專利名稱：用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種免疫學(xué)檢測、分析和診斷的蛋白質(zhì)芯片。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)芯片是一種在固體基片表面固定蛋白質(zhì)或多肽微陣列，通過免疫學(xué)原理對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測、識別、分析和診斷，可應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、及生物傳感器的研制等相關(guān)領(lǐng)域。
傳統(tǒng)的免疫分析方法目前主要有免疫熒光方法(Fluorescent Immunoassay，F(xiàn)IA)，酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked Immunoassay，EIA)和放射免疫分析技術(shù)(RadioactiveImmunoassay，RIA)。這些技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，在臨床醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究中發(fā)揮了重要作用。然而，傳統(tǒng)方法檢測速度慢，效率低，已不能滿足醫(yī)學(xué)尤其是生命科學(xué)飛速發(fā)展的要求。例如，F(xiàn)IA和EIA法靈敏度較低，而RIA雖然靈敏度較高，但其放射性又會對操作人員身體造成傷害。
生物芯片的出現(xiàn)給免疫分析技術(shù)帶來了新的發(fā)展契機(jī)?，F(xiàn)代生物芯片是指包括在固相載體表面固定排列高密度的DNA、抗原、抗體或細(xì)胞的為陣列，利用生物大分子之間具有的特異識別的能力，與檢測樣品或生物大分子進(jìn)行反應(yīng)或雜交，通過自動檢測設(shè)備可獲得大量有用的生物信息。
蛋白質(zhì)芯片是在一種固相載體基片上，將蛋白質(zhì)或多肽直接點樣于其上，使之與基片表面牢固結(jié)合，形成蛋白質(zhì)微陣列?？乖贵w大都是蛋白質(zhì)，并且它們之間的結(jié)合又是特異性的。因此，固定在基片表面的蛋白質(zhì)可與帶有特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子(抗體或抗原)進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，兩者結(jié)合后，通過對標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物的檢測來實現(xiàn)抗原抗體的互檢，用于檢測相應(yīng)的抗體或抗原。該技術(shù)的特點是高通量、微型化和自動化。可廣泛應(yīng)用于臨床診斷、藥物篩選以及蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域的研究。
蛋白質(zhì)芯片可分為化學(xué)型和生物化學(xué)型兩種類型?；瘜W(xué)型蛋白質(zhì)芯片是基于經(jīng)典的色譜介質(zhì)，其基本原理是在蛋白質(zhì)芯片表面鋪上特定的介質(zhì)，通過介質(zhì)的疏水力、靜電力以及共價鍵等結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì)。然后用特定的洗脫液洗去雜質(zhì)蛋白，而保留特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片是把生物活性分子(如抗原、抗體或受體、配體等)固定到芯片表面，用于結(jié)合樣品中的互補靶蛋白。由于生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片具有較高的特異性和生物活性分子的多樣性，因此其應(yīng)用范圍和前景都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片。蛋白質(zhì)芯片的制備必須保證蛋白質(zhì)的正確定位和其生物活性的保持。但是，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)芯片對實驗操作要求高，反應(yīng)體系嚴(yán)格，由于人為因素產(chǎn)生的誤差較大，結(jié)果不穩(wěn)定，并且其檢測儀器設(shè)備價格昂貴，檢測成本高，因此無法大批量生產(chǎn)和使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片，本發(fā)明是靈敏度和特異性都較高的生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片，制作方法簡便、適合于批量生產(chǎn)，并且可以對多種蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測分析。
本發(fā)明用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片的具體技術(shù)方案是1)在潔凈的玻璃基片上鍍一層金屬膜(如金屬鉻膜或鋁膜)后用高速旋轉(zhuǎn)的甩膠機(jī)在上面涂一層光敏膠；2)將具有的光刻掩模蓋在基片上，在紫外光刻機(jī)下光刻，顯影定影后得到金屬基底圖案；3)再將露出的金屬膜腐蝕掉，露出玻璃基底圖案，去膠后，修飾露出的玻璃基底圖案，使其具有活性功能基團(tuán)——氨基；4)去掉剩余的金屬膜并清洗晾干后，將抗原蛋白溶液覆蓋于基片表面，蛋白質(zhì)與氨基作用后通過化學(xué)鍵連接于載玻片上而被固定；所述的蛋白質(zhì)樣品成微陣列；5)利用熒光標(biāo)記物對蛋白質(zhì)樣品分子進(jìn)行標(biāo)記，最后利用芯片熒光顯微鏡對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測分析。
所述的蛋白質(zhì)樣品微陣列為方塊狀點陣或長條狀陣列。
所述的方塊狀微陣列每個方塊狀微陣列中點的數(shù)目為40×40-400×400個。所述的方塊狀微陣列中蛋白質(zhì)樣品點的直徑為50μm，點之間的間隙距離為50μm。
所述的長條狀微陣列中為10-100組，每組4個條。所述的長條狀微陣列中條的寬度依次為30μm、50μm、80μm和120μm，條之間的間隙距離為50μm。條的長度為0.2-2.0cm。
用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片的制作工藝采取如下步驟1)在潔凈的載玻片表面鍍一層厚約150-250nm的金屬鉻膜或鋁膜，然后在上面用高速旋轉(zhuǎn)的甩膠機(jī)涂一層500-700nm厚的紫外正型光刻膠；2)在60-80℃下烘干堅膜30-60min，使光膠與金屬膜緊密結(jié)合；3)通過微電子學(xué)中制作電路版的技術(shù)制作的具有微陣列圖案的光刻掩模；或者事先設(shè)計并打印出微陣列圖案，通過翻拍技術(shù)制得照相底片，以其作為光刻掩模；4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機(jī)下光刻；5)用0.5-1％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出金屬基底圖案；6)用硝酸鈰銨溶液腐蝕掉露出的鉻層或?qū)︿X膜用1.6mol/L的磷酸溶液腐蝕，得到玻璃圖案；用1-10％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠。
采取如下方法修飾玻璃表面1)將玻璃片用體積比1∶1∶5的25％NH3，30％H2O2和H2O溶液清洗；然后用體積比1∶1∶5為37％HCl，30％H2O2和H2O溶液處理5-10分鐘；對鍍鋁的玻璃片則改用30％的H2O2處理；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100-120℃的烘箱內(nèi)干燥0.5-1小時；2)將玻璃片用1-5％的3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷(APTES)的甲苯溶液修飾3-10分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100-120℃下干燥0.5-1小時，使玻璃片表面帶上氨基；3)用硝酸鈰銨腐蝕液腐蝕掉剩余的鉻層；或用磷酸溶液腐蝕鋁膜；并用雙蒸水進(jìn)行充分的清洗后晾干。
所述的硝酸鈰銨腐蝕液配方硝酸鈰銨100克，醋酸17.5mL，加雙蒸水稀釋至500mL；所述的磷酸溶液為1.6mol/L的磷酸溶液。
用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片的使用方法是經(jīng)過下述步驟1)將配好的抗原(雞IgG)加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質(zhì)與表面的氨基作用約10-30min，通過化學(xué)鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；2)將用熒光標(biāo)記的待測樣品(如FITC標(biāo)記的雞Anti-IgG)溶液加到固定有抗原(雞IgG)的玻璃片表面上，在常溫下保持5-10min，使抗原和抗體充分反應(yīng)；3)用pH值在7.2-7.4之間的磷酸鹽緩沖液和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；4)在熒光顯微鏡下對芯片進(jìn)行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。
本發(fā)明用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片，首次將半導(dǎo)體制作工藝及微電子技術(shù)引入免疫分析的研究中來，使蛋白質(zhì)芯片微陣列實現(xiàn)集成化。本發(fā)明是靈敏度和特異性都較高的生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片，制作方法簡便，并且檢測方法更加快捷靈敏，檢測效率更高。適合于批量生產(chǎn)，并且可以對多種蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測分析。


圖1是通過翻拍技術(shù)制得的光刻掩模照片。
圖2是免疫反應(yīng)后所拍的蛋白質(zhì)微圖案熒光顯微照片。
圖3是蛋白質(zhì)芯片的方塊狀微陣列圖形的光學(xué)顯微照片。
圖4是蛋白質(zhì)芯片的方塊狀微陣列圖形的掃描電鏡照片。
圖5是蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行免疫反應(yīng)后所拍的方塊狀蛋白質(zhì)微陣列熒光顯微照片。
圖6是蛋白質(zhì)芯片的長條狀微陣列圖形的光學(xué)顯微照片。
圖7是蛋白質(zhì)芯片的長條狀微陣列圖形的掃描電鏡照片。
圖8是蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行免疫反應(yīng)后所拍的長條狀蛋白質(zhì)微陣列熒光顯微照片。
具體實施例方式
實例1蛋白質(zhì)微陣列芯片(鍍鉻膜)的制作方法1)使用鍍膜機(jī)(鍍膜機(jī)，DM-450C型，北京儀器廠)，真空下加熱鉻絲在潔凈的載玻片表面蒸鍍一層厚約154nm的金屬鉻膜，然后在上面用高速旋轉(zhuǎn)的甩膠機(jī)涂一層600nm厚的正型光刻(膠勻膠凈化工作臺，型號SW-CJ-9B，蘇州凈化設(shè)備廠；紫外正型光刻膠，型號BP212，北京化學(xué)試劑研究所)；2)在80℃下烘干堅膜30min，使光膠與金屬膜緊密結(jié)合；3)設(shè)計并打印出微陣列圖案，如圖1所示；圖1是通過翻拍技術(shù)制得的光刻掩模照片，圖1中圓形及五角星的直徑分別為150-250不等。間距為150μm，微陣列中點的數(shù)目為48×60個，并通過翻拍技術(shù)制得照相底片，以其作為光刻掩模。
4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機(jī)下光刻(半自動光刻機(jī)，JKG-1型，上海光學(xué)機(jī)械廠)；5)用0.5％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出鉻的圖案；6)用硝酸鈰銨溶液腐蝕掉露出的鉻層，得到玻璃基底圖案，然后用5％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠；7)將玻璃片用25％NH3，30％H2O2，和H2O溶液(體積比1∶1∶5)清洗片刻；然后用37％HCl，30％H2O2和H2O溶液(體積比1∶1∶5)處理5-10分鐘；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100℃的烘箱內(nèi)干燥0.5小時；8)將玻璃片用1-5％的APTES(3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷)(3-aminopropyltriethoxysilane)的甲苯溶液修飾3-10分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100℃下干燥1小時，使玻璃片表面帶上氨基；9)用硝酸鈰銨溶液(配方硝酸鈰銨100克，醋酸17.5mL，.加雙蒸水稀釋至500mL)腐蝕掉剩余的鉻層，并用雙蒸水進(jìn)行充分的清洗后晾干。
10)將配好的抗原(雞IgG)加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質(zhì)與表面的氨基作用約10-30min，通過化學(xué)鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液(PBS，0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合)和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；11)將用熒光標(biāo)記的待測樣品FITC標(biāo)記的雞Anti-IgG溶液加到固定有雞IgG的玻璃片表面上，在常溫下保持5-10min，使抗原和抗體充分反應(yīng)；12)用pH值在7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；
13)在熒光顯微鏡下對芯片進(jìn)行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，如圖2所示，圖2是免疫反應(yīng)后所拍的蛋白質(zhì)微圖案熒光顯微照片。通過抗原與熒光標(biāo)記的抗體之間的免疫反應(yīng)，可以得到清晰的綠色熒光圖案，圖中圓形及五角星的直徑分別為150-250不等。間距為150μm，微陣列中點的數(shù)目為48×60個。這說明只有經(jīng)過化學(xué)修飾而具有功能基團(tuán)(氨基)的區(qū)域才可結(jié)合抗原，而未經(jīng)修飾的區(qū)域基本上不結(jié)合蛋白，進(jìn)而通過免疫反應(yīng)特異性地結(jié)合熒光蛋白，形成綠色微圖案?？梢钥闯鏊脠D案十分清晰，這說明本生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片具有較高的靈敏度和特異性。并且制作方法簡便，檢測方法更加快捷靈敏，檢測效率更高。
實例2方塊狀蛋白質(zhì)微陣列芯片(鍍鋁膜)的制作方法1)使用鍍膜機(jī)，真空下加熱鋁絲在潔凈的載玻片表面蒸鍍一層厚約200nm的金屬鋁膜，然后在上面用高速旋轉(zhuǎn)的甩膠機(jī)涂一層600nm厚的正型光刻膠(膠勻膠凈化工作臺，型號SW-CJ-9B，蘇州凈化設(shè)備廠；紫外正型光刻膠，型號BP212，北京化學(xué)試劑研究所)；2)在80℃下烘干堅膜30min，使光刻膠與金屬膜緊密結(jié)合；3)通過微電子學(xué)中制作電路的制版技術(shù)制作方塊微陣列光刻掩模；4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機(jī)下光刻(半自動光刻機(jī)，JKG-1型，上海光學(xué)機(jī)械廠)；5)用0.5％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出鉻的圖案；6)用磷酸溶液(1.6mol/L)腐蝕掉露出的鋁層，得到玻璃基底圖案，如圖3所示，圖3是蛋白質(zhì)芯片的方塊狀微陣列圖形的光學(xué)顯微照片。然后用5％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠，并在掃描電鏡下觀測圖案形貌，如圖4所示，圖4是蛋白質(zhì)芯片的方塊狀微陣列圖形的掃描電鏡照片。
7)將玻璃片用25％NH3，30％H2O2，和H2O溶液(體積比1∶1∶5)清洗片刻；然后用30％H2O2處理10分鐘；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100℃的烘箱內(nèi)干燥0.5小時；8)將玻璃片用5％的APTES(3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷)(3-aminopropyltriethoxysilane)的甲苯溶液修飾5分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100℃下干燥1小時，使玻璃片表面帶上氨基；9)用磷酸溶液(1.6mol/L)腐蝕掉剩余的鋁層，并用雙蒸水進(jìn)行充分的清洗后晾干。
10)將配好的抗原(雞IgG)加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質(zhì)與表面的氨基作用約10min，通過化學(xué)鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液(PBS，0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合)和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；
11)將用熒光標(biāo)記的待測樣品FITC標(biāo)記的雞Anti-IgG溶液加到固定有雞IgG的玻璃片表面上，在常溫下保持5min，使抗原和抗體充分反應(yīng)；12)用pH值在7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；13)在熒光顯微鏡下對芯片進(jìn)行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，如圖5所示，圖5是蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行免疫反應(yīng)后所拍的方塊狀蛋白質(zhì)微陣列熒光顯微照片。通過抗原與熒光標(biāo)記的抗體之間的免疫反應(yīng)，可以得到清晰的綠色熒光圖案，方塊狀微陣列每個方塊狀微陣列中點的數(shù)目為200×200個，蛋白質(zhì)樣品點的直徑為50μm，點之間的間隙距離為50μm。這說明只有經(jīng)過化學(xué)修飾而具有功能基團(tuán)(氨基)的區(qū)域才可結(jié)合抗原，而未經(jīng)修飾的區(qū)域基本上不結(jié)合蛋白，進(jìn)而通過免疫反應(yīng)特異性地結(jié)合熒光蛋白，形成方塊狀綠色微圖案。可以看出所得圖案十分清晰，這說明本生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片具有較高的靈敏度和特異性。并且制作方法簡便，檢測方法更加快捷靈敏，檢測效率更高。
實例3長條狀蛋白質(zhì)微陣列芯片(鍍鋁膜)的制作方法1)使用鍍膜機(jī)(鍍膜機(jī)，DM-450C型，北京儀器廠)，真空下加熱鋁絲在潔凈的載玻片表面蒸鍍一層厚約200nm的金屬鋁膜，然后在上面用高速旋轉(zhuǎn)的甩膠機(jī)涂一層600nm厚的正型光刻膠(膠勻膠凈化工作臺，型號SW-CJ-9B，蘇州凈化設(shè)備廠；紫外正型光刻膠，型號BP212，北京化學(xué)試劑研究所)；2)在80℃下烘干堅膜30min，使光刻膠與金屬膜緊密結(jié)合；3)通過微電子學(xué)中制作電路的制版技術(shù)制作方塊微陣列光刻掩模；4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機(jī)下光刻(半自動光刻機(jī)，JKG-1型，上海光學(xué)機(jī)械廠)；5)用0.5％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出鉻的圖案；6)用磷酸溶液(1.6mol/L)腐蝕掉露出的鋁層，得到玻璃基底圖案，如圖6所示，圖6是蛋白質(zhì)芯片的長條狀微陣列圖形的光學(xué)顯微照片。然后用5％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠，并在掃描電鏡下觀測圖案形貌，如圖7所示，圖7是蛋白質(zhì)芯片的長條狀微陣列圖形的掃描電鏡照片。。
7)將玻璃片用25％NH3，30％H2O2，和H2O溶液(體積比1∶1∶5)清洗片刻；然后用30％H2O2處理10分鐘；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100℃的烘箱內(nèi)干燥0.5小時；8)將玻璃片用5％的APTES(3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷)(3-aminopropyltriethoxysilane)的甲苯溶液修飾5分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100℃下干燥1小時，使玻璃片表面帶上氨基；9)用磷酸溶液(1.6mol/L)腐蝕掉剩余的鋁層，并用雙蒸水進(jìn)行充分的清洗后晾干。
10)將配好的雞IgG溶液加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質(zhì)與表面的氨基作用約10min，通過化學(xué)鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液(PBS，0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合)和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；11)將用熒光標(biāo)記的待測樣品FITC標(biāo)記的雞Anti-IgG溶液加到固定有抗原雞IgG的玻璃片表面上，在常溫下保持5min，使抗原和抗體充分反應(yīng)；12)用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；13)在熒光顯微鏡下對芯片進(jìn)行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，如圖8所示，圖8是蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行免疫反應(yīng)后所拍的長條狀蛋白質(zhì)微陣列熒光顯微照片。通過抗原與熒光標(biāo)記的抗體之間的免疫反應(yīng)，可以得到清晰的綠色熒光圖案，長條狀微陣列中共有60組，每組4個條，長條狀微陣列中條的寬度依次為30μm、50μm、80μm和120μm，條的長度為2cm，條之間的間隙距離為50μm。這說明只有經(jīng)過化學(xué)修飾而具有功能基團(tuán)(氨基)的區(qū)域才可結(jié)合抗原，而未經(jīng)修飾的區(qū)域基本上不結(jié)合蛋白，進(jìn)而通過免疫反應(yīng)特異性地結(jié)合熒光蛋白，形成長條狀綠色微圖案?？梢钥闯鏊脠D案十分清晰，這說明本生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片具有較高的靈敏度和特異性。并且制作方法簡便，檢測方法更加快捷靈敏，檢測效率更高。
權(quán)利要求
1.一種用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于1)在潔凈的玻璃基片上鍍一層金屬膜后用高速旋轉(zhuǎn)的甩膠機(jī)在上面涂一層光敏膠；2)將具有的光刻掩模蓋在基片上，在紫外光刻機(jī)下光刻，顯影定影后得到金屬基底圖案；3)再將露出的金屬膜腐蝕掉，露出玻璃基底圖案，去膠后，修飾露出的玻璃基底圖案，使其具有活性功能基團(tuán)——氨基；4)去掉剩余的金屬膜并清洗晾干后，將抗原蛋白溶液覆蓋于基片表面，蛋白質(zhì)與氨基作用后通過化學(xué)鍵連接于載玻片上而被固定；所述的蛋白質(zhì)樣品成微陣列；5)利用熒光標(biāo)記物對蛋白質(zhì)樣品分子進(jìn)行標(biāo)記，最后利用芯片熒光顯微鏡對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的蛋白質(zhì)樣品微陣列為方塊狀點陣或長條狀陣列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的方塊狀微陣列每個方塊狀微陣列中點的數(shù)目為40×40-400×400個。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的方塊狀微陣列中蛋白質(zhì)樣品點的直徑為50μm，點之間的間隙距離為50μm。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的長條狀微陣列中為10-100組，每組4個條。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的長條狀微陣列中條的寬度依次為30μm、50μm、80μm和120μm，條之間的間隙距離為50μm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片的制作工藝，其特征在于采取如下步驟1)在潔凈的載玻片表面鍍一層厚約150-250nm的金屬鉻膜或鋁膜，然后在上面用高速旋轉(zhuǎn)的甩膠機(jī)涂一層500-700nm厚的紫外正型光刻膠；2)在60-80℃下烘干堅膜30-60min，使光膠與金屬膜緊密結(jié)合；3)通過微電子學(xué)中制作電路版的技術(shù)制作的具有微陣列圖案的光刻掩模；或者事先設(shè)計并打印出微陣列圖案，通過翻拍技術(shù)制得照相底片，以其作為光刻掩模；4)將光刻掩模蓋在涂膠的玻片上面，在紫外光刻機(jī)下光刻；5)用0.5-1％的NaOH溶液顯影，去掉曝光圖案部分的光刻膠，露出金屬基底圖案；6)用硝酸鈰銨溶液腐蝕掉露出的鉻層或?qū)︿X膜用1.6mol/L的磷酸溶液腐蝕，得到玻璃圖案；用1-10％的NaOH溶液去掉剩余的光刻膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片的制作工藝，其特征在于采取如下方法修飾玻璃表面1)將玻璃片用體積比1∶1∶5的25％NH3，30％H2O2和H2O溶液清洗；然后用體積比1∶1∶5為37％HCl，30％H2O2和H2O溶液處理5-10分鐘；對鍍鋁的玻璃片則改用30％的H2O2處理；再將其分別用水，酒精和丙酮清洗，使其在空氣下干燥后再置于100-120℃的烘箱內(nèi)干燥0.5-1小時；2)將玻璃片用1-5％的3-胺基-丙基-三乙氧基硅烷(APTES)的甲苯溶液修飾3-10分鐘，再用甲苯及丙酮清洗之，然后在100-120℃下干燥0.5-1小時，使玻璃片表面帶上氨基；3)用硝酸鈰銨腐蝕液腐蝕掉剩余的鉻層；或用磷酸溶液腐蝕鋁膜；并用雙蒸水進(jìn)行充分的清洗后晾干。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片的制作工藝，其特征在于所述的硝酸鈰銨腐蝕液配方硝酸鈰銨100克，醋酸17.5mL，加雙蒸水稀釋至500mL；所述的磷酸溶液為1.6mol/L的磷酸溶液。
10.權(quán)利要求1所述的用于免疫學(xué)分析的蛋白質(zhì)芯片的使用方法，其特征在于它是經(jīng)過下述步驟1)將配好的抗原加到經(jīng)過修飾的玻璃基片表面，使蛋白質(zhì)與表面的氨基作用約10-30min，通過化學(xué)鍵連接于載玻片上而被固定；然后用pH值在7.2-7.4之間磷酸鹽緩沖液0.2mol/L的Na2HPO481.0mL，0.2mol/L的NaH2PO419.0mL混合和雙蒸水分別沖洗基片表面，洗掉多余的抗原后晾干；2)將用熒光標(biāo)記的待測樣品溶液加到固定有抗原的玻璃片表面上，在常溫下保持5-10min，使抗原和抗體充分反應(yīng)；3)用pH值在7.2-7.4之間的磷酸鹽緩沖液和雙蒸水依次沖洗玻璃片，洗去殘余的樣品，并在常溫下晾干；4)在熒光顯微鏡下對芯片進(jìn)行檢測分析，或利用CCD系統(tǒng)拍照后對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于免疫學(xué)分析的新型蛋白質(zhì)芯片。在潔凈的玻璃基片上鍍一層金屬膜后用甩膠機(jī)在上面涂一層光敏膠。將具有圖案的光刻掩模蓋在基片上，在紫外光刻機(jī)下光刻，顯影定影后得到微圖案。再將露出的金屬圖案腐蝕掉，露出玻璃圖案。去膠后，修飾露出的玻璃圖案，使其具有活性功能基團(tuán)——氨基。去掉剩余的金屬膜并清洗晾干后，將抗原蛋白溶液覆蓋于基片表面，蛋白質(zhì)與氨基作用后通過化學(xué)鍵連接于載玻片上而被固定。利用熒光標(biāo)記物對蛋白質(zhì)樣品分子進(jìn)行標(biāo)記，最后利用芯片熒光顯微分析系統(tǒng)對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測分析。本發(fā)明是靈敏度和特異性都較高的生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片，制作方法簡便、適合于批量生產(chǎn)，并且可以對多種蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測分析。
文檔編號G01N21/64GK1645147SQ200510013108
公開日2005年7月27日 申請日期2005年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月18日
發(fā)明者王立凱, 馮喜增, 秦明, 張福海, 賈云芳, 牛文成 申請人:南開大學(xué)