專利名稱：快速測定甜葉菊糖含量的方法及其專用試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種檢測方法，具體地說是一種甜葉菊糖(也稱甜菊糖、甜葉菊糖、甜葉菊糖苷、甜葉菊糖甙)含量的快速檢測方法。本發(fā)明也涉及這種檢測方法的專用試劑。
背景技術(shù)：
目前糖尿病患者逐漸增加，另外正常人過量攝取可吸收性糖也不利于身體健康，為此具有與蔗糖口感相近，同時(shí)為非吸收性糖的甜味劑開發(fā)利用是今后的發(fā)展方向。
在世界上許可添加的幾大類甜味劑中，一半來自化工合成，另一半來自于天然植物。隨著人們生活水平的不斷提高，越來越傾向于使用天然植物無能量甜味劑。
在天然植物無能量甜味劑中甜度比較高的有甜葉菊植物，其糖作為甜味劑應(yīng)用也是近十幾年的事。甜葉菊植物中有7種甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(Stevioside)和450倍的RA(RebaudiosideA，或稱為甜菊A3Stevioside A3)。由于它們的特性而被應(yīng)用于食品、保健品、藥品、化妝品、抗氧化食用商品、飼料添加劑。
隨著甜菊糖應(yīng)用范圍不斷地?cái)U(kuò)大，快速檢測手段也越來越受重視。目前分析檢測方法有(1)分光光度計(jì)比色(黃海水，林靜1990；付寶忠，史立華1995；項(xiàng)秀珠，郭秀珠1996)、(2)薄層色譜(黃雨三2003)、(3)高壓液相色譜(黃曉蘭，倪爾葭1990)、(4)毛細(xì)管電泳(邵寒娟，胡涌剛2001)等方法。薄層色譜法的化學(xué)試劑比較多，適合于小樣品的純化。高壓液相色譜法和毛細(xì)管電泳法儀器比較貴，同時(shí)要有該專業(yè)技術(shù)人員，一般甜葉菊糖加工廠不易實(shí)現(xiàn)。它們都不方便攜帶，在農(nóng)業(yè)甜葉菊的育種和栽培生產(chǎn)中的隨時(shí)監(jiān)控比較困難。這3種方法適合于大學(xué)及研究所對(duì)甜菊糖的研究；相比之下，分光光度計(jì)比色法操作簡單，檢測成本低，容易克服上述不足，做常規(guī)性測定易于被生產(chǎn)廠家所應(yīng)用。
原理在煮沸的堿性溶液中，還原糖(具有醛基或酮基)使3，5-二硝基水楊酸成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的含量和棕紅色物的顏色深淺的程度成一定比例關(guān)系。540nm波長下測定棕紅色物質(zhì)的消光值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求出樣品中還原糖的含量。這是許多生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書中還原糖的分光光度計(jì)比色測定方法(郝再彬等2004；入村達(dá)郎等2004)。
植物體內(nèi)的還原糖主要是單糖(葡萄糖和果糖)、雙糖(麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖)。葡萄糖有6個(gè)碳原子、一個(gè)醛基；果糖有6個(gè)碳原子、一個(gè)酮基；麥芽糖由兩個(gè)葡萄糖分子以α-1，4-鍵相結(jié)合、含一個(gè)醛基；異麥芽糖由兩個(gè)葡萄糖分子以α-1，6-鍵相結(jié)合、含一個(gè)醛基；纖維二糖由兩個(gè)葡萄糖分子以β-1，4-鍵相結(jié)合、含一個(gè)醛基。蔗糖是非還原糖，由葡萄糖和果糖分子以α-1，2-鍵相結(jié)合，與3，5-二硝基水楊酸沒有呈色反應(yīng)。
根據(jù)上述理論，我們認(rèn)為相同濃度摩爾的葡萄糖和麥芽糖所含的醛基數(shù)量相同時(shí)，540nm波長下、3，5-二硝基水楊酸方法測定它們的消光值應(yīng)該相等，葡萄糖和麥芽糖兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率也應(yīng)該相同；然而，我們發(fā)現(xiàn)它們不相等，麥芽糖的消光值數(shù)據(jù)大于葡萄糖。即在麥芽糖分子中除醛基之外還有其他基團(tuán)與測定試劑發(fā)生了反應(yīng)，從而導(dǎo)致消光值數(shù)據(jù)大于葡萄糖。由此，我們利用該原理發(fā)明了3，5-二硝基水楊酸和鐵氰化鉀方法測定甜葉菊糖。
根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，測定甜葉菊糖的發(fā)明做如下說明。
甜葉菊糖(主要是兩種成分，St和RA。St、RA的分子結(jié)構(gòu)分別見圖1、2)為甜菊醇苷體與兩個(gè)配糖體(R1、R2)相結(jié)合。St的R1和R2配糖體分別是一個(gè)葡萄糖和α-1，2-鍵相結(jié)合兩個(gè)葡萄糖；RA是在St的基礎(chǔ)上R2配糖體除α-1，2-鍵外又增加了一個(gè)α-1，3-鍵相結(jié)合三個(gè)葡萄糖。在甜葉菊糖(St、RA)分子中無游離醛基和酮基結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)的還原糖測定方法表明這種分子結(jié)構(gòu)的甜葉菊糖與還原糖測定試劑沒有反應(yīng)，因此也不能用于甜葉菊糖的定量分析。但是，我們發(fā)現(xiàn)了它們之間有反應(yīng)。
另外，甜葉菊糖的粗提取物樣品中常常含有還原糖，該還原糖對(duì)甜葉菊糖定量有影響，為此發(fā)明了在不同溫度下讓它們反應(yīng)，從而將它們分別定量。既用兩組樣品，加入測定試劑之后，一組樣品在50℃加熱1小時(shí)(或25℃-30℃的室溫下放置24小時(shí))，另一組樣品在100℃加熱10分鐘。前者還原糖有呈色反應(yīng)，而甜葉菊糖沒有反應(yīng)；后者還原糖和甜葉菊糖都有呈色反應(yīng)。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用分光光度計(jì)比色法快速測定甜葉菊糖含量的方法。本發(fā)明的目的還在于提供快速測定甜葉菊糖含量的方法的專用試劑。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的首先配制測定用試劑，分別制備出1％葡萄糖及1％甜葉菊糖標(biāo)準(zhǔn)液母液；用母液制備出不同濃度的溶液，向這些不同濃度的溶液中添加測定用試劑測定，在50℃和100℃溫度下反應(yīng)；之后利用分光光度計(jì)在波長540nm下測定出它們的消光值，制作出濃度和消光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算公式；其次配制未知樣品溶液，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算公式計(jì)算出未知樣品中甜葉菊糖濃度。
本發(fā)明還可以包括1、所述的測定用試劑為將200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與10-30g氫氧化鈉(NaOH)溶于0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)3-9g、結(jié)晶酚(苯酚)1-8g、亞硫酸鈉(Na2SO3)1-8g，先后于溶液中溶解；最后再加入鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]2-5g使其溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1L所得到的溶液。
2、所述的其測定過程為葡萄糖、甜葉菊糖標(biāo)準(zhǔn)樣品和測定用試劑在體積為5ml的離心管中搖勻，100℃水浴加熱10分鐘，取出后立即放入4℃冰箱中冷卻，之后各管在天平上以蒸餾水定重量至4.0g，加蓋后顛倒混勻；在540nm波長下，測定消光值；以濃度為橫坐標(biāo)，消光值為縱坐標(biāo)，分別繪制出葡萄糖、甜葉菊糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線方程；同時(shí)做出50℃下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線方程；未知樣品用同樣方法進(jìn)行。
發(fā)明方法的原理甜葉菊糖(主要是兩種成分，St和RA。St、RA的分子結(jié)構(gòu)分別見圖1、2)為甜菊醇苷體與兩個(gè)配糖體(R1、R2)相結(jié)合。St的R1和R2配糖體分別是一個(gè)葡萄糖和α-1，2-鍵相結(jié)合兩個(gè)葡萄糖；RA是在St的基礎(chǔ)上R2配糖體除α-1，2-鍵外又增加了一個(gè)α-1，3-鍵相結(jié)合三個(gè)葡萄糖。在甜葉菊糖(St、RA)分子中無游離醛基和酮基結(jié)構(gòu)，但是能與測定還原糖的試劑反應(yīng)，從而進(jìn)行定量。甜葉菊糖的粗提取物樣品中常常含有還原糖，該還原糖對(duì)甜葉菊糖定量有影響，為此用兩組樣品，加入測定試劑之后，一組樣品在50℃加熱1小時(shí)(或25℃-30℃的室溫下放置24小時(shí))，另一組樣品在100℃加熱10分鐘。前者還原糖有呈色反應(yīng)，而甜葉菊糖沒有反應(yīng)；后者還原糖和甜葉菊糖都有呈色反應(yīng)。
本發(fā)明的方法可以用來測定甜葉菊糖(也稱甜菊糖、甜葉菊糖苷、甜葉菊糖甙)。
本發(fā)明的方法應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，可以應(yīng)用于1)工業(yè)甜葉菊糖的提取、純化等工業(yè)化生產(chǎn)的隨時(shí)監(jiān)控；2)農(nóng)業(yè)在甜葉菊栽培和育種的種植中，甜葉菊糖含量質(zhì)量監(jiān)控；3)原料收購收購甜葉菊葉片(或莖稈)時(shí)，其中的甜葉菊糖含量測定；4)相關(guān)終端產(chǎn)品在食品、保健品、藥品、化妝品、添加甜葉菊糖的抗氧化商品以及飼料添加劑中，甜葉菊糖被濃縮之后用該方法測定等。


附圖是甜葉菊糖苷的分子結(jié)構(gòu)。其中R是H時(shí)為St、R是葡萄糖時(shí)為RA。
(五)具體實(shí)施方案下面對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的描述1.材料甜葉菊葉片或甜葉菊糖粉。
2.儀器設(shè)備分光光度計(jì)；分析天平；離心機(jī)；水浴鍋；5ml離心管；容量瓶；研缽。
3.試劑和標(biāo)準(zhǔn)液(1)測定用試劑200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與20g NaOH溶于0.8L蒸餾水中。攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)6g，結(jié)晶酚(苯酚)5g，亞硫酸鈉(Na2SO3)5g，先后于溶液中溶解。最后再加入鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)3.2g使其溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1L，貯于棕色瓶中備用；備用試劑出現(xiàn)混濁時(shí)要過濾。(2)標(biāo)準(zhǔn)液80℃下烘至恒重的葡萄糖、甜葉菊糖各100mg，分別加蒸餾水溶解，定容至10ml，搖勻后置冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 4.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將7支5ml離心管編號(hào)，按下表所示的量精確加入濃度為10mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液和測定試劑。將各管搖勻，在100℃加熱10分鐘，取出后立即放入4℃冰箱中冷卻，之后各管在天平上以蒸餾水定重量至4g，加蓋后顛倒混勻。在540nm波長下，用0號(hào)管調(diào)零，分別讀取1～6號(hào)管的消光值。以消光值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制出葡萄糖、甜葉菊糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線方程。同時(shí)做出50℃下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線方程。
5.樣品中糖的提取準(zhǔn)確稱取1g樣品，放在100ml的燒杯中，先以少量蒸餾水調(diào)制，然后加50ml蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20分鐘，使糖浸出，攪勻后于4000rpm離心10分鐘，離心的上清液收集在100ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為待測液。葉片樣品至少要105℃干燥3個(gè)小時(shí)以上，再進(jìn)行上述過程。
表1各試管加溶液的量管號(hào) 0 1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)液(μl) 0 20 40 60 80 100120水(μl) 20018016014012010080測定試劑(μl)200200200200200200200標(biāo)準(zhǔn)量(mg) 0 0.20.40.60.81.01.2定容到4.0g后標(biāo)準(zhǔn)量(mg/ml)0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30注意表中各量是根據(jù)分光光度計(jì)比色杯厚度為0.8-1.0cm設(shè)計(jì)的。
6.計(jì)算待測液的比色方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法相同。比色后根據(jù)消光值、標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算公式即可計(jì)算出樣品中甜葉菊糖濃度。
按下式計(jì)算百分含量(1)、根據(jù)50℃下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得50℃下還原糖量；50℃下還原糖量A(％)＝(C50)·V0(1000V1·W)-1式中C5050℃下標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得的還原糖量(mg)；V0提取液的體積(ml)V1顯色時(shí)吸取樣品液體積(ml)；W樣品重(g)。
(2)、根據(jù)100℃下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出C50的消光值為B；(3)、100℃下葡萄糖和甜葉菊糖共存下的消光值為C；(4)、100℃下甜葉菊糖消光值C-B＝D；(5)、根據(jù)100℃下甜葉菊糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出甜葉菊糖百分含量；甜葉菊糖(％)＝(C100)·V0(1000V1·W)-1式中C100根據(jù)消光值D，100℃下標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得的甜葉菊糖(mg)；V0提取液的體積(ml)V1顯色時(shí)吸取樣品液體積(ml)；W樣品重(g)。
權(quán)利要求
1.一種快速測定甜葉菊糖含量的方法，其特征是首先配制測定用試劑，分別制備出1％葡萄糖及1％甜葉菊糖標(biāo)準(zhǔn)液母液；用母液制備出不同濃度的溶液，向這些不同濃度的溶液中添加測定用試劑測定，在50℃和100℃溫度下反應(yīng)；之后利用分光光度計(jì)在波長540nm下測定出它們的消光值，制作出濃度和消光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算公式；其次配制未知樣品溶液，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算公式計(jì)算出未知樣品中甜葉菊糖濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速測定甜葉菊糖含量的方法，其特征是所述的測定用試劑為將200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與10-30g氫氧化鈉(NaOH)溶于0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)3-9g、結(jié)晶酚(苯酚)1-8g、亞硫酸鈉(Na2SO3)1-8g，先后于溶液中溶解；最后再加入鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]2-5g使其溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1L所得到的溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速測定甜葉菊糖含量的方法，其特征是所述的其測定過程為葡萄糖、甜葉菊糖標(biāo)準(zhǔn)樣品和測定用試劑在體積為5ml的離心管中搖勻，100℃水浴加熱10分鐘，取出后立即放入4℃冰箱中冷卻，之后各管在天平上以蒸餾水定重量至4.0g，加蓋后顛倒混勻；在540nm波長下，測定消光值；以濃度為橫坐標(biāo)，消光值為縱坐標(biāo)，分別繪制出葡萄糖、甜葉菊糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線方程；同時(shí)做出50℃下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線方程；未知樣品用同樣方法進(jìn)行。
4.一種快速測定甜葉菊糖含量的方法的專用試劑，其特征是它是200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與10-30g氫氧化鈉(NaOH)溶于0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)3-9g、結(jié)晶酚(苯酚)1-8g、亞硫酸鈉(Na2SO3)1-8g，先后于溶液中溶解；最后再加入鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]2-5g使其溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1L所得到的溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速測定甜葉菊糖含量的方法的專用試劑，其特征是它是200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與20g氫氧化鈉(NaOH)溶于0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)6g、結(jié)晶酚(苯酚)5g、亞硫酸鈉(Na2SO3)5g，先后于溶液中溶解；最后再加入鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]3.2g使其溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1L所得到的溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種快速測定甜葉菊糖含量的方法及其專用試劑。首先配制測定用試劑，分別制備出1％葡萄糖及 1％甜葉菊糖標(biāo)準(zhǔn)液母液；用母液制備出不同濃度的溶液，向這些不同濃度的溶液中添加測定用試劑測定，在50℃和100℃溫度下反應(yīng)；之后利用分光光度計(jì)在波長540nm下測定出它們的消光值，制作出濃度和消光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算公式；其次配制未知樣品溶液，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算公式計(jì)算出未知樣品中甜葉菊糖濃度。本發(fā)明的方法可以用來測定甜葉菊糖；應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，可以應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、原料收購及相關(guān)終端產(chǎn)品等的測定。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1731144SQ20051001027
公開日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者郝再彬, 蒼晶, 一井真比古, 武田真 申請(qǐng)人:郝再彬