專利名稱：通過隧道電導(dǎo)變化檢測來對聚合物測序的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及識別聚合物鏈中的分子，更具體地涉及通過隧道電流測量來對這些分子測序。
背景技術(shù)：
關(guān)于生物聚合物的功能性已經(jīng)進行了大量研究，所述功能性是由生物聚合物內(nèi)單體的主要次序來確定的。識別單體的次序是理解生物聚合物的功能性所必需的?？焖?、可靠且成本低廉地表征聚合物已經(jīng)變得愈來愈重要，尤其是表征核酸。當(dāng)前典型的核酸測序方法依賴于化學(xué)反應(yīng)或酶促反應(yīng)，其中化學(xué)反應(yīng)生成在特定堿基處斷開的不同長度的DNA片段，酶促反應(yīng)生成在特定堿基處終止的不同長度的DNA片段。
已知的聚合物測序方法每種都存在缺陷。例如，大部分方法都慢而且是勞動密集型的?；谀z的DNA測序方法需要將近1-3天來識別長度為300-800個堿基的次序。例如質(zhì)譜和ELIDA測序的方法僅能對非常短的聚合物進行。
最近，天然或人造納米孔的開發(fā)已經(jīng)使得快速確定核酸分子的次序成為可能。在納米孔測序中，使單鏈DNA通過合適溶液中的納米孔，并且單個核苷酸(或者在核苷酸環(huán)境中的物理變化)被物理地檢測。例如，具有納米孔的膜將溶液中的兩室隔開，低電壓施加在這兩室之間。溶液中這兩室之間通過納米孔的離子電流被用來監(jiān)測納米孔內(nèi)DNA的存在。當(dāng)單鏈DNA在納米孔中時，它部分阻塞了納米孔，以致這兩室之間的離子電流降低。因而建議利用離子電流的變化來識別DNA堿基。(例如見“Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molecules”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.971079-85，2000；Baldarelli等，美國專利No.6,015,714；和Church等，美國專利No.5,795,782，這里通過引用將每個的內(nèi)容都結(jié)合于此。)因為由于納米孔的高寬比，在任意給定時間，納米孔中通常存在大約10個DNA堿基，所以利用離子電流的變化來識別單個DNA堿基是非常困難的。
另一方面，納米技術(shù)的發(fā)展使得限制分子通過納米孔變得可行。例如，已經(jīng)研究了當(dāng)分子通過納米孔時，利用膜通道來表征聚核苷酸。Kasianowicz等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9313770-3，1996，這里通過引用將其內(nèi)容結(jié)合于此)利用電場來迫使單鏈RNA和DNA分子通過脂質(zhì)雙層膜中2.6nm直徑的離子通道。通道直徑在任意給定時間僅允許單鏈的核酸聚合物穿過通道。當(dāng)核酸聚合物穿過通道時，聚合物部分阻塞了通道，導(dǎo)致離子電流瞬時下降。由于電流下降的持續(xù)時間與核酸聚合物的長度直接成比例，所以Kasianowicz等人(見前述文獻)能夠通過測量離子電流的變化而用實驗方法確定核酸的長度。
本領(lǐng)域中一直需要對先前未被識別或表征的、例如生物分子的聚合物進行識別和/或測序。
以下描述直接檢測或識別分子的改進方法和裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及通過使聚合物穿過形成在一對納米電極之間的納米級通道而依次識別該聚合物中的相連的分子(linked molecules)，例如核酸的核苷酸堿基。作用在納米電極上的偏壓的變化和/或調(diào)制以及隨后的信號處理允許導(dǎo)出特有的電學(xué)特征或電學(xué)信號，其可以與對應(yīng)于所期望的感興趣的分子的已知特征信號值進行比較。這種比較導(dǎo)致可依次識別聚合物的分子。在以下提供的對本發(fā)明的描述中，具體提到了優(yōu)選實施例，其中被測序的聚合物優(yōu)選地是核酸，例如單鏈或雙鏈DNA堿基，但是本發(fā)明并非意在限于這種聚合物。
一方面，本發(fā)明提供了利用隧道電流與隧道偏壓的關(guān)系(即隧道電導(dǎo)的變化)來識別所研究分子的裝置和方法。例如內(nèi)部本征態(tài)之類的分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)修正了隧道電流和隧道偏壓之間的關(guān)系。這種修正生成了隧道電流與隧道偏壓之間關(guān)系中的某些獨特的特征。因此，它們可用來識別所研究的分子。
納米技術(shù)的發(fā)展使制備一對納米電極變得可行，并可使它們之間具有納米級的通道。然后，在調(diào)制和/或變化電極上的偏壓的同時，聚合物的相連的分子依次穿過該通道，并利用隧道電流的幅度作為標(biāo)準(zhǔn)而被識別。該偏壓優(yōu)選在已知分子的(一個或多個)特有特征值的初步確定期間變化，以識別能最有效地識別已知分子的偏壓。在識別化學(xué)上已知的感興趣的分子的特有電學(xué)性能期間，在當(dāng)感興趣的(一個或多個)分子穿過納米電極之間的通道時，該偏壓被集中到對應(yīng)于已知分子的預(yù)定偏壓附近，并被調(diào)制。接著隧道電流和偏壓被用來導(dǎo)出特有特征，以隨后用于與已知的特有特征值進行比較，從而識別出通道中感興趣的(一個或多個)分子。
例如，低的固定偏壓(如100mV)可用來識別DNA堿基。該偏壓被集中到共振電壓附近，該共振電壓被選擇來對應(yīng)于已知分子內(nèi)部能級之間的一個或多個能量差。接著，當(dāng)偏壓被調(diào)制波形調(diào)制時，感興趣的未知分子被驅(qū)動依次穿過通道，并且當(dāng)感興趣的分子在電極和偏壓之間穿過時，通過解調(diào)通過分子的隧道電流而導(dǎo)出表示該分子的一個或多個電信號。接著，將所導(dǎo)出的電信號與對應(yīng)于已知分子的已知信號值進行比較。
本發(fā)明依賴于與內(nèi)部能級的關(guān)系，這是因為當(dāng)相對于納米電極的定向不同的兩個不相類似的DNA堿基穿過通道時，它們可能具有類似的隧道電流(在固定偏壓下)，從而使識別變得復(fù)雜。
優(yōu)選地，制備接近納米孔的電極，以使分子以每次單個分子的方式“漏過”(“funnel”)或受限穿過通道。分子由本領(lǐng)域已知技術(shù)驅(qū)動穿過電極通道和/或納米孔，例如施加電場，施加機械壓力到溶液上，或利用光學(xué)鑷子。
在本發(fā)明的一個實施例中，調(diào)制偏壓的波形是正弦波，優(yōu)選地，該正弦波的所有諧波都被抑制。在另一實施例中，調(diào)制波形是方形波。調(diào)制波形可以合成為在所導(dǎo)出電信號中不帶有要被檢測的諧波。這些技術(shù)和信號選擇意在增強電信號中存在的對應(yīng)于感興趣的分子的可檢測諧波。
隧道電流優(yōu)選地用解調(diào)波形相干地解調(diào)。因為利用解調(diào)波形的解調(diào)方法可以利用模擬電路、數(shù)字電路或數(shù)字過程來實現(xiàn)，這些對本領(lǐng)域而言都是已知的，所以沒有討論解調(diào)器的實現(xiàn)細(xì)節(jié)，以簡化這里的討論。解調(diào)導(dǎo)致某些特有特征被顯示出來。例如，分子中的非彈性電子隧道效應(yīng)可能在利用調(diào)制波形的二次諧波而被解調(diào)的隧道電流中在共振電壓處顯示峰。結(jié)果，對于相同的物理過程，利用調(diào)制波形的三次諧波而被解調(diào)的隧道電流可能顯示彌散狀曲線。在與已知分子的已知曲線的比較中，這兩種特征信號每種都有用。解調(diào)波形的頻率可以與調(diào)制波形的頻率相同，或者是其諧波或子諧波?；蛘?，解調(diào)波形包含下面頻率分量的其中至少之一調(diào)制波形的相同頻率、調(diào)制波形的所有子諧波和調(diào)制波形的所有諧波。隧道電流在解調(diào)之前(例如，帶通)或解調(diào)之后(例如，低通)可選地被濾波以提高信噪比。
在另一實施例中，多于一對的納米電極可以被定向成使得聚合物穿過形成在相鄰對電極之間的每個通道。接著，對各個經(jīng)調(diào)制隧道電流中的每個的類似信號處理和/或濾波允許同時識別多于一個的感興趣的分子。
已知分子的內(nèi)部能級和特有電學(xué)特征可通過例如光譜法的常規(guī)技術(shù)來標(biāo)識，但是本發(fā)明提供了可替換的方法。一個或多個已知的(一個或多個)相同分子可以定位在納米電極之間一段時間，這段時間足以使偏壓在包含該分子的可能內(nèi)部能級的電壓范圍內(nèi)變化，并且同時用其頻率高于偏壓變化速率的調(diào)制波形來調(diào)制偏壓。通過解調(diào)當(dāng)該分子位于電極之間時所測得的通過該分子的隧道電流而導(dǎo)出與已知分子相關(guān)的(一個或多個)特征電信號，該信號隨后被用在上述測序方法的比較中。將(一個或多個)已知分子定位在納米電極之間可以這樣來實現(xiàn)通過用光學(xué)鑷子將(一個或多個)分子保持在通道中，或者通過使由穿過通道的相同分子所組成的聚合物穿過納米通道，以使相同分子在信號處理期間的所有時間內(nèi)都將存在。
另一方面，本發(fā)明提供了執(zhí)行上述研究方法的裝置，由連接到信號發(fā)生器的納米電極對、用于驅(qū)動聚合物穿過納米電極通道的裝置和信號處理裝置組成，其中信號發(fā)生器用于施加并調(diào)制(可選地改變)偏壓，該偏壓對應(yīng)于感興趣的分子的內(nèi)部能級之間的一個或多個能量差；信號處理裝置用于獲取隧道電流信號，相干地解調(diào)所獲得的信號并將所得特征電信號與已知分子的已知信號值進行比較。在可選實施例中，納米孔或納米通道可以貼近納米電極，以限制聚合物以每次單個分子的方式穿過通道。如上所討論的，光學(xué)鑷子、電場發(fā)生器或其他驅(qū)動裝置可用來迫使聚合物穿過納米電級通道，濾波器可用來提高所得信號的信噪比。
信號處理器還包括用于采集并存儲所導(dǎo)出的感興趣分子的特征電信號的存儲器，用于檢索與已知分子相關(guān)的這種信號的已知值以進行比較。本發(fā)明提供了更快的測序速度(即實時)以及對更長的聚合物進行測序的能力，這在降低例如與核苷酸測序相關(guān)的分析成本中有用。
從下面對本發(fā)明優(yōu)選實施例的描述和權(quán)利要求中，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將變得清楚。


為了更好地理解本發(fā)明，參照附圖和具體的描述，其中圖1是根據(jù)本發(fā)明的聚合物測序裝置的組成示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明的具有漏過裝置和電泳場發(fā)生器的納米電極的示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明的同時識別聚合物中多個分子的裝置的部分示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了對聚合物進行測序的系統(tǒng)和方法。參照圖1(未按比例繪制)，本發(fā)明的優(yōu)選實施例涉及驅(qū)動溶液中的聚合物2的一個分子8穿過一對納米電極6之間的通道4，并利用常規(guī)信號發(fā)生器10將電極6上的偏壓VB12集中，該偏壓對應(yīng)于感興趣分子8的任意兩個內(nèi)部能級之間的能量差。然后，調(diào)制波形WMOD14應(yīng)用到偏壓VB12上。穿過分子8通過通道4的隧道電流IT16被傳感器18(例如，電流傳感器)獲取，并被傳送到可包括鎖相放大器和/或相敏檢測器的信號處理設(shè)備20。所獲得的隧道電流IT16接著被解調(diào)器22解調(diào)，以導(dǎo)出特征信號SC24 該信號接著可以與已知分子的相關(guān)預(yù)定信號S已知26進行比較，以確定穿過通道4的分子8是否與已知分子相同。所獲得的隧道電流IT16在解調(diào)之前或解調(diào)之后可任選地分別通過帶通濾波器或低通濾波器28。常規(guī)技術(shù)可用來完成所導(dǎo)出的特征信號SC24與預(yù)定信號S已知26之間的比較，例如通過線性和/或非線性曲線擬合和/或變化分析(例如，Allan偏差)。
參照圖2，聚合物2可以是本領(lǐng)域已知的任意類型的聚合物，但優(yōu)選包括核酸或蛋白質(zhì)。DNA是脫氧核苷酸的聚合物，其由脫氧核糖、一個或多個磷酸基團以及腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的衍生物組成。DNA鏈3的遺傳信息可以通過對鏈3中的4個不同堿基(A，G，C和T)進行測序而確定。RNA也可以被測序，但注意RNA鏈包括尿嘧啶(U)分子，其取代4個堿基中的胸腺嘧啶。DNA鏈可以是單鏈或雙鏈，并且已知技術(shù)可用來將最初的雙鏈樣品減少到單鏈，并且/或者去除次級DNA結(jié)構(gòu)。為方便起見，任何常規(guī)方法可用來將雙鏈DNA鏈分解為單鏈，例如用熱或電離酸或堿斷開成對堿基之間的氫鍵。
聚合物2分布在其中的溶液可以是任何允許穿過納米電極通道4的合適聚合物遷移率以用于測序的流體。這種溶液一般含有作為導(dǎo)電劑的離子，例如鋇、鈣、銫、氯化物、磷酸鉀、鈉或硫酸鹽，并且優(yōu)選是但也并非一定是模擬體內(nèi)環(huán)境的基于水的溶液。通過在納米電極6的兩側(cè)分別設(shè)置一個電極32的方式，建立和調(diào)節(jié)(調(diào)節(jié)到零或反轉(zhuǎn)其極性)與納米電極6不平行的電泳電場30，可以驅(qū)動聚合物2進入或穿過通道4。(見Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.93，pp.13770-13773，November 1996，這里通過引用將其內(nèi)容結(jié)合于此)其他驅(qū)動聚合物穿過通道4的方法也可以應(yīng)用，例如僅在納米電極6的一側(cè)將機械壓力施加到溶液上，或者使用光學(xué)鑷子(如圖3中的元件7)。也可以將催化劑物理鏈接到聚合鏈的端部，并通過移動催化劑來拖動聚合物，由此來誘導(dǎo)聚合物2穿過通道。
納米電極6應(yīng)該被隔離以防止電流損失，并且可利用現(xiàn)有納米級制備技術(shù)由導(dǎo)電但對溶液呈惰性的材料(例如，金)制成為各種大小和形狀(見“Rapid nanopore discrimination between single polynucleotidemolecules”，A.Meller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.97，pp.1079(2000)。)單原子層和亞單原子層可以精確地沉積或減少到嚴(yán)格的規(guī)格。而且，電解金屬-溶解反應(yīng)可用來打開并控制金屬內(nèi)的納米孔或納米通道，并且用來控制納米電極尖端之間的通道大小。已知的納米光刻方法包括但不限于化學(xué)氣相沉積、電化學(xué)沉積、化學(xué)沉積、電鍍、熱擴散和蒸發(fā)、物理氣相沉積、溶膠-凝膠沉積、聚焦電子束、聚焦離子束、分子束外延、蘸水筆(dip-pen)納米光刻、反應(yīng)性離子束蝕刻、化學(xué)輔助離子束蝕刻、微波輔助等離子體蝕刻、電子氧化、掃描探針方法、化學(xué)蝕刻、納米印刷和激光燒蝕。
穿過通道4的分子8的特征可以由通過納米電極6的隧道電導(dǎo)變化的幅度或持續(xù)時間來識別。每種類型的分子都將表現(xiàn)出能夠識別該分子的特有特征。每個單體的體積、形狀或電荷都將以特有的方式影響電導(dǎo)。此外，整個聚合物2的大小可以通過觀測電導(dǎo)變化的持續(xù)時間來確定。隧道電導(dǎo)變化可以通過調(diào)制偏壓VB12并接著解調(diào)從納米電極6(該納米電極中的一個作為陽極，另一個作為陰極)獲得的隧道電流IT16而被有效地確定。納米電極6之間通道4的寬度是納米量級的，長度5與鏈3的堿基分子之間的間距量級相當(dāng)或更小。如果通道長度和厚度相對較小，則納米電極的精確形狀并不重要。我們認(rèn)為納米電極之間通道4的寬度不能制成完全一致，但是，因為可測量的隧道電流會大致以寬度的指數(shù)函數(shù)上升，所以當(dāng)分子通過最窄寬度的點時，可歸因于該分子隧道電流的信號將支配測量。這樣實際上具有如下的有益效果即，限制了可能與感興趣的特定分子一起存在于通道中的其他不希望分子的隧道電流的影響(例如，因為納米電極之間通道的長度不合要求而允許納米電極之間存在多于一個分子)。
通道4的尺寸可以起限制分子的作用，使得分子受限而以一個分子接著一個分子的方式穿過納米電極之間，但是優(yōu)選地，可替換地首先使聚合物2“漏過”(funnel)固態(tài)納米通道或納米孔，或天然納米孔(例如α-溶血素)34以將分子重新排序或重新定向。納米孔應(yīng)該由非導(dǎo)電材料形成，例如氮化硅，其類似地對溶液呈惰性，并且利用上面描述的技術(shù)之一就可形成。
再參照圖1，信號發(fā)生器10提供了應(yīng)用到納米電極6上的偏壓VB12和調(diào)制波形WMOD14。傳感器18被用來詢問納米電極以測量隧道電流IT16隨時間的變化。所獲取的隧道電流IT16信號可以存儲在可選的數(shù)據(jù)存儲設(shè)備25中以用于以后的分析，或者利用高處理量、實時方法立即進行處理。在任一種方法中，在使用解調(diào)波形WDEMOD27的情況下，所獲取的隧道電流IT16信號被傳遞給解調(diào)器22。接著，所得特有“特征”或信號SC24可以與已知分子特有的或與已知分子相關(guān)的一個或多個預(yù)定信號S已知26進行比較，以確定感興趣的分子8和已知分子之間的關(guān)系(例如，同一性)。
根據(jù)量子力學(xué)，隧道電流IT16是偏壓VB12的線性函數(shù)，這樣使得對于相對于納米電極6具有給定定向的分子8，定義為d IT/dVB的隧道電導(dǎo)是恒定的。這種近似僅對低偏壓才是準(zhǔn)確的，這是因為它不包括可歸因于分子8的內(nèi)部狀態(tài)的影響。如果考慮分子的內(nèi)部狀態(tài)，則當(dāng)隧道電子的能量在Δεij≡εi-εj附近時，要修正隧道電導(dǎo)，其中εi和εj分別是分子的狀態(tài)|i＞和狀態(tài)|j＞的能量。相應(yīng)的“共振電壓”可以由隧道電導(dǎo)的變化來確定，并且可用來識別正被研究的分子8。由于這些“共振電壓”值是由分子8的內(nèi)部狀態(tài)確定的，所以預(yù)計它們對(例如，DNA堿基)分子定向不太敏感。不同量子狀態(tài)對隧道電導(dǎo)的影響細(xì)節(jié)取決于所涉及的物理過程。例如，在某些分子中，非彈性電子隧道效應(yīng)是主要的過程，其至少在隧道電子能量的小范圍內(nèi)修正了隧道電導(dǎo)。
分子狀態(tài)能量由其電子的、振動的和旋轉(zhuǎn)的量子數(shù)目確定。有關(guān)分子中電子狀態(tài)、振動狀態(tài)和旋轉(zhuǎn)狀態(tài)的能量量級分別為eV、100meV和100μeV。這樣，基態(tài)電子中的振動狀態(tài)將是最適合利用所討論方法來識別感興趣分子的狀態(tài)。
為了最初識別特定分子的一個或多個相關(guān)特征信號，需要將單個已知分子定位在納米電極之間的通道4中(例如，用光學(xué)鑷子)，或者需要生成由重復(fù)分子組成的聚合鏈并使其穿過通道。本領(lǐng)域已知的任意酶促生成技術(shù)，優(yōu)選為生成次級結(jié)構(gòu)已減少或去除的、帶有重復(fù)序列的單鏈核酸的技術(shù)，都可以使用。一旦感興趣的分子8位于納米電極之間的通道4中，偏壓VB12即可在相關(guān)范圍內(nèi)掃蕩(線性或非線性地)，該范圍是包括分子8的(一個或多個)所期望共振電壓的電壓范圍。隧道偏壓VB12和傳感器18所獲得的相應(yīng)隧道電流IT16可任選地存儲在數(shù)據(jù)存儲設(shè)備25中用于以后的處理以揭示這些“共振電壓”。
可歸因于非彈性電子隧道效應(yīng)的特征是可觀測的，并且在導(dǎo)出識別信息的過程中有用。在這個過程中，隧道電流IT16相對于偏壓的二次導(dǎo)數(shù)d2IT/dVB2在“共振電壓”處表現(xiàn)出可檢測的峰。(見“Single-MoleculeVibrational Spectroscopy and Microscopy”，B.Stipe等，Science，Vol.280，pp.1732-1735，12 June 1998，這里通過引用將其內(nèi)容結(jié)合于此。)如果不同的物理過程正在發(fā)生，則“共振電壓”下的隧道電流特征可能不同。那么dnIT/dVBn(n為不同值)在“共振電壓”處將表現(xiàn)出某種特有特征，例如峰。由于在單個分子8停留在納米電極6之間的通道4中的時間期間，偏壓VB12要在感興趣的范圍內(nèi)掃蕩，所以這種方法的帶寬相對較大。
或者，可以用調(diào)制頻率為fm的調(diào)制波形WMOD14來調(diào)制(高頻振動)偏壓VB12。通過用調(diào)制頻率的n次諧波解調(diào)隧道電流IT16可獲得信號dnIT/dVBn。當(dāng)偏壓VB12掃描通過“共振電壓”時，所尋找的特有特征將出現(xiàn)。調(diào)制波形WMOD14優(yōu)選被生成為使得其缺少認(rèn)為將在特征信號中發(fā)現(xiàn)的諧波信號。合適的波形例如可以包括方形波或正弦波，其中正弦波的所有諧波已經(jīng)被抑制。調(diào)制波形也可以合成產(chǎn)生，這樣使得其以某種方式增強了特征信號中的諧波。所得的隧道電流信號被解調(diào)波形WDEMOD27相干地解調(diào)，以導(dǎo)出(一個或多個)特征信號。解調(diào)波形可以具有與調(diào)制波形WMOD14相同的頻率fm、或諧波或其子諧波。或者，解調(diào)波形可以包含下列頻率分量的其中至少之一調(diào)制波形的基頻、調(diào)制波形的所有子諧波和調(diào)制波形的所有諧波。對于某些分子，非彈性電子隧道效應(yīng)在利用調(diào)制波形的二次諧波解調(diào)的隧道電流中將出現(xiàn)峰。結(jié)果，在利用調(diào)制波形的三次諧波所解調(diào)的隧道電流中將呈現(xiàn)彌散狀曲線。
在已經(jīng)為特定分子初步確定了隧道電導(dǎo)的特征信號S已知之后，通過上述方法或者振動光譜法，可以詢問感興趣的未知分子以確定它們是否呈現(xiàn)出已知的(一個或多個)特征信號，從而識別感興趣的分子。在一個方法中，這通過將偏壓(通過調(diào)制)向已知分子特有的“共振電壓”集中來實現(xiàn)。當(dāng)已知類型的感興趣的分子穿過納米電極6之間的通道4時，從解調(diào)隧道電流所導(dǎo)出的信號在時域中將表現(xiàn)出特有特征。與同樣分子的特有特征相對于掃描偏壓的變化曲線相比較，該特有特征隨時間(固定偏壓)的變化曲線可能看起來不同。以這種檢測模式，檢測帶寬由分子在通道中的停留時間決定，這樣使得信噪比將獲得顯著改善。
在一個實施例中，已知特征信號和未知特征信號的比較功能直接在分散的或集成的硬件元件中實現(xiàn)。在另一實施例中，所檢測到的隧道電流IT可選地被存儲在數(shù)據(jù)存儲設(shè)備25中，以在需要的時候用于分析來確定有關(guān)聚合物的結(jié)構(gòu)信息。適于用在本發(fā)明中的計算機29包括作為用戶接口的輸出設(shè)備和輸入設(shè)備、數(shù)據(jù)存儲設(shè)備以及與數(shù)據(jù)存儲設(shè)備連接的處理器，處理器帶有可執(zhí)行的存儲空間以進行分析。輸入和輸出設(shè)備也連接到處理器和存儲系統(tǒng)。用于對上述所檢測到的信號進行數(shù)據(jù)分析的計算機程序可較容易獲得。
參照圖3，在本發(fā)明的另一實施例中，多對納米電極6A-6D獨立地識別穿過它們各自通道的分子。它們可以共用信號處理設(shè)備20。被施加到納米電極6A-6D中每對上的各個偏壓中的每個被集中在與唯一的已知分子相關(guān)的共振電壓附近，并以唯一的調(diào)制頻率被調(diào)制。應(yīng)該注意到要確保相鄰納米電極對之間的偏壓不會互相干擾，例如通過隔離或屏蔽措施。從每對納米電極6A-6D所采集的相應(yīng)隧道電流ITA-ITD被同時用上述解調(diào)器以特定調(diào)制頻率的各個所希望諧波解調(diào)。同樣，如上所述，在解調(diào)之前和/或之后也可以使用可選的濾波來提高信噪比。對于給定分子，當(dāng)相應(yīng)的解調(diào)信號通過被校準(zhǔn)而適合于該分子的檢測器時，它將顯示要尋找的特有特征。這種裝置和方法允許以非常快速的方式來識別幾個不同分子和對聚合物進行測序。
連續(xù)的納米電極對并不要求象圖3中描繪的那樣排列；存在某個角度或偏移都是允許的。此外，每對納米電極并不必識別不同的感興趣的分子。例如，每對都可以應(yīng)用不同的共振電壓來尋找同一未知分子的不同特征信號?？梢源嬖谶@種情況作用到不同納米電極對上來識別特定分子的多于一個的共振電壓是有必要的或者希望的，以增加檢測/識別的可靠性。在應(yīng)用多個納米電極對的情況下，可以將分子穿過各個通道時間和所導(dǎo)出的信號進行關(guān)聯(lián)。
對于發(fā)明人而言，可應(yīng)用本發(fā)明而被測序的聚合物的長度是沒有限制的，但是，當(dāng)要被測序的聚合物具有線型、曲線型或直線型骨架時，本發(fā)明能提供最佳結(jié)果，而如果聚合物的形狀太不規(guī)則，則在將該聚合物弄直(即，漏過)的可選步驟中可能會遇到困難。對最佳處理量的愿望實際上也將限制以多慢的速度將聚合物進行測序——更慢的速度將產(chǎn)生更好的信噪比，但是在最小的速度下限，布朗運動將產(chǎn)生不確定性。這樣，應(yīng)該選擇驅(qū)動方法來消除布朗運動效應(yīng)并增加處理量。
雖然已描述了本發(fā)明的各種實施例，但應(yīng)該認(rèn)識到，本發(fā)明也能夠適用于在本發(fā)明精神內(nèi)的更多其他實施例。
權(quán)利要求
1.一種對聚合物分子測序的方法，包括如下步驟集中由在其間的通道隔開的納米電極對上的偏壓，所述偏壓對應(yīng)于感興趣的分子的任意兩個內(nèi)部能級之間的能量差；用調(diào)制波形調(diào)制所述偏壓；依次驅(qū)動由相連的分子組成的聚合物分子穿過所述通道，所述相連的分子包括至少一個所述感興趣的分子；由通過所述感興趣的分子的隧道電流導(dǎo)出表示所述感興趣的分子的電信號，所述隧道電流是當(dāng)所述聚合物穿過所述通道時，所述感興趣的分子處于所述納米電極之間的同時測得的；以及通過將所導(dǎo)出的電信號與所述感興趣的分子的已知信號值進行比較來識別所述感興趣的分子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述依次驅(qū)動步驟還包括使所述聚合物漏過所述通道，以將所述聚合物限制為每次一個分子地通過所述通道。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述漏過步驟還包括迫使所述聚合物通過納米孔或納米通道。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物是核酸。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述聚合物是雙鏈DNA，所述感興趣的分子包括一個DNA堿基或一對DNA堿基。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述聚合物是單鏈DNA，所述感興趣的分子包括一個DNA堿基。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述依次驅(qū)動步驟還包括下列步驟的其中之一用電場驅(qū)動所述聚合物，將機械壓力施加到所述聚合物懸浮在其中的溶液，或者直接用一對或多對光學(xué)鑷子操縱所述聚合物。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述調(diào)制波形選自正弦波、其中正弦波的所有諧波被抑制的正弦波、方形波、不帶所導(dǎo)出電信號中要被檢測的諧波的合成波形、或增強所導(dǎo)出電信號中存在的對應(yīng)于所述感興趣的分子的至少一種所期望諧波的合成波形。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述導(dǎo)出特征電信號的步驟還包括用解調(diào)波形相干地解調(diào)所述隧道電流。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述分子中的非彈性電子隧道效應(yīng)在用所述調(diào)制波形的二次諧波所解調(diào)的所述隧道電流中呈現(xiàn)出峰形。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述分子中的非彈性電子隧道效應(yīng)在用所述調(diào)制波形的三次諧波所解調(diào)的所述隧道電流中呈現(xiàn)出彌散狀曲線。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述解調(diào)波形包含下面頻率分量的其中至少之一所述調(diào)制波形的相同頻率、所述調(diào)制波形的所有子諧波和所述調(diào)制波形的所有諧波。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，還包括對所述隧道電流進行濾波以提高信噪比的步驟。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述導(dǎo)出步驟還包括通過濾波和/或后處理從經(jīng)解調(diào)的隧道電流中提取所述信號。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述電信號包括由從所述隧道電流得到的隧道電導(dǎo)的變化所確定的共振電壓。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述偏壓對應(yīng)于所述感興趣的分子的共振電壓。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括集中至少一個附加偏壓，所述附加偏壓加在至少一對附加的、由通道隔開以在其間形成至少一個附加通道的納米電極，并且所述至少一個附加偏壓對應(yīng)于至少一個附加的感興趣的分子的任意兩個內(nèi)部能級之間的能量差；用至少一個附加調(diào)制波形調(diào)制所述至少一個附加偏壓；驅(qū)動所述聚合物穿過所述至少一個附加通道；由各對電極之間的隧道電流導(dǎo)出表示所述至少一個附加的感興趣的分子的至少一個附加電信號，所述隧道電流是在所述聚合物的一分子部分穿過各個通道的同時測得的；以及通過所述聚合物單次通過多個通道所導(dǎo)出的各個電信號與感興趣的多個分子的多個已知信號值進行比較，來識別至少一個附加的感興趣的分子。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括集中至少一個附加偏壓，所述附加偏壓加在至少一對附加的、由通道隔開以在其間形成至少一個附加通道的納米電極，并且所述至少一個附加偏壓對應(yīng)于所述感興趣的分子的任意兩個內(nèi)部能級之間的能量差；用至少一個附加調(diào)制波形調(diào)制所述至少一個附加偏壓；驅(qū)動所述聚合物穿過所述至少一個附加通道；由各對電極之間的隧道電流導(dǎo)出表示所述感興趣的分子的至少一個附加電信號，所述隧道電流是在所述聚合物的一分子部分穿過各個通道的同時測得的；以及還通過所述聚合物單次通過多個通道所導(dǎo)出的各個電信號與感興趣的分子的多個已知信號值進行比較，來識別所述感興趣的分子。
19.一種識別化學(xué)上已知分子的特征電信號的方法，包括如下步驟將一個或多個化學(xué)上已知的相同分子定位在一對由通道隔開的納米電極之間；在包括所述分子的可能內(nèi)部能級的電壓范圍內(nèi)改變所述納米電極之間的偏壓；用調(diào)制波形調(diào)制所述偏壓；以及通過分析和/或解調(diào)通過所述一個或多個分子的隧道電流來導(dǎo)出表示所述一個或多個已知分子的電信號，所述隧道電流是在所述一個或多個已知相同分子被定位在所述納米電極之間的所述通道中的同時測得的。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述定位步驟還包括下列步驟之一用一對或多對光學(xué)鑷子將所述一個或多個已知分子保留在所述通道中，或驅(qū)動由所述一個或多個相同分子組成的聚合物通過所述通道。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述定位步驟還包括將電泳驅(qū)動電壓施加在所述一個或多個已知分子懸浮在其中的溶液上并調(diào)節(jié)該電壓。
22.一種聚合物分子測序系統(tǒng)，包括一對納米電極，其被設(shè)置來依次地接收位于形成在其間的通道中的溶液中聚合物的相連的分子；信號發(fā)生器，其電連接到所述納米電極以集中加在所述納米電極上的偏壓并用調(diào)制波形調(diào)制所述偏壓，所述偏壓對應(yīng)于感興趣的分子的任意兩個內(nèi)部能級之間的能量差；用于驅(qū)動所述聚合物穿過所述通道的裝置；用于測量在所述聚合物的一分子部分穿過所述通道時所述納米電極之間的隧道電流的裝置；和信號處理器，用于從所述隧道電流導(dǎo)出表示所述感興趣的分子的電信號，并通過將所導(dǎo)出的電信號與所述感興趣的分子的已知電信號值進行比較來識別所述感興趣的分子。
23.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，還包括用于限制所述聚合物以每次一個分子的方式通過所述通道的裝置。
24.如權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，其中所述限制裝置包括納米孔或納米通道。
25.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中所述驅(qū)動裝置選自形成作用到所述溶液上的電場的電極，形成在所述納米電極之間通道上的壓力梯度的機械裝置，或者一對或多對光學(xué)鑷子。
26.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中所述調(diào)制波形不帶所導(dǎo)出電信號中要被檢測的諧波。
27.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中所述調(diào)制波形增強所述電信號中存在的對應(yīng)于所述感興趣的分子的至少一種所期望的諧波。
28.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中所述信號處理器用解調(diào)波形相干地解調(diào)所述隧道電流。
29.如權(quán)利要求28所述的系統(tǒng)，其中所述解調(diào)波形包含下面頻率分量的其中至少之一所述調(diào)制波形的相同頻率、所述調(diào)制波形的所有子諧波和所述調(diào)制波形的所有諧波。
30.如權(quán)利要求28所述的系統(tǒng)，還包括用于在解調(diào)之前提高信噪比的一個或多個隧道電流濾波器。
31.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中所述電信號包括由從所述隧道電流得到的隧道電導(dǎo)的變化所確定的共振電壓。
32.如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其中所述偏壓對應(yīng)于所述感興趣的分子的共振電壓。
33.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中所述信號處理器還包括用于采集并存儲所導(dǎo)出的電信號的數(shù)據(jù)存儲設(shè)備。
34.如權(quán)利要求33所述的系統(tǒng)，其中所述信號處理器還被設(shè)置來訪問存儲在所述數(shù)據(jù)存儲設(shè)備中與感興趣的分子有關(guān)的已知電信號記錄，用于與所導(dǎo)出的電信號進行比較。
全文摘要
本發(fā)明描述了識別例如核酸的聚合物分子的系統(tǒng)和方法。該方法涉及集中由通道隔開的一對納米電極上的偏壓，并在感興趣的分子在通道中時用調(diào)制波形調(diào)制偏壓，所述偏壓對應(yīng)于感興趣的分子的任意兩個內(nèi)部能級之間的能量差。表征感興趣的分子的電信號從納米電極之間的隧道電流導(dǎo)出，并且表征電信號被與化學(xué)上已知分子的已知信號值進行比較以識別該感興趣的分子。多個納米電極對也可用來更可靠地識別單個分子或多個分子。
文檔編號G01N27/416GK1667401SQ20051000298
公開日2005年9月14日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者朱淼 申請人:安捷倫科技有限公司