專利名稱：農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥殘留的測定方法，尤其涉及農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速測定方法。
背景技術：
由于殺蟲活性強以及殺蟲譜廣的特點，阿維菌素作為甲胺磷、馬拉硫磷等高毒有機磷類農(nóng)藥的替代品在全國各地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛地應用。雖然阿維菌素是屬于微生物源農(nóng)藥，但它對大鼠的致死中量值為10mg·kg-1，與對硫磷的致死中量值(3.5-12.5mg·kg-1)相仿，屬高毒農(nóng)藥。另外，阿維菌素對哺乳動物的繁殖生育能力具有潛在毒性作用[3]，有研究發(fā)現(xiàn)]，進食劑量為1.19～2.13mg/只/天的水后，雄性老鼠的輸精管有明顯的結(jié)合組織累積，并伴隨有明顯的血管出血，血清中的睪丸素含量水量顯著下降，生殖實驗也證明這些雄性老鼠的生育生殖能力顯著下降，并且配偶發(fā)生死胎的機率明顯提高。因此，人們對阿維菌素的最高殘留限量(MRL值)標準要求非常嚴格，其中農(nóng)業(yè)部規(guī)定它的MRL值在柑桔中為20μg·kg-1，葉菜為50μg·kg-1 [1]；歐盟詳細規(guī)定了它在多種農(nóng)產(chǎn)品中的MRL值，在果蔬產(chǎn)品、谷物等農(nóng)產(chǎn)品MRL值多為10μg·kg-1；韓國規(guī)定它的MRL值在蘋果中為20μg·kg-1，芹菜為50μg·kg-1；以色列規(guī)定的MRL值在黃瓜、茄子、桃子、草莓等果蔬農(nóng)產(chǎn)品中為10μg·kg-1；澳大利亞規(guī)定的MRL值在蘋果、梨、番茄等產(chǎn)品上為10μg·kg-1]。
阿維菌素分子量大，極難氣化，而且尚無可行的GC衍生化方法，無法采用GC進行分析，目前阿維菌素及其有毒代謝物的殘留檢測研究大多數(shù)以HPLC為手段來進行。阿維菌素分子結(jié)構中具有共軛二烯結(jié)構，能在245nm處有強的紫外吸收，但紫外檢測的靈敏度太低，無法滿足目前農(nóng)產(chǎn)品阿維菌素及其有毒代謝物的殘留分析要求；熒光檢測器(FD)由于其良好的檢測靈敏度和選擇性，成為目前阿維菌素及其代謝物的殘留分析主要手段。盡管在果蔬等農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)上使用越來越多，但目前阿維菌素及其有毒代謝物的殘留分析報道多見于畜產(chǎn)品上的殘留分析，而關于果蔬產(chǎn)品上的殘留分析報道較少，并且所報道的方法中樣品前處理多為繁瑣。專利檢索發(fā)現(xiàn)，相關于阿維菌素的專利大多集中在產(chǎn)品開發(fā)應用及其衍生產(chǎn)品開發(fā)應用上，關于阿維菌素在果蔬類農(nóng)產(chǎn)品上殘留檢測方法的專利尚未檢索到。

發(fā)明內(nèi)容
針對已有技術存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速高效液相-熒光檢測方法，該方法操作簡單、成本低、快速、準確。
實現(xiàn)本發(fā)明發(fā)明目的的技術方案如下一種農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速測定方法，其步驟如下A、樣品制備采集果蔬樣品先用刀具切碎，再用組織搗碎機勻漿，并冷凍保存；B、樣品前處理取樣品勻漿液置于容器中，加入乙腈，混合均勻后過濾，濾液收集到裝有氯化鈉的具塞量筒中，劇烈震蕩后靜止，使乙腈相和水相分層，然后將乙腈相中溶液移至試管并吹干，向試管中加入無水乙腈使附著在試管壁的阿維菌素溶解于乙腈溶液中。
C、柱前衍生化在避光、室溫條件下，在乙腈溶解的待衍生化樣品中，先加入N-甲基咪唑∶乙腈(體積比3∶7～5∶5)組成的衍生試劑，再加入三氟乙酸酐∶乙腈(體積比3∶7～5∶5)組成的衍生試劑，振蕩搖勻反應30-35min后，再加入甲醇搖勻反應60-70min，反應液過濾后進入高效液相色譜-熒光檢測器(HPLC-FD)測定。
所述B步驟中樣品勻漿液與乙腈的比例范圍為1/2.5～1/3(體積比)。
所述C步驟中各組分的體積比為乙腈溶解的待衍生化樣品N-甲基咪唑∶乙腈(體積比3∶7～5∶5)組成的衍生試劑三氟乙酸酐∶乙腈(體積比3∶7～5∶5)組成的衍生試劑∶甲醇＝1∶0.5∶0.5∶1～1∶0.5∶0.5∶2。
所述B步驟中乙腈相樣品提取溶液放在氮吹儀上吹干。
本發(fā)明以乙腈為提取劑，將殘留在果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中的阿維菌素提取出來，并利用鹽析作用使用有機相和水相分離，阿維菌素進入有機相，省略凈化過程，直接將提取的阿維菌素在無水狀態(tài)下用三氟乙酸酐(TFAA)-N-甲基咪唑(NMIM)-乙腈(ACN)法進行柱前熒光衍生化，在此過程中，阿維菌素反應生帶有衍光基團的衍生物，最后樣品在高效液相色譜-熒光檢測器進行阿維菌素殘留分析。
本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點；1、本發(fā)明方法用乙腈對樣品提取后直接進行柱前衍生化，省略了SPE柱凈化的過程，該前處理方法操作更為簡便、省時，同時節(jié)省了分析試劑和SPE柱的使用，極大降低了檢測成本。
2、本發(fā)明方法能除了檢測阿維菌素自身外，還能檢測其有毒代謝物8，9-Z-B1(見

圖1)，8，9-Z-B1是阿維菌素B1光異構化產(chǎn)物，它經(jīng)過NMIM-TFAA-CAN法熒光衍生反應后所得的產(chǎn)物與B1a的衍生產(chǎn)物是同一物質(zhì)。
3、本發(fā)明方法的檢測限低于現(xiàn)有的最大殘留限量值一個數(shù)量級以上，準確度和精密度符合殘留檢測要求。
4、本發(fā)明方法在衍生反應完成后，再加入一定量甲醇并放置一定時間，使阿維菌素的酯式結(jié)構衍生產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的醇式結(jié)構，在數(shù)據(jù)處理時只需對醇式結(jié)構產(chǎn)物的峰值進行積分就能準確測定阿維菌素殘留量，避免以前技術方法只對酯式結(jié)構產(chǎn)物積分而遺漏了醇式結(jié)構產(chǎn)物的問題，從而本發(fā)明方法更加有利于準確測定阿維菌素殘留量。
說明書附1為阿維菌素標樣的液相色譜(HPLC-FD)圖；
圖2為空白對照甘藍的液相色譜(HPLC-FD)圖；圖3為添加阿維菌素標樣的甘藍樣品液相色譜(HPLC-FD)圖。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明是如何實現(xiàn)的實施例11樣品前處理1.1樣品制備采集樣品約200g，先用刀具切碎，再用組織搗碎機勻漿，放在-20℃冰箱中保存。
1.2樣品前處理準確稱取樣品勻漿液20g置于250mL平底玻璃瓶中，加入50mL乙腈，樣品在14000r·min-1高速勻質(zhì)器勻質(zhì)2min后，用濾紙過濾，濾液收集到裝有5g～7g氯化鈉的100mL具塞量筒中，收集濾液，蓋上塞子，劇烈震蕩2min，在室溫下靜止30min，使乙腈相和水相分層。從乙腈相中吸取10mL溶液轉(zhuǎn)移至10mL刻度試管，將裝有樣品液的試管放在氮吹儀上吹近干，試管中加入0.5mL無水乙腈，然后在超聲波清洗機上超聲1min，使附著在試管壁的阿維菌素能完全溶解于乙腈溶液，待衍生化。
2柱前衍生化衍生試劑AN-甲基咪唑(NMIM)及乙腈(二者體積比3∶7)，現(xiàn)配現(xiàn)用；衍生試劑B三氟乙酸酐(TFAA)及乙腈(二者體積比3∶7)，現(xiàn)配現(xiàn)用；
具體操作步驟在避光、室溫環(huán)境條件下，在裝有0.5mL乙腈溶解的待衍生化樣品或標樣的試管中，先后分別加入0.25mL衍生試劑A和0.25mL衍生試劑B，立即蓋上試管塞振蕩搖勻，反應30min后，試管中再加入1mL甲醇搖勻，再反應1h后，反應液過0.45μm濾膜后進行HPLC-FD測定。
3色譜條件色譜柱Waters-C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相水∶乙腈＝5∶95，流速為1.0mL·min-1；檢測波長熒光激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長475nm；柱溫40℃；進樣量10μl；定量方法外標法(峰面積)。
實施例21樣品前處理1.1樣品制備采集樣品約200g，先用刀具切碎，再用組織搗碎機勻漿，放在-20℃冰箱中保存。
1.2樣品前處理準確稱取樣品勻漿液25g置于250mL平底玻璃瓶中，加入60mL乙腈，樣品在14000r·min-1高速勻質(zhì)器勻質(zhì)2min后，用濾紙過濾，濾液收集到裝有5g～7g氯化鈉的100mL具塞量筒中，收集濾液，蓋上塞子，劇烈震蕩2min，在室溫下靜止35min，使乙腈相和水相分層。從乙腈相中吸取10mL溶液轉(zhuǎn)移至10mL刻度試管，將裝有樣品液的試管放在氮吹儀上吹近干，試管中加入0.5mL無水乙腈，然后在超聲波清洗機上超聲1min，使附著在試管壁的阿維菌素能完全溶解于乙腈溶液，待衍生化。
2柱前衍生化衍生試劑A衍生試劑AN-甲基咪唑(NMIM)及乙腈(二者體積比5∶5)，現(xiàn)配現(xiàn)用；衍生試劑B三氟乙酸酐(TFAA)及乙腈(二者體積比5∶5)，現(xiàn)配現(xiàn)用；具體操作步驟在避光、室溫環(huán)境條件下，在裝有0.5mL乙腈溶解的待衍生化樣品或標樣的試管中，先后分別加入0.25mL衍生試劑A和0.25mL衍生試劑B，立即蓋上試管塞振蕩搖勻，反應35min后，試管中再加入0.5mL甲醇搖勻，再反應70min后，反應液過0.45μm濾膜后進行HPLC-FD測定。
3色譜條件色譜柱Waters-C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相水∶乙腈＝5∶95，流速為1.0mL·min-1；檢測波長熒光激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長475nm；柱溫40℃；進樣量10μl；定量方法外標法(峰面積)。
用本發(fā)明方法分別對甘藍、黃瓜、西蘭花、蔥、菠菜、草莓、梨、蘋果這8種果蔬產(chǎn)品在0.001mg·kg-1、0.01mg·kg-1、0.1mg·kg-1三個不同濃度水平進行了添加回收實驗，結(jié)果表明，經(jīng)過本前處理后的這8個樣品色譜圖都沒有出現(xiàn)明顯的雜質(zhì)峰(如圖1-圖3所示)，這些樣品的添加回收率范圍在83.1％～110.8％(如表1所示)，完全達到了殘留分析的要求。
表1阿維菌素在果蔬產(chǎn)品中的添加回收率(n＝4)

方法的線性范圍、檢出限和最低檢測濃度
在最佳實驗條件下，本實驗方法線性范圍上限可達1.0×104μg·L-1，以4倍信噪比(S/N＝3)作為方法的檢測下限，阿維菌素的檢測下限為0.5μg·L-1，其線性系數(shù)達0.999以上；該方法的最低檢測濃度能達到1μg·kg-1，低于最低的MRL值(10μg·kg-1)一個數(shù)量級，完全符合阿維菌素殘留分析要求。
實驗方法的精密度添加回收實驗結(jié)果可見，實驗中8種樣品在三個不同濃度水平下的平行樣品的相對標準偏差范圍在1.9％～12.3％，符合阿維菌素殘留分析要求。
權利要求
1.一種農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速測定方法，其步驟如下A、樣品制備采集果蔬樣品先用刀具切碎，再用組織搗碎機勻漿，并冷凍保存；B、樣品前處理取樣品勻漿液置于容器中，加入乙腈，混合均勻后過濾，濾液收集到裝有氯化鈉的具塞量筒中，劇烈震蕩后靜止，使乙腈相和水相分層，然后將乙腈相中溶液移至試管并吹干，向試管中加入無水乙腈使附著在試管壁的阿維菌素溶解于乙腈溶液中，C、柱前衍生化在避光、室溫條件下，在乙腈溶解的待衍生化樣品中，先加入N-甲基咪唑與乙腈組成的衍生試劑，再加入三氟乙酸酐與乙腈組成的衍生試劑，振蕩搖勻反應30-35min后，再加入甲醇搖勻反應60-70min，反應液過濾后進入高效液相色譜-熒光檢測器測定。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速測定方法，其特征在于所述B步驟中樣品勻漿液與乙腈的體積比為1∶2.5～1∶3。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速測定方法，其特征在于所述C步驟中N-甲基咪唑與乙腈的體積比為3∶7～5∶5，三氟乙酸酐與乙腈的體積比為3∶7～5∶5。
4.根據(jù)權利要求1或3任意一項權利要求所述的一種農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速測定方法，其特征在于所述C步驟中各組分的體積比為乙腈溶解的待衍生化樣品∶N-甲基咪唑與乙腈組成的衍生試劑∶三氟乙酸酐與乙腈組成的衍生試劑∶甲醇＝1∶0.5∶0.5∶1～1∶0.5∶0.5∶2。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速測定方法，其特征在于所述B步驟中乙腈相樣品提取溶液放在氮吹儀上吹干。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)藥阿維菌素及其有毒代謝物殘留的快速測定方法，以乙腈為提取劑，將殘留在果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中的阿維菌素提取出來，并利用鹽析作用使用有機相和水相分離，阿維菌素進入有機相，省略凈化過程，直接將提取的阿維菌素在無水狀態(tài)下用三氟乙酸酐(TFAA)－N－甲基咪唑(NMIM)－乙腈(ACN)法進行柱前熒光衍生化，在此過程中，阿維菌素反應生帶有衍光基團的衍生物，最后樣品在高效液相色譜－熒光檢測器進行阿維菌素殘留分析。本發(fā)明方法具有操作簡便、快速、檢測成本低、檢測結(jié)果準確等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/04GK1766604SQ200510030028
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月27日 優(yōu)先權日2005年9月27日
發(fā)明者謝顯傳, 王冬生, 張少華, 袁永達, 李琳一, 於文俊 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院