專利名稱：復(fù)方血栓通制劑hplc指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標準指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以天然植物藥材原料制成的復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此方法所得到的復(fù)方血栓通制劑HPLC標準指紋圖譜。
背景技術(shù)：
中藥指紋圖譜是指某種或某幾種中藥材中所共有的，具有特征性的某類成分的色譜或光譜的圖譜。當(dāng)前，中藥指紋圖譜質(zhì)量控制技術(shù)作為控制中藥質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性的檢測手段，是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵技術(shù)之一，這對有效地控制中藥材的質(zhì)量有重要意義。色譜指紋圖譜質(zhì)量控制技術(shù)是當(dāng)前中藥質(zhì)量研究的亮點。對于成份復(fù)雜的中藥，過去那種以單一有效成份作為其質(zhì)量控制指標的做法是不全面的，用“盲人摸象”做比喻是再貼切不過的了。而色譜指紋圖譜質(zhì)量控制模式則以色譜分析為手段，從中獲取反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的信息，通過對指紋特征的分析比較，評價中藥內(nèi)在質(zhì)量的真實性、一致性和穩(wěn)定性，這是現(xiàn)階段綜合評價中藥質(zhì)量的最優(yōu)技術(shù)，國家藥品監(jiān)督管理局已要求中藥制劑實施指紋圖譜質(zhì)量控制。據(jù)報道，日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在于20世紀80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用液相指紋圖譜控制質(zhì)量，美國、德國、法國等國家亦對植物草藥采用指紋圖譜質(zhì)量控制技術(shù)。隨著中醫(yī)中藥的推廣應(yīng)用，指紋圖譜作為中草藥及其提取物質(zhì)量控制方法，目前已為國際所共識。但目前中藥植物的指紋圖譜往往采用單一植物，例如中國專利申請CN1233951A丹參藥材指紋圖譜建立的方法及其標準指紋圖譜。對多種中藥材合成的中成藥復(fù)方制劑的質(zhì)量圖譜研究仍處于起步階段。復(fù)方血栓通制劑是純中藥制劑，由三七、黃芪、丹參、玄參四味藥材組成，具有活血化瘀，益氣養(yǎng)陰的功效，用于治療血瘀兼氣陰兩虛證的視網(wǎng)膜靜脈栓塞以及用于血瘀兼氣陰兩虛的穩(wěn)定性勞累型心絞痛。復(fù)方血栓通膠囊生產(chǎn)時采用50％乙醇提取工藝，故其成品中成分既有水溶性成分又有脂溶性成分，成分復(fù)雜，極性相差大，質(zhì)量標準項下采用TLC分別以三七、黃芪、丹參的對照藥材和原兒茶醛對照品在各特定色譜條件下的薄層斑點為對照鑒別，并采用薄層掃描測定人參皂苷Rg1和Rb1的總量，其不足之處在于1、沒有對四味藥材中的化學(xué)成分進行全面、系統(tǒng)的檢測。
2、沒有對玄參進行檢測。
3、不能全面監(jiān)控中間體，成品的質(zhì)量。
4、不能監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種通過對復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的研究，摸索出一種復(fù)方血栓通制劑藥材的質(zhì)量控制方法，該指紋圖譜質(zhì)量控制方法能全面反映復(fù)方血栓通制劑的質(zhì)量，還可依據(jù)成品、半成品的指紋圖譜的變化來追根溯源尋找工藝操作中的問題。并采用HPLC線性梯度洗脫在一個流動相系統(tǒng)首次利用不同檢測波長，同時檢出復(fù)方中的全部四味藥材成分，從色譜峰的特征和相似度結(jié)果判斷復(fù)方血栓通制劑樣品的合格與否，從整體上全面反映藥材內(nèi)在質(zhì)量的復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，本發(fā)明還提供了復(fù)方血栓通制劑的標準指紋圖譜。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到這種復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特殊之處在于它包括以下步驟(1)供試品溶液的制備精密稱取復(fù)方血栓通制劑0.1g～10.0g，用50％～100％甲醇提取1～3次，每次10～60分鐘，每次10～100ml，濾過，合并濾液，蒸干，適當(dāng)凈化，用甲醇配成供試品溶液；(2)對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、三七皂苷R1、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA、哈帕酯苷適量，加乙腈使溶解，分別制成對照品溶液人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re，三七皂苷R1分別為1mg/ml，隱丹參酮、丹參酮IIA分別為0.2mg/ml，丹參酮I為0.5mg/ml，哈帕酯苷為0.1mg/ml；
(3)復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，進樣，用高效液相色譜儀測定，以對照品的色譜峰相對保留時間和峰面積為1，計算供試品的相對保留時間和相對峰面積，即得到復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜。
所述高效液相色譜儀中的色譜柱，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相水∶乙腈，水(％)85～43∶乙腈(％)15～57；線性梯度洗脫；T(min)0～180；柱溫10～50℃；檢測波長203nm，270nm。
供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價，各檢測波長下的相似度均大于0.80。
其成分之一的三七、玄參、黃芪、丹參四味藥材的HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，與復(fù)方血栓通制劑具有相同的檢測條件并分別得到各自藥材的指紋圖譜。
復(fù)方血栓通制劑的劑型是任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。
本發(fā)明的目的還可以通過以下措施來達到這種利用權(quán)利要求1所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的HPLC指紋圖譜，其特殊之處在于，所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜在203nm下歸屬于三七的指紋圖譜具有10個特征峰；歸屬于黃芪的指紋圖譜具有2個特征峰；歸屬于丹參的指紋圖譜具有2個特征峰；歸屬于玄參的指紋圖譜具有3個特征峰；在270nm下歸屬于丹參的指紋圖譜具有3個特征峰；歸屬于玄參的指紋圖譜具有1個特征峰；所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖1、圖2所示的圖譜。
本發(fā)明的目的還可以通過以下措施來達到這種利用權(quán)利要求1所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的HPLC指紋圖譜，其殊之處在于，所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜203nm的共有峰為〔1〕、〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔7〕、〔8〕、〔11〕、〔14〕、〔17〕、〔31〕、〔39〕11個峰；其中歸屬于三七的共有峰為〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔14〕、〔17〕5個峰；歸屬于玄參的共有峰為〔1〕、〔8〕2個峰；歸屬于黃芪的共有峰為〔7〕、〔11〕2個峰；歸屬于丹參的共有峰為〔31〕、〔39〕2個峰；所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖1所示的圖譜；所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜270nm的共有峰為〔2〕、〔4〕、〔5〕、〔6〕4個峰，歸屬于玄參的共有峰為〔2〕號峰；歸屬于丹參的共有峰為〔4〕、〔5〕、〔6〕3個峰。所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖2所示的圖譜。由HPLC指紋圖譜各指紋特征峰共同組成了復(fù)方血栓通制劑的指紋圖譜特征，可以完整的對復(fù)方血栓通制劑所含的4味植物藥材作出色譜鑒定。
利用DAD檢測器對主要峰進行峰純度檢查，通過UV吸收曲線的比較確定203nm1號峰為安格洛苷，2號峰為三七皂苷R1、3號峰為人參皂苷Rg1、4號峰為人參皂苷Re、14號峰為人參皂苷Rb1、8號峰為哈帕酯苷、31號峰為隱丹參酮、39號峰為丹參酮IIA；270nm2號峰為哈帕酯苷、4號峰為隱丹參酮、5號峰為丹參酮I、6號峰為丹參酮IIA。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點1、HPLC線性梯度洗脫在一個流動相系統(tǒng)首次利用不同檢測波長，同時檢出復(fù)方中的全部四味藥材。
2、更全面地監(jiān)控原料藥材、中間體和成品的質(zhì)量，監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。
3、該法建立的指紋圖譜適用于國產(chǎn)柱和進口柱，不同的儀器，即具有良好的重現(xiàn)性和更好的適用性。
4、選用HPLC作為檢測方法，超聲法作為提取方法，固相萃取作為純化方法，選用的方法和試驗條件易于推廣、便于執(zhí)行，即具有良好的可行性。
5、該法建立的指紋圖譜能夠表達該產(chǎn)品的特征(包括8個已知成分，都為純)，即具有良好的專屬性。
6、更加準確、全面地評價其質(zhì)量，為更加合理、規(guī)范使用藥材提供科學(xué)依據(jù)。
7、所建立的指紋圖譜涵蓋了部版標準及藥典標準，而且比它們有所提高(可以進行定量)。
8、固相萃取法凈化效果好、回收率高、重現(xiàn)性好，所需溶劑少。
9、本發(fā)明制作該指紋圖譜的方法簡單、準確可靠、適用于復(fù)方血栓通制劑的質(zhì)量控制。


圖1是復(fù)方血栓通膠囊203nm的HPLC參照指紋圖譜。
圖2是復(fù)方血栓通膠囊270nm的HPLC參照指紋圖譜。
圖3是203nm歸屬于三七的共有峰UV掃描圖。
圖4是270nm歸屬于黃芪的共有峰UV掃描圖。
圖5是270nm歸屬于丹參的共有峰UV掃描圖。
圖6是203nm，270nm歸屬于玄參的共有峰UV掃描圖。
圖7是復(fù)方血栓通膠囊精密度(203nm)結(jié)果示意圖。
圖8是復(fù)方血栓通膠囊精密度(270nm)結(jié)果示意圖。
圖9是復(fù)方血栓通膠囊穩(wěn)定性(203nm)結(jié)果示意圖。
圖10是復(fù)方血栓通膠囊穩(wěn)定性(270nm)結(jié)果示意圖。
圖11是復(fù)方血栓通膠囊重現(xiàn)性(203nm)結(jié)果示意圖。
圖12是復(fù)方血栓通膠囊重現(xiàn)性(270nm)結(jié)果示意圖。
圖13是復(fù)方血栓通膠囊成品(203nm)指紋圖譜相似度示意圖。
圖14是復(fù)方血栓通膠囊成品(270nm)指紋圖譜相似度示意圖。
圖15是270nm歸屬于玄參的共有峰UV掃描圖。
圖16是玄參指紋圖譜峰純度的主要色譜圖。
圖17是玄參指紋圖譜的色譜峰。
圖18是玄參指紋圖譜相似度結(jié)果的色譜圖。
圖19是三七指紋圖譜各共有峰紫外掃描曲線圖。
圖20是三七指紋圖譜色譜峰示意圖。
圖21是三七指紋圖譜相似度結(jié)果示意圖。
圖22是丹參指紋圖譜各共有峰紫外掃描曲線示意圖。
圖23是丹參指紋圖譜丹參指紋(270nm)圖譜。
圖24是丹參指紋圖譜相似度結(jié)果示意圖。
圖25是黃芪指紋圖譜的色譜峰。
圖26是黃芪指紋圖譜各共有峰紫外掃描曲線示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳述復(fù)方血栓通制劑包括膠囊劑(軟膠囊、硬膠囊)、片劑、滴丸劑、合劑等口服制劑，并由玄參、三七、丹參、黃芪四種組份制成。
實施例1復(fù)方血栓通膠囊HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法及復(fù)方血栓通膠囊HPLC指紋圖譜1、儀器與試藥1.1儀器電子分析天平；超聲波清洗器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；超純水器；ODS固相萃取小柱；液相色譜儀；高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)的色譜儀；紫外檢測器；質(zhì)譜檢測器。
色譜柱①Merck Lichrospher Rp-18e5μm，250×4.0mm；②Agilent Hypersil5μm，250×4.0mm；③依利特Lichrosorb Rp-18e5μm，250×4.6mm；④迪馬Diamonsil C185μm，250×4.6mm；⑤大連依利特Hypersil C185μm，250×4.0mm1.2試藥對照品

對照藥材

2、方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱高效液相色譜儀中的色譜柱，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相水∶乙腈，水(％)85~43∶乙腈(％)15~57；線性梯度洗脫；T(min)0~180；柱溫30℃；檢測波長203nm，270nm。
根據(jù)成品工藝，主要成分包括了從極性較大的皂苷到極性較小的丹參酮，故使用ODS柱。
根據(jù)文獻，人參皂苷Rg1和人參皂苷Re很難分離，因此，采用這兩個峰作為衡量色譜柱的指標。
比較色譜柱Agilent Hypersil5μm，250×4.0mm；Merck Lichrospher Rp-18e5μm，250×4.0mm；Diamonsil C185μm，250×4.6mm；Elite Lichrosorb Rp-18e10μm，250×4.6mm；Hypersil C185μm，250×4.0mm發(fā)現(xiàn)Agilent色譜柱(Hypersil填料)的理論塔板數(shù)以人參皂苷Rb1計算不小于90000，可使人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的分離度達到1.0；兩者的分離度達不到1.0時，分離度變化前后相似度差別＜0.02。
除了這兩個峰，其他色譜峰采用不同色譜柱后分離度和基線無明顯差別。
3、指紋圖譜測定3.1指紋圖譜制備(1)供試品溶液的制備精密稱取復(fù)方血栓通膠囊內(nèi)容物1.5g，用70％甲醇30ml超聲提取2次，每次30分鐘，濾過，濾液回收溶劑至近干，用水2ml溶解樣品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液棄去，用10ml甲醇分次洗脫，洗脫液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液；(2)對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、三七皂苷R1、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA、哈帕酯苷適量，加乙腈使溶解，分別制成對照品溶液人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re，三七皂苷R1分別為1mg/ml，隱丹參酮、丹參酮IIA分別為0.2mg/ml，丹參酮I為0.5mg/ml，哈帕酯苷為0.1mg/ml；(3)復(fù)方血栓通膠囊HPLC指紋圖譜的測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，進樣，用高效液相色譜儀測定，以對照品的色譜峰相對保留時間和峰面積為1，計算相對保留時間和相對峰面積，即得到復(fù)方血栓通膠囊HPLC指紋圖譜。
3.2共有峰確定按照實驗方法，對所有復(fù)方血栓通膠囊進行分析，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價，共有峰列表如下成品在203nm的共有峰列表如下

成品在270nm的共有峰列表如下

3.3共有特征峰的描述所述復(fù)方血栓通膠囊HPLC指紋圖譜203nm的共有峰為〔1〕、〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔6〕、〔7〕、〔8〕、〔10〕、〔11〕、〔12〕、〔13〕、〔14〕、〔16〕、〔17〕、〔19〕、〔21〕、〔22〕、〔23〕、〔24〕、〔25〕、〔27〕、〔30〕、〔31〕、〔34〕、〔35〕、〔36〕、〔37〕、〔38〕、〔39〕29個峰，其中歸屬于三七的共有峰為〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔10〕、〔12〕、〔13〕、〔14〕、〔16〕、〔17〕、〔19〕、〔23〕、〔36〕、〔37〕、〔38〕；歸屬于玄參的共有峰為〔1〕、〔8〕、〔30〕；歸屬于黃芪的共有峰為〔7〕、〔11〕；歸屬于丹參的共有峰為〔31〕、〔39〕。
所述復(fù)方血栓通膠囊HPLC指紋圖譜在203nm下歸屬于三七的指紋圖譜具有14個特征峰；歸屬于黃芪的指紋圖譜具有2個特征峰；歸屬于丹參的指紋圖譜具有2個特征峰；歸屬于玄參的指紋圖譜具有3個特征峰；所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖1所示的圖譜。
利用DAD檢測器對主要峰進行峰純度檢查，通過UV吸收曲線的比較確定203nm1號峰為安格洛苷，2號峰為三七皂苷R1、3號峰為人參皂苷Rg1、4號峰為人參皂苷Re、14號峰為人參皂苷Rb1、8號峰為哈帕酯苷、31號峰為隱丹參酮、39號峰為丹參酮IIA。
所述復(fù)方血栓通膠囊HPLC指紋圖譜270nm的共有峰為〔1〕、〔2〕、〔4〕、〔5〕、〔6〕5個峰，歸屬于玄參的共有峰為〔2〕號峰；歸屬于丹參的共有峰為〔4〕、〔5〕、〔6〕。在270nm下歸屬于丹參的指紋圖譜具有3個特征峰；歸屬于玄參的指紋圖譜具有1個特征峰；所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖2所示的圖譜。
利用DAD檢測器對主要峰進行峰純度檢查，通過UV吸收曲線的比較確定270nm2號峰為哈帕酯苷、4號峰為隱丹參酮、5號峰為丹參酮I、6號峰為丹參酮IIA。
3.4指紋圖譜精密度試驗取同一個復(fù)方血栓通膠囊溶液，連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示儀器的精密度很好，各檢測波長下的相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下203nm

270nm

3.5指紋圖譜穩(wěn)定性試驗取一個編號的復(fù)方血栓通膠囊樣品溶液，分別在0、4、8、12、24、48小時進樣，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示，穩(wěn)定性良好，相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下203nm

270nm

3.6指紋圖譜重現(xiàn)性試驗取同一批復(fù)方血栓通膠囊6份，按藥材樣品溶液制備項下方法制備，分別進樣，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示樣品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下203nm

270nm

由HPLC指紋圖譜各指紋特征峰共同組成了復(fù)方血栓通膠囊的指紋圖譜特征，可以完整的對復(fù)方血栓通膠囊所含的4味植物藥材作出色譜鑒定。
實施例2玄參HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法1、儀器與試藥1.1儀器電子分析天平；超聲波清洗器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；超純水器；ODS固相萃取小柱；液相色譜儀；高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)的色譜儀；紫外檢測器；質(zhì)譜檢測器。
色譜柱①Merck Lichrospher Rp-18e5μm，250×4.0mm；②Agilent Hypersil5μm，250×4.0mm；③依利特Lichrosorb Rp-18e5μm，250×4.6mm；④迪馬Diamonsil C185μm，250×4.6mm；⑤大連依利特Hypersil C185μm，250×4.0mm1.2試藥樣品均為廣東眾生藥業(yè)股份有限公司投產(chǎn)藥材，為藥典規(guī)定的品種，按《中國藥典》收載的藥材標準進行檢驗，均為合格藥材。
2、方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相水(％)85~43∶乙腈(％)15~57；T(min)0~180；檢測波長270nm；柱溫30℃。
3、指紋圖譜測定3.1指紋圖譜制備(1)供試品溶液的制備取玄參粉末1g，精密稱定，加70％甲醇20ml，超聲處理2次，每次30分鐘濾過，濾液減壓回收至近干，用水2ml溶解樣品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液棄去，用10ml甲醇分次洗脫，洗脫液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液；(2)高效液相色譜分析精密吸取供試品溶液20μl進樣，色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相水(％)85～43∶乙腈(％)15～57；T(min)0～180；柱溫30℃；檢測波長270nm，得到玄參HPLC指紋圖譜。
3.2共有峰確定對所有玄參藥材的樣品進行分析，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖16所示的圖譜。
共有峰列表如下

3.3指紋圖譜精密度試驗取同一個玄參藥材溶液連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價，結(jié)果顯示儀器的精密度很好，相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下

3.4指紋圖譜穩(wěn)定性試驗取一個編號的藥材樣品溶液，分別在0、4、8、12、24、48小時進樣，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示樣品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下

3.5指紋圖譜重現(xiàn)性試驗取同一批玄參藥材6份，按藥材樣品溶液制備項下方法制備，分別進樣，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示樣品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下

相似度評價本品的指紋圖譜與共有模式圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》比較，相似系數(shù)應(yīng)不得低于0.80。

實施例3三七HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法1、儀器與試藥1.1儀器電子分析天平；超聲波清洗器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；超純水器；ODS固相萃取小柱；液相色譜儀；高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)的色譜儀；紫外檢測器；質(zhì)譜檢測器。
色譜柱①Merck Lichrospher Rp-18e5μm，250×4.0mm；②Agilent Hypersil5μm，250×4.0mm；③依利特Lichrosorb Rp-18e5μm，250×4.6mm；④迪馬Diamonsil C185μm，250×4.6mm；⑤大連依利特Hypersil C185μm，250×4.0mm1.2試藥樣品均為廣東眾生藥業(yè)股份有限公司投產(chǎn)藥材，為藥典規(guī)定的品種，按《中國藥典》收載的藥材標準進行檢驗，均為合格藥材。
2、方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相水(％)85~43∶乙腈(％)15~57；線性梯度洗脫；T(min)0~180；檢測波長203nm；柱溫30℃。
3、指紋圖譜測定3.1指紋圖譜制備(1)供試品溶液的制備取三七粉末0.75g，精密稱定，加70％甲醇15ml，超聲處理2次，每次30分鐘，濾過，濾液減壓回收溶劑至近干，用水2ml溶解樣品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液棄去，用10ml甲醇分次洗脫，洗脫液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液；(2)對照品溶液的制備精密稱取各種對照品適量，加乙腈使溶解，分別制成人參皂苷Rg1 1mg/ml，人參皂苷Rb1 1mg/m1，人參皂苷Re0.2mg/ml，三七皂苷R10.2mg/ml；(3)三七HPLC指紋圖譜的測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，進樣，用高效液相色譜儀測定，以對照品的色譜峰相對保留時間和峰面積為1，計算相對保留時間和相對峰面積，即得到三七HPLC指紋圖譜。所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖20所示的圖譜。
3.2共有峰確定精密吸取供試品溶液20μl，進樣，測定，應(yīng)有如下共有峰

三七指紋圖譜通過紫外吸收曲線的比較定性，確定3號峰為三七皂苷R1、4號峰為人參皂苷Rg1、5號峰為人參皂苷Re、16號峰為人參皂苷Rb1。
4.3指紋圖譜精密度試驗取同一個三七藥材溶液連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價，結(jié)果顯示儀器的精密度很好，相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下

3.4指紋圖譜穩(wěn)定性試驗取一個編號的藥材樣品溶液，分別在0、4、8、12、24、48小時進樣，檢測指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示樣品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下

3.5指紋圖譜重現(xiàn)性試驗取同一批三七藥材6份，按藥材樣品溶液制備項下方法制備，分別進樣，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示樣品溶液很好，相似度均大于0.80。

相似度結(jié)果如下相似度評價本品的指紋圖譜與共有模式圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》比較，相似系數(shù)應(yīng)不得低于0.80。

實施例4丹參HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法1、儀器與試藥1.1儀器電子分析天平；超聲波清洗器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；超純水器；ODS固相萃取小柱；液相色譜儀；高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)的色譜儀；紫外檢測器；質(zhì)譜檢測器。
色譜柱①Merck Lichrospher Rp-18e5μm，250×4.0mm；②Agilent Hypersil5μm，250×4.0mm；③依利特Lichrosorb Rp-18e5μm，250×4.6mm；
④迪馬Diamonsil C185μm，250×4.6mm；⑤大連依利特Hypersil C185μm，250×4.0mm1.2試藥樣品均為廣東眾生藥業(yè)股份有限公司投產(chǎn)藥材，為藥典規(guī)定的品種，按《中國藥典》收載的藥材標準進行檢驗，均為合格藥材。
2、方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相水(％)85~43∶乙腈(％)15~57；線性梯度洗脫；T(min)0~180；檢測波長270nm；柱溫30℃。理論塔板數(shù)以丹參酮IIA計算不小于4000。
3、指紋圖譜測定3.1指紋圖譜制備(1)供試品溶液的制備取丹參粉末0.75g，精密稱定，加70％甲醇15ml，超聲處理2次，每次30分鐘，濾過，濾液減壓回收溶劑至近干，用水2ml溶解樣品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液棄去，用10ml甲醇分次洗脫，洗脫液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液；(2)對照品溶液的制備精密稱取各種對照品適量，加乙腈使溶解，分別制成丹參酮I 0.2mg/ml，隱丹參酮0.5mg/ml，丹參酮IIA 0.2mg/ml；(3)丹參HPLC指紋圖譜的測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，進樣，用高效液相色譜儀測定，以對照品的色譜峰相對保留時間和峰面積為1，計算相對保留時間和相對峰面積，即得到丹參HPLC指紋圖譜。所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖23所示的圖譜。
3.2共有峰確定丹參指紋圖譜通過紫外吸收曲線的比較及液質(zhì)聯(lián)用定性確定7號峰為隱丹參酮、8號峰為丹參酮I、10號峰為丹參酮IIA。
3.3指紋圖譜精密度試驗取同一個丹參藥材溶液連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示儀器的精密度很好，相似度均大于0.80。

3.4指紋圖譜穩(wěn)定性試驗取一個編號的藥材樣品溶液，分別在0、4、8、12、24、48小時進樣，檢測指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示樣品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下

3.5指紋圖譜重現(xiàn)性試驗

取同一批丹參藥材6份，按藥材樣品溶液制備項下方法制備，分別進樣，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價。結(jié)果顯示樣品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度結(jié)果如下相似度評價本品的指紋圖譜與共有模式圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》比較，相似系數(shù)應(yīng)不得低于0.80。
丹參指紋圖譜270nm相似度結(jié)果

實施例5黃芪HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法1、儀器與試藥1.1儀器電子分析天平；超聲波清洗器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；超純水器；ODS固相萃取小柱；液相色譜儀；高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)的色譜儀；紫外檢測器；質(zhì)譜檢測器。
色譜柱①Merck Lichrospher Rp-18e5μm，250×4.0mm；②Agilent Hypersil5μm，250×4.0mm；③依利特Lichrosorb Rp-18e5μm，250×4.6mm；④迪馬Diamonsil C185μm，250×4.6mm；⑤大連依利特Hypersil C185μm，250×4.0mm1.2試藥樣品均為廣東眾生藥業(yè)股份有限公司投產(chǎn)藥材，為藥典規(guī)定的品種，按《中國藥典》收載的藥材標準進行檢驗，均為合格藥材。
2、方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相水(％)85～43∶乙腈(％)15～57；線性梯度洗脫；T(min)0～180；檢測波長270nm；柱溫30℃。
3、指紋圖譜測定3.1指紋圖譜制備復(fù)方血栓通膠囊成分之一的黃芪HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法包括以下步驟(1)供試品溶液的制備取黃芪粉末約1g，精密稱定，加70％甲醇20ml，超聲處理2次，每次30分鐘，濾過，濾液減壓回收溶劑至近干，用水2ml溶解樣品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液棄去，用10ml甲醇分次洗脫，洗脫液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液；(2)高效液相色譜分析精密吸取供試品溶液20μl進樣，色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相水(％)85~43∶乙腈(％)15～57；線性梯度洗脫；T(min)0～180；柱溫30℃；檢測波長270nm；得到黃芪HPLC指紋圖譜。所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖25所示的圖譜。
3.2共有峰確定精密吸取供試品溶液20μl，進樣，按上述項下色譜條件進行測定，應(yīng)有如下共有峰

以上所述僅為本發(fā)明專利的較佳實施例，凡依本發(fā)明專利要求范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利權(quán)利要求的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征是它包括以下步驟(1)供試品溶液的制備精密稱取復(fù)方血栓通制劑0.1g～10.0g，用50％～100％甲醇提取1～3次，每次10～60分鐘，每次10～100ml，濾過，合并濾液，蒸干，適當(dāng)凈化，用甲醇配成供試品溶液；(2)對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、三七皂苷R1、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA、哈帕酯苷適量，加乙腈使溶解，分別制成對照品溶液人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re，三七皂苷R1分別為1mg/ml，隱丹參酮、丹參酮IIA分別為0.2mg/ml，丹參酮I為0.5mg/ml，哈帕酯苷為0.1mg/ml；(3)復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，進樣，用高效液相色譜儀測定，以對照品的色譜峰相對保留時間和峰面積為1，計算供試品的相對保留時間和相對峰面積，即得到復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征是，所述高效液相色譜儀中的色譜柱，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相水∶乙腈，水(％)85～43∶乙腈(％)15～57；線性梯度洗脫；T(min)0～180；柱溫10～50℃；檢測波長203nm，270nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征是，供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價，各檢測波長下的相似度均大于0.80。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征是，其成分之一的三七、玄參、黃芪、丹參四味藥材的HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，與復(fù)方血栓通制劑具有相同的檢測條件并分別得到各自藥材的指紋圖譜。
5.一種利用權(quán)利要求1所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的HPLC指紋圖譜，其特征是所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜在203nm下歸屬于三七的指紋圖譜具有10個特征峰；歸屬于黃芪的指紋圖譜具有2個特征峰；歸屬于丹參的指紋圖譜具有2個特征峰；歸屬于玄參的指紋圖譜具有3個特征峰；在270nm下歸屬于丹參的指紋圖譜具有3個特征峰；歸屬于玄參的指紋圖譜具有1個特征峰；所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖1、圖2所示的圖譜。
6.一種利用權(quán)利要求1所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的HPLC指紋圖譜，其特征是所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜203nm的共有峰為〔1〕、〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔7〕、〔8〕、〔11〕、〔14〕、〔17〕、〔31〕、〔39〕11個峰；其中歸屬于三七的共有峰為〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔14〕、〔17〕5個峰；歸屬于玄參的共有峰為〔1〕、〔8〕2個峰；歸屬于黃芪的共有峰為〔7〕、〔11〕2個峰；歸屬于丹參的共有峰為〔31〕、〔39〕2個峰；所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖1所示的圖譜；所述復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜270nm的共有峰為〔2〕、〔4〕、〔5〕、〔6〕4個峰，歸屬于玄參的共有峰為〔2〕號峰；歸屬于丹參的共有峰為〔4〕、〔5〕、〔6〕3個峰。所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖2所示的圖譜。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的HPLC指紋圖譜，其特征是，由HPLC指紋圖譜各指紋特征峰共同組成了復(fù)方血栓通制劑的指紋圖譜特征，可以完整的對復(fù)方血栓通制劑所含的4味植物藥材作出色譜鑒定。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的HPLC指紋圖譜，其特征是，利用DAD檢測器對主要峰進行峰純度檢查，通過UV吸收曲線的比較確定203nm1號峰為安格洛苷，2號峰為三七皂苷R1、3號峰為人參皂苷Rg1、4號峰為人參皂苷Re、14號峰為人參皂苷Rb1、8號峰為哈帕酯苷、31號峰為隱丹參酮、39號峰為丹參酮IIA；270nm2號峰為哈帕酯苷、4號峰為隱丹參酮、5號峰為丹參酮I、6號峰為丹參酮IIA。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于制劑的劑型是任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及以天然植物藥材原料制成的復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括供試品溶液的制備；對照品溶液的制備；用高效液相色譜儀測定，以對照品的色譜峰相對保留時間和峰面積為1，計算供試品相對保留時間和相對峰面積，即得到復(fù)方血栓通制劑HPLC指紋圖譜。并由此方法所得到的復(fù)方血栓通制劑HPLC標準指紋圖譜在203nm下歸屬于三七的指紋圖譜具有5個共有峰；歸屬于黃芪的指紋圖譜具有2個共有峰；歸屬于丹參的指紋圖譜具有2個共有峰；歸屬于玄參的指紋圖譜具有2個共有峰；在270nm下歸屬于丹參的指紋圖譜具有3個共有峰；歸屬于玄參的指紋圖譜具有1個共有峰；所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖1、圖2所示的圖譜。
文檔編號G01N33/60GK1670529SQ200510033778
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月28日
發(fā)明者蘇薇薇, 龍超峰, 白楊, 謝稱石, 彭維, 杜靜, 王永剛 申請人:廣東眾生藥業(yè)股份有限公司