專利名稱：一種總丹酚酸的含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及總丹酚酸的含量測(cè)定方法，特別是涉及采用分光光度法測(cè)定總丹酚酸的含量。
背景技術(shù)：
總丹酚酸(total salvianolic acid，TSA)是唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhizaBunge)的水溶性有效成分，其多具有酚酸性結(jié)構(gòu)。最早發(fā)現(xiàn)的丹參素化學(xué)名為β-3，4-二羥苯乳酸(β-3，4-dihydroxybenyl lactic acid)是各種丹酚酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，此后發(fā)現(xiàn)了一系列酚酸類化合物，命名為丹酚酸(salvianolic acid)并按照英文字母排序，主要有丹酚酸A、B、C、D、E、G、H、I、J、四甲基丹酚酸F、異丹酚酸C，還有迷迭香酸、紫草酸等等。丹酚酸多數(shù)是由丹參素與其它有機(jī)酸類化合物縮合而成。如丹酚酸A是由一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮和而成，丹酚酸B是由三分子丹參素與一分子咖啡酸縮和而成，丹酚酸C則為兩分子丹參素縮合而成，迷迭香酸是由一分子丹參素與一分子咖啡酸縮和而成，其它丹酚酸亦有類似結(jié)構(gòu)。
有關(guān)總丹酚酸的含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道較少。有采用丹參素、丹參素鈉或丹酚酸B為對(duì)照品，以紫外分光光度法在286nm左右進(jìn)行測(cè)定，此法僅適用于純化程度較高的總丹酚酸，而對(duì)于丹參的水溶性提取物中的總丹酚酸測(cè)定，或者由總丹酚酸組成的復(fù)方制劑等中總丹酚酸測(cè)定，則存在較大的誤差。也有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法測(cè)定一種或數(shù)種丹酚酸類化合物(如丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B等等)來控制總酚酸的含量，但此法僅能反映所測(cè)丹酚酸類化合物的含量，而不能表示總丹酚酸的含量。王勝春等[第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，14(5)386]報(bào)道以鐵氰化鉀-三氯化鐵為顯色劑，在730nm處進(jìn)行比色測(cè)定，但此法需加入十二烷基硫酸鈉防止產(chǎn)生沉淀，但十二烷基硫酸鈉的加入量不易控制，顯色后生成物的顏色變化較快，不易進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，且操作步驟較多，十分繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的總丹酚酸含量的分光光度測(cè)定方法。
本發(fā)明方法的技術(shù)措施如下供試品溶液和對(duì)照品溶液中分別加入亞硝酸或亞硝酸鹽，在酸性條件下進(jìn)行氧化，氧化后將溶液調(diào)節(jié)至堿性，然后按分光光度法在497±2nm進(jìn)行測(cè)定。
上述供試品溶液是由待測(cè)含量的總丹酚酸提取物或由總丹酚酸組成的復(fù)方制劑制備而成的溶液；上述對(duì)照品溶液是由丹參素、丹參素鈉或丹酚酸B配制而成的溶液。
上述亞硝酸或亞硝酸鹽是在溶液中可離解為亞硝酸根離子(NO2-)的亞硝酸鹽，如亞硝酸鈉(NaNO2)、亞硝酸鉀(KNO2)、亞硝酸(HNO2)、亞硝酸鋰(LiNO2)或亞硝酸鈷鈉[NaCo(NO2)6]等。上述酸性條件可通過加入強(qiáng)酸弱堿鹽如硝酸鋁[Al(NO3)]、硝酸鎳[Ni(NO3)2]等，或者酸式鹽如磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)等，或者有機(jī)酸如甲酸、乙酸等，或者無機(jī)酸如高氯酸、濃酸、硝酸、鹽酸、磷酸等來實(shí)現(xiàn)。上述將溶液調(diào)節(jié)至堿性，可通過加入在水溶液中呈堿性的化合物來實(shí)現(xiàn)，如氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)或氨水(NH3·H2O)等。
總丹酚酸是由丹參提取所得的有效部位，其中含有丹參素、丹酚酸A和丹酚酸B等多種丹酚酸類，這些丹酚酸類化合物均具有藥理活性。藥理研究表明，總丹酚酸對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用；對(duì)腦組織細(xì)胞損傷有保護(hù)作用并且具有抗氧化作用。采用本發(fā)明方法對(duì)作為有效部位的總丹酚酸整體進(jìn)行了含量測(cè)定，先在酸性條件下用亞硝酸根離子(NO2-)進(jìn)行氧化，氧化后將溶液調(diào)節(jié)至堿性，在堿性條件下進(jìn)行分光光度測(cè)定，避開了雜質(zhì)干擾嚴(yán)重的波長(zhǎng)范圍，操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)。


圖1為經(jīng)本發(fā)明方法處理過的含總丹酚酸復(fù)方制劑的紫外可見波長(zhǎng)掃描圖。
圖2為經(jīng)本發(fā)明方法處理過的丹酚酸B的紫外可見波長(zhǎng)掃描圖。
圖3為未經(jīng)本發(fā)明方法處理的含總丹酚酸復(fù)方制劑的紫外可見波長(zhǎng)掃描圖。
圖4為未經(jīng)本發(fā)明方法處理的丹酚酸B的紫外可見波長(zhǎng)掃描圖。
圖5為經(jīng)本發(fā)明方法處理過的總丹酚酸提取物的紫外可見波長(zhǎng)掃描圖。
圖6為經(jīng)本發(fā)明方法處理過的丹參素鈉的紫外可見波長(zhǎng)掃描圖。
具體實(shí)施例方式
下面列舉實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，該實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而對(duì)本發(fā)明并沒有限制。
實(shí)施例一和對(duì)比例對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹酚酸B 0.1mg的溶液，精密量取此溶液5ml，用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至25ml，即得。
供試品溶液的制備 精密稱取一種由總丹酚酸所組成的復(fù)方制劑100mg(總酚酸的含量按投藥量計(jì)算應(yīng)為5.80％)，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，離心，取上清液5ml，用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至25ml，即得。
對(duì)比例測(cè)定與結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液分別照分光光度法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄V A)，于287nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果該復(fù)方制劑中總酚酸含量為6.92％。
實(shí)施例一測(cè)定與結(jié)果精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入10％Al(NO3)3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VA)，于497nm波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果該復(fù)方制劑中總酚酸含量為5.61％。
結(jié)論該種復(fù)方制劑中總酚酸的含量按投藥量計(jì)算應(yīng)為5.80％，用本發(fā)明方法(實(shí)施例一)測(cè)定為5.61％，與實(shí)際值接近；而對(duì)比例中的方法測(cè)定為6.92％，遠(yuǎn)高于實(shí)際值，說明雜質(zhì)干擾較多，導(dǎo)致測(cè)定不準(zhǔn)確。
從波長(zhǎng)掃描圖也可看出，本發(fā)明方法實(shí)施例一之圖1供試品和圖2對(duì)照品在497nm附近波譜峰清晰而無干擾；而對(duì)比例之圖3供試品和圖4對(duì)照品在497nm附近波譜峰不明顯，在287nm附近有干擾。
實(shí)施例二對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉對(duì)照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹參素鈉0.1mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸提取物50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測(cè)定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入10％Al(NO3)3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄V A)，于497nm波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果該總丹酚酸提取物中總丹酚酸百分含量(以丹參素鈉計(jì))為71.23％。圖5供試品和圖6對(duì)照品在497nm附近波譜峰清晰而無干擾。
實(shí)施例三對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹酚酸B 0.1mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸提取物50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測(cè)定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入10％Al(NO3)3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄V A)，于497nm波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果該總丹酚酸提取物中總丹酚酸百分含量(以丹酚酸B計(jì))為73.55％。
實(shí)施例四對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉對(duì)照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹參素鈉0.1mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸提取物50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測(cè)定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入0.7mol/l的HNO3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鉀溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄V A)，于498nm波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果該總丹酚酸提取物中總丹酚酸百分含量(以丹參素鈉計(jì))為71.82％。
實(shí)施例五對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹酚酸B 0.1mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸提取物50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測(cè)定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入冰乙酸2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入氨試液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄V A)，于497nm波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果該總丹酚酸提取物中總丹酚酸百分含量(以丹酚酸B計(jì))為72.95％。
實(shí)施例六對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉對(duì)照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹參素鈉0.1mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸膠囊內(nèi)容物100mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，離心，精密量取上清液5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測(cè)定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入甲酸0.5ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄V A)，于496nm波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果該總丹酚酸膠囊的總丹酚酸百分含量(以丹參素鈉計(jì))為8.42％。
實(shí)施例七對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹酚酸B 0.1mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取丹酚酸粉針50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測(cè)定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入10％Al(NO3)3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄V A)，于497nm波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果該總丹酚酸粉針的總丹酚酸百分含量(以丹酚酸B計(jì))為62.85％。
權(quán)利要求
1.一種總丹酚酸的含量測(cè)定方法，包括供試品溶液和對(duì)照品溶液測(cè)定前的處理，處理后用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，其特征在于，測(cè)定前在所述供試品溶液和對(duì)照品溶液中分別加入亞硝酸或亞硝酸鹽，在酸性條件下進(jìn)行氧化，氧化后將溶液調(diào)節(jié)至堿性，然后按分光光度法在497±2nm進(jìn)行測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述供試品溶液是由待測(cè)含量的總丹酚酸提取物或由總丹酚酸組成的復(fù)方制劑制備而成的溶液；所述對(duì)照品溶液是由丹參素、丹參素鈉或丹酚酸B配制而成的溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述亞硝酸鹽為亞硝酸鈉、亞硝酸鉀、亞硝酸鋰或亞硝酸鈷鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述酸性條件是通過加入強(qiáng)酸弱堿鹽、酸式鹽、有機(jī)酸或者無機(jī)酸而形成酸性條件。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述強(qiáng)酸弱堿鹽為硝酸鋁或硝酸鎳；所述酸式鹽為磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀；所述有機(jī)酸為甲酸或乙酸；所述無機(jī)酸為高氯酸、濃酸、硝酸、鹽酸或磷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述將溶液調(diào)節(jié)至堿性，是通過加入氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水而將溶液調(diào)節(jié)至堿性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種總丹酚酸的含量測(cè)定方法，它在測(cè)定前在供試品溶液和對(duì)照品溶液中分別加入亞硝酸或亞硝酸鹽，在酸性條件下進(jìn)行氧化，氧化后將溶液調(diào)節(jié)至堿性，然后按分光光度法在497±2nm進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明的總丹酚酸含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高。
文檔編號(hào)G01N21/25GK1923226SQ20051001496
公開日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者李偉, 張文生, 葉正良 申請(qǐng)人:天津天士力制藥股份有限公司