi)注射到左耳中來被動致敏PKC-θ敲除(即PKC-θ-/-)小鼠和C57BL/6野生型對照。作為對照，動物在對側(cè)右耳中接受20μl 0.9％鹽水。二十四小時后，收集基線耳測定值，然后將動物進(jìn)行DNP-HSA(10mg/kg，在100μl 0.9％鹽水中)靜脈內(nèi)攻擊。在隨后的6小時期間(即在攻擊后1小時、2小時、4小時和6小時讀數(shù))，如上所述收集耳厚度測定值。如圖19所示，PKC-θ敲除小鼠與同樣處理的野生型對照相比，具有顯著更小的耳腫。這些PCA研究結(jié)果(圖18和19)支持了PKC-θ小分子拮抗劑在動物疾病模型中的過敏和哮喘中的用途。
實施例10與PKC-θ野生型小鼠相比，PKC-θ敲除小鼠的TH1和TH2T細(xì)胞在反應(yīng)于刺激時顯示出減少的增殖為確定PKC-θ敲除小鼠的分化T細(xì)胞在它們應(yīng)答刺激的能力方面是否正常，將野生型和PKC-θ敲除小鼠的脾細(xì)胞體外分化為TH1或TH2群，以確定在PKC-θ不表達(dá)時T輔助細(xì)胞亞組的增殖缺陷。就這些實驗來說，分離幼稚T細(xì)胞，產(chǎn)生TH1和TH2效應(yīng)細(xì)胞。為此，將C57/B6小鼠(商業(yè)獲自Taconic，Germantown，NY)的脾制成單細(xì)胞懸液。將紅細(xì)胞(RBC)用RBC裂解緩沖液(0.3g/L氯化銨于0.0M Tris-HCl緩沖液pH 7.5中)裂解，漂洗兩次。經(jīng)抗-CD4磁性顆粒、接著經(jīng)Detach-A-Bead(Dynal)，按照廠商用法說明分離CD4+細(xì)胞。將細(xì)胞作為幼稚T細(xì)胞分析，或者激活產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞。通過將處于補(bǔ)充了10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、5×10-5M2-巰基乙醇、青霉素、鏈霉素、丙酮酸鈉和非必需氨基酸(均來自GibcoLife Technologies)的DMEM培養(yǎng)基中的6×105CD4+分離細(xì)胞/ml鋪板在已包被了1μg/ml抗-CD3和4μg/ml抗-CD28的24-孔板中激活幼稚T細(xì)胞來產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞。富含TH1的T細(xì)胞(即大多數(shù)是TH1細(xì)胞的T細(xì)胞群)通過將細(xì)胞在30ng/ml重組鼠IL-12(Wyeth，Cambridge，MA)、10U/ml重組人IL-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)和5μg/ml抗-小鼠IL4存在下培養(yǎng)3天而產(chǎn)生。富含TH2的T細(xì)胞通過將細(xì)胞在40ng/ml重組鼠IL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN)、10U/ml重組人IL-2(Invitrogen)和5μg/ml抗-小鼠IFN-gamma存在下培養(yǎng)3天而產(chǎn)生。所有抗體均來自B-D PharMingen，San Jose，CA。就增殖分析來說，將TH1-或TH2-效應(yīng)細(xì)胞以1×105細(xì)胞/0.2ml/孔鋪板到已包被了各種濃度抗-CD3(2C11)的96-孔平底板中，如所示存在或不存在可溶的5μg/ml抗-CD28(克隆37.51)和/或10U/ml重組人IL-2。在第2天，用0.5μCi的[3H]胸苷(Amersham Bioscience，Piscataway，NJ)脈沖培養(yǎng)物，6-8小時后使用96-孔板收獲機(jī)收獲到過濾器上。使用液體閃爍計數(shù)器(Wallac，Gaithersburg，MD)測定摻入的放射性。所有抗體均來自B-D PharMingen，San Jose，CA。如圖20和21所示，PKC-θ敲除小鼠的TH1和TH2細(xì)胞對最佳(0.5μg/ml)和亞最佳(0.05μg/ml)抗-CD3信號強(qiáng)度的TCR刺激(分別為圖20C和圖21C)以及TCR/CD28共刺激(分別為圖20A和圖21A)的增殖反應(yīng)顯著降低。外源IL-2的加入不依賴于PKC-θ的途徑支持T細(xì)胞增殖部分地克服了PKC-θ敲除小鼠的幼稚TH0、TH1和TH2細(xì)胞增殖反應(yīng)降低，但是只是在最佳的0.5μg/ml抗-CD3信號(圖20B有抗-CD28，圖20D沒有抗-CD28)時與TCR/CD28共刺激協(xié)同才行。在亞最佳的0.05μg/ml抗-CD3時，CD28共刺激未能克服PKC-θ敲除小鼠細(xì)胞增殖的幾乎完全缺乏(圖21A)。在這些條件下只有中度的外源IL-2效應(yīng)(圖21B和21D)，PKC-θ敲除小鼠的TH2細(xì)胞增殖保留了野生型小鼠TH2細(xì)胞增殖的大約30％。這些結(jié)果與由PKC-θ敲除T細(xì)胞抑制IL-2產(chǎn)生(參見例如Sun et al.，Nature 404402-407(2000))一起，表明TCR-刺激誘導(dǎo)的增殖不能被TH0、TH1和TH2細(xì)胞維持，前提是PKC-θ活性在這些細(xì)胞中被抑制。連同降低的TH2細(xì)胞因子產(chǎn)生，這些T輔助細(xì)胞因此將不會作為最佳效應(yīng)細(xì)胞起作用來介導(dǎo)哮喘和過敏性疾病生理學(xué)中的T細(xì)胞依賴的途徑。由于這些發(fā)現(xiàn)，發(fā)明進(jìn)一步的方面是靶向TH2 T細(xì)胞中的PKC-θ。因此，發(fā)明進(jìn)一步提供了通過靶向TH2 T細(xì)胞中的PKC-θ來預(yù)防和/或減輕哮喘癥狀的治療干預(yù)。盡管已經(jīng)在附圖和前述說明書中詳細(xì)例證并描述了發(fā)明，然而同樣被認(rèn)為是例證性的并在性質(zhì)上沒有限制性，要理解的是已經(jīng)顯示和描述的僅僅是優(yōu)選實施方案，在發(fā)明精神范圍之內(nèi)的所有改變和修正是期望被保護(hù)的。
序列表SEQ ID NO1GenBankNM_006257人PKC-θMSPFLRIGLSNFDCGSCQSCQGEAVNPYCAVLVKEYVESENGQMYIQKKPTMYPPWDSTFDAHINKGRVMQIIVKGKNVDLISETTVELYSLAERCRKNNGKTEIWLELKPQGRMLMNARYFLEMSDTKDMNEFETEGFFALHQRRGAIKQAKVHHVKCHEFTATFFPQPTFCSVCHEFVWGLNKQGYQCRQCNAAIHKKCIDKVIAKCTGSAINSRETMFHKERFKIDMPHRFKVYNYKSPTFCEHCGTLLWGLARQGLKCDACGMNVHHRCQTKVANLCGINQKLMAEALAMIESTQQARCLRDTEQIFREGPVEIGLPCSIKNEARPPCLPTPGKREPQGISWESPLDEVDKMCHLPEPELNKERPSLQIKLKIEDFILHKMLGKGSFGKVFLAEFKKTNQFFAIKALKKDVVLMDDDVECTMVEKRVLSLAWEHPFLTHMFCTFQTKENLFFVMEYLNGGDLMYHIQSCHKFDLSRATFYAAEIILGLQFLHSKGIVYRDLKLDNILLDKDGHIKIADFGMCKENMLGDAKTNTFCGTPDYIAPEILLGQKYNHSVDWWSFGVLLYEMLIGQSPFHGQDEEELFHSIRMDNPFYPRWLEKEAKDLLVKLFVREPEKRLGVRGDIRQHPLFREINWEELERKEIDPPFRPKVKSPFDCSNFDKEFLNEKPRLSFADRALINSMDQNMFRNFSFMNPGMERLISSEQ ID NO3人PKC-θ核苷酸1 tgctcgctcc agggcgcaac catgtcgcca tttcttcgga ttggcttgtc caactttgac61 tgcgggtcct gccagtcttg tcagggcgag gctgttaacc cttactgtgc tgtgctcgtc121 aaagagtatg tcgaatcaga gaacgggcag atgtatatcc agaaaaagcc taccatgtac181 ccaccctggg acagcacttt tgatgcccat atcaacaagg gaagagtcat gcagatcatt241 gtgaaaggca aaaacgtgga cctcatctct gaaaccaccg tggagctcta ctcgctggct301 gagaggtgca ggaagaacaa cgggaagaca gaaatatggt tagagctgaa acctcaaggc361 cgaatgctaa tgaatgcaag atactttctg gaaatgagtg acacaaagga catgaatgaa421 tttgagacgg aaggcttctt tgctttgcat cagcgccggg gtgccatcaa gcaggcaaag481 gtccaccacg tcaagtgcca cgagttcact gccaccttct tcccacagcc cacattttgc541 tctgtctgcc acgagtttgt ctggggcctg aacaaacagg gctaccagtg ccgacaatgc601 aatgcagcaa ttcacaagaa gtgtattgat aaagttatag caaagtgcac aggatcagct661 atcaatagcc gagaaaccat gttccacaag gagagattca aaattgacat gccacacaga721 tttaaagtct acaattacaa gagcccgacc ttctgtgaac actgtgggac cctgctgtgg781 ggactggcac ggcaaggact caagtgtgat gcatgtggca tgaatgtgca tcatagatgc841 cagacaaagg tggccaacct ttgtggcata aaccagaagc taatggctga agcgctggcc901 atgattgaga gcactcaaca ggctcgctgc ttaagagata ctgaacagat cttcagagaa961 ggtccggttg aaattggtct cccatgctcc atcaaaaatg aagcaaggcc gccatgttta
1021 ccgacaccgg gaaaaagaga gcctcagggc atttcctggg agtctccgtt ggatgaggtg1081 gataaaatgt gccatcttcc agaacctgaa ctgaacaaag aaagaccatc tctgcagatt1141 aaactaaaaa ttgaggattt tatcttgcac aaaatgttgg ggaaaggaag ttttggcaag1201 gtcttcctgg cagaattcaa gaaaaccaat caatttttcg caataaaggc cttaaagaaa1261 gatgtggtct tgatggacga tgatgttgag tgcacgatgg tagagaagag agttctttcc1321 ttggcctggg agcatccgtt tctgacgcac atgttttgta cattccagac caaggaaaac1381 ctcttttttg tgatggagta cctcaacgga ggggacttaa tgtaccacat ccaaagctgc1441 cacaagttcg acctttccag agcgacgttt tatgctgctg aaatcattct tggtctgcag1501 ttccttcatt ccaaaggaat agtctacagg gacctgaagc tagataacat cctgttagac1561 aaagatggac atatcaagat cgcggatttt ggaatgtgca aggagaacat gttaggagat1621 gccaagacga ataccttctg tgggacacct gactacatcg ccccagagat cttgctgggt1681 cagaaataca accactctgt ggactggtgg tccttcgggg ttctccttta tgaaatgctg1741 attggtcagt cgcctttcca cgggcaggat gaggaggagc tcttccactc catccgcatg1801 gacaatccct tttacccacg gtggctggag aaggaagcaa aggaccttct ggtgaagctc1861 ttcgtgcgag aacctgagaa gaggctgggc gtgaggggag acatccgcca gcaccctttg1921 tttcgggaga tcaactggga ggaacttgaa cggaaggaga ttgacccacc gttccggccg1981 aaagtgaaat caccatttga ctgcagcaat ttcgacaaag aattcttaaa cgagaagccc2041 cggctgtcat ttgccgacag agcactgatc aacagcatgg accagaatat gttcaggaac2101 ttttccttca tgaaccccgg gatggagcgg ctgatatcct gaatcttgcc cctccagaga2161 caggaaagaa tttgccttct ccctgggaac tggttcaaga gacactgctt gggttccttt2221 ttcaacttgg aaaaagaaag aaacactcaa caataaagac tgagacccgt tcgcccccat2281 gtgactttat ctgtagcaga aaccaagtct acttcactaa tgacgatgcc gtgtgtctcg2341 tctcctgaca tgtctcacag acgctcctga agttaggtca ttactaacca tagttattta2401 cttgaaagat gggtctccgc acttggaaag gtttcaagac ttgatactgc aataaattat2461 ggctcttcac ctgggcgcca actgctgatc aacgaaatgc ttgttgaatc aggggcaaac2521 ggagtacaga cgtctcaaga ctgaaacggc cccattgcct ggtctagtag cggatctcac2581 tcagccgcag acaagtaatc actaacccgt tttattctat cctatctgtg gatgtataaa2641 tgctgggggc cagccctgga taggttttta tgggaattct ttacaataaa catagcttgt2701 acttgllSEQ ID NO2NM_008859鼠PKC-θ氨基酸序列
MSPFLRIGLSNFDCGTCQACQGEAVNPYCAVLVKEYVESENGQMYIQKKPTMYPPWDSTFDAHINKGRVMQIIVKGKNVDLISETTVELYSLAERCRKNNGRTEIWLELKPQGRMLMNARYFLEMSDTKDMSEFENEGFFALHQRRGAIKQAKVHHVKCHEFTATFFPQPTFCSVCHEFVWGLNKQGYQCRQCNAAIHKKCIDKVIAKCTGSAINSRETMFHKERFKIDMPHRFKVYNYKSPTFCEHCGTLLWGLARQGLKCDACGMNVHHRCQTKVANLCGINQKLMAEALAMIESTQQARSLRDSEHIFREGPVEIGLPCSTKNETRPPCVPTPGKREPQGISWDSPLDGSNKSAGPPEPEVSMRRTSLQLKLKIDDFILHKMLGKGSFGKVFLAEFKRTNQFFAIKALKKDVVLMDDDVECTMVEKRVLSLAWEHPFLTHMFCTFQTKENLFFVMEYLNGGDLMYHIQSCHKFDLSRATFYAAEVILGLQFLHSKGIVYRDLKLDNILLDRDGHIKIADFGMCKENMLGDAKTNTFCGTPDYIAPEILLGQKYNHSVDWWSFGVLVYEMLIGQSPFHGQDEEELFHSIRMDNPFYPRWLEREAKDLLVKLFVREPEKRLGVRGDIRQHPLFREINWEELERKEIDPPFRPKVKSPYDCSNFDKEFLSEKPRLSFADRALINSMDQNMFSNFSFINPGMETLICS″SEQ ID NO4鼠PKC-θ核苷酸序列1 cttgggtcgc caggcccgcg ccagtccccg ccatccgagc aacagcggcg ctgctctggg61 accgcggccg cgacaccagg gaacaaccat gtcaccgttt cttcgaatcg gtttatccaa121 ctttgactgt gggacctgcc aagcttgtca gggagaggca gtgaacccct actgcgctgt181 gcttgtcaaa gagtatgtgg aatcagaaaa tgggcagatg tacatccaga aaaagccaac241 catgtaccca ccttgggaca gcacctttga cgcccacatt aacaagggaa gggtgatgca301 gatcatcgtg aagggcaaga atgtagacct catctcagaa acaaccgtgg aactctactc361 cctggcggag agatgccgca agaacaatgg gcggacagaa atatggttag agctgaaacc421 tcaaggccga atgctaatga atgcaagata ctttctggaa atgagtgaca caaaggacat481 gagtgagttt gagaatgaag gattctttgc actgcatcag cgccgaggag ccatcaaaca541 ggccaaagtc caccatgtca agtgtcacga gttcacggcc acctttttcc ctcaacccac601 attttgctct gtctgccatg aatttgtctg gggcctgaac aagcagggtt accagtgccg661 acagtgtaat gcagcgattc acaagaagtg cattgataaa gtgatagcca agtgcacagg721 atccgcaatc aatagccgag aaaccatgtt ccataaggag agattcaaga tcgacatgcc781 acacagattc aaagtctaca actacaagag tccaaccttc tgtgagcact gtggtaccct841 gctctggggg ctggcgaggc aaggactcaa atgtgatgca tgtggcatga acgtccacca901 ccgatgccag acaaaggttg ccaatctttg tggtataaac cagaagctaa tggctgaagc961 actagcgatg attgaaagca cccaacaggc tcgctcctta cgagattcag aacacatctt1021 ccgagaaggc ccagttgaaa ttggtctccc atgctccacc aaaaacgaaa ccaggccacc1081 atgcgtacca acacctggga aaagagaacc ccagggcatt tcctgggatt cccctttgga1141 tgggtcaaat aaatcggccg gtcctcctga acccgaagtg agcatgcgca ggacttcact1201 gcagctgaaa ctgaagatcg atgacttcat cctgcacaag atgttgggaa aaggaagttt1261 tggcaaggtc ttcctggcag agttcaagag aaccaatcag tttttcgcaa taaaagcctt1321 aaagaaagat gtggtgttga tggatgatga cgtcgagtgt acaatggtgg aaaagagggt
1381 tctgtccttg gcatgggagc atccatttct aacacacatg ttctgcacat tccagaccaa1441 ggaaaatctc tttttcgtga tggagtatct caatggaggc gacttaatgt accacatcca1501 aagttgccac aaatttgatc tttccagagc cacgttttat gctgctgagg tcatccttgg1561 tctgcagttc cttcattcca aaggaattgt ctacagggac ctgaagcttg ataatatcct1621 gttagacaga gatggacata tcaaaatagc agactttggg atgtgcaaag agaacatgct1681 aggagatgcg aagacaaata ctttctgtgg aactcctgac tacattgctc cggagatctt1741 gctgggtcag aagtacaacc attccgtcga ctggtggtcc ttcggggtgc tcgtttatga1801 gatgctgatt ggccagtccc ccttccacgg gcaggacgag gaggagctgt tccactccat1861 ccgcatggac aaccccttct acccgaggtg gctcgaaagg gaggccaagg accttctagt1921 gaagcttttt gtgagagaac ctgagaagag gctgggagtg agaggagaca tccgccagca1981 tcctttgttt cgagagatca actgggaaga gcttgaaagg aaagagattg acccaccctt2041 cagaccaaaa gtgaaatcac catatgactg tagcaatttc gacaaggaat tcctaagtga2101 gaaaccccgg ctatcattcg ccgacagagc actcatcaac agcatggacc agaacatgtt2161 cagcaacttt tccttcatta acccagggat ggagactctc atttgctcct gaacctcatc2221 tgtctccaga ctggaaggga tttgccttct ctctgggaac tggttcaagt aacacttctg2281 ggggtggggg tctctttttc acgttagaga agaaaagaaa cactgcaaag gcagggagga2341 ctcctgagct ccttgtgtga cttgttacct acagcacaaa ccacgcctac ttcactaatg2401 acatcatccc taatgacatc atcccgttat atctcctgga atctctcaca gcagcccttg2461 aagttagatc attattaact ctagtcattt acttgaaaga tggttcccga tgctgtgaaa2521 gattcgaaat gcagttctgc tcttgcccta gacaacagct gctggttggt gatgaaccaa2581 ggcgcaagtg gaacagattt ctcaagactg gagcagtgat cgcctgttat agaagtcaat2641 tccactcaac cacagagaag gaaccactaa gccacgttga tgtgtgcatg tctgtggaaa2701 tgtcgatgac agaagggagg gaaaggggaa gctctgagca gattgtaatg ggaagctctc2761 caataaacat agcatgaaac ttgaaattta caaatctgtt cattctggct agccccaaaa2821 ttcccaaggc agaggaaagt aaagggcagt gagcttagca gagccctttg tcgccaacag2881 ggaagggtaa ggatgtcgcc tacgtggaac aacttataca cacagaagga aagtataacc2941 aacaagggca gggtggttta cagctgccaa tcaaacctgc cctcccccct ctgttctcag3001 ttgatctctc tgtcagcgta ggtaggcact cattaccatc ctcccatcat acaagaaata3061 aaatgcatga ctcttctaag ataaagaaaa ccaatccctt atcacgttgt tcccagtgat3121 ttgatggcaa ataagtccct ccttaggcat cctgcaagac aacccaaccc atgcatgcta3181 tttgcagtag tcagtcctgt tgagttagag tcctaactat acacaatatc gtgcgatgtt3241 tatatatgtt gatgagatgt tgtgatgata acgtggatat gtaaaaggga ataaaagaag3301 aaagaaagat gccKKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)FARKGSLRQKN(SEQ ID NO6)CAGAATATGTTCAGGAACTTTTCCTTCATGAACCCCG(SEQ ID NO7)QNMFRNFSFMNP(SEQ ID NO8)，
GGAGATGCCAAGACGAATACCTTCTGTGGGACACCT(SEQ ID NO9)GDAKTNTFCGTP(SEQ ID NO10)，SEQ ID NO11PKCθ全長C-末端HA標(biāo)記的nt序列atgtcgccatttcttcggattggcttgtccaactttgactgcgggtcctgccagtcttgtcagggcgaggctgttaacccttactgtgctgtgctcgtcaaagagtatgtcgaatcagagaacgggcagatgtatatccagaaaaagcctaccatgtacccaccctgggacagcacttttgatgcccatatcaacaagggaagagtcatgcagatcattgtgaaaggcaaaaacgtggacctcatctctgaaaccaccgtggagctctactcgctggctgagaggtgcaggaagaacaacgggaagacagaaatatggttagagctgaaacctcaaggccgaatgctaatgaatgcaagatactttctggaaatgagtgacacaaaggacatgaatgaatttgagacggaaggcttctttgctttgcatcagcgccggggtgccatcaagcaggcaaaggtccaccacgtcaagtgccacgagttcactgccaccttcttcccacagcccacattttgctctgtctgccacgagtttgtctggggcctgaacaaacagggctaccagtgccgacaatgcaatgcagcaattcacaagaagtgtattgataaagttatagcaaagtgcacaggatcagctatcaatagccgagaaaccatgttccacaaggagagattcaaaattgacatgccacacagatttaaagtctacaattacaagagcccgaccttctgtgaacactgtgggaccctgctgtggggactggcacggcaaggactcaagtgtgatgcatgtggcatgaatgtgcatcatagatgccagacaaaggtggccaacctttgtggcataaaccagaagctaatggctgaagcgctggccatgattgagagcactcaacaggctcgctgcttgagagatactgaacagatcttcagagaaggtccggttgaaattggtctcccatgctccatcaaaaatgaagcaaggccgccatgtttaccgacaccgggaaaaagagagcctcagggcatttcctgggagtctccgttggatgaggtggataaaatgtgccatcttccagaacctgaactgaacaaagaaagaccatctctgcagattaaactaaaaattgaggattttatcttgcacaaaatgttggggaaaggaagttttggcaaggtcttcctggcagaattcaagaaaaccaatcaatttttcgcaataaaggccttaaagaaagatgtggtcttgatggacgatgatgttgagtgcacgatggtagagaagagagttctttccttggcctgggagcatccgtttctgacgcacatgttttgtacattccagaccaaggaaaacctcttttttgtgatggagtacctcaacggaggggacttaatgtaccacatccaaagctgccacaagttcgacctttccagagcgacgttttatgctgctgaaatcattcttggtctgcagttccttcattccaaaggaatagtctacagggacctgaagctagataacatcctgttagacaaagatggacatatcaagatcgcggattttggaatgtgcaaggagaacatgttaggagatgccaagacgaataccttctgtgggacacctgactacatcgccccagagatcttgctgggtcagaaatacaaccactctgtggactggtggtccttcggggttctcctttatgaaatgctgattggtcagtcgcctttccacgggcaggatgaggaggagctcttccactccatccgcatggacaatcccttttacccacggtggctggagaaggaagcaaaggaccttctggtgaagctcttcgtgcgagaacctgagaagaggctgggcgtgaggggagacatccgccagcaccctttgtttcgggagatcaactgggaggaacttgaacggaaggagattgacccaccgttccggccgaaagtgaaatcaccatttgactgcagcaatttcgacaaagaattcttaaacgagaagccccggctgtcatttgccgacagagcactgatcaacagcatggaccagaatatgttcaggaacttttccttcatgaaccccgggatggagcggctgatatcctacccatacgatgttccagattacgcttagSEQ ID NO12PKCθ全長C-末端HA標(biāo)記的aa序列MSPFLRIGLSNFDCGSCQSCQGEAVNPYCAVLVKEYVESENGQMYIQKKPTMYPPWDSTFDAHINKGRVMQIIVKGKNVDLISETTVELYSLAERCRKNNGKTEIWLELKPQGRMLMNARYFLEMSDTKDMNEFETEGFFALHQRRGAIKQAKVHHVKCHEFTATFFPQPTFCSVCHEFVWGLNKQGYQCRQCNAAIHKKCIDKVIAKCTGSAINSRETMFHKERFKIDMPHRFKVYNYKSPTFCEHCGTLLWGLARQGLKCDACGMNVHHRCQTKVANLCGINQKLMAEALAMIESTQQARCLRDTEQIFREGPVEIGLPCSIKNEARPPCLPTPGKREPQGISWESPLDEVDKMCHLPEPELNKERPSLQIKLKIEDFILHKMLGKGSFGKVFLAEFKKTNQFFAIKALKKDVVLMDDDVECTMVEKRVLSLAWEHPFLTHMFCTFQTKENLFFVMEYLNGGDLMYHIQSCHKFDLSRATFYAAEIILGLQFLHSKGIVYRDLKLDNILLDKDGHIKIADFGMCKENMLGDAKTNTFCGTPDYIAPEILLGQKYNHSVDWWSFGVLLYEMLIGQSPFHGQDEEELFHSIRMDNPFYPRWLEKEAKDLLVKLFVREPEKRLGVRGDI
RQHPLFREINWEELERKEIDPPFRPKVKSPFDCSNFDKEFLNEKPRLSFADRALINSMDQNMFRNFSFMNPGMERLISYPYDVPDYASEQ ID NO13；PKCθ全長K409W激酶失活C-末端HA標(biāo)記的nt序列atgtcgccatttcttcggattggcttgtccaactttgactgcgggtcctgccagtcttgtcagggcgaggctgttaacccttactgtgctgtgctcgtcaaagagtatgtcgaatcagagaacgggcagatgtatatccagaaaaagcctaccatgtacccaccctgggacagcacttttgatgcccatatcaacaagggaagagtcatgcagatcattgtgaaaggcaaaaacgtggacctcatctctgaaaccaccgtggagctctactcgctggctgagaggtgcaggaagaacaacgggaagacagaaatatggttagagctgaaacctcaaggccgaatgctaatgaatgcaagatactttctggaaatgagtgacacaaaggacatgaatgaatttgagacggaaggcttctttgctttgcatcagcgccggggtgccatcaagcaggcaaaggtccaccacgtcaagtgccacgagttcactgccaccttcttcccacagcccacattttgctctgtctgccacgagtttgtctggggcctgaacaaacagggctaccagtgccgacaatgcaatgcagcaattcacaagaagtgtattgataaagttatagcaaagtgcacaggatcagctatcaatagccgagaaaccatgttccacaaggagagattcaaaattgacatgccacacagatttaaagtctacaattacaagagcccgaccttctgtgaacactgtgggaccctgctgtggggactggcacggcaaggactcaagtgtgatgcatgtggcatgaatgtgcatcatagatgccagacaaaggtggccaacctttgtggcataaaccagaagctaatggctgaagcgctggccatgattgagagcactcaacaggctcgctgcttgagagatactgaacagatcttcagagaaggtccggttgaaattggtctcccatgctccatcaaaaatgaagcaaggccgccatgtttaccgacaccgggaaaaagagagcctcagggcatttcctgggagtctccgttggatgaggtggataaaatgtgccatcttccagaacctgaactgaacaaagaaagaccatctctgcagattaaactaaaaattgaggattttatcttgcacaaaatgttggggaaaggaagttttggcaaggtcttcctggcagaattcaagaaaaccaatcaatttttcgcaatatgggccttaaagaaagatgtggtcttgatggacgatgatgttgagtgcacgatggtagagaagagagttctttccttggcctgggagcatccgtttctgacgcacatgttttgtacattccagaccaaggaaaacctcttttttgtgatggagtacctcaacggaggggacttaatgtaccacatccaaagctgccacaag tcgacctttccagagcgacgttttatgctgctgaaatcattcttggtctgcagttccttcattccaaaggaatagtctacagggacctgaagctagataacatcctgttagacaaagatggacatatcaagatcgcggattttggaatgtgcaaggagaacatgttaggagatgccaagacgaataccttctgtgggacacctgactacatcgccccagagatcttgctgggtcagaaatacaaccactctgtggactggtggtccttcggggttctcctttatgaaatgctgattggtcagtcgcctttccacgggcaggatgaggaggagctcttccactccatccgcatggacaatcccttttacccacggtggctggagaaggaagcaaaggaccttctggtgaagctcttcgtgcgagaacctgagaagaggctgggcgtgaggggagacatccgccagcaccctttgtttcgggagatcaactgggaggaacttgaacggaaggagattgacccaccgttccggccgaaagtgaaatcaccatttgactgcagcaatttcgacaaagaattcttaaacgagaagccccggctgtcatttgccgacagagcactgatcaacagcatggaccagaatatgttcaggaacttttccttcatgaaccccgggatggagcggctgatatcctacccatacgatgttccagattacgcttagSEQ I DNO14PKCθ全長K409W激酶失活C-末端HA標(biāo)記的aa序列MSPFLRIGLSNFDCGSCQSCQGEAVNPYCAVLVKEYVESENGQMYIQKKPTMYPPWDSTFDAHINKGRVMQIIVKGKNVDLISETTVELYSLAERCRKNNGKTEIWLELKPQGRMLMNARYFLEMSDTKDMNEFETEGFFALHQRRGAIKQAKVHHVKCHEFTATFFPQPTFCSVCHEFVWGLNKQGYQCRQCNAAIHKKCIDKVIAKCTGSAINSRETMFHKERFKIDMPHRFKVYNYKSPTFCEHCGTLLWGLARQGLKCDACGMNVHHRCQTKVANLCGINQKLMAEALAMIESTQQARCLRDTEQIFREGPVEIGLPCSIKNEARPPCLPTPGKREPQGISWESPLDEVDKMCHLPEPELNKERPSLQIKLKIEDFILHKMLGKGSFGKVFLAEFKKTNQFFAIWALKKDVVLMDDDVECTMVEKRVLSLAWEHPFLTHMFCTFQTKENLFFVMEYLNGGDLMYHIQSCHKFDLSRATFYAAEIILGLQFLHSKGIVYRDLKLDNILLDKDGHIKIADFGMCKENMLGDAKTNTFCGTPDYIAPEILLGQKYNHSVDWWSFGVLLYEMLIGQSPFHGQDEEELFHSIRMDNPFYPRWLEKEAKDLLVKLFVREPEKRLGVRGDIRQHPLFREINWEELERKEIDPPFRPKVKSPFDCSNFDKEFLNEKPRLSFADRALINSMDQNMFRNFSFMNPGMERLISYPYDVPDYA.
FARKGSLRQ；SEQ ID NO15)KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO16)QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)KIQASFRGHMA(SEQ ID NO18)LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)PKRPGSVHRTP(SEQ ID NO23)ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)SPLRHSFQKQQ(SEQ ID NO25)KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)QAWSKTTRRI(SEQ ID NO31)RGFLRSASLGR(SEQ ID NO32)ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)DIKRLTPRFTL(SEQ ID NO34)APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)MYHNSSQKRH(SEQ ID NO36)MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)EEPVLTLVDEA(SEQ ID NO41)SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)KPFKLSGLSFK(SEQ ID NO43)AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)RVVGGSLRGAQ(SEQ ID NO50)LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)KTRKISQSAQT(SEQ ID NO52)NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)
NKRRGSVPILR(SEQ ID NO57)GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)QKKRVSMILQS(SEQ ID NO59)RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)SEQ ID NO61PELNKERP SLQIKLKIED FILHKMLGKG SFGKVFLAEF KKTNQFFAIKALKKDVVLMD DDVECTMVEK RVLSLAWEHP FLTHMFCTFQ TKENLFFVMEYLNGGDLMYH IQSCHKFDLS RATFYAAEII LGLQFLHSKG IVYRDLKLDNILLDKDGHIK IADFGMCKEN MLGDAKTNTF CGTPDYIAPE ILLGQKYNHSVDWWSFGVLL YEMLIGQSPF HGQDEEELFH SIRMDNPFYP RWLEKEAKDLLVKLFVREPE KRLGVRGDIR QHPLFREINW EELERKEIDP PFRPKVKSPFDCSNFDKEFL NEKPRLSFAD RALINSMDQN MFRNFSFMNP GMERLISSEQ ID NO62MGPELNKERP SLQIKLKIED FILHKMLGKG SFGKVFLAEF KKTNQFFAIKALKKDVVLMD DDVECTMVEK RVLSLAWEHP FLTHMFCTFQ TKENLFFVMEYLNGGDLMYH IQSCHKFDLS RATFYAAEII LGLQFLHSKG IVYRDLKLDNILLDKDGHIK IADFGMCKEN MLGDAKTNTF CGTPDYIAPE ILLGQKYNHSVDWWSFGVLL YEMLIGQSPF HGQDEEELFH SIRMDNPFYP RWLEKEAKDLLVKLFVREPE KRLGVRGDIR QHPLFREINW EELERKEIDP PFRPKVKSPFDCSNFDKEFL NEKPRLSFAD RALINSMDQN MFRNFSFMNP GMERLISSEQ ID NO63MGPELNKERP SLQIKLKIED FILHKMLGKG SFGKVFLAEF KKTNQFFAIKALKKDVVLMD DDVECTMVEK RVLSLAWEHP FLTHMFCTFQ TKENLFFVMEYLNGGDLMYH IQSCHKFDLS RATFYAAEII LGLQFLHSKG IVYRDLKLDNILLDKDGHIK IADFGMCKEN MLGDAKTNTF CGTPDYIAPE ILLGQKYNHSVDWWSFGVLL YEMLIGQSPF HGQDEEELFH SIRMDNPFYP RWLEKEAKDLLVKLFVREPE KRLGVRGDIR QHPLFREINW EELERKEIDP PFRPKVKSPFDCSNFDKEFL NEKPRLSFAD RALINSMDQN MFRNFSFMNP GMERLISHHHHHHNFSFMNPGMER(SEQ ID NO64)ALINSMDQNMFR(SEQ ID NO65)TNTFCGTPDYIAPEILLGQK(SEQ ID NO66)
權(quán)利要求
1.用于鑒別PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑的方法，包括(a)將PKC-θ蛋白或其功能性片段與測試試劑接觸；以及(b)確定測試試劑是否調(diào)節(jié)PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性，其中在測試試劑存在下，PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性的變化表明PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中降低激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制劑。
3.權(quán)利要求1的方法，其中增加激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活劑。
4.權(quán)利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白是全長PKC-θ蛋白。
5.權(quán)利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白是全長PKC-θ蛋白的功能性變體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中功能性片段是PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求1的方法，其中確定步驟包括比較測試試劑相對于不存在測試試劑的條件下的激酶活性。
8.權(quán)利要求1的方法，其中接觸步驟是通過提供PKC-θ蛋白或其功能性片段與測試試劑的反應(yīng)混合物而實現(xiàn)的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中反應(yīng)混合物是在含有選自50mM-100mM、100-150mM、150-200mM和200-250mM以及250-300mM的濃度的NaCl的緩沖液中。
10.權(quán)利要求9的方法，其中NaCl濃度是250mM。
11.權(quán)利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白或其片段是從原核細(xì)胞獲得的。
12.權(quán)利要求11的方法，其中原核細(xì)胞是大腸桿菌。
13.權(quán)利要求1的方法，其中接觸步驟是在細(xì)胞中實現(xiàn)的。
14.權(quán)利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑對于治療哺乳動物哮喘是有用的。
15.權(quán)利要求14的方法，其中哺乳動物是人。
16.權(quán)利要求14的方法，其中哮喘是IgE-介導(dǎo)的哮喘。
17.權(quán)利要求1的方法，其中激酶活性是PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化。
18.權(quán)利要求17的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1的選自695位絲氨酸殘基、685位絲氨酸殘基、538位蘇氨酸殘基和536位蘇氨酸殘基的氨基酸殘基上。
19.權(quán)利要求18的方法，其中自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1的538位蘇氨酸殘基上。
20.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)進(jìn)一步包括將PKC-θ蛋白或其功能性片段與測試試劑和PKC-θ底物相接觸。
21.權(quán)利要求20的方法，其中激酶活性是PKC-θ底物的磷酸化。
22.權(quán)利要求20的方法，其中PKC-θ底物含有R-X-X-S基序或者R-X-X-T基序，其中R是精氨酸，X是未知的或任何已知的氨基酸，S是絲氨酸，T是蘇氨酸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中PKC-θ底物具有選自如下的氨基酸序列KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ARKGSLRQKN(SEQ IDNO6)，F(xiàn)ARKGSLRQ(SEQ ID NO15)，KKRFSFKKSFK(SEQ IDNO16)，QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)，KIQASFRGHMA(SEQID NO18)，LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)，AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)，VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)，KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)，PKRPGSVHRTP(SEQ IDNO23)，ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)，SPLRHSFQKQQ(SEQID NO25)，KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)，IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)，KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)，RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)，MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)，QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)，RGFLRSASLGR(SEQ IDNO32)，ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)，DIKRLTPRFTL(SEQID NO34)，APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)，MYHNSSQKRH(SEQID NO36)，MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)，TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)，LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)，ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)，EEPVLTLVDEA(SEQ IDNO41)，SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)，KPFKLSGLSFK(SEQID NO43)，AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)，ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)，VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)，KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)，WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)，GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)，RVVGGSLRGAQ(SEQ IDNO50)，LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)，KTRKISQSAQT(SEQID NO52)，NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)，SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)，NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)，RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)，NKRRGSVPILR(SEQ IDNO57)，GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)，QKKRVSMILQS(SEQID NO59)，和RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)。
24.權(quán)利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑使PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性降低至少兩倍。
25.權(quán)利要求1的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段是在細(xì)胞中的。
26.權(quán)利要求25的方法，其中細(xì)胞選自肥大細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞。
27.權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括在體外或體內(nèi)哮喘模型中評估步驟(b)中鑒別的測試試劑的效力，其中在體外或體內(nèi)哮喘模型中顯示出相對于對照試劑效力增加的測試試劑就被鑒別為對于治療哮喘是有用的。
28.用于鑒別PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑的方法，包括(a)將表達(dá)PKC-θ蛋白或其功能性片段的細(xì)胞與測試試劑接觸；以及(b)確定測試試劑是否減少PKC-θ蛋白或其功能性片段在細(xì)胞中的自身磷酸化，其中在測試試劑存在下，PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化的變化表明PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中降低激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的抑制劑。
30.權(quán)利要求28的方法，其中增加激酶活性的PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑是PKC-θ蛋白或其功能性片段的激活劑。
31.權(quán)利要求28的方法，其中PKC-θ蛋白是全長PKC-θ蛋白。
32.權(quán)利要求28的方法，其中PKC-θ蛋白是全長PKC-θ蛋白的功能性變體。
33.權(quán)利要求28的方法，其中功能性片段是PKC-θ激酶結(jié)構(gòu)域。
34.權(quán)利要求28的方法，其中確定步驟包括比較測試試劑相對于不存在測試試劑的條件下的激酶活性。
35.權(quán)利要求28的方法，其中PKC-θ蛋白的調(diào)節(jié)劑對于治療哮喘是有用的。
36.權(quán)利要求35的方法，進(jìn)一步包括在體外或體內(nèi)哮喘模型中評估步驟(b)中鑒別的測試試劑的效力，其中在體外或體內(nèi)哮喘模型中顯示出相對于對照試劑效力增加的測試試劑就被鑒別為對于治療哮喘是有用的。
37.權(quán)利要求28的方法，其中細(xì)胞是原核細(xì)胞。
38.權(quán)利要求37的方法，其中原核細(xì)胞是大腸桿菌。
39.權(quán)利要求28的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1的選自695位絲氨酸殘基、685位絲氨酸殘基、538位蘇氨酸殘基和536位蘇氨酸殘基的氨基酸殘基上。
40.權(quán)利要求39的方法，其中自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1的538位蘇氨酸殘基上。
41.治療哮喘的方法，包括給患有哮喘或患有哮喘癥狀的哺乳動物施用治療有效量的降低PKC-θ蛋白或其功能性片段的激酶活性或者減少功能性PKC-θ蛋白產(chǎn)生的試劑。
42.權(quán)利要求41的方法，其中試劑是在藥學(xué)可接受的載體中施用的。
43.權(quán)利要求42的方法，其中載體是氣霧劑形式。
44.權(quán)利要求41的方法，其中試劑是通過選自靜脈內(nèi)、口服、經(jīng)皮以及肌肉內(nèi)的途徑施用的。
45.權(quán)利要求41的方法，其中試劑是經(jīng)吸入施用的。
46.權(quán)利要求41的方法，其中哮喘是IgE-介導(dǎo)的哮喘。
47.權(quán)利要求41的方法，其中試劑是與選自β-腎上腺素能試劑、茶堿化合物、皮質(zhì)類固醇、抗膽堿能劑、抗組胺劑、鈣通道阻斷劑以及色甘酸鈉的藥物共施用的。
48.權(quán)利要求41的方法，其中試劑是特異性結(jié)合PKC-θ蛋白或其片段的抗體。
49.權(quán)利要求48的方法，其中抗體是多克隆抗體。
50.權(quán)利要求48的方法，其中抗體是單克隆抗體。
51.權(quán)利要求41的方法，其中試劑是核酸分子。
52.權(quán)利要求51的方法，其中核酸分子是核糖核酸分子。
53.權(quán)利要求52的方法，其中核糖核酸分子包括與SEQ ID NO3所述核苷酸序列的部分互補(bǔ)的核苷酸序列。
54.權(quán)利要求41的方法，其中激酶活性是PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化。
55.權(quán)利要求54的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1的選自695位絲氨酸殘基、685位絲氨酸殘基、538位蘇氨酸殘基和536位蘇氨酸殘基的氨基酸殘基上。
56.權(quán)利要求55的方法，其中PKC-θ蛋白或其功能性片段的自身磷酸化發(fā)生在SEQ ID NO1的538位蘇氨酸殘基上。
57.權(quán)利要求41的方法，其中激酶活性是PKC-θ底物的磷酸化。
58.權(quán)利要求57的方法，其中PKC-θ底物含有R-X-X-S基序或者R-X-X-T基序，其中R是精氨酸，X是未知的或任何已知的氨基酸，S是絲氨酸，T是蘇氨酸。
59.權(quán)利要求58的方法，其中PKC-θ底物具有選自如下的氨基酸序列KKRFSFKKSFK(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ARKGSLRQKN(SEQ IDNO6)，F(xiàn)ARKGSLRQ(SEQ ID NO15)，KKRFSFKKSFK(SEQ IDNO16)，QKRPSQRSKYL(SEQ ID NO17)，KIQASFRGHMA(SEQID NO18)，LSRTLSVAAKK(SEQ ID NO19)，AKIQASFRGHM(SEQ ID NO20)，VAKRESRGLKS(SEQ ID NO21)，KAFRDTFRLLL(SEQ ID NO22)，PKRPGSVHRTP(SEQ IDNO23)，ATFKKTFKHLL(SEQ ID NO24)，SPLRHSFQKQQ(SEQID NO25)，KFRTPSFLKKS(SEQ ID NO26)，IYRASYYRKGG(SEQ ID NO27)，KTRRLSAFQQG(SEQ ID NO28)，RGRSRSAPPNL(SEQ ID NO29)，MYRRSYVFQT(SEQ ID NO30)，QAWSKTTPRRI(SEQ ID NO31)，RGFLRSASLGR(SEQ IDNO32)，ETKKQSFKQTG(SEQ ID NO33)，DIKRLTPRFTL(SEQID NO34)，APKRGSILSKP(SEQ ID NO35)，MYHNSSQKRH(SEQID NO36)，MRRSKSPADSA(SEQ ID NO37)，TRSKGTLRYMS(SEQ ID NO38)，LMRRNSVTPLA(SEQ ID NO39)，ITRKRSGEAAV(SEQ ID NO40)，EEPVLTLVDEA(SEQ IDNO41)，SQKRPSQRHGS(SEQ ID NO42)，KPFKLSGLSFK(SEQID NO43)，AFRRTSLAGGG(SEQ ID NO44)，ALGKRTAKYRW(SEQ ID NO45)，VVRTDSLKGRR(SEQ ID NO46)，KRRQISIRGIV(SEQ ID NO47)，WPWQVSLRTRF(SEQ ID NO48)，GTFRSSIRRLS(SEQ ID NO49)，RVVGGSLRGAQ(SEQ IDNO50)，LRQLRSPRRTQ(SEQ ID NO51)，KTRKISQSAQT(SEQID NO52)，NKRRATLPHPG(SEQ ID NO53)，SYTRFSLARQV(SEQ ID NO54)，NSRRPSRATWL(SEQ ID NO55)，RLRRLTAREAA(SEQ ID NO56)，NKRRGSVPILR(SEQ IDNO57)，GKRRPSRLVAL(SEQ ID NO58)，QKKRVSMILQS(SEQID NO59)，和RLRRLTAREAA(SEQ ID NO60)。
60.不表達(dá)內(nèi)源PKC-θ蛋白的分離的肥大細(xì)胞。
61.權(quán)利要求40的肥大細(xì)胞，其中細(xì)胞表達(dá)外源PKC-θ蛋白或其片段。
全文摘要
公開了對于治療哮喘有用的試劑的方法。該方法包括篩選抑制PKC－θ蛋白產(chǎn)生的試劑、以及抑制PKC－θ蛋白的激酶活性的試劑、或其功能性片段，其中這些試劑對于治療哮喘是有用的。該方法也包括篩選抑制由可操作地連接到PKC－θ啟動子上的核酸序列編碼的報道基因產(chǎn)物產(chǎn)生的試劑。也公開了治療哮喘的方法，包括施用抑制功能性PKC－θ蛋白或PKC－θ蛋白的激酶活性或其功能性片段的試劑。也公開了不表達(dá)內(nèi)源PKC－θ的分離的肥大細(xì)胞。
文檔編號G01N33/53GK1898564SQ200480039082
公開日2007年1月17日 申請日期2004年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者D·喬哈里, M·卡塞安, C·威廉斯, S·馬魯西克, R·M·切爾溫斯基 申請人:惠氏公司