專利名稱：預測抗氧化劑治療在預防高血糖患者的心血管疾病中的益處的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種依據(jù)觸珠蛋白2等位基因的多態(tài)性確定補充抗氧化劑在預防糖尿病患者的心血管疾病中的預期益處的方法。
心血管疾病(CVD)是2型糖尿病患者的最常見的、最嚴重的和花費最昂貴的并發(fā)癥1。在2型糖尿病患者中，這是一種最主要的死亡原因，它與糖尿病的病程無關(guān)2。一些基于人群的研究已經(jīng)一致表明糖尿病個體的CVD的相對危險度要比非糖尿病患者高出數(shù)倍3-7。在女性中所增加的危險甚至更為突出4，5，8。危險因素例如高血壓、高脂血癥和吸煙都獨立地增加了糖尿病患者發(fā)生CVD的相對危險度，但是糖尿病的作用顯示出是獨立于常見危險因素的9。
雖然在所有被研究的人群中，糖尿病患者中的CVD發(fā)病率都要比非糖尿病患者更高，但糖尿病患者的CVD的相對危險度仍存在著明顯的地區(qū)和人種的差異，這并不能被組間的常見心臟危險因素的差異所完全解釋10-20。例如，對生活在英國的不同人種組中的CVD的相對危險度的分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與歐洲人起源的糖尿病患者比較，南亞人起源的糖尿病患者有著明顯增高的CVD危險度12，15，而非洲-加勒比海的糖尿病患者有著明顯減低的CVD危險度14，16。
這些研究說明遺傳差異可能造成糖尿病患者對CVD易感性的差異。
當構(gòu)思本發(fā)明時，當時假設(shè)一個可能的原因在于觸珠蛋白基因的功能性等位基因的多態(tài)性。
觸珠蛋白(Hp)是一種結(jié)合血紅蛋白的血清蛋白，它在保護性對抗血色素啟動的氧化應激上發(fā)揮著重要作用23，24。缺少Hp基因的鼠表現(xiàn)出氧化應激的顯著增加以及特別是在腎臟內(nèi)的氧化性組織損傷。在人類，有兩種常見的Hp等位基因(1和2)，表現(xiàn)為1-1、2-1和2-2三種主要的表型21-23。
已經(jīng)證實三種表型在結(jié)合血紅蛋白的能力上的功能差異。Hp1-1表型患者的每克Hp比含有觸珠蛋白2等位基因產(chǎn)物的Hp能結(jié)合更多的血紅蛋白23。觸珠蛋白1-1表型患者的觸珠蛋白分子也是更為有效的抗氧化劑，因為更小體積的觸珠蛋白1-1比觸珠蛋白2等位基因的產(chǎn)物更容易進入氧化性組織損傷的血管外部位。這也包括具有觸珠蛋白1-1的患者具有顯著更大的腎小球?qū)τ|珠蛋白的濾過(sieving)22。
觸珠蛋白2等位基因顯示是在將近2000萬年前經(jīng)部分基因復制事件起源于1等位基因，并作為與耐感染性病原體相關(guān)的選擇壓力的結(jié)果在全球范圍內(nèi)得以散布24，25。目前，觸珠蛋白等位基因的相對頻率在不同的人種中有著很大不同。基因復制事件已經(jīng)造成2等位基因中的每一個所編碼的觸珠蛋白蛋白質(zhì)的生物物理和生物化學性能的極大變化26。例如，與2等位基因所產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物比較，1等位基因的蛋白產(chǎn)物是更好的抗氧化劑23。通過凝膠電泳容易從10ml血漿中鑒定出任何個體的觸珠蛋白表型1-1、2-1或2-2。
最近已經(jīng)證實觸珠蛋白表型是糖尿病患者發(fā)生各種微血管并發(fā)癥的預測因素27-29。具體地，發(fā)現(xiàn)觸珠蛋白1等位基因純合子的患者具有降低的發(fā)生視網(wǎng)膜病變和腎病的危險。在1型和2型糖尿病患者中都觀察到了這種作用，至少是對腎病的作用，以及觸珠蛋白2等位基因數(shù)目與發(fā)生腎病的梯度效應的發(fā)現(xiàn)強化了這種相關(guān)性29。此外，已經(jīng)顯示觸珠蛋白表型可能是糖尿病患者發(fā)生大血管并發(fā)癥的預測因素。我們已經(jīng)顯示具有1-1觸珠蛋白表型的糖尿病患者經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)后的再狹窄的發(fā)生是顯著降低的27，30。以往的檢測普通人群的觸珠蛋白和冠狀動脈疾病的回顧性和橫向研究已經(jīng)得到了相互矛盾的結(jié)果31-38。還沒有研究觸珠蛋白表型在糖尿病患者發(fā)生冠狀動脈粥樣硬化性疾病中的作用。
以往認為不容易發(fā)生冠狀動脈疾病的美洲印第安人現(xiàn)在也正在流行CVD20。CVD發(fā)病率的增加已經(jīng)被歸結(jié)于2型糖尿病在該人群中的快速增長1，2。Strong心臟研究已經(jīng)檢測了3個地理區(qū)域內(nèi)的美洲印第安人的心血管病的發(fā)病率、患病率和危險因素，從1988年開始并持續(xù)監(jiān)測到現(xiàn)在20。該人群患者的相對的遺傳學均一性可以容許識別出引起糖尿病病變中的CVD的特異的遺傳因素。
因此，在美國專利No.6,613,519中，首次在Strong心臟研究的病例/對照樣本中得出了糖尿病患者的CVD的相對危險度與觸珠蛋白表型之間的相關(guān)性。
一些以往的科學出版物描述了在觸珠蛋白表型與疾病之間建立聯(lián)系的方法。WO98/37419提出了一種用于確定觸珠蛋白的方法和試劑盒，并具體地涉及包括人觸珠蛋白的應用。該申請的內(nèi)容集中于觸珠蛋白2-2表型作為獨立危險因素的用途，特別是涉及難治性原發(fā)性高血壓的靶器官損傷，涉及動脈粥樣硬化(普通人群)和急性心肌梗死以及涉及HIV感染的死亡率。這個申請沒有提及觸珠蛋白表型作為DM的心血管病的危險因素的用途。因為觸珠蛋白2-2表型具有使得患者更容易成為氧化應激的趨勢，因此可能會有人認為該專利間接提及了2-2表型作為DM的心血管病的負性預測因素的用途。但是，該專利的闡述沒有包括如下的想法，即將觸珠蛋白1-1表型作為減少DM發(fā)生心血管病的傾向的陽性預測因素，或作為補充抗氧化劑的療效的陽性預測因素。事實上，在后來的研究中，PCT WO98/37419的作者報告了相反的結(jié)果，他們總結(jié)Hp1-1患者的心血管病死亡率的危險是增加的(De Bacquer et al，Atherosclerosis2001；157161-6)。既然許多研究已經(jīng)報道沒有結(jié)果或相互矛盾的結(jié)果(Buhlin et al Eur Heart J 2003；242099-107；Lind et al Angiology 2003；54401-10；Hong et al Hum Hered 1997；47283-7)，那么推論觸珠蛋白表型和疾病之間的有用的相關(guān)性就需要仔細的和富有想象力的分析。
換句話說，已經(jīng)提出來源于Hp 2-1或2-2表型的氧化應激造成了普通人群中的血管并發(fā)癥。也已知某些血管并發(fā)癥與DM相關(guān)的氧化應激相關(guān)。然而，對于Hp1-1表型是否能影響對用于預防糖尿病患者的血管并發(fā)癥的補充抗氧化劑治療的應答，現(xiàn)在仍不清楚也不能預測。
PCT WO98/37419的描述包括一種觸珠蛋白結(jié)合伴侶的用途。PCTWO98/37419的結(jié)合伴侶可以是任何具有至少兩個與觸珠蛋白結(jié)合的位點的分子。可以通過肽、抗體或它們的一部分，或通過凝集素、細胞受體、分子印跡(imprint)或細菌抗原或它們的一部分，而形成位點。這個專利的描述具體提及了化膿性鏈球菌的T4抗原的用途。所有的觸珠蛋白都含有α鏈和β鏈。所有觸珠蛋白的β鏈都是相同的，但是觸珠蛋白基因的兩個等位基因之間的α鏈是不同的。觸珠蛋白的α2鏈是根據(jù)不等交換的突變的結(jié)果，它包括142個氨基酸，不同于α1鏈的83個氨基酸。α1和α2鏈是免疫學相似的，除了α2鏈具有獨特的氨基酸殘基序列(Ala-Val-Gly-Asp-Lys-Leu-Pro-Glu-Cys-Glu-Ala-Asp-Asp-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Lys-Cys-Ile，SEQ ID NO1)。因此，這個獨特肽序列的任一部分都可以是用于形成區(qū)別含有α1和α2鏈的觸珠蛋白的抗體的適合的表位，如在“Using AntibodiesA Laboratory Manual”(Ed Harlow and David Laneeds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999))中所描述的那樣，在此將其全部內(nèi)容一同并入?yún)⒖?。這些抗體可以是單克隆的、多克隆的或它們的任何部分，它們可以被本領(lǐng)域人員所熟知的各種方法中的任一方法所富集或純化。另外，編碼該序列的核苷酸序列可以被便利地用于區(qū)分Hp基因型。
抗氧化劑、觸珠蛋白和糖尿病患者的心血管疾病(CVD)的預防與普通人群中的2-4％的發(fā)病率相比較，成人糖尿病患者中的冠狀動脈疾病的總發(fā)病率超過55％。與非糖尿病患者相比較，有糖尿病的CVD男性患者的死亡率比無糖尿病的患者多出兩倍，女性患者則要多出四倍(Stamler，et al.Diabetes Care 1993；16434-444)。氧化應激的增加代表了一種吸引人的統(tǒng)一機制，其可解釋一些已知的介導糖尿病血管病變的信號傳導通路的共同激活(Nishikawa et al.，Nature 2000；404787-790)。高糖血癥和葡萄糖自氧化所形成的氧化環(huán)境使得形成了晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)(Ohgami et al.，J Diabetes Complic 2002；1656-59)及修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)(Steinberg D J Biol Chem 1997；27220963-6)，它能刺激涉及糖尿病血管病中所發(fā)現(xiàn)的病理和形態(tài)學改變的多種炎性因子的形成。實驗動物數(shù)據(jù)支持了氧化假說，其中抗氧化劑例如維生素E已經(jīng)被證實能顯著地延遲動脈粥樣硬化的進程(Williams et al Atherosclerosis 1992；94153-59)。但是，盡管在體外和實驗室研究中都有著有希望的結(jié)果，但是一些最近的、大規(guī)模的前瞻性的安慰劑對照臨床試驗不能提供結(jié)論性的證據(jù)支持單獨使用維生素E(HOPE Study Investigators N E J Med 2000；342154-160；Hodis et al，Circulation 2002；1061453-59；Jiang et al，J BiolChem 2002；27731850-6)或與其他抗氧化維生素聯(lián)合使用維生素E(GISSI，Lancet 1999；3544477-55；Brown et al NE J Med 2001；3451538-92；Marchioli et al，Lipids；200136 SupplS53-63；Waters et al，JAMA2002；2882432-40；Witztum et al Trends Cardio Med 2001；1193-102)減少大的不良心血管事件的發(fā)生率的益處。心臟后果預防評價(HOPE)試驗就是這樣的一個研究，它特異地研究了維生素E治療對預防糖尿病的CVD的療效(HOPE Study Investigators N E J Med 2000；342154-160)。HOPE研究沒有證實每日施與400IU維生素E 4.5年對心血管(CV)后果的任何臨床益處。已經(jīng)提出一些機制解釋維生素E在這些研究中表面失敗的原因。Steinberg已經(jīng)提出只有在表現(xiàn)為氧化應激增強的特異的患者亞組中才有可能證實抗氧化劑治療的益處(Steinberg et al Circulation2002；1052107-111)。
糖尿病患者的血管并發(fā)癥隨著時間而發(fā)生，即使用胰島素或口服降糖(降低血糖)藥物控制住他們的血糖水平。有多種糖尿病患者高危發(fā)生的血管并發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性白內(nèi)障和青光眼、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變、間歇性跛行和壞疽、高脂血癥和心血管問題例如高血壓、動脈粥樣硬化和冠狀動脈疾病。動脈粥樣硬化可以引起心絞痛和心臟病發(fā)作，并且它在糖尿病人群中的發(fā)病率是非糖尿病人群的兩倍，同等影響著男性和女性。
越來越多的證據(jù)顯示這些糖尿病的血管疾病只發(fā)生在那些遺傳學易感的患者中(UK Prospective Study Group Diab Care 1998；211271-77)。觸珠蛋白基因具有多態(tài)性，具有兩類主要類型的等位基因，稱為1和2。最近已經(jīng)證實觸珠蛋白基因的這種多態(tài)性是糖尿病個體的CVD的獨立的危險因素(見2003年9月2日授予Levy等的美國專利No6,613,519、下面的實施例1、和Levy et al J Am Coll Card 2002；401984-90)。發(fā)現(xiàn)觸珠蛋白2等位基因純合子的糖尿病患者有著比那些觸珠蛋白1等位基因純合子的患者高出5倍的CVD危險度。同一作者也已經(jīng)證實觸珠蛋白2等位基因蛋白產(chǎn)物是一種弱抗氧化劑，弱于觸珠蛋白1等位基因蛋白產(chǎn)物(Melamed-Frank et al Blood 2001；983693-98)。但是，上述的研究既沒有尋找也沒有暗示補充抗氧化劑和糖尿病患者的CVD、以及觸珠蛋白表型的相關(guān)性、或這種相關(guān)性在預測從抗氧化劑治療中獲益的用途。因此，我們假設(shè)補充抗氧化劑對于預防觸珠蛋白2等位基因純合子的糖尿病患者的不良心血管事件將是有益的。為了驗證這種假說，我們測定了HOPE研究的參與者的觸珠蛋白類型并依據(jù)維生素E和雷米普利(Ramipril)治療確定出這3種可能的觸珠蛋白類型的主要心血管終點的相對危險率。
一種預測哪些特殊的糖尿病患者有著更低的心血管病的危險以及哪些特殊的患者亞組將從預防性抗氧化劑治療中獲益的方法是一種被廣泛認同的需要，并且這將是極為有益的。這樣的一種方法將容許醫(yī)生最好地利用可獲得的資源，且最大程度地將每個患者的危險最小化。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種確定糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型并據(jù)此確定出糖尿病患者從所述抗氧化劑治療中獲益的可能性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，具有觸珠蛋白2-2表型的患者從所述抗氧化劑治療中的獲益更大。
根據(jù)本發(fā)明的仍另一個部分，提供了一種確定減少糖尿病患者的氧化應激對于預防糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的重要性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型的步驟，并據(jù)此確定出減少特定的糖尿病患者的氧化應激的重要性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，在具有觸珠蛋白2-2表型的患者中減少氧化應激的重要性更大。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的進一步的特點，血管并發(fā)癥選自由微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥所組成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的仍進一步的特點，血管并發(fā)癥是一種選自由慢性心衰、心血管死亡、中風、心肌梗死和冠狀動脈血管成形術(shù)相關(guān)的再狹窄所組成的組的大血管并發(fā)癥。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的仍進一步的特點，微血管并發(fā)癥選自由糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和糖尿病神經(jīng)病變所組成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的進一步的特點，大血管并發(fā)癥選自由冠狀動脈側(cè)支血管減少(fewer coronary artery collateralblood vessels)和心肌缺血所組成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的仍進一步的特點，通過確定糖尿病患者的觸珠蛋白基因型實現(xiàn)對觸珠蛋白表型的確定。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的仍進一步的特點，通過一種選自由信號擴增法、直接檢測法和對至少一種序列改變的檢測所組成的組的方法實現(xiàn)確定糖尿病患者的觸珠蛋白基因型的步驟。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的進一步的特點，信號擴增法擴增一種選自由DNA分子和RNA分子所組成的組的分子。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的仍進一步的特點，信號擴增法選自由PCR、LCR(LAR)、自動維持合成反應(3SR/NASBA)和Qβ復制酶反應所組成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的仍進一步的特點，直接檢測法選自由循環(huán)探針反應(CPR)和分支DNA(branched DNA)分析所組成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的進一步的特點，對至少一種序列改變的檢測采用了選自由限制性片段長度多態(tài)性(RFLP分析)、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和雙脫氧指紋印跡法(ddF)所組成的組的方法。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的仍進一步的特點，通過直接確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型實現(xiàn)對所述觸珠蛋白表型的確定。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的仍進一步的特點，通過免疫檢測法實現(xiàn)確定觸珠蛋白表型的步驟。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的進一步的特點，免疫檢測法選自由放射免疫檢測法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)、western印跡法、免疫組織化學分析法和熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)所組成的組。
具體實施方案本發(fā)明是一種評價高血糖患者發(fā)生心血管疾病的危險的方法，以便能夠在適當?shù)那闆r下施用預防性藥物。具體地，本發(fā)明是一種評價糖尿病患者從用于預防心血管疾病(CVD)的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法。
在詳細地解釋本發(fā)明的至少一種具體實施方案之前，要明白本發(fā)明并沒有將其應用限制于在下面的描述和


中所公開的成分的構(gòu)建和排列的細節(jié)中。本發(fā)明能以不同的方法實踐或?qū)嵤┢渌膶嵤┓桨浮Ｒ惨靼自诖怂捎玫拇朕o和術(shù)語只是用于說明的目的，并不應當被認作為限制。
根據(jù)一些大的最近發(fā)表的大臨床試驗，抗氧化劑治療沒有被推薦用于預防CVD高?；颊叩牟涣嫉腃V后果(The Heart Outcomes PreventionEvaluation Study Investigators.N Eng J Med 2000；342154-160；Hodis，et al.Circulation 2002；1061453-1459；Gruppo Italiano per lo Studio dellaSoprawivenza nell′Infarto Miocardico.Lancet 1999；354447-455；Brown etal.N Engl J Med 2001；3451583-1592.)。
但是，這些研究不能除外這些患者中的亞組從中獲益的可能性(Steinberg D，Witzum JL.Circulation 2002；105；2107-2111)。雖然對來自一項對預防性抗氧化劑治療的療效的大規(guī)模研究的數(shù)據(jù)的分析沒有提示整個樣本從抗氧化劑治療中的任何獲益，但是本作者首次證實了可以鑒定出的確從補充抗氧化劑中獲益的亞組。具體地，在HOPE研究中，用維生素E補充具有顯著統(tǒng)計學意義地減少了具有Hp 2-2表型的糖尿病個體的CV死亡和非致死性心肌梗死，以及用雷米普利治療具有顯著統(tǒng)計學意義地減少了復合終點(非致死性MI、中風或心血管死亡)(見以下的實施例II)。對Strong心臟研究中的觸珠蛋白表型與CVD的相關(guān)性的分析表明Hp 2-2患者增加了糖尿病CVD的危險(見以下的實施例I，和Levy AP et al.J Am Coll Card 2002；401984-1990)以及Hp 2-2是一種較差的抗氧化劑(Melamed-Frank M，et al.Blood 2001；983693-3698)。無意于受單一假說的限制，Hp 2-2的較差的抗氧化劑特性可以解釋從抗氧化劑中獲益可能是選擇性來自該糖尿病患者亞組的原因，并且這些發(fā)現(xiàn)明顯是具有顯著統(tǒng)計學意義的。在已經(jīng)觀察到觸珠蛋白類型對非糖尿病患者的CVD發(fā)生率沒有顯著影響(見以下的實施例I)，以及已經(jīng)顯示出抗氧化劑治療(用維生素E)對非糖尿病患者沒有任何作用(見以下的實施例II)，從這些事實中可以找到觸珠蛋白的這種作用的其他支持。無意于受單一假說的限制，可以假設(shè)Hp 2-2的低下的抗氧化活性的重要性只能在存在產(chǎn)生氧化應激的附加機制(糖尿病)的情況下才能在臨床上表現(xiàn)出來。
因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種確定糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法，該方法包括確定出糖尿病患者的觸珠蛋白表型并據(jù)此確定出糖尿病患者從所述抗氧化劑治療中獲益的可能性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，具有觸珠蛋白2-2表型的患者從所述抗氧化劑治療中的獲益更大。
鑒于例如HOPE和GISSI研究等的研究結(jié)果并沒有對抗氧化劑治療對其起效的亞群提供任何提示，在此所示的數(shù)據(jù)首次清楚地顯示了維生素E補充具有顯著統(tǒng)計學意義地減少了具有Hp 2-2表型的糖尿病個體的CV死亡及非致死性心肌梗死，而雷米普利具有顯著統(tǒng)計學意義地減少了復合終點(非致死性MI、中風或心血管死亡)(見以下的實施例II)。因此，本發(fā)明還提供了一種確定減少糖尿病患者的氧化應激以預防糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的重要性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型的步驟，據(jù)此確定出減少特異的糖尿病患者的氧化應激的重要性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，在具有觸珠蛋白2-2表型的患者中減少氧化應激的重要性更大。
本發(fā)明也提供了一種用于評價糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的試劑盒。試劑盒包括用于確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型的套裝試劑且該試劑盒被指明用于評價糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性。從下面的描述以及進一步從觸珠蛋白1和2等位基因的熟知的和特征性的序列數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)，這些試劑的特性對于本領(lǐng)域人員將是顯而易見的。
通過下面實施例部分的表1-6中的數(shù)據(jù)證實了本發(fā)明的方法和試劑盒的效用。
因此，在來自基于人群的縱向研究的樣本中，在此證實了觸珠蛋白表型是一種糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的重要的預測因素。在本發(fā)明的一個實施方案中，血管并發(fā)癥選自由微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥所組成的組。
糖尿病患者有著發(fā)生各種血管并發(fā)癥的危險，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性白內(nèi)障和青光眼、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變、間歇性跛行和壞疽、高脂血癥及心血管問題例如高血壓、動脈粥樣硬化和冠狀動脈疾病。動脈粥樣硬化可以引起心絞痛和心臟病發(fā)作，并且它在糖尿病人群中的發(fā)生率是非糖尿病人群的兩倍，同等影響男性和女性。糖尿病的微血管并發(fā)癥在此包括糖尿病神經(jīng)病變(神經(jīng)損傷)、糖尿病腎病(腎病)和視覺異常(例如糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼、白內(nèi)障和角膜疾病)。大血管并發(fā)癥包括進展性動脈粥樣硬化性冠狀動脈血管病變例如心肌梗死、慢性心臟衰竭、心血管死亡和心臟病、中風和周圍血管病(它可導致潰瘍、壞疽和截肢)。
在另一個實施方案中，血管并發(fā)癥是一種選自由慢性心衰、心血管死亡、中風、心肌梗死、冠狀動脈血管成形術(shù)相關(guān)的再狹窄、冠狀動脈側(cè)支血管減少和心肌缺血所組成的組的大血管并發(fā)癥。在另一個實施方案中，血管并發(fā)癥是一種微血管并發(fā)癥，例如糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病腎病或糖尿病視網(wǎng)膜病變。
在不同的人種組中的觸珠蛋白1等位基因的頻率與這些組中的糖尿病微血管和大血管并發(fā)癥的相對發(fā)病率之間的相關(guān)性進一步支持了觸珠蛋白對于補充抗氧化劑對糖尿病的血管病變的可能益處的預測價值。
例如，非洲-加勒比海的糖尿病患者具有低相對危險度的CVD14，16和微血管并發(fā)癥以及高頻率的觸珠蛋白1等位基因(在一些人群中高達0.87)26，而澳大利亞土著19的糖尿病患者和南亞的糖尿病患者12，15具有高相對危險度的CVD和糖尿病微血管47并發(fā)癥以及相對低頻率的觸珠蛋白1等位基因(分別為0.18和0.09)26。
最近鑒定了觸珠蛋白表型可以影響動脈粥樣硬化性CVD的臨床病程的兩種機制。首先，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈血管成形術(shù)后的再狹窄的分級危險被證實是與觸珠蛋白2等位基因相關(guān)27，30。其次，證實了具有觸珠蛋白2-1表型的糖尿病個體比有著相似程度的冠狀動脈疾病的具有觸珠蛋白2-2表型的個體有著顯著更多的冠狀動脈的側(cè)支血管。以往已經(jīng)證實個體間在冠狀動脈側(cè)支循環(huán)程度上的差異是心肌梗死的嚴重度的關(guān)鍵的決定因素48。
一些功能已經(jīng)被指定到觸珠蛋白，它可以影響動脈粥樣硬化的發(fā)展。血清觸珠蛋白的主要功能是結(jié)合游離的血紅蛋白，這已經(jīng)被認識超過60年22。這種相互作用被認為是幫助清除鐵并阻止它從尿液的丟失，以及作用為一種抗氧化劑，據(jù)此保護組織對抗血紅蛋白介導的組織氧化23。不同觸珠蛋白表型的抗氧化能力已經(jīng)顯示出不同，觸珠蛋白1-1蛋白顯示出具有比其他形式的蛋白更優(yōu)的抗氧化保護作用23。假定氧化應激在發(fā)生糖尿病血管并發(fā)癥中的非常重要的作用，這樣的一種抗氧化劑假說是特別吸引人的49，50?？赡苓M一步放大的不同類型的觸珠蛋白所提供的氧化保護的表面差異是具有不同表型的個體中所存在的觸珠蛋白的大小的大體差異。觸珠蛋白1-1明顯要比觸珠蛋白2-2更小，因此可能能更好地進入到血管外間隙并預防血管損傷部位上的血紅蛋白介導的組織損傷23。但是，對觸珠蛋白在動脈粥樣硬化中的作用仍了解的很少，一些研究相互矛盾地證實了Hp1-1增加了心血管死亡率的危險(De Bacquer et al，Atherosclerosis 2001；157161-6)。
觸珠蛋白也被證實是作為免疫調(diào)節(jié)物發(fā)揮作用，并且這種作用可能與它在血紅蛋白代謝中的作用沒有關(guān)聯(lián)21，23。最近在單核細胞/巨噬細胞中已經(jīng)鑒定出一種觸珠蛋白-血紅蛋白復合物的特異性受體為CD16351，一個B組清道夫受體富含半胱氨酸超家族的成員52。另一個該清道夫受體超家族的成員CD36先前已經(jīng)被表明在LDL代謝中發(fā)揮著重要作用以及對于動脈粥樣硬化病變的發(fā)展具有重要意義53-55。發(fā)現(xiàn)與血紅蛋白復合的觸珠蛋白2-2對該受體的親和力比與血紅蛋白復合的觸珠蛋白1-1高出10倍51。已經(jīng)表明與CD163結(jié)合的配體誘導了酪氨酸激酶依賴性信號級聯(lián)，造成了大量炎性細胞因子的分泌56。也已經(jīng)證實觸珠蛋白單獨能與粒細胞和單核細胞結(jié)合。觸珠蛋白阻斷了中性粒細胞對各種激動劑和已知的血漿膜受體的應答，說明觸珠蛋白可能作用為一種免疫系統(tǒng)的受體-配體相互作用的拮抗劑57。已經(jīng)證實觸珠蛋白與MAC-1或CD11b/CD18受體58(一種整聯(lián)蛋白家族的成員)的特異性結(jié)合。這些整聯(lián)蛋白已經(jīng)顯示出在血管壁對損傷的應答上發(fā)揮著重要作用59。
多個研究最近已經(jīng)說明細菌感染在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和去穩(wěn)定上的重要作用60。在這個方面，各種表型在預防體外和體內(nèi)細菌及病毒復制上的能力的差別對于與觸珠蛋白相關(guān)的動脈粥樣硬化的不同的相對危險度可能是重要的23-25。這可以歸結(jié)于鐵清除上的差異23以及不同表型所提供的免疫調(diào)節(jié)的差異51。
這些發(fā)現(xiàn)與在此所示的關(guān)于觸珠蛋白表型和從用于預防糖尿病血管并發(fā)癥的補充抗氧化劑中獲益的結(jié)果完全一致。具有不同的觸珠蛋白表型的糖尿病患者對抗氧化劑治療的相對反應的顯著差異應該足以保證對在CVD危險分層算法中和在評價為預防糖尿病患者的CVD所設(shè)計的潛在的治療干預(例如補充抗氧化劑和聯(lián)合抗氧化劑與藥物治療)中所用的糖尿病患者進行大規(guī)模測試。
根據(jù)本發(fā)明方法的各種優(yōu)選的實施方案，通過多種方法中的任一方法實現(xiàn)對受試者的觸珠蛋白表型的確定，這些方法包括但不限于信號擴增法、直接檢測法和對至少一種序列改變的檢測。這些方法通過確定基因型間接地確定出表型。如在下面所解釋的那樣，通過分析觸珠蛋白基因產(chǎn)物直接地完成對觸珠蛋白表型的確定。
本發(fā)明的各種優(yōu)選的實施方案的信號擴增法可以擴增例如DNA分子或RNA分子?？杀挥米鳛楸景l(fā)明的一部分的信號擴增法包括，但不限于，PCR、LCR(LAR)、自動維持合成反應(3SR/NASBA)或Qβ復制酶反應。
聚合酶鏈反應(PCR)如在授予Mullis和Mullis等的美國專利No.4,683,195和4,683,202中所描述的聚合酶鏈反應(PCR)是一種增加基因組DNA混和物中的靶序列片段的濃度且無克隆或純化的方法。該技術(shù)提供了一種解決低濃度靶序列的問題的方法。PCR可被用于將靶序列濃度直接地增加到可被容易檢測到的水平。用于擴增靶序列的這個方法包括往含有所需的靶序列的DNA混和物中引入摩爾過量的兩種與雙鏈靶序列的相應鏈互補的寡核苷酸引物。將混和物變性，然后雜交。在雜交后，用聚合酶延伸引物使得形成互補鏈。常可按需重復變性、雜交(退火)和聚合酶延長(延伸)的步驟，以獲得相對高濃度的所需的靶序列片段。
通過引物彼此的相對位置可確定所需靶序列片段的長度，因此該長度是可控的參數(shù)。因為所需的靶序列片段成為了混和物中的主導序列(按濃度方式)，它們稱為是“PCR擴增的”。
連接酶鏈反應(LCR或LAR)Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.，88189(1991)；Barany，PCR Methods and Applic.，15(1991)；和Wu and Wallace，Genomics 4560(1989)所描述的連接酶鏈反應[LCR，有時被稱為“連接酶擴增反應(LAR)]已經(jīng)發(fā)展成為擴增核酸的公認的可選擇的方法。在LCR中，將四種寡核苷酸，與靶DNA的一條鏈獨特雜交的兩種鄰近的寡核苷酸，以及與相反鏈雜交的一個鄰近寡核苷酸的互補組混和，并往混和物中加入DNA連接酶。假若在連接處具有完全的互補性，連接酶將共價連接每組雜交分子。重要的是，在LCR中，僅當探針與靶樣本的序列堿基配對且無缺口或錯配時，兩個探針才被連接在一起。重復循環(huán)的變性和連接擴增DNA的短片段。LCR也已經(jīng)與PCR聯(lián)用得到對單堿基改變的強化檢測(Segev，PCT Publication No.WO9001069Al(1990))。但是，因為在本檢測中所用的四種寡核苷酸能配對形成兩個短的可連接的片段，因此有形成靶序列非依賴性背景信號的可能。用于突變篩選的LCR的應用被限制于檢查特異的核酸位點。
自動維持合成反應(3SR/NASBA)自動維持合成反應(3SR)(Guatelli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，871874-1878，1990)和Proc.Natl.Acad.Sci.，877797，1990中的勘誤表)是一種基于轉(zhuǎn)錄的體外擴增體系(Kwok et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，861173-1177，1989)，它能在單一溫度下指數(shù)擴增RNA序列。然后擴增的RNA可被用于突變檢測(Fahy et al.，PCR Meth.Appl.，125-33，1991)。在這個方法中，寡核苷酸引物被用于將噬菌體RNA聚合酶啟動子加入到相關(guān)序列的5’末端。在酶和包括第二種引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、RNA聚合酶和核糖及脫氧核糖核苷三磷酸的底物的雞尾酒中，靶序列進行轉(zhuǎn)錄、cDNA合成及第二鏈合成的重復循環(huán)以擴增相關(guān)區(qū)域。3SR檢測突變的用途被動態(tài)地限制于篩選DNA的小片段(例如200-300個堿基對)。
Qβ復制酶在這個方法中，識別相關(guān)序列的探針被連接到用于Qβ復制酶的可復制的RNA模板上。通過使用序列特異性連接步驟已經(jīng)解決了非雜交探針的復制所產(chǎn)生的具有假陽性的先前被認識到的主要問題。但是，可得到的耐熱的DNA連接酶對于這種RNA底物是無效的，因此必須用T4 DNA連接酶在低溫(37℃)下進行裂解。這種方法避免了使用高溫，以此作為得到和LCR一樣的特異性的方法，連接事件可被用于檢測連接位點處的突變而不是其他部位的突變。
一種成功的診斷方法必須是非常特異的?？刂坪怂犭s交的特異性的筆直方法是通過控制反應溫度。雖然3SR/NASBA和Qβ體系都能生成大量的信號，但是每個體系中所含的一種或多種酶都無法在高溫(即＞55℃)下使用。因此，不能通過提高反應溫度避免探針的非特異性雜交。如果為了使得探針更容易在低溫下解鏈而將探針縮短，在復合基因組中具有超過一個完全匹配的類然比將增加。因為這些原因，PCR和LCR目前在檢測技術(shù)的研究領(lǐng)域占據(jù)主導地位。
PCR和LCR中的擴增方法的基礎(chǔ)是一個循環(huán)的產(chǎn)物成為了所有隨后循環(huán)的模板，據(jù)此每個循環(huán)將數(shù)量加倍的事實。每個如此加倍體系的最終產(chǎn)量可表示為(1+X)n＝y(tǒng)，其中“X”是平均效率(每個循環(huán)所拷貝的百分比)，“n”是循環(huán)數(shù)目，以及“y”是總效率或反應的產(chǎn)量(Mullis，PCRMethods Applic.，11，1991)。如果靶DNA的每個拷貝都被用作為聚合酶鏈反應的每個循環(huán)的模板，那么平均效率為100％。如果進行20個循環(huán)的PCR，那么產(chǎn)量將是原料的220、或1,048,576個拷貝。如果反應條件將平均效率減少為85％，那么在這20個循環(huán)內(nèi)的產(chǎn)量將僅僅是原料的1.8520或220,513個拷貝。換句話說，85％效率下進行的PCR將產(chǎn)生只有在100％效率下進行的反應中所產(chǎn)生的終產(chǎn)物的21％。被減少為50％平均效率的反應將生成少于1％的可能產(chǎn)物。
在實踐中，常規(guī)聚合酶反應很少得到理論上的最大產(chǎn)率，PCR通常進行超過20個循環(huán)以補償更低的產(chǎn)量。在50％平均效率下，需要34個循環(huán)以得到在20個循環(huán)所得到的理論上可能的百萬級擴增，以及在更低的效率下，所需的循環(huán)數(shù)目是被禁止的。另外，以比預期靶序列更好的平均效率擴增的任何的背景產(chǎn)物將成為主導產(chǎn)物。
許多變量也可影響PCR的平均效率，包括靶DNA長度和二級結(jié)構(gòu)、引物長度和設(shè)計、引物和dNTP濃度、和緩沖液組合物，等等。外源DNA對反應物的污染(例如DNA濺到實驗品的表面)或交叉污染也是一個主要原因。必須為每個不同的引物對和靶序列仔細地優(yōu)化反應條件，甚至對于有經(jīng)驗的研究者，這個過程也需要花費數(shù)天。這些過程的煩瑣包括多種技術(shù)原因和其他因素，代表著在臨床實踐中使用PCR的明顯缺點。事實上，PCR仍以重要的方式滲透到臨床市場中。LCR有著同樣的問題，如LCR必須被優(yōu)化使用各種靶序列的不同的寡核苷酸序列。另外，兩種方法都要求能進行精確溫度循環(huán)的昂貴設(shè)備。
核酸檢測技術(shù)的多個應用例如對等位基因變異的研究不僅涉及檢測復合背景中的特異序列，也涉及具有一些或單個核苷酸差異的序列之間的區(qū)別。PCR檢測等位基因特異性變異的一個方法是依據(jù)當模板鏈和引物的3’末端之間存在錯配時難以用Taq聚合酶合成DNA鏈的事實。通過使用僅與其中一種可能的等位基因完全配對的引物可以檢測等位基因特異性變異，與另一種等位基因的錯配作用為阻止引物的延伸，并據(jù)此避免該序列的擴增。該方法有著很大的局限，就是錯配的堿基組成影響著阻止延伸通過錯配的能力，以及某些錯配不能阻止延伸或只有很小的影響(Kwok et al.，Nucl.Acids Res.，18999，1990)。
使用具有更大影響的相似的3’錯配策略阻止LCR中的連接(Barany，PCR Meth.Applic.，15，1991)。任何錯配有效地阻斷了耐熱連接酶的作用，但是用LCR仍有著靶序列非依賴性背景連接產(chǎn)物啟動擴增的缺點。而且，用于鑒別個別位置上的核苷酸的PCR與隨后的LCR的組合對于臨床實驗室也是非常麻煩的問題。
本發(fā)明的各種優(yōu)選的實施方案的直接檢測法可以是例如循環(huán)探針反應或分支DNA分析。
當?shù)玫阶銐蛄康乃铏z測的核酸時，優(yōu)選地是對序列的直接檢測而不是制備靶序列的更多拷貝(如PCR和LCR)。最特別的是，沒有指數(shù)擴增信號的方法更適合于定量分析。甚至如果通過將多個染料連接到單個寡核苷酸來增強信號，終信號強度和靶序列量之間的相關(guān)性是直接的。這樣的一種體系所有的其他優(yōu)點是反應的產(chǎn)物本身不會啟動其他的反應，所以產(chǎn)物對實驗品表面的污染不是那樣多被關(guān)注的問題。直接檢測的常用方法包括Northern和Southern區(qū)帶核糖核酸酶保護測定通常需要使用放射性以及不適用于自動化檢測。最近設(shè)計的技術(shù)已經(jīng)設(shè)法去消除使用放射性和/或改善自動化格式的敏感性。兩個實例是“循環(huán)探針反應”(CPR)和“分支DNA”(bDNA)。
循環(huán)探針反應(CPR)循環(huán)探針反應(CPR)(Duck et al.，BioTech.，9142，1990)使用一種長的嵌合寡核苷酸，其中中心部分是由RNA構(gòu)成的，而兩個末端是由DNA構(gòu)成的。探針與靶DNA的雜交以及對耐熱的RNaseH的暴露造成RNA部分被消化。這就不穩(wěn)定了雙鏈體的剩余的DNA部分，將探針的剩余部分從靶DNA中釋放出來并容許另一個探針分子重復該過程。以線性速度蓄積了以分割的探針分子形式的信號。雖然重復過程增加了信號，但寡核苷酸的RNA部分對于在樣本制備過程中所帶入的RNase是敏感的。
分支DNAUrdea et al.，Gene 61253-264(1987)所描述的分支DNA(bDNA)包括具有分支結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，它容許每個單個寡核苷酸攜帶35到40個標記(例如堿性磷酸酶)。雖然這個方法增強了來自雜交事件的信號，但同樣增加了來自非特異性結(jié)合的信號。
根據(jù)本發(fā)明不同的優(yōu)選的實施方案對至少一種序列改變的檢測可以通過例如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析或雙脫氧指紋(ddF)來實現(xiàn)。
在臨床診斷上，對于容許檢測特異性核酸序列和序列改變的測試的需要正在快速增長。隨著來自人和致病性生物體的基因的核酸序列數(shù)據(jù)的積累，對用于檢測特異序列內(nèi)的突變的快速、廉價和易用的測試的需要正在快速增長。
已經(jīng)設(shè)計了多種方法來掃描核酸片段的突變。一個選擇是確定每個測試樣本(例如細菌分離物)的整個基因序列。對于小于大約600個核苷酸的序列，用擴增的材料(例如PCR反應產(chǎn)物)可以完成測試。這雖然避免了與克隆相關(guān)片段有關(guān)的時間和費用。但是，需要特殊的設(shè)備和訓練有素的人員，并且該方法的勞動強度太大和太昂貴，因此在臨床環(huán)境中是不現(xiàn)實和不有效的。
考慮到與測序相關(guān)的困難，可以在一些其他的水平上描述核酸的給定片段。在最低分辨率上，可以用電泳通過與在相同的膠上所跑的已知鏈進行比較確定出分子的大小。通過在電泳之前用限制性酶的組合進行分解可以得到分子的更多詳細的圖像，以容許構(gòu)建出有序的圖譜。用標記探針的雜交可以檢測片段內(nèi)的特異性序列的存在，或用部分化學降解或在存在鏈終止核苷酸類似物時用引物延伸可以確定出精確的核苷酸序列。
限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)對于相似序列之間的單堿基差異的檢測，通常需要最高分辨率水平上的分析。對于預先已知相關(guān)核苷酸的位置的情況，已經(jīng)發(fā)展出一些用于檢測單一堿基改變而非直接測序的方法。例如，如果相關(guān)突變發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別序列內(nèi)，消化模式的改變可作為診斷工具(例如限制性片段長度多態(tài)性[RFLP]分析)。
通過RFLP的形成或破壞也可以檢測單點突變。通過在錯配處的降解所生成的RNA片段的存在或大小可以檢測并定位突變。用一些化學試劑也可識別并降解DNA異雙鏈體中的單核苷酸錯配，這提供了一種可選擇的檢測單堿基取代的策略，遺傳學稱為“錯配化學降解”(MCC)(Gogoset al.，Nucl.Acids Res.，186807-6817，1990)。但是，這種方法需要使用四氧化鋨和六氫吡啶，這是兩種劇毒化學物，它們不適合用于臨床實驗室。
RFLP分析具有低敏感性并需要大量樣本。當RFLP分析被用于檢測點突變時，因為其特性，它被限制僅用于檢測那些在已知限制性內(nèi)切酶的限制性序列內(nèi)的單堿基改變。此外，大部分現(xiàn)有的酶具有4到6個堿基對的識別序列，并且對于許多大規(guī)模的DNA操作，這些酶的裂解過于頻繁(Eckstein and Lilley(eds.)，Nucleic Acids and Molecular Biology，vol.2，Springer-Verlag，Heidelberg，1988)。因此，它只適用于很少部分的情況，因為大多數(shù)突變都不在這些位點的范圍內(nèi)。
已經(jīng)分離出一些具有8堿基對特異性的稀有切割的限制性內(nèi)切酶，它們被廣泛地用于遺傳學繪圖，但是這些酶很少，被限制于對富含G+C序列的識別，并在高度簇生的位點降解(Barlow and Lehrach，TrendsGenet.，3167，1987)。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)I組內(nèi)含子所編碼的內(nèi)切酶可能有著超過12個堿基對的特異性(Perlman and Butow，Science 2461106，1989)，但是它們?nèi)允呛苌贁?shù)目的。
等位基因特異性寡核苷酸(ASO)如果改變不是在識別序列內(nèi)，那么可以設(shè)計等位基因特異性寡核苷酸(ASO)以在突變的核苷酸附近進行雜交，這樣引物的延伸或連接事件可被作為匹配或錯配的指示。與放射性標記的等位基因特異性寡核苷酸(ASO)的雜交也已經(jīng)被用于檢測特異的點突變(Conner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，80278-282，1983)。該方法依據(jù)單個核苷酸差異所造成的短DNA片段的解鏈溫度的差異。嚴格的雜交和洗滌條件可以區(qū)分突變型和野生型等位基因。多個研究者也已經(jīng)廣泛地用應用于PCR產(chǎn)物的ASO方法檢測并描述ras基因(Vogelsteinet al.，N.Eng.J.Med.，319525-532，1988；和Farr et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，851629-1633，1988)和gsp/gip癌基因(Lyons et al.，Science 249655-659，1990)中的點突變。因為在多個位點存在不同的核苷酸改變，ASO方法要求使用覆蓋所有可能的致癌性突變的多個寡核苷酸。
對于上述的每種技術(shù)(即RFLP和ASO)，必須在測試前預先知道可疑突變的精確位置。也就是說，當需要檢測一個相關(guān)基因或序列中是否存在的突變時，它們是不適合的。
變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)兩種其他的方法依賴于檢測較少的序列改變所造成的電泳遷移率的改變。這些方法中的一個方法被稱為“變性梯度凝膠電泳”(DGGE)，它根據(jù)對當電泳地溶解于梯度凝膠時，稍微不同的序列將表現(xiàn)出局灶解鏈的不同模式的觀察。以這種方法，可以將變體區(qū)分為有著單一核苷酸差異的同源雙鏈體對異源雙鏈體的解鏈特性的差異，這種差異可以檢測靶序列中的突變的存在，因為它們的電泳遷移率的相應改變。用長的G-C堿基對(30-80)在一端“鎖定(clamped)”所分析的片段(常為PCR產(chǎn)物)，以容許將相關(guān)序列完全變性而不發(fā)生鏈的完全解離。將GC“鎖(clamp)”連接到DNA片段上的增加了可被DGGE識別的突變的比例(Abrams et al.，Genomics 7463-475，1990)。將一個GC“鎖”連接到一個引物上是關(guān)鍵的，它保證了所擴增的序列具有低的解離溫度(Sheffield et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，86232-236，1989；and Lerman and Silverstein，Meth.Enzymol.，155482-501，1987)。已經(jīng)發(fā)展出利用溫度梯度的對該技術(shù)的修飾方法(Wartell et al.，Nucl.AcidsRes.，182699-2701，1990)，并且該方法也可被應用于RNARNA雙鏈體(Smith et al.，Genomics 3217-223，1988)。
DGGE應用的限制包括需要必須將所測試的每種類型的DNA的變性條件最優(yōu)化。此外，方法還需要制備膠和在電泳期間保持所需高溫的特殊設(shè)備。與合成所測試的每個序列的一種寡核苷酸上的鎖定尾(clampingtail)所相關(guān)的費用也是一個主要問題。另外，DGGE需要長的運轉(zhuǎn)時間。在被稱為恒定變性凝膠電泳(CDGE)的DGGE的修飾方法中縮短了DGGE的長運轉(zhuǎn)時間(Borrensen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888405，1991)。為了達到高效地檢測突變，CDGE要求在不同的變性條件下完成凝膠。
一種與DGGE類似的技術(shù)被命名為穩(wěn)定梯度凝膠電泳(TGGE)，它使用溫度梯度而不是化學變性梯度(Scholz，et al.，Hum.Mol.Genet.22155，1993)。TGGE需要使用能產(chǎn)生垂直定位于電場的溫度梯度的特殊設(shè)備。TGGE能檢測相對小的DNA片段中的突變，因此掃描大的基因片段要求在跑膠之前使用多量PCR產(chǎn)物。
單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)另一種常用的方法是Hayashi、Sekya和他們的同事們發(fā)展的被稱為“單鏈構(gòu)象多態(tài)性”的方法(Hayashi，PCR Meth.Appl.，134-38，1991所綜述的)，它依據(jù)于單鏈核酸在非變性條件中具有特征性的構(gòu)象的發(fā)現(xiàn)，這些構(gòu)象影響遷移率。認為互補鏈具有非常不同的結(jié)構(gòu)，使得一條鏈能與另一條鏈區(qū)分開。片段內(nèi)的序列的改變也將改變構(gòu)象，最終改變遷移率，使得它能被用作為一種檢測序列變異的方法(Orita，et al.，Genomics 5874-879，1989)。
SSCP過程包括變性在雙鏈上都被標記的DNA片段(例如PCR產(chǎn)物)，隨后在非變性的聚丙烯酰胺凝膠上進行慢的電泳分離，這樣可以形成分子間的相互作用以及在跑膠期間不會相互干擾。該技術(shù)對于凝膠組成和溫度上的差異是極為敏感的。這個方法的嚴重的局限性是比較在明顯相似的條件下在不同的實驗室所生成的數(shù)據(jù)中會遇到相當大的困難。
雙脫氧指紋印跡法(ddF)雙脫氧指紋印跡法(ddF)是另一種被發(fā)展用于掃描基因內(nèi)突變的技術(shù)(Liu and Sommer，PCR Methods Appli.，497，1994)。ddF技術(shù)組合了Sanger雙脫氧測序和SSCP的內(nèi)容。用一個雙脫氧終止物進行雙脫氧測序反應，然后如SCCP分析那樣，在非變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳反應產(chǎn)物以檢測出終止片段的遷移率的變更。雖然ddF在增加敏感性方面是對SSCP的一個改進，但是ddF需要使用昂貴的雙脫氧核苷酸，并且該技術(shù)仍被局限于分析適合于SSCP分析的大小的片段(即，最適合于檢測200-300個堿基對的片段中的突變)。
除上述的限制外，所有的這些方法都受所分析的核酸片段的大小的限制。對于直接測序法，超過600個堿基對的序列需要克隆，以及為了覆蓋整個片段所需的缺失亞克隆或引物步移所帶來的耽擱和花費。SSCP和DGGE甚至有著更為嚴重的大小限制。因為減少了對序列改變的敏感性，認為這些方法不適用于更大的片段。盡管報道SSCP能檢測200個堿基對片段內(nèi)的90％的單堿基取代，但是對于400個堿基對的片段，檢測降低到了50％。同樣的，當片段的長度達到500個堿基對時，DGGE的敏感性降低。作為直接檢測和SSCP組合的ddF技術(shù)也受可被篩選的DNA的相當小的大小的限制。
根據(jù)本發(fā)明的一個當前的優(yōu)選的實施方案，通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)技術(shù)例如cDNA-SSCP或基因組DNA-SSCP實現(xiàn)尋找腫瘤細胞或來源于腫瘤患者的細胞內(nèi)的上述的任一基因例如還原葉酸載體(RFC)基因內(nèi)的一個或多個突變的步驟。不過，也可采用其他的方法，它們包括但不限于核酸測序、聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應、自動維持合成反應、Qβ復制酶、循環(huán)探針反應、分支DNA、限制性片段長度多態(tài)性分析、錯配化學切割、異雙鏈體分析、等位基因寡核苷酸、變性梯度凝膠電泳、恒定變性凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳和雙脫氧指紋印跡法。
如在下面的實施例部分所進一步舉例的那樣，通過分析觸珠蛋白基因的蛋白基因產(chǎn)物或其部分，也能直接地完成對觸珠蛋白表型的確定。經(jīng)常用一種免疫學檢測法完成這樣的直接分析。
例如在“Using AntibodiesA Laboratory Manual”(Ed Harlow，DavidLaneeds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)中充分解釋了免疫學檢測法，那些本領(lǐng)域人員能實現(xiàn)下面所總結(jié)的作為本發(fā)明一部分的各種技術(shù)。所有的免疫學技術(shù)都需要特異于兩種觸珠蛋白的等位基因中的至少一種等位基因的抗體。適合用作為本發(fā)明的一部分的免疫學檢測法包括，但不限于放射免疫測定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、western印跡法、免疫組化分析和熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)。
放射免疫測定法(PIA)在一個版本中，該方法包括用特異的抗體和固定于可沉淀載體例如瓊脂糖珠上的放射性標記的抗體結(jié)合蛋白(例如用I125標記的蛋白A)沉淀所需的底物，在本例和下面詳細描述的方法中該底物為觸珠蛋白。在所沉淀的珠中的計數(shù)數(shù)目與底物的數(shù)目成正比。
在RIA的另一個版本中，采用了標記底物和未標記的抗體結(jié)合蛋白。加入不同數(shù)量的含有未知量底物的標本。來自標記底物的所沉淀的計數(shù)的減少與所加入樣本中的底物數(shù)目成正比。
酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)該方法包括將含有蛋白底物的樣本(例如固定的細胞或蛋白質(zhì)溶液)固定于一個表面例如微量滴定板的一個孔上。與酶偶聯(lián)的底物特異性抗體被使用并被容許與底物結(jié)合。然后用采用與抗體偶聯(lián)的酶的色度法反應檢測并定量抗體的存在。在這個方法中常用的酶包括辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。如果被很好地標定以及在線性的反應范圍內(nèi)，樣本中所存在的底物的量與所產(chǎn)生的色度成比例。常采用標準底物提高定量的準確性。
Western印跡法該方法包括用丙烯酰胺凝膠將底物與其他蛋白分開，隨后將底物轉(zhuǎn)移到膜上(例如尼龍或PVDF)。然后用特異于底物的抗體檢測底物的存在，隨后用抗體結(jié)合試劑檢測抗體?？贵w結(jié)合試劑可以是例如蛋白A或其他抗體?？贵w結(jié)合試劑可以是如上述的被放射性標記的或酶聯(lián)的。檢測可以是通過放射自顯影技術(shù)、比色反應或化學發(fā)光法。該方法容許定量底物的量并通過底物在膜上的相對位置確定出底物的身份，該相對位置是底物在電泳期間在丙烯酰胺凝膠上的移動距離的指示。
免疫組織化學分析這個方法包括用底物特異性抗體檢測固定細胞內(nèi)的原位底物。底物特異性抗體可以是酶聯(lián)的或與熒光團相連的。檢測是通過顯微鏡或主觀評價。如果采用酶聯(lián)抗體，可能需要比色反應。
熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)這個方法包括用底物特異性抗體檢測細胞內(nèi)原位的底物。底物特異性抗體與熒光團相連。檢測是通過細胞分選儀，它可閱讀當每個細胞經(jīng)過光束時所發(fā)射出的光的波長。這個方法可以同時采用兩種或多種抗體。
當把本發(fā)明付諸實踐時，對HOPE研究數(shù)據(jù)的分析也首次發(fā)現(xiàn)，維生素E和藥物雷米普利具有相似的觸珠蛋白型特異性的益處。雷米普利是常用的治療高血壓的藥物，因此預計它可用于預防CVD。但是，雷米普利的預防作用的幅度(RR＝0.57)以及預防被嚴格地限制于一種觸珠蛋白表型亞組(Hp 2-2)的情況說明，雷米普利的預防作用超過了它對高血壓的療效。除了它的作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑的活性外，雷米普利還有作為抗氧化劑的活性，因為雷米普利治療在體內(nèi)減少了氧自由基種類(Lopez-Jaramillo，et al J Hum Hypertens 2002；16S 1S 100-300)。這里兩種具有明顯不同的生物化學后果的抗氧化劑為經(jīng)觸珠蛋白分型所鑒定出的糖尿病患者亞組提供了相似的臨床益處的論證說明，抗氧化劑治療的范例可適用于其他的抗氧化劑，例如Trolox(Sagach et al PharmaRes 202；45435-39)、Raxofelast(Campo et al，Cardiovasc Drug Rev 1997；15157-73)、TMG(Meng et al Bioorg Med Chem Ltrs 2002；122545-48)、AGI-1067(Yoshida et al Atheroscler 2002；162111-17)、Probucol(Kita et alPNAS USA 1987；847725)以及具有與維生素E相似的抗氧化作用的機制的鈣離子通道阻滯劑(MakI，et al.Pharma Res.2002；4527-33)，例如尼索地平、尼非地平和尼卡地平。因此，預計將從這些抗氧化劑的預防治療最大獲益的人群(Hp 2-2的糖尿病患者)將類似于在此所證實的從維生素E和雷米普利補充中獲益的人群。但是，對糖尿病患者從補充抗氧化劑中獲益的確定不能被應用于所有的抗氧化劑維生素，因為不管是在未經(jīng)選擇的樣本還是在糖尿病患者中，在CVD后果和維生素C補充之間都沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
在此對HOPE研究數(shù)據(jù)的新的分析處理現(xiàn)在已經(jīng)提供了清楚的證據(jù)，其中抗氧化劑維生素E在未分層的糖尿病患者中沒有明顯的益處，可以確定出一個證實從抗氧化劑治療中顯著獲益的糖尿病患者的亞組。因此，這些數(shù)據(jù)說明將所有糖尿病患者的觸珠蛋白表型分型以及為了預防糖尿病的CVD給具有Hp 2-2表型的患者提供預防性抗氧劑補充治療的巨大價值。這種預防性抗氧化劑作用并不限制于單一的抗氧化劑(例如維生素E)，多種潛在的抗氧化劑例如Trolox、Raxefiolfast、AGI-1067、Probucol、TMG和鈣離子通道阻滯劑也是有效的。從對其他臨床研究的分析中可以確定出這些不同的藥劑的相對療效。
本領(lǐng)域人員明白用任何來自受測個體的適合的生物學樣本都可以直接地或遺傳學地實現(xiàn)對個體的觸珠蛋白表型的確定，這些樣本包括但不限于血液、血漿、血細胞、唾液或漱口所得到的細胞、以及身體分泌物例如尿液和淚液、以及來自活檢的樣本等等。
通過閱讀以下的實施例，本領(lǐng)域人員將清楚地知道本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和新的特點，這些實施例無意于對本發(fā)明做任何限制。另外，每一個在上面所描述的以及在下面的權(quán)利要求書中所要求的本發(fā)明的各種實施方案和部分都可以在下面的實施例中找到實驗支持。
實施例現(xiàn)參照下面的實施例以及上述的描述，以非限制性方式舉例說明本發(fā)明。
一般地，在此所用的術(shù)語和在本發(fā)明中所用的實驗室方法包括分子、生物化學、微生物學和重組DNA技術(shù)。在文獻中已經(jīng)充分地解釋了這些技術(shù)。見例如，“Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook et al.，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”Volumesl-111 Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guideto Molecular Cloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson et al.，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren et al.(eds)“Genome AnalysisA Laboratory Manual Series”，Vols.1-4，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如在美國專利No.4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所提出的方法學；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”，VolumesI-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”by Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，Third Edition；“Current Protocols in Immunology”VolumesI-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites et al.(eds)，“Basic and ClinicalImmunology”(8th Edition)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishelland Shiigi(eds)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freemanand Co.，New York(1980)；在專利和科學文獻中廣泛地描述了可獲得的免疫檢測法，見例如美國專利No.3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic AcidHybridization”Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；“Transcriptionand Translation”Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1984)；“Animal CellCulture”Freshney，R.I.，ed.(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRLPress，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”Vol.1-317，Academic Press；“PCR ProtocolsAGuide To Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak et al.，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；在此將其全部內(nèi)容一同并入作為參考。在本文件的全文中提供了其他常用的參考文獻。相信這些方法在本領(lǐng)域是熟知的，為了讀者的便利，我們提供了這些方法。在此一同并入?yún)⒖计渌乃行畔ⅰ?br> 實驗方法在給出提供實驗數(shù)據(jù)支持本發(fā)明的實施例之前，參照以下的方法患者對Strong心臟研究的設(shè)計、調(diào)查方法和實驗室技術(shù)以及參與的印第安人團體的詳細描述先前已經(jīng)被發(fā)表20，39，40。
研究組包括超過4,549位在1989年7月和1992年1月之間在首次進行檢查時年齡為45歲到74歲的個體。所有入選部落成員的參與率平均為65％。未參與者在年齡和糖尿病的自報率上與參與者相似。在第二次檢查(1993年7月到1995年12月)及第三次檢查(1997年7月到1999年12月)時仍存活的個體的復檢率分別平均為88％和90％。
每個階段的臨床檢查包括個人調(diào)查和體格檢查。取空腹血液樣本用于生物化學測定，并進行75克口服葡萄糖耐受試驗。將血液樣本收集于EDTA中，收集血漿并儲存于-20℃。得到標準的血壓測定，以及按先前所描述的連接并記錄心電圖39，40。根據(jù)世界衛(wèi)生組織標準將參與者分類為糖尿病41。如果參與者正在服用抗高血壓藥物或者如果他們的收縮壓超過140mmHg或舒張壓超過90mmHg，就認為這些參與者為高血壓。
通過部落和醫(yī)院的記錄以及通過研究者與參與者和他們家庭的直接接觸鑒定出1998年和至今期間的Strong心臟研究組中的死亡。從州衛(wèi)生部中得到死亡證明書的拷貝并由一位疾病分類學家集中進行ICD-9編號。最初從如前所述死亡證明書中鑒定出可能的CVD死亡42。從尸解報告、病歷記錄摘要和如前所述填表員的調(diào)查中研究死亡原因42。由Strong心臟研究死亡率復習委員會的醫(yī)師成員獨立地復習所有材料確認死亡原因。先前描述了致死性CVD和中風的標準42。
在每次檢查時都復習病歷記錄以識別自上一次檢查以來所已經(jīng)發(fā)生的如前所述任何致死性心血管事件、明確的MI和明確的CVD。也復習了那些在第二次或第三次檢查中沒有參與的人員的記錄。對于所有潛在的CVD事件或干涉，病歷記錄被經(jīng)訓練的病歷記錄摘錄者所復習。復習并摘要了門診隨診記錄中的CVD診斷性操作(例如平板試驗、冠狀動脈造影)。由Strong心臟研究發(fā)病率或死亡率復習委員會的一個醫(yī)師成員復習了從圖表復習中所得到的信息以建立特異的CVD診斷。發(fā)病率復習委員會的其他醫(yī)師成員對摘要記錄的盲向復習顯示在診斷上有著＞90％的一致性。
HOPE研究和患者特征心臟后果預防評估(HOPE)研究被設(shè)計用于驗證關(guān)于兩種稱為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑或維生素E的預防性處理策略將比安慰劑更能改善心血管事件高?；颊叩陌l(fā)病率和死亡率的假說。在這個研究中所包括的患者被認為是具有未來致死性或非致死性心血管事件的高危性，因為他們的年齡(＞55歲)、現(xiàn)有的或以往的心血管病或糖尿病。糖尿病患者至少還有一種其他的危險因素，或者是已知的心血管病或其他因素例如吸煙、高膽固醇或高血壓。將雷米普利或安慰劑加入到伴隨藥物中，在大多數(shù)患者中，這些藥物包括抗高血壓藥物(除ACE-I以外)、降脂藥或阿司匹林。先前已經(jīng)詳細地描述了HOPE研究設(shè)計和方案(見例如，The Heart Outcomes Prevention EvaluationStudy Investigators，N E J Med，2000；342154-60and Sleight，P，J RenninAngioten Aldost Sys 2000；118-20)。簡單地，研究人群包括超過9,451個CVD高危的患者(3,654個DM)。研究為2×2因子設(shè)計，被隨機分為400IU天然維生素E(RRR-a-tocophorol acetate)或安慰劑和10mg雷米普利或安慰劑。隨診患者平均4.5年。主要研究后果包括非致死性MI、中風或心血管死亡。
病例和對照的定義本研究是一個病例對照研究，設(shè)計用于檢測CVD和觸珠蛋白表型之間的相關(guān)性。206個CVD病例和對照(經(jīng)年齡、性別和地理區(qū)域匹配)被用于這個分析。
觸珠蛋白表型分型通過凝膠電泳和利用Smith最初描述的使用淀粉凝膠電泳和聯(lián)苯胺的過氧化物酶染色的方法的改良方法的過氧化物酶染色從10μl EDTA血漿中確定出觸珠蛋白表型44，45，46?；颊哐獫{被儲存于-20℃。所有化合物都購自以色列Sigma公司(Rehovot，Israel)。通過首先在磷酸緩沖鹽水中洗滌血細胞5次，然后將細胞裂解在每ml壓縮細胞體積9ml的無菌水中，從肝素化血液中制備得到10％血紅蛋白水溶液。在10,000g離心細胞裂解液40分鐘，并將含有血紅蛋白的上清液分裝儲存在-70℃。將血漿(10μl)和2μl 10％血紅蛋白溶液混和，并將樣本在室溫下放置5分鐘以使得形成觸珠蛋白-血紅蛋白復合物。在跑電泳之前，將等體積(12μl)的含有125mM Tris堿pH 6.8、20％(w/v)甘油和0.001％(w/v)溴酚藍的樣本緩沖液加入到每樣本中。利用含有25mM Tris堿和192mM甘氨酸的緩沖液用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離觸珠蛋白血紅蛋白復合物。成層膠為125mMTris堿(pH 6.8)中的4％聚丙烯酰胺(29∶1丙烯酰胺/雙丙烯酰胺)，以及分離膠是360mM Tris堿(pH 8.8)中的4.7％聚丙烯酰胺(29∶1丙烯酰胺/雙丙烯酰胺)。在250伏恒壓下進行電泳3個小時。在完成電泳后，通過將膠浸泡在玻璃器皿內(nèi)的新鮮制備的染色溶液中可以肉眼看到觸珠蛋白-血紅蛋白復合物。染色溶液(通過按所列的次序加入試劑制備得到)含有5ml 0.2％(w/v)3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺甲醇溶液、0.5ml二甲基亞砜、10ml5％(v/v)冰醋酸、1ml 1％(w/v)鐵氰化鉀和150μl 30％(w/w)過氧化氫。在15分鐘內(nèi)可看到對應于觸珠蛋白-血紅蛋白復合物的條帶，該條帶是穩(wěn)定超過48個小時。照相記錄下所有的膠。在實驗室中，無任何有關(guān)于患者的知識下確定出所有樣本的觸珠蛋白表型。
實驗室接受用于分析的血漿樣本，觸珠蛋白表型分型在所有的除了6個樣本外都是可能的。對于這6個患者，還不清楚是否它們表示患者不合成任何的觸珠蛋白(Hp 0表型)22，23或觸珠蛋白的濃度在所描述的檢測法的檢測限度之下。
對于來自HOPE研究的樣本，根據(jù)已建立的方法(Hochberg I et alAtherosclerosis 2002；161441-446)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳從10μl樣本中進行觸珠蛋白表型分型。從1等位基因純合子(Hp1-1)、2等位基因純合子(Hp2-2)或在觸珠蛋白位點為雜合子(Hp2-1)的個體中得到標記條帶圖案。我們已經(jīng)在從血漿中所確定的觸珠蛋白表型和用聚合酶鏈反應從基因組DNA中所確定的觸珠蛋白基因型之間建立了100％一致性(Koch W.et al Clin Chem 2002；27713635-40)。在超過99.6％的所有檢測樣本中得到了一個明確的觸珠蛋白表型。在未知患者的臨床或治療狀態(tài)下進行觸珠蛋白表型分型。
統(tǒng)計學分析在病例和對照之間以及在三種觸珠蛋白表型之間比較了CVD的危險因素年齡、性別、LDL和HDL膽固醇、甘油三脂、收縮期BP、BMI、糖尿病、吸煙、CVD家族史和入選中心。另外，在病例和對照之間以及在三種觸珠蛋白表型之間比較了由胰島素、空腹血糖水平、HbAlc、DM持續(xù)時間和DM家族史所構(gòu)成的DM特征。進行了單因素和多因素logistic回歸模型以確定出這些CVD危險因素和DM特征是否與表型相關(guān)。用類然比測定參數(shù)。
通過調(diào)整三種觸珠蛋白表型的CVD危險因素和DM特征，運行條件logistic回歸模型將糖尿病患者具有CVD事件的可能性模型化。用兩個指示符變量編碼糖尿病-表型之間的相互作用，一個指的是糖尿病患者，另一個指的是非糖尿病患者。通過對殘數(shù)(residuals)進行分析測定出模型的符合度。
用SAS 6.02進行對HOPE研究數(shù)據(jù)的所有分析。按需用t檢驗或χ2檢驗比較根據(jù)觸珠蛋白的患者的特征。報告了主要后果心血管死亡、非致死性心肌梗死和中風的相對危險度(RR)和95％可信度區(qū)間。
實驗結(jié)果實施例I觸珠蛋白表型是糖尿病患者的CVD危險的預測因素在下面的表1中顯示了病例對照組的根據(jù)CVD危險因素和DM特征的臨床特征。
表1病例-對照組的CVD危險因素

病例和對照在年齡、性別和地理區(qū)域上進行了匹配。這些數(shù)據(jù)與先前在該人群中的發(fā)現(xiàn)一致，即糖尿病、LDL膽固醇和高血壓都是CVD的獨立的預后因素20。
對本隊列的觸珠蛋白表型分型發(fā)現(xiàn)了25％1-1、44％2-1和31％2-2的分布。1等位基因的頻率為0.47％，這與已經(jīng)報道的該人群中的觸珠蛋白等位基因的頻率非常吻合。在不同的觸珠蛋白表型之間都沒有發(fā)現(xiàn)在單因素和多因素logistic回歸分析具有1-1表型的概率中所確定出的任何的CVD危險因素或DM特征上任何顯著的差異。
下面的表2提供了在調(diào)整CVD危險因素和DM特征之前和之后預測每個糖尿病和非糖尿病個體的觸珠蛋白表型的CVD事件的概率的條件logistic回歸。
表2預測CVD事件的概率的條件logistic回歸



這些數(shù)據(jù)顯示，在調(diào)整了所有的CVD危險因素和DM特征后，在Strong心臟研究的糖尿病參與者中，那些具有觸珠蛋白表型2-2的參與者發(fā)生CVD事件的可能性是那些具有1-1表型的參與者發(fā)生CVD事件的可能性的4.7倍(1.86-11.88 OR 95％CI)(p＝0.001)，以及是那些具有2-1表型的參與者發(fā)生CVD事件的可能性的2.5倍(1.14-5.67OR 95％CI)(p＝0.022)。此外，具有觸珠蛋白表型2-1的患者發(fā)生CVD事件的可能性是具有1-1表型的患者的1.8倍(0.86-3.96 OR 95％CI)，盡管沒有統(tǒng)計學顯著差異。綜上所述，這些數(shù)據(jù)說明觸珠蛋白2等位基因數(shù)目造成糖尿病個體具有不同程度的發(fā)生CVD的危險。
最后，在非糖尿病患者中，觀察到有著臨界統(tǒng)計學顯著差異的趨勢，即具有觸珠蛋白表型2-2的非糖尿病患者發(fā)生CVD事件的可能性是具有1-1表型的非糖尿病患者的3.0倍(0.90-9.77OR 95％CI)(p＝0.073)。
下面的表3總結(jié)了這些結(jié)果。
表3預測經(jīng)DM和CVD危險因素調(diào)整后的CVD事件的概率的條件logistic回歸

實施例II觸珠蛋白表型是糖尿病患者從抗氧化劑治療中獲益的預測因素進行觸珠蛋白表型分型的HOPE樣本的患者特征在來自最初的HOPE隊列的本來就已得到血漿的3176個患者(1078個糖尿病)中獲得觸珠蛋白表型。這些患者代表隨機選擇的連續(xù)的來自整個HOPE隊列的患者的組。在下面的表4中顯示了根據(jù)CVD危險因素和治療方案的HOPE隊列的臨床特征。
表4HOPE研究中的患者特征

這個HOPE隊列的亞組的基本特征與整個隊列沒有顯著差異。由觸珠蛋白表型所分組的樣本的基本特征在基本的人口統(tǒng)計學的、臨床的或治療特征上都沒有顯著差異(表4)。
Hp表型對CV后果的作用在沒有接受抗氧化劑治療的對象中，在整個研究樣本的各個觸珠蛋白表型的主要復合終點(非致死性MI、中風或心血管死亡)的發(fā)生率上沒有顯著差異(Hp 1-145/25917.4％，Hp 2-1113/737 15.3％，Hp 2-2 95/581 16.4％，趨勢χ2為0.08，P＝0.87)。但是，與在上述的Strong心臟研究中所報道的結(jié)果相一致的是(見實施例I和Levy AP，et al.Haptoglobin phenotype is an independent risk factor forcardiovascular disease in individuals with diabetesthe strong heart study.JAm Coll Card 2002；401984-1990))，我們發(fā)現(xiàn)在沒有接受抗氧化劑治療的HOPE研究的DM患者中，增加了與Hp2等位基因相關(guān)的主要復合終點(非致死性MI、中風或心血管死亡)的危險度(Hp 1-1 13/79 16.5％，Hp 2-1 44/225 19.6％，Hp 2-2 48/187 25.7％，趨勢χ2為5.67，P＝0.02)。
維生素E對CV后果的作用下面的表5顯示了對所有患者和糖尿病(DM)患者的與觸珠蛋白表型相關(guān)的有和無維生素E補充的主要CV后果(非致死性MI、中風或心血管死亡)的分析結(jié)果。
表5CV后果與維生素E補充的相對危險度所有患者

僅糖尿病患者

給定RRR為有維生素E與無維生素E的CV事件比較的危險度的平均值(95％CI)。
*，p＜0.05，統(tǒng)計學顯著性差異；NS，無統(tǒng)計學顯著差異。
在整個所研究的樣本中，不論觸珠蛋白表型如何，沒有與維生素E補充所相關(guān)的對任何主要CV后果的顯著性益處(表5，所有患者)。此外，如先前所報道的(The Heart Outcomes Prevention Evaluation StudyInvestigators.Vitamin E supplementation and cardiovascular events inhigh-risk patients.N Eng J Med 2000；342154-160)(表5，DM患者)，維生素E補充在未經(jīng)選擇的DM組沒有顯著益處。令人驚奇的是，在具有觸珠蛋白2-2表型的DM患者中，發(fā)現(xiàn)維生素E治療顯著地降低了CV死亡的危險(RR 0.45，95％CI 0.23-0.90；P＝0.003)以及顯著地降低了非致死性心肌梗死(MI)的危險(RR 0.57，95％0.33-0.97；P＝0.02)，而維生素E治療對任何其他的觸珠蛋白表型(Hp1-1和Hp 2-1)的DM患者的任何主要CV后果都沒有顯著的益處。
雷米普利對CV后果的作用下面的表6顯示了對所有患者和糖尿病(DM)患者的與觸珠蛋白表型相關(guān)的有和無雷米普利補充的主要CV后果(非致死性MI、中風或心血管死亡)的分析結(jié)果。
表6CV后果與雷米普利補充的相對危險度所有患者

僅糖尿病患者

*，p＜0.05，統(tǒng)計學顯著性差異；NS，無統(tǒng)計學顯著差異。給定RRR為有雷米普利與無雷米普利的CV事件比較的危險度的平均值(95％CI)。
從對整個樣本的分析中可證實，不論觸珠蛋白表型如何，沒有與雷米普利補充所相關(guān)的對任何主要CV后果的顯著性益處(表6，所有患者)。和維生素E的作用相似，雷米普利補充在未經(jīng)選擇的DM組中沒有顯著益處。令人驚奇的是，僅在具有觸珠蛋白2-2表型的糖尿病(DM)患者中觀察到雷米普利對復合主要終點中風、CV死亡和心肌梗死的顯著益處(RR 0.57，95％CI 0.36-0.90；P＜0.05)。雷米普利對任何其他的觸珠蛋白表型(Hp1-1和Hp2-1)的任何主要CV后果都沒有益處(表6)。
應該理解，為了清楚的目的在各個實施方案的上下文中所描述的本發(fā)明的某些特征也可以以組合形式出現(xiàn)于單一實施方案中。相反地，為了簡潔的目的在單個實施方案的上下文中所描述的本發(fā)明的各種特征也可以被分開地或以任何合適的亞組合的形式提供。
盡管已經(jīng)結(jié)合特異的實施方案描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域人員顯然能進行許多變更、修飾和變異。因此，本發(fā)明包括所有這些只要在所附的權(quán)利要求書的精神及大范圍內(nèi)的變更、修飾和變異。在本說明書中所提及的所有出版物、專利和專利申請均在此以其全部內(nèi)容并入本說明書作為參考，如同每個出版物、專利或?qū)＠暾埦痪唧w地和單獨地指明并入本申請作為參考。另外，在本申請中對任何參考文獻的引用或認可都不應當被解釋為承認這些參考文獻作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
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序列表<110>拉帕波特家族醫(yī)學研究院<120>預測抗氧化劑治療在預防高血糖患者的心血管疾病中的益處的方法<130>26782<160>1<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>21<212>PRT<213>Human<220>
<223>haptoglobin peptide alpha 2 chain<400>1Ala val Gly Asp Lys Leu pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Gln pro1 5 10 15Pro Pro Lys Cys Ile20
權(quán)利要求
1.一種確定糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型并據(jù)此確定糖尿病患者從所述抗氧化劑治療中獲益的可能性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，具有觸珠蛋白2-2表型的患者從所述抗氧化劑治療中的獲益更大。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述血管并發(fā)癥選自由微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥所組成的組。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述血管并發(fā)癥是選自由慢性心衰、心血管死亡、中風、心肌梗死和冠狀動脈血管成形術(shù)相關(guān)的再狹窄所組成的組的大血管并發(fā)癥。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述微血管并發(fā)癥選自由糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和糖尿病神經(jīng)病變所組成的組。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述大血管并發(fā)癥選自由冠狀動脈側(cè)支血管減少和心肌缺血所組成的組。
6.權(quán)利要求1的方法，其中通過確定糖尿病患者的觸珠蛋白的基因型來實現(xiàn)所述的對所述觸珠蛋白表型的確定。
7.權(quán)利要求6的方法，其中通過一種選自如下一組的方法來實現(xiàn)所述的確定糖尿病患者的觸珠蛋白基因型的步驟，所述組由信號擴增法、直接檢測法和對至少一種序列改變的檢測組成。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述信號擴增法擴增的是選自由DNA分子和RNA分子所組成的組的分子。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述信號擴增法選自由PCR、LCR(LAR)、自動維持合成反應(3SR/NASBA)和Qβ復制酶反應所組成的組。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述直接檢測法選自由循環(huán)探針反應(CPR)和分支DNA分析所組成的組。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述對至少一種序列改變的檢測采用選自如下一組的方法，所述組由限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析和雙脫氧指紋印跡法(ddF)所組成。
12.權(quán)利要求1的方法，其中通過直接確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型來實現(xiàn)所述的對所述觸珠蛋白表型的確定。
13.權(quán)利要求12的方法，其中用免疫學檢測法實現(xiàn)確定所述觸珠蛋白表型的步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述免疫學檢測法選自由放射免疫測定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、western印跡法、免疫組織化學分析和熒光激活細胞分選(FACS)所組成的組。
15.一種確定減少糖尿病患者的氧化應激以預防糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的重要性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型的步驟，據(jù)此確定減少特定的糖尿病患者的氧化應激的重要性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，在具有觸珠蛋白2-2表型的患者中減少氧化應激的重要性更大。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述血管并發(fā)癥選自由微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥所組成的組。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述血管并發(fā)癥是選自由慢性心衰、心血管死亡、中風、心肌梗死和冠狀動脈血管成形術(shù)相關(guān)的再狹窄所組成的組的大血管并發(fā)癥。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述微血管并發(fā)癥選自由糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和糖尿病神經(jīng)病變所組成的組。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述大血管并發(fā)癥選自由冠狀動脈側(cè)支血管減少和心肌缺血所組成的組。
20.權(quán)利要求15的方法，其中通過確定糖尿病患者的觸珠蛋白的基因型實現(xiàn)所述的確定所述觸珠蛋白表型的步驟。
21.權(quán)利要求15的方法，其中通過選自如下一組的方法來實現(xiàn)所述的確定糖尿病患者的所述觸珠蛋白基因型的步驟，所述組由信號擴增法、直接檢測法和對至少一種序列改變的檢測所組成。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述信號擴增法擴增選自由DNA分子和RNA分子所組成的組的分子。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述信號擴增法選自由PCR、LCR(LAR)、自動維持合成反應(3SR/NASBA)和Qβ復制酶反應所組成的組。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述直接檢測法選自由循環(huán)探針反應(CPR)和分支DNA分析所組成的組。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述對至少一種序列改變的檢測采用選自如下一組的方法，所述組由限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析和雙脫氧指紋印跡法(ddF)所組成。
26.權(quán)利要求15的方法，其中通過直接確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型來實現(xiàn)所述的確定所述觸珠蛋白表型的步驟。
27.權(quán)利要求26的方法，其中通過免疫學檢測法實現(xiàn)所述的確定所述觸珠蛋白表型的步驟。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫學檢測法選自由放射免疫測定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、western印跡法、免疫組織化學分析和熒光激活細胞分選(FACS)所組成的組。
29.一種用于評價糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的試劑盒，所述試劑盒包括用于確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型的套裝試劑以及指明所述試劑盒用于評價糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的標簽或包裝插頁。
全文摘要
一種確定糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型并據(jù)此確定糖尿病患者從所述抗氧化劑治療中獲益的可能性，其中與具有觸珠蛋白1－2表型或觸珠蛋白1－1表型的患者相比，具有觸珠蛋白2－2表型的患者從抗氧化劑治療中的獲益更多。
文檔編號G01N33/53GK1922200SQ200480042196
公開日2007年2月28日 申請日期2004年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者安德魯·P·利維 申請人:拉帕波特家族醫(yī)學研究院