專利名稱：抗SARS病毒人源性抗體lgG Fab片段的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬基因工程領域，具體涉及抗SARS病毒人源性抗體IgGFab片段。
背景技術：
2003年非典型性肺炎即嚴重呼吸道綜合癥(Severe AcuteRespiratory Syndrome，SARS)在世界范圍內爆發(fā)流行。該疾病主要通過飛沫傳播，具有潛伏期長、傳染性高、傳播快、癥狀重、死亡率高、無特效藥物、無疫苗預防等特點。據報道，該病由新種的冠狀病毒——SARS病毒所引起，已證實人冠狀病毒基因編碼的糖蛋白之一E2亦稱S蛋白(spike protein)，可與上皮細胞表面受體相互作用，是介導病毒吸附與細胞膜融合的關鍵。在對人冠狀病毒E229毒株的研究中證明，抗S蛋白417至547位氨基酸部位的抗體可以阻斷該毒株與靶細胞的結合，豚鼠抗該毒株的抗血清可以中和該病毒的傳染性。國內亦有感染SARS病毒的醫(yī)務人員應用SARS恢復期病人的血清成功控制自身病情的報道。鑒于冠狀病毒毒株存在的變異，防患于未然，尋找有效的藥物或疫苗仍然是本領域研究的重點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是構建人免疫球蛋白G基因文庫，重組表達冠狀病毒S蛋白，制備抗SARS病毒人源性基因工程抗體，用于SARS的診斷和治療。
本發(fā)明的目的通過下述方法和步驟實現，1.構建抗體庫取恢復期病人外周血，分離淋巴細胞，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，擴增得到人免疫球蛋白G重輕鏈可變區(qū)基因，構建人免疫球蛋白G Fab抗體庫。
2.重組表達S蛋白構建表達質粒，IPTG誘導表達，提純，復性。酶聯免疫吸附實驗檢測重組S蛋白特異性和敏感性。
3.篩選抗冠狀病毒人免疫球蛋白G人免疫球蛋白G Fab抗體庫DNA轉化大腸桿菌，IPTG誘導表達，以重組S蛋白作為抗原，通過克隆印跡法、ELISA方法及間接免疫熒光反應篩選得到陽性克隆AS3-3。
4.抗冠狀病毒Fab抗體片段AS3-3的特性分析對所得陽性克隆AS3-3進行測序，推定氨基酸序列，并進行同源性分析。對所得抗體片段進行純化，以試劑盒測定蛋白含量，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其純度，同時以Western blot檢測該Fab抗體與重組抗原S蛋白的反應性，并進行親和力檢測。
實驗證實，應用重組蛋白技術及抗體庫技術獲得的抗冠狀病毒人源性基因工程抗體Fab片段AS3-3，與重組冠狀病毒S蛋白具有較高的親和力，并可特異性識別冠狀病毒感染的EU 14細胞?？赏ㄟ^進一步實驗證實該Fab片段與冠狀病毒S蛋白的高度親和可發(fā)揮抑制冠狀病毒對宿主細胞的吸附與穿入，從而中和冠狀病毒傳染性的作用，對SARS的治療和預防工作具有重要的應用價值。
動物源性單克隆抗體制備技術雖已普及，但應用于人體時可引起人抗異源性抗體發(fā)應，雖可通過抗體人源化技術得以改進，但過程繁雜，耗時耗力，短期難以取得成效。本發(fā)明克服了已有技術的缺陷，獲得的人源性抗冠狀病毒因工程抗體Fab片段，由于無Fc段，在發(fā)揮中和病毒與宿主細胞作用的同時，不會激活補體和引起人體免疫反應等病理損害，應用于人體安全可靠。


圖1.人免疫球蛋白Fab表達載體pFab-His2圖2.陽性克隆AS3-3的間接免疫熒光檢測其中，A-陽性克隆AS3-3與SARS冠狀病毒感染細胞(species EU 14)的間接免疫熒光反應，B-陽性克隆AS3-3與無SARS冠狀病毒感染細胞(species EU14)的間接免疫熒光反應。
圖3.SDS-PAGE檢測Fab抗體純度其中，A-考馬斯亮蘭染色FabB-辣根過氧化酶標記的山羊抗人κ鏈抗體C-辣根過氧化酶標記的氨基三乙酸(Qiagen)1-大腸桿菌JM 109表達的Fab片段
2-純化的重組Fab片段圖4.Western blot檢測Fab抗體與重組抗原S蛋白的反應性其中，1-考馬斯亮蘭染色。
2-重組人抗SARS冠狀病毒Fab3-人Fab4～7 SARS患者恢復期血清8-正常人血清9-抗SARS病毒S蛋白多克隆抗體(IMG-542)10-正常兔IgG。
具體實施例方式
實施例11.構建抗體庫取2名SARS恢復期病人外周抗凝血(每人5ml)(上海市疾病控制中心)，以Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)分離淋巴細胞，用試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)提取總RNA。將總RNA用Gene-Amp RNA PCR試劑盒(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，Conn)以Oligo(dT)16逆轉錄成cDNA，并以人IgG輕重鏈可變區(qū)保守序列的上、下游引物(Invitrogen)(κ鏈5′端引物-序列3、序列4、序列5、序列6；κ鏈3′端引物-序列7；λ鏈5′端引物-序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13；λ鏈3′端引物-序列14；γ鏈5′端引物-序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20；γ鏈3′端引物-序列21；序列22、序列23、序列24)進行免疫球蛋白γ、κ、λ鏈基因的PCR擴增。PCR產物經試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)提純后，分別以AscI和NheI(NEW ENGLAND BioLabs)雙酶切κ鏈和λ鏈產物。酶切后的κ鏈和λ鏈產物與人免疫球蛋白Fab表達載體pFab-His2(圖2)(Am.J.Trop.Med.Hyg.6035-40.1999)連接，隨后電轉入大腸桿菌JM109(Takara)中，構成輕鏈庫。分別以SfiI和NotI(NEW ENGLAND BioLabs)對輕鏈庫及γ鏈PCR產物進行酶切修飾，連接反應后，電轉導入大腸桿菌JM109中，構成9.8×106的非依賴性克隆滴度的抗體庫。
2.重組表達S蛋白棘突蛋白(S蛋白)是冠狀病毒的外部糖蛋白，具有多種功能，與病毒的致病性及組織親嗜性密切相關。全長S蛋白過大，可能會影響與抗體的結合，本發(fā)明首先合成編碼S蛋白(21477～25244)所需的DNA片段，而后以PCR擴增772～1719位堿基(Invitrogen合成)，得到S蛋白部分基因片段(氨基酸位點257～573)。該基因片段經過BamHI和EcoRI酶切后，與表達載體pET21b(Novagen)連接，轉化入大腸桿菌JM109中，將獲得的陽性克隆進行序列分析，將含有正確序列的質粒轉入表達菌BL21(DE3)(Novagen)，經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(上海生工)誘導表達，提取包涵體蛋白，并進行蛋白復性(根據Novagen的包涵體蛋白提純方法)，其分子量為30kDa。以提純的重組蛋白0.1μg/100μl包被酶標板，檢測重組蛋白的特異性和敏感性。當稀釋度為1∶400時，病人血清反應的OD490值為1.744～1.945，而正常對照為0.424～0.492。當稀釋度為1∶800時，患者血清讀數為1.067～1.381，正常對照為0.132～0.147。提示該重組抗原可以作為SARS病毒棘突蛋白的部分片段，用于抗SARS免疫球蛋白抗體庫的篩選。
3.篩選抗冠狀病毒人免疫球蛋白G取9.8×106的非依賴性克隆滴度的抗體庫DNA 10ng，轉化100μlJM109大腸桿菌，將菌液涂布在Luria broth(10g sodii chloridum，10gtryptone，5g yeast extract/L，PH7)平板(含氨芐青霉素50μg/ml)上，37℃培養(yǎng)7小時，待克隆(約5×103個克隆/90mm直徑平板)直徑為0.1～0.2mm時，以直徑為82mm硝酸纖維素膜(Armacia/Pharmacia)覆于平板上，待克隆完全轉移至膜上，將膜置于含1.0mM IPTG的LB平板上，30℃誘導表達6小時，而后用溶菌酶、DNA酶和牛血清白蛋白(100mMTris-HCl[pH7]，150mM NaCl，5mM MgCl2，1.5％ BSA，1mg of DNase，40mglysozyme/ml)對膜進行溶菌。經洗滌除去膜上殘留的細菌碎片等，以牛血清白蛋白(BSA)封閉，與125μg純化的重組蛋白反應，隨后分別與陽性血清、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人IgG Fc抗體(ICNPharmaceuticals，Aurora，Ohio)反應，顯色(HRP-1000，Konica Co，Tokyo，Japan)。每次以4～8張膜進行篩選，在膜上發(fā)現深染的克隆都作為陽性克隆，此為克隆印跡法。
或從抗體庫中取10ng DNA，轉化100μlJM109大腸桿菌，挑取轉化所得的每個單個克隆至2ml含氨芐青霉素的super broth培養(yǎng)基(30gtryptone，20g yeast extract，10g 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid[MOPS]/L，pH7)中，待OD600為0.6～0.8時加入IPTG，使其最終濃度為0.1mM，30℃誘導表達10～12小時，14000rpm 2分鐘離心收集細菌，細菌沉淀中加入100μl含1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)的PBS，懸浮細菌，4℃進行超聲粉碎，而后14000rpm離心10分鐘，取上清液，加入包被有0.1μg重組S蛋白/孔的酶標板上，進行酶聯免疫反應，以HRP標記的抗人IgGFab(ICN Pharmaceuticals，Aurora，Ohio)為二抗，以鄰苯二胺(o-phenylene-diamin，OPD)顯色。每塊酶標板上均加入陽性血清為陽性對照，OD490讀數高于一定數值即為陽性。
將克隆印跡法或ELISA篩選所得的陽性克隆挑入25ml含氨芐青霉素的的SB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，加入IPTG，使其最終濃度為0.1mM，30℃誘導表達10～12小時，14000rpm 2分鐘離心收集細菌，細菌沉淀中加入500μl含1mM PMSF的PBS，懸浮細菌，4℃進行超聲粉碎，而后14000rpm離心10分鐘，取上清液，加入每孔包被有0.1μg重組蛋白或其他無關蛋白如BSA、重組溶組織內阿米巴150kDa表面蛋白等的酶標板上，進行酶聯免疫反應，以HRP標記的抗人IgG Fab為二抗，顯色。當重組S蛋白與其他無關蛋白的OD490讀數有顯著性差別時，即將該克隆的細菌混懸液與SARS冠狀病毒感染的細胞(species EU 14)(EUROIMMUNU LLC購入)進行間接免疫熒光反應，當細胞出現特異性熒光反應，即為陽性克隆。
累計篩選約4.8×104個克隆，其中陽性克隆AS3-3與冠狀病毒感染細胞呈明顯的特異性結合反應。
4.抗冠狀病毒Fab抗體片段AS3-3的特性分析取陽性克隆AS3-3的質粒，分別以AscI-NdeI和SfiI-NotI限制性內切酶酶切，獲得輕鏈和重鏈基因，再與經酶切修飾的測序載體CV-2和CV-1連接，轉化大腸桿菌JM109，分別提取含輕鏈或重鏈基因的質粒DNA，以M13Reverse引物(5′-GGATAACAATTTCACACAGG-3′)，及BigDyeFerminatorV3.1 cycle測序試劑盒(Applied Biosystems，Foster City Calif)進行測序，測序反應在ABIPrism3100 geneticAnalyzer(Applied Biosystems)上進行。并以GENETYX-MAC Verll進行氨基酸序列推定(序列1、序列2)，以IgBlast進行同源性分析。
表1是陽性克隆AS3-3基因序列的同源性比較結果。
表1.

由于Fab抗體含有6個His-Tag，且重鏈與His相連，故選用His結合樹脂(Novagen，Madison，Wis.)進行提純。陽性克隆AS3-3進行大量培養(yǎng)和誘導表達后，收集細菌，進行溶菌和超聲粉碎，離心取上清液進行純化。以1M咪唑溶出純化的Fab片段，以DC Protein Assay(BioRad)測定蛋白含量，并通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測其純度(圖3)。同時以Western blot檢測Fab抗體與重組抗原S蛋白的反應性(圖4)。純化的抗體以Biocore3000(Biocore AB，Uppsala Sweden)檢測其親和力，以純化的重組抗原S蛋白包被后，分別以濃度為2.5μg/ml，1.25μg/ml，0.625μg/ml，0.3125μg/ml的Fab抗體片段與其進行反應，以BIAevalution3.1軟件求出結合率(KA)和解離率(KD)分別為5.05×107(1/M)和1.98×10-8(M)結果提示該Fab抗體與重組冠狀病毒S蛋白具有較高的親和力。
表2是抗重組冠狀病毒S蛋白Fab抗體結合率(KA)和解離率(KD)。
表2

SEQUENCE LISTING<110>復旦大學<120>抗SARS病毒人源性抗體IgG Fab片段<130>抗SARS病毒20050622<160>24<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>121<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Thr Tyr20 25 30Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Arg Ile Ser His Asp Gly Ser Gln Thr His Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Gln Gly Arg Phe Gly Val Ser Arg Asp Asn Ser Asn Tyr Thr Ala Tyr65 70 75 80Val Gln Leu Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Ala Tyr Ser Ser Thr Pro Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>110<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln1 5 10 15Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Thr Asn20 25 30Gly Asn Thr Tyr Leu Ile Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro35 40 45Arg Arg Leu Ile Tyr Gln Val Ser Lys Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val65 70 75 80Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Met Gln Gly Thr Tyr Arg85 90 95Pro Pro Thr Leu Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>3<211>31
<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3ccgctagcgm catycagwtg acccagtctc c 31<210>4<211>31<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4ccgctagcga trttgtgatg acycagwctc c 31<210>5<211>31<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5ccgctagcga aattgtgwtg acgcagtctc c 31<210>6<211>31<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6ccgctagcga catcgwghtg acccagtctc c 31<210>7<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7ttggcgcgcc acactctccc ctgttgaagc tctt34<210>8
<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>8ccgctagcca gtctgysctg actcagccw 29<210>9<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>9ccgctagcca gtctgtgytg acgcagccg 29<210>10<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>10ccgctagcma ckttataytg actcaaccg 29<210>11<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>11ccgctagcca gactgtggta acycaggag 29<210>12<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>12ccgctagctc ctatgwgctg actcagcca 29
<210>13<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>13ccgctagctc ttctgagctg actcaggac 29<210>14<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>14ttgccgcgcc tgaamatkct gtagsggcca ctgt34<210>15<211>44<212>DNA<213>Homo sapiens<400>15aaggcccaac cggccatggc ccaggtgcag ctggtgcagt ctgg 44<210>16<211>44<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16aaggcccaac cggccatggc ccagrtycag ctggtgcagt ctgg 44<210>17<211>44<212>DNA<213>Homo sapiens<400>17aaggcccaac cggccatggc ccagstrcag ctgcagsagt crgg 44
<210>18<211>44<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18aaggcccaac cggccatggc csargtgcag ktggtggagt ctgg 44<210>19<211>44<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19aaggcccaac cggccatggc cccagtgtga ggtgcagctg gtgg 44<210>20<211>44<212>DNA<213>Homo sapiens<400>20aaggcccaac cggccatggc ccaggtgcag ctacagsagt gggg 44<210>21<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>21ccgcggccgc tgtgtgagtt ttgtcacaag attt34<210>22<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>22ccgcggccgc tttgcgctca actgtcttgt ccac34
<210>23<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>23ccgcggccgc tgtgtgagtt gtgtcaccaa gtgg34<210>24<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>24ccgcggccgc tgggggacca tatttggact caac3權利要求
1.抗SARS病毒人源性抗體IgG Fab片段，其特征是具有序列1，序列2的氨基酸序列。
2.按權利要求1所述的抗SARS病毒人源性抗體IgG Fab片段，其特征是所述的抗體片段的蛋白質包括重鏈和輕鏈，其中重鏈部分由121個氨基酸組成，含有三個互補決定區(qū)CDR1，CDR2，CDR3，和四個骨架區(qū)FR1，FR2，FR3，FR4；其中輕鏈部分由110個氨基酸組成，含有三個互補決定區(qū)CDR1，CDR2，CDR3和四個骨架區(qū)FR1，FR2，FR3，FR4。
3.按權利要求2所述的抗SARS病毒人源性抗體IgG Fab片段，其中重鏈部分的FR1含有30個氨基酸，CDR1含有5個氨基酸，FR2含有14個氨基酸，CDR2含有17個氨基酸，FR3含有32個氨基酸，CDR3含有12個氨基酸，FR4含有11個氨基酸；輕鏈部分的FR1含有22個氨基酸，CDR1含有16個氨基酸，FR2含有15個氨基酸，CDR2含有7個氨基酸，FR3含有30個氨基酸，CDR3含有9個氨基酸，FR4含有11個氨基酸。
4.權利要求1所述的抗SARS病毒人源性抗體IgG Fab片段在制備檢測冠狀病毒感染的制劑中的用途。
5.權利要求1所述的抗SARS病毒人源性抗體IgG Fab片段在制備治療冠狀病毒感染的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程領域，具體涉及抗SARS病毒人源性抗體。本發(fā)明應用重組蛋白技術及抗體庫技術獲得的抗冠狀病毒人源性基因工程抗體Fab片段AS3－3，實驗證實與重組冠狀病毒S蛋白具有較高的親和力，并可特異性識別冠狀病毒感染的EU 14細胞，可用于SARS的診斷和治療。本發(fā)明的抗體片段在發(fā)揮中和病毒與宿主細胞作用的同時，不會激活補體和引起人體免疫反應等病理損害，應用于人體安全可靠。對SARS的治療和預防工作具有重要的應用價值。
文檔編號G01N33/563GK1903878SQ20051002815
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月26日 優(yōu)先權日2005年7月26日
發(fā)明者劉金也, 胡庚熙, 楊小麗, 程訓佳 申請人:復旦大學