專利名稱：基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、材料、化學(xué)、病毒學(xué)等學(xué)科的交叉學(xué)科領(lǐng)域。更具體涉及一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備方法。
背景技術(shù)：
環(huán)境毒素、重要致病微生物和病毒是危害人類生命安全和身體健康的大敵，生物恐怖主義陰影增加，新的病毒不斷地出現(xiàn)，本已得到控制的疾病也可能會重新爆發(fā)，給人類的生存，社會穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來嚴(yán)重威脅和挑戰(zhàn)。在疾病早期診斷、環(huán)境監(jiān)測與保護(hù)、病毒及細(xì)菌監(jiān)測等方面，人們迫切需要具有實(shí)時(shí)、快速、靈敏及特異性的檢測手段。人們逐步認(rèn)識到，公共場合更易受到生化恐怖襲擊，對檢測技術(shù)的靈敏度和選擇性提出了越來越高的要求，這些技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷和生物醫(yī)學(xué)研究中也會得到廣泛的應(yīng)用?；谒苄詿晒夤曹椌酆衔锏幕瘜W(xué)/生物傳感器技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種快速、高靈敏的化學(xué)/生物傳感技術(shù)。此類傳感器已成為化學(xué)與生物學(xué)交叉學(xué)科研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。水溶性熒光共軛聚合物在生物傳感器中的應(yīng)用將實(shí)現(xiàn)對生物樣品(大分子或小分子)的實(shí)時(shí)、快速、均相、靈敏及選擇性檢測。
識別生物分子(大分子或小分子)的方法，例如酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)和免疫競爭法(小分子檢測)，選擇性好，但操作步驟多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高。其它具有選擇性的配體-受體檢測方法如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法，通常需要將生物分子固定基質(zhì)或薄膜上(如DNA芯片和蛋白質(zhì)芯片)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備方法。采用水溶性熒光共軛聚合物為敏感材料的傳感器性質(zhì)穩(wěn)定，對生物樣品檢測靈敏度高，選擇性好，通用性強(qiáng)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施其步驟如下(1)以4-甲氧基苯酚、3-氯丙醇，四氫噻吩，金屬鈉，無水乙醇，乙醚，吡啶，甲基磺酰氯，濃鹽酸，無水硫酸鈉，氯仿，丙酮，碘化鈉，氯化鈉，濃硫酸，無水硫酸鎂(MgSO4)，亞硫酸鈉(Na2SO3)，氫氧化鈉(NaOH)，N，N二甲基甲酰胺(DMF)，亞硫酰氯，甲醛，二氧雜環(huán)己烷，苯，無水甲醇為原料，通過回流、用陽離子交換樹脂提純、真空干燥、減壓蒸餾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或冷凍干燥結(jié)晶、重結(jié)晶等技術(shù)[黃濤主編，張治民副主編，有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)(第二版)，北京，高等教育出版社，1998年]制備水溶性好的聚合物聚(5-甲氧基-2-(3-磺?；?丙氧基-1，4-對苯撐乙烯)(MPS-PPV)或聚(5-甲氧基-2-(4-磺?；嚩⊙趸?-1，4-對苯撐乙烯)(MBL-PPV)，將其溶解于水或醇(甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、或四氫呋喃)中，得濃度為10-10mol/L～10-5mol/L反應(yīng)液A(MPS-PPV或MBL-PPV)；共軛聚合物為水溶性或醇溶性；共軛聚合物為水溶性或醇溶性的陰離子或陽離子聚對苯撐乙烯衍生物或聚對苯撐乙炔烯衍生物。
(2)將生物大分子或生物素化的金屬配合物作為探針溶于溶劑中，得濃度為10-10mol/L～10-5mol/L反應(yīng)液B(病毒抗體溶液或Re-Biotin溶液或Ru-Biotin溶液或Ir-Biotin溶液)；所述的生物大分子為抗體或抗原。
所述的生物素化的金屬配合物為生物素化錸(I)配合物、生物素化釕(II)配合物、生物素化銥(III)配合物，或生物素化的其它金屬配合物；或是金屬配合物與抗原/抗體、DNA/RNA、配體/受體的偶聯(lián)物；所述的溶劑為水、或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、或四氫呋喃(任意一種)；(3)取反應(yīng)液A、反應(yīng)液B及水或0.01mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH為7.4)或0.1mol·L-1碳酸銨緩沖溶液(pH為8.9)，按物質(zhì)的量比10∶10∶1～1∶1∶10混合，得混合溶液C；(4)取混合溶液C 500～1000μL于微量熒光比色皿中，以一定的激發(fā)波.長280～450nm激發(fā)，測量其在適當(dāng)發(fā)射波長350～600nm處的熒光強(qiáng)度。
(5)加入被測樣品如病毒抗原或親和素/鏈親和素于前述混合溶液C中，以相同的激發(fā)波長激發(fā)，測量其在同一發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度。
本傳感器用于出血熱病毒抗體/抗原或親和素或鏈親和素的檢測，可在1-15分鐘完成。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果與酶聯(lián)免疫吸附分析及芯片技術(shù)相比，本法靈敏度高、簡便快速、選擇性好、通用性強(qiáng)。將它應(yīng)用于抗原-抗體反應(yīng)或DNA∶DNA(或DNA∶RNA)反應(yīng)檢測，將使現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)發(fā)生根本性變革。如果一種生物分子如抗體或抗原，既可以作為增強(qiáng)劑或猝滅劑，又可以通過與對應(yīng)的抗原或抗體的特異性相互作用改變體系的熒光特性，便可以建立一種通用的免疫傳感技術(shù)。
基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備將實(shí)現(xiàn)生物樣品(大分子)如SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血熱病毒抗體/抗原和其它小分子的實(shí)時(shí)、快速、均相、靈敏及選擇性檢測。
響應(yīng)快(1～200秒鐘)，親水性好，靈敏度高，選擇性好，通用性強(qiáng)。


圖1為溶液pH變化對MPS-PPV(1.0×10-5mol·L-1)-抗體L133(4.0×10-8mol·L-1)體系熒光強(qiáng)度的影響pH4.0～9.0Britton-Robinson緩沖溶液(正磷酸、乙酸、硼酸三酸混合溶液與NaOH溶液組成)圖2為傳感器對出血熱病毒抗體-L133/抗原-EHF的響應(yīng)特性及可逆性圖2A熒光光譜曲線(a)1.0×10-5mol·L-1MPS-PPV，(b)a+1.6×10-7mol·L-1抗體-L133，(c)b+2.9×10-10mol·L-1抗原-EHF圖2B熒光光譜曲線(a)1.0×10-5mol·L-1MPS-PPV，(b)a+2.9×10-9mol·L-1抗原-EHF，(c)b+1.6×10-7mol·L-1抗體-L133圖3為敏感材料MPS-PPV的激發(fā)及發(fā)射光譜激發(fā)波長390nm，發(fā)射波長497nm圖4為抗體-L133濃度變化對MPS-PPV水溶液熒光強(qiáng)度的影響1.0×10-5mol·L-1MPS-PPV水溶液中注入不同濃度的抗體-L133圖5為出血熱病毒免疫傳感器示意圖(MPS-PPV與抗體-L133及抗原-EHF之間作用)聚合物MPS-PPV受到抗體-L133微擾使熒光增強(qiáng)，加入抗原-EHF后，由于抗體-抗原間的特異性相互作用，使熒光減弱圖6為聚合物MPS-PPV、MPS-PPV與抗體-L133或抗原-EHF及三者之間的原子力顯微圖(a)MPS-PPV，(b)MPS-PPV+L133，(c)MPS-PPV+EHF，(d)MPS-PPV+L133+EHF圖象大小(a，b，c)3.0×3.0μm2，(d)1.5×1.5μm2圖7為透射電子顯微圖(a)MPS-PPV，(b)MPS-PPV+L133+EHF圖8為鏈親和素(SA)傳感器示意圖(被Re-Biotin猝滅的MPS-PPV熒光加入鏈親和素后熒光恢復(fù))具體實(shí)施方式
實(shí)施例1一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備方法，其步驟為(1)將制備的MPS-PPV或MBL-PPV溶解于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇中，得濃度為10-10mol/L～10-5mol/L反應(yīng)液A；(2)將生物素化的金屬配合物如生物素化錸(I)配合物——六氟磷酸化-N-4-吡啶-甲基氨基化生物素-三羰基-2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-鄰二氮雜菲合錸(I)(Re-Biotin)作為探針溶于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、或四氫呋喃中，得濃度為10-10mol/L～10-5mol/L反應(yīng)液B；(3)取反應(yīng)液A 10～100μL，反應(yīng)液B 10～100μL及水或0.01mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)或0.1mol·L-1碳酸銨緩沖溶液(pH＝8.9)800～1000μL混和，得混合溶液C；(4)取混合溶液C 500～1000μL于微量熒光比色皿中，以一定的激發(fā)波長280～450nm激發(fā)，測量其在適當(dāng)發(fā)射波長350～600nm處的熒光強(qiáng)度。
(5)加入被測樣品親和素或鏈親和素于前述混合溶液C中，以相同的激發(fā)波長激發(fā)，測量其在同一發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度(見圖8)。
實(shí)施例2一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備方法，其步驟為(1)將制備的MPS-PPV或MBL-PPV溶解于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇中，得濃度為10-10mol/L～10-5mol/L反應(yīng)液A(見圖3)；(2)將生物大分子如出血熱病毒抗體作為探針溶于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇或四氫呋喃中，得濃度為10-10mol/L～10-5mol/L反應(yīng)液B；(3)取反應(yīng)液A 10～100μL，反應(yīng)液B 10～100μL及水或0.01mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)或0.1mol·L-1碳酸銨緩沖溶液(pH＝8.9)800～1000μL混和，得混合溶液C；(4)取混合溶液C500～1000μL于微量熒光比色皿中，以一定的激發(fā)波長280～450nm激發(fā)，測量其在適當(dāng)發(fā)射波長350～600nm處的熒光強(qiáng)度(見圖2、圖4)。
(5)加入被測樣品如出血熱病毒抗原于前述混合溶液C中，以相同的激發(fā)波長激發(fā)，測量其在同一發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度(見圖2)。
權(quán)利要求
1.一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備方法，包括下列步驟A、以無水甲醇為原料，通過回流，用陽離子交換樹脂提純、真空干燥、減壓蒸餾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或冷凍干燥結(jié)晶、重結(jié)晶制備水溶性好的聚合物，將其溶解于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、或四氫呋喃中，得濃度為10-10mol/L～10-5mol/L反應(yīng)液A；B、將生物大分子或生物素化的金屬配合物作為探針溶于溶劑水或醇或四氫呋喃中，得濃度為10-10mol/L～10-5mol/L反應(yīng)液B；C、取反應(yīng)液A、反應(yīng)液B及水或0.01mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液pH為7.4或0.1mol·L-1碳酸銨緩沖溶液pH為8.9，按物質(zhì)的量比10∶10∶1～1∶1∶10混合，得混合溶液C；D、取混合溶液C 500～1000μL于微量熒光比色皿中，波長280～450nm激發(fā)，測量其發(fā)射波長350～600nm處的熒光強(qiáng)度；E、加入被測樣品或親和素/鏈親和素于前述混合溶液C中，以相同的激發(fā)波長激發(fā)，測量其在同一發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備方法，其特征在于共軛聚合物為水溶性或醇溶性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備方法，其特征在于共軛聚合物為水溶性或醇溶性的陰離子或陽離子聚對苯撐乙烯衍生物或聚對苯撐乙炔衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備方法，其特征在于溶劑為水、或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器的制備方法，其特征在于所述的生物素化的金屬配合物為生物素化錸(I)配合物、生物素化釕(II)配合物、生物素化銥(III)配合物，或是金屬配合物與抗原/抗體、DNA/RNA、配體/受體的偶聯(lián)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于水溶性共軛聚合物的熒光傳感器制備方法，其步驟是首先制備水溶性陰離子熒光共軛聚合物聚(5－甲氧基－2－(3－磺?；?丙氧基－1，4－對苯撐乙烯)，將其溶解于水中，得反應(yīng)液A；其次是將生物大分子或生物素化金屬配合物作為探針溶于水或醇或四氫呋喃中，得反應(yīng)液B；第三是取反應(yīng)液A、反應(yīng)液B及水或緩沖溶液混合，得混合溶液C；第四是取混合溶液C于熒光比色皿中，測量其熒光強(qiáng)度；第五是加入被測樣品如抗原/抗體或親和素/鏈親和素于混合溶液C中，測量其熒光強(qiáng)度。本方法簡便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、可實(shí)現(xiàn)高通量檢測。
文檔編號G01N21/64GK1712940SQ20051001920
公開日2005年12月28日 申請日期2005年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日
發(fā)明者何治柯, 陳彥國 申請人:武漢大學(xué)