專利名稱：一種檢測生物大分子相互作用的方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物芯片領域，具體地說，本發(fā)明涉及微流控生物芯片檢測生物大分子相互作用的方法，同時還涉及一種微流控的生物芯片的裝置。
背景技術：
生物芯片主要是指通過微加工和微電子技術在固體芯片表面構建微型生物化學分析系統，以實現對生命機體的組織、細胞、蛋白質、核酸、糖類以及其他生物組分進行準確、快速、大信息量的檢測。目前常見的生物芯片分為三大類即基因芯片、蛋白芯片和芯片實驗室(或稱微流控芯片)。生物芯片主要特點是高通量、微型化和自動化。生物芯片上高度集成的成千上萬密集排列的分子微陣列，能夠在很短時間內分析大量的生物分子，使人們能夠快速準確地獲取樣品中的生物信息，檢測效率是傳統檢測手段的成百上千倍。微流控生物芯片即芯片實驗室是生物芯片技術發(fā)展一個重要方向，它以分析化學為基礎，以微機電加工技術為依托，以微管道網絡為結構特征，以生命科學為目前主要應用對象，是當前微型全分析系統發(fā)展的重點。它的目標是把整個化驗室的功能，包括采樣、稀釋、加試劑、反應、分離、檢測等集成在微芯片上，且可多次使用，因此較生物芯片有更廣泛的適用性及應用前景?，F在已有由加熱器、微泵、微閥、微流量控制器、微電極、電子化學和電子發(fā)光探測器等組成的芯片實驗室問世，并出現了將生化反應、樣品制備、檢測和分析等部分集成的生物芯片。例如可以將樣品制備和PCR擴增反應同時在一塊小小的芯片上完成。再如GeneLogic公司設計制造的生物芯片可以從待檢樣品中分離出DNA或RNA，并對其進行熒光標記，然后當樣品流過固定于柵欄狀微通道內的寡核苷酸探針時便可捕獲與之互補的靶核酸序列。生物芯片是在多種固定化載體上刻蝕具有多種性能的生物反應器。此類生物芯片的突出優(yōu)越性在于通過芯片通道中的微流控(microfluidic)操作，很容易在低于普通化學分析幾個數量級的體積(納升至微升)的水平上，實現微機控制的自動化定量操作，不僅分析速度大為提高，試樣與試劑消耗量也大為降低，而且由于這類微分析系統易于批量生產，因而生產成本顯著降低，這也為現代分析技術的大規(guī)模普及創(chuàng)造了條件。
細胞或組織的蛋白質不是雜亂無章的混合物，蛋白質間的相互作用和相互協調是細胞進行一切代謝活動的基礎。蛋白質間的相互作用及作用方式同樣也是蛋白質組研究所面臨的問題，從近期國際上蛋白質組學研究的發(fā)展動向可以看出，揭示蛋白質之間的相互作用關系，建立相互作用關系的網絡圖，已成為揭示蛋白質組復雜體系與蛋白質功能模式的先導，業(yè)已成為蛋白質組學領域的研究熱點。傳統的生物學手段是通過酵母雙雜交系統來分析一種細胞或特定組織的所有可能的蛋白質之間的相互作用，酵母雙雜交技術問世不到十年，已經在蛋白質間的相互作用研究、篩選新的蛋白質、研究蛋白質的功能等諸方面發(fā)揮重要作用。然而雙雜交技術也有其內在的不足之處，如假陰性現象是雙雜交分析過程中經常碰到的問題；此外一些對細胞致命的蛋白質也不適宜通過雙雜交系統來分析。雙雜交只是反映蛋白質間能發(fā)生作用的可能性，這種可能還必須經過其他實驗驗證，尤其要與生理功能研究相結合。生物芯片技術有望成為后基因組時代最重要的藥物研究和開發(fā)手段，但蛋白質芯片到2003年還只占有不到20％的生物芯片市場。微流控芯片旨在集樣品準備、檢測及分析于一張芯片完成，預計將在藥物開發(fā)(包括藥物靶標鑒定、藥物毒理學預測、高通量藥物篩選及臨床藥物安全性)中得到廣泛的應用。在尋找HIV藥物中，Jellis等用組合化學合成及DNA芯片技術篩選了654536種硫代磷酸八聚核苷酸，并從中確定了具有XXG4XX樣結構的抑制物，實驗表明，這種篩選物對HIV感染細胞有明顯阻斷作用。生物芯片技術使得藥物篩選，靶基因鑒別和新藥測試的速度大大提高，成本大大降低。芯片藥物篩選技術具有很大的潛在應用價值。美國已有多家生物芯片公司股票上市，而且其股價平均以每年75％的速率上漲。根據前線決策管理咨詢公司的最新報告，基因芯片市場包括用于臨床實驗和研究應用的芯片以及用于制造和分析芯片的相關設備在2000年達到了47億美元。
目前在中國專利網中，涉及生物芯片的專利共有178項，有115項是以各式各樣的新型生物芯片為內容的，在這當中與疾病治療相關的有33項，但這些生物芯片承擔的大多是檢測和診斷功能。我國專利CN95195417發(fā)明了一種對化學分析和合成進行微流體處理的裝置和方法，即一種用于分析和合成化學材料的微流控芯片系統。我國專利CN02132622發(fā)明了一種蛋白質分析用微流控芯片。美國專利US2003207467名稱為Protein chips for highthroughput screening of protein activity，涉及蛋白質芯片用于研究蛋白質功能。法國專利FR2827612名稱為New nucleic acid encoding G protein coupled receptor，useful for identifyingmodulators，potentially useful for treating e.g.Diabetes or Parkinson’s disease，涉及核酸編碼GPCR用于治療糖尿病和帕金森疾病。美國專利US20020094544將生物膜點陣結合在特殊基質表明，通過靶標復合物誘導激活與GPCR結合的標記G蛋白，來檢測靶標復合物與探針GPCR的結合。但是，與這些專利或論文的公開的生物芯片相比，本發(fā)明的微流控生物芯片能夠同時檢測幾種生物大分子相互作用，也可以利用其來檢測藥物對于某兩種生物大分子相互作用強弱的影響。本發(fā)明公開的微流控生物芯片具有樣品需求量少、使用方便高效等特點，并可能發(fā)展成為篩選藥物的有利工具。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測生物大分子相互作用的方法，該方法簡單易行且操作方便，能夠同時在線檢測幾種生物大分子相互作用，樣品需求量少、使用方便高效，并可成為篩選藥物的有利工具。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測生物大分子相互作用的裝置，該裝置結構簡單、成本低廉，應用此生物芯片可準確地檢測到特異性的生物大分子。
為了實現上述任務，本發(fā)明采用以下技術方案本發(fā)明設計的微流控生物芯片能夠在儲液池內加入待研究的生物大分子樣品(如蛋白質、核酸及多糖等)，通過改變儲液池間的電壓驅動樣品溶液定向移動并實現在微混合器中的混合并相互作用，然后通過T字型通道上樣分離，由分離通道末端熒光信號的檢測實現對蛋白質相互作用定性乃至定量的研究。利用本發(fā)明提供的微流控芯片及相關研究方法來研究生物大分子相互作用，能在很短的時間內得到相關蛋白相互作用的大量信息，相對傳統的蛋白質相互作用研究模式更加方便、高效，同時也可作為酵母雙雜交系統研究蛋白質相互作用的有利驗證。
本發(fā)明微流控生物芯片是一種在有機玻璃上蝕刻有儲液池、槽道及微型混合器的芯片，其特點在于芯片由儲液池、槽道及微型混合器分別形成樣品混合作用流路、樣品分離與檢測流路及夾流流路三部分。
在本發(fā)明中，樣品混合作用流路由4個獨立樣品儲液池和3個獨立微型層流混合器通過槽道連接而成，其中儲液池P1與縱向槽道T1連通接混合器M1，儲液池P2與橫向槽道T2連通接混合器M1，實現儲液池P1與儲液池P2中樣品的混合作用；儲液池P3與橫向槽道T3連通接混合器M2，在混合器M2中實現儲液池P1、P2和P3中樣品的混合作用；儲液池P4與橫向槽道T4連通接混合器M3，實現儲液池P1、P1、P3及P4中樣品的充分混合作用?；旌掀鱉3與縱向槽道T7接縱向槽道T8，縱向槽道T8再與橫向槽道T5連接。
本發(fā)明的夾流流路由儲液池P6、P8及連通槽道組成，儲液池P6與縱向槽道T6連通接橫向槽道T5，儲液池P8與縱向槽道T8連通接橫向槽道T5，槽道T6與T8等長實現樣品夾流。
本發(fā)明的樣品分離檢測流路由儲液池P5與儲液池P7及連接P5、P7的橫向槽道T5組成，實現樣品的橫向分離與檢測。
儲液池P1、P2中流出的樣品由縱向槽道連接混合后進入微型層流混合器M1，混合后的溶液再與儲液池P3中流出的樣品混合后進入微型層流混合器M2，混合后的溶液再次與儲池液P4中流出的樣品混合后進入微型層流混合器M3；樣品分離與檢測流路由儲液池P5和P7橫向連接而成，待檢測樣品與檢測試劑在夾流流路中的電流作用下經過樣品混合反應流路、樣品分離并收集檢測流路中信號；夾流流路由儲液池P6與P8縱向連接而成。
在本發(fā)明中，樣品分離與檢測流路由兩個獨立的儲液池通過橫向的槽道相連，其中儲液池P5與P7在樣品混合反應流路下游，通過槽道末端的光電倍增管檢測待測樣品熒光信號的變化。
在本發(fā)明中，夾流流路由兩個獨立的儲液池通過縱向的槽道相連，并且槽道長度相等且對稱，其中儲液池P6與P8位于橫向槽道兩側，通過電極對微流控生物芯片兩端增加相等大小的電壓以實現夾流。
本發(fā)明公開的微流控芯片由蝕刻有儲液池、槽道及微型混合器的一塊聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，即有機玻璃)片與另一塊無蝕刻的完整聚甲基丙烯酸甲酯片鍵和而成，在兩塊片子之間形成封閉的連通電泳槽道。由儲液池加入的樣品在電壓的驅動下定向移動、混合并在層流微混合器中實現混合及相互作用，之后由T字型槽道上樣，改加分離電壓后，納升級樣品帶由電滲流驅動橫向移動，再由于樣品帶中個成分所帶電荷及分子量的差異而實現分離。
本發(fā)明微流控生物芯片檢測生物大分子相互作用的方法，該方法包括下列步驟1)儲液池P7中加入緩沖液并使之在毛細作用下充滿整個芯片縱向槽道(T1、T6、T7、T8)和橫向槽道(T2、T3、T4、T5)；2)用微量加樣器將待檢測生物大分子樣品加入儲液池P1、P2、P3及P4中；3)調節(jié)上樣電壓150～550V/cm，樣品以電滲流驅動的方式在電壓作用下定向移動并進樣；4)改變電壓為分離電壓(300V/cm)，在芯片分離通道末端聯結熒光檢測器，檢測樣品信號，可準確檢測到特異性的生物大分子。
在本發(fā)明中，待檢測樣品可以是蛋白質、核酸、多糖乃至藥物分子。
在本發(fā)明中，由高壓電源分出8路高壓鉑電極，8路高壓電極分別插入8個儲液池中，通過調節(jié)高壓電場實現芯片表面流體的定向移動與混合。
在本發(fā)明中，樣品相互作用之后，在分離通道末端分離，可以通過紫外、熒光或偶聯質譜的方法檢測并得到結果。
本發(fā)明以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，即有機玻璃)片作為基底制作微芯片。HF/HNO3為刻蝕混合劑實現所設計的流路。電滲流泵首先被用于樣品的輸送以及反應混合，反應后的溶液進入芯片上的電泳分離信道。通過分離通道末端連接熒光檢測器檢測熒光標記蛋白的信號變化。
聚甲基丙烯酸甲酯為聚酯類高分子材料，實驗表明，經0.1M NaOH浸泡過夜的聚甲基丙烯酸甲酯表面在兩端加有高壓的堿性緩沖液條件下電離出大量羥基，使得芯片那表面與緩沖液中形成雙電層，從而產生一定的電滲流推動樣品在芯片槽道中的流動。先在緩沖液儲液池中加入電泳緩沖液(如pH 8.1的硼砂緩沖液)并使其充滿槽道，然后依次在對應儲液池中加入蛋白樣品，分別調節(jié)8個儲液池中電極電壓，使得液流由樣品儲液池向樣品廢液池移動，在溶液流動的過程中經過微型混合器實現多個樣品的充分混合作用。最后切換個電極電壓為分離電壓，使得充分混合并進樣的樣品在分離通道實現有效分離。在分離通道末端，可連接紫外或熒光信號檢測器，通過檢測樣品紫外或標記熒光的信號變化定性判斷生物大分子相互作用強弱及藥物對某幾種生物大分子相互作用的影響。
本發(fā)明的目的在于實現一種利用微流控芯片研究生物大分子相互作用的有效方法，因此本發(fā)明設計了多儲液池分布混合的流路設計。根據實際研究的需要，可以選擇其中兩個樣品儲液池加入待測樣品，研究兩種生物大分子的相互作用，也可以研究幾種生物大分子分布混合且相互作用后的存在形式。為了防止大分子物質在流動過程中的阻塞，本發(fā)明在液流匯合處均設計90度的彎角結構以利于液流順利實現定向移動，此外鋸齒形微槽道混合器能有效實現層流式的樣品混合以利于樣品之間充分作用。當樣品處于混合反應流路時，樣品儲液池均加有高壓，樣品廢液池則接地，樣品在電滲流的驅動下由儲液池向廢液池方向移動，在槽道中實現相互混合并作用。當樣品流過T字型通道時，橫向截留的100μm左右液柱即為進樣樣品。此時切換緩沖液池P5接高壓，緩沖液池P7接地，樣品實現橫向的電泳分離。同時在緩沖液池P6與P8加一定強度的高壓實現夾流。在分離槽道末端偶聯熒光信號檢測器，檢測已標記的待測蛋白樣品信號及相互作用后的樣品信號，以此定性的判斷生物大分子相互作用的強弱。
與以前的專利及論文公開的生物芯片相比，本發(fā)明能夠同時檢測幾種生物大分子相互作用，也可利用其來檢測藥物對于某兩種生物大分子相互作用強弱的影響，具有樣品需求量小、使用方便快捷等優(yōu)點，可能發(fā)展成為藥物篩選的有利工具。本發(fā)明公開了一種微流控芯片，該芯片成本低廉、操作方便，利用本發(fā)明提供的微流控芯片及其檢測生物大分子相互作用的方法，能在很短的時間內得到相關蛋白相互作用的大量信息，相對傳統的蛋白質相互作用研究模式更加方便、高效，同時也可作為酵母雙雜交系統研究蛋白質相互作用的有利驗證。本發(fā)明旨在提供一種實現樣品在線混合、反應并檢測幾種不同生物樣品之間相互作用強弱的有效方法，該方法的實現對于蛋白質組學研究蛋白質相互作用有極大意義。此外，利用本發(fā)明也可定性的研究藥物對于某兩種生物大分子相互作用強弱的影響，并以此作為藥物篩選的重要指標。


圖1為微流控生物芯片結構示意圖；圖2、圖3均為圖1的配合示意圖；圖4為利用微流控芯片單獨進樣熒光標記G蛋白時，在分離槽道末端檢測的熒光信號譜峰圖。其中兩個峰分別為熒光標記G蛋白和過量熒光標記物的峰；圖5為利用微流控芯片同時進樣熒光標記G蛋白和D2型多巴胺偶聯受體，充分混合作用后，橫向分離并在槽道末端檢測的熒光信號譜峰圖。三個峰分別為熒光標記G蛋白、過量熒光標記物及兩種蛋白相互作用形成的復合物的峰；圖1所示為微流控生物芯片實際構造圖，其特征為蝕刻有8個儲液池并由相互連通的槽道組成，各儲液池加樣方式依實施例中說明。
整個芯片的流路設計，包括電滲流進樣及電泳分離的流路示意圖如圖2及圖3所示。在圖2的進樣方式中，到待檢測樣品所在的儲液池(P1、P2、P3和P4)均接高壓，而樣品的廢液池(P6)接地，樣品以電滲流移動的方式按圖2中箭頭的方向移動，實現樣品的充分混合和相互作用并進樣。切換分離電壓至如圖3所示，緩沖液所在的儲液池(P7)接高壓，廢液池(P5)為接地。這時其它的儲液池均切斷了電源，在進樣區(qū)帶中的反應試劑和產物沿著分離信道電泳分離后經過檢測窗口，最后進入廢液池(P5)。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，2002，分子克隆實驗指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。
實施例11.1芯片構造及加樣方式本發(fā)明所公開的新型微流控生物芯片其特點在于芯片由儲液池、槽道及微型混合器分別形成樣品混合反應流路、樣品分離與檢測流路及夾流流路三部分在本發(fā)明中，樣品混合作用流路由4個獨立樣品儲液池P1、P2、P3和P4和3個獨立微型層流混合器M1、M2和M3通過槽道連接而成，其中儲液池P1由縱向槽道T1連通接入混合器M1，儲液池P2由橫向槽道T2連通接入混合器M1，實現儲液池P1與P2中樣品的混合作用；儲液池P3由橫向槽道T3連通接入混合器M2，在M2中實現P1、P2和P3中樣品的混合作用；儲液池P4由橫向槽道T4連通接入混合器M3，實現P1、P1、P3及P4中樣品的充分混合作用?；旌掀鱉3由縱向槽道T7接入縱向槽道T8，縱向槽道T8再與橫向槽道T5連通實現樣品的進樣。
本發(fā)明的夾流流路由儲液池P6、P8及連通槽道組成，儲液池P6與縱向槽道T6連通接橫向槽道T5，儲液池P8與縱向槽道T8連通接入橫向槽道T5，縱向槽道T6與T8等長實現樣品夾流。
本發(fā)明的樣品分離檢測流路由儲液池P5與儲液池P7及連接儲液池P5、P7的橫向槽道T5組成，實現樣品的橫向分離與檢測。
在本發(fā)明中，儲液池P1、P2中流出的樣品由縱向槽道連接混合后進入微型層流混合器M1，混合后的溶液再與儲液池P3中流出的樣品混合后進入微型層流混合器M2，混合后的溶液再次與儲池液P4中流出的樣品混合后進入微型層流混合器M3；樣品分離與檢測流路由儲液池P5和P7橫向連接而成，待檢測樣品與檢測試劑在夾流流路中的電流作用下經過樣品混合反應流路、樣品分離并收集檢測流路中信號；夾流流路由儲液池P6與P8縱向連接而成。
該芯片由蝕刻在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片表面的8個獨立加樣儲液池(如圖1所示P1～P8)及相互連通的槽道組成，儲液池通過高壓電極外加不同電壓以形成電壓差實現槽道內部樣品的移動、分離及檢測。其中儲液池加P7、P8加入50～150μl樣品緩沖液(不需很準確，只要求充滿槽道)；儲液池P1、P2、P3、P4加入10μl生物大分子樣品溶液；儲液池P6為上樣樣品廢液池；儲液池P5為樣品廢液池。
1.2試劑的配制1)芯片體系緩沖液——PBS緩沖液8.0g氯化鈉(NaCl)、0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，加雙蒸水溶解并定容至1000ml，用0.45μm膜過濾以除去雜質，防止堵塞槽道。
2)蛋白質樣品及藥物溶液的配制蛋白質樣品均溶于1)所述之PBS緩沖液，其濃度不大于μM級即可。
實施例2利用該芯片分離檢測D2型多巴胺偶聯受體與G蛋白相互作用1)用微量加樣器在圖1所示的儲液池P7中用微量加樣器加入25μl的20mM PBS緩沖液(pH 8.0)，抽氣使緩沖液充滿整個芯片槽道；2)用微量加樣器在圖1所示的儲液池P1中加入10μl濃度為0.1mg/ml的熒光標記的G蛋白；3)如下表所示在各儲液池插入電極并加上上樣電壓，實現樣品進樣

4)此時如下表所示在各儲液池插入電極并加上分離電壓

5)在分離槽道末端連接熒光檢測及光電轉換裝置，檢測樣品信號；6)用0.1M NaOH溶液充分沖洗芯片槽道，然后用氮氣吹干，之后用微量加樣器在圖1所示的儲液池P7中用微量加樣器加入25μl的20mM PBS緩沖液(pH 8.0)，抽氣使緩沖液充滿整個芯片槽道；7)用微量加樣器在圖1所示的儲液池P1中加入10μl濃度為0.1mg/ml的熒光標記G蛋白；8)用微量加樣器在圖1所示的儲液池P2中加入10μl濃度為0.25mg/ml的D2型多巴胺偶聯受體及濃度為1mM的鹽酸多巴胺混合物，充分混合并使其充滿儲液池；9)如下表所示在各儲液池插入電極并加上上樣電壓，實現樣品進樣，當樣品流經各個微型混合器時，各樣品經過結構式混合器充分混合并相互作用，然后流入下游槽道；

10)當樣品之間充分混合互作并進樣完畢之后，部分樣品流入樣品廢液池(如圖1所示號儲液池P6)，而在芯片十字交叉處滯留待分離的樣品帶；11)此時如下表所示在各儲液池插入電極并加上分離電壓

12)在分離槽道末端連接熒光檢測及光電轉換裝置，檢測樣品信號；利用該微流控生物芯片單獨檢測熒光標記G蛋白時，其譜圖為G蛋白熒光峰信號與過量FITC熒光標記物的峰信號(如圖4)；當D2型多巴胺偶聯受體與G蛋白相互作用后進樣分離，可見除上述兩個峰之外的相互作用復合物峰的形成(如圖5)，由此判斷D2多巴胺偶聯受體與G蛋白有較強的相互作用。
權利要求
1.一種檢測生物大分子相互作用的方法，它包括下列步驟A、儲液池(P7)中加入緩沖液并使之在毛細作用下充滿整個芯片縱向槽道(T1、T6、T7、T8)和橫向槽道(T2、T3、T4、T5)；B、用微量加樣器將待檢測生物大分子樣品加入儲液池(P1、P2、P3、P4)中；C、調節(jié)上樣電壓150～550v/cm，樣品以電滲流驅動的方式在電壓作用下定向移動并進樣；D、改變電壓為分離電壓300V/cm，在芯片分離通道末端聯結熒光檢測器，檢測樣品信號。
2.一種實現權利要求1所述的檢測生物大分子相互作用的裝置，包括儲液池(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8)；混合器(M1、M2、M3)；儲液池(P1)與縱向槽道(T1)連接通混合器(M1)，儲液池(P2)與橫向槽道(T2)連通接混合器(M1)，儲液池(P3)與橫向槽道(T3)連通接混合器(M2)，儲液池(P4)與橫向槽道(T4)連通接混合器(M3)，混合器(M3)與縱向槽道(T7)接縱向槽道(T8)，縱向槽道(T8)與橫向槽道(T5)連接；儲液池(P6)與縱向槽道(T6)連通接橫向槽道(T5)，儲液池(P8)與縱向槽道(T8)連通接橫向槽道(T5)；儲液池(P5)與儲液池(P7)連通接儲液池(P5、P7)的橫向槽道(T5)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測生物大分子相互作用的方法及裝置，其步驟是首先將儲液池P7中加入緩沖液并使之在毛細作用下充滿整個芯片槽道；其次是用微量加樣器將待檢測生物大分子樣品加入儲液池中；第三是調節(jié)上樣電壓150～550v/cm，樣品以電滲流驅動的方式定向移動并進樣；第四是改變電壓為分離電壓，在芯片分離通道末端聯結熒光檢測器，檢測樣品信號。實現該方法的裝置由儲液池、連通槽道和混合器組合而成。本發(fā)明方法簡單易行，操作方便，結構簡單、成本低廉，可準確檢測到特異性的生物大分子相互作用。
文檔編號G01N21/76GK1696667SQ20051001882
公開日2005年11月16日 申請日期2005年5月31日 優(yōu)先權日2005年5月31日
發(fā)明者梁毅, 周拯, 項瑾, 廖俊明, 周兵瑞, 杜芬, 陳杰 申請人:武漢大學