專利名稱：鏈霉素免疫層析半定量試紙檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品中一種抗生素殘留檢測(cè)方法，特別是一種鏈霉素半定量試紙檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
抗生素殘留是全世界畜禽養(yǎng)殖中普遍存在的問題，其中鏈霉素是一種比較常見的殘留抗生素。鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，其在治療家畜革蘭氏陰性菌和結(jié)核桿菌感染性疾病中發(fā)揮了重要作用，但其殘留物毒副作用比較大。為了加強(qiáng)獸藥殘留管理工作，保證畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年修訂了《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》，其中規(guī)定牛奶中鏈霉素的最高殘留限量為200μg/kg，對(duì)牛、羊、豬、雞等動(dòng)物肌肉、脂肪、肝臟、腎臟中鏈霉素殘留也有規(guī)定了相應(yīng)限量。
對(duì)鏈霉素殘留的檢測(cè)目前主要采用高效液相色譜法(HPLC)。然而，由于氨基糖苷類抗生素缺少發(fā)色基團(tuán)，應(yīng)用到HPLC時(shí)常要對(duì)其衍生化，樣品前處理繁瑣，測(cè)定方法相當(dāng)復(fù)雜，需受過專門訓(xùn)練的人員才能操作，檢測(cè)通量很小。在我國(guó)目前動(dòng)物養(yǎng)殖分散經(jīng)營(yíng)的情況下，很難統(tǒng)一管理，因此造成動(dòng)物源性食品的質(zhì)量很難一致，單純采用大型儀器檢測(cè)監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量，很不現(xiàn)實(shí)，而且儀器檢測(cè)費(fèi)用高，很難普及使用。國(guó)外對(duì)鏈霉素殘留的檢測(cè)普遍采用快速篩選檢測(cè)結(jié)合儀器確證的方法，我國(guó)在大量樣品快速篩選檢測(cè)技術(shù)方面上研究不多。微生物抑制法是一種較為常用的抗生素篩選檢測(cè)方法，其主要原理是根據(jù)抗微生物藥對(duì)特異微生物的抑制作用來檢測(cè)受檢樣品中殘留的抗微生物藥，主要包括杯碟法、紙片法、瓊脂擴(kuò)散法和氯化三苯基四氮唑法，雖然目前仍在使用，但這些方法特異性差，耗時(shí)費(fèi)力，測(cè)定結(jié)果誤差很大。ELISA法是另一種目前研究較多的抗生素篩選檢測(cè)方法，具有靈敏度高、檢測(cè)量大、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但該方法也需酶標(biāo)儀等部分實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，分析時(shí)間一般1-4小時(shí)，仍有一定局限性。因此，目前我國(guó)相應(yīng)的鏈霉素檢測(cè)技術(shù)并不很完備，很有必要研究更加簡(jiǎn)單快捷方便的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于研制出簡(jiǎn)便、靈敏、價(jià)格低廉的鏈霉素免疫層析半定量試紙檢測(cè)方法。
本發(fā)明在試紙的背襯上依次貼有樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分、吸水部分。膠體金部分為玻璃纖維或醋酸纖維或尼龍膜，其上標(biāo)記的物質(zhì)為第二種屬動(dòng)物蛋白與鏈霉素抗體的混合物，或第二種屬動(dòng)物蛋白與鏈霉素檢測(cè)用抗原的混合物。檢測(cè)反應(yīng)部分上面包被有鏈霉素檢測(cè)用抗原1-3條作為檢測(cè)線，或包被有鏈霉素抗體1-3條作為檢測(cè)線，同時(shí)還包被有抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG 1-3條作為參考線。檢測(cè)線和參考線組合時(shí)不能同時(shí)多于1條，組合線條數(shù)為2-4條，組合方式為1條檢測(cè)線+1條參考線、1條檢測(cè)線+2條參考線、1條檢測(cè)線+3條參考線、2條檢測(cè)線+1條參考線、3條檢測(cè)線+1條參考線五種形式。根據(jù)半定量檢測(cè)的準(zhǔn)確度要求，組合線數(shù)越多，半定量越準(zhǔn)確。
本發(fā)明中檢測(cè)用抗原是指鏈霉素與載體物質(zhì)形成的偶合物，其中載體物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽、半合成多肽、多糖，如血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖，示例性的載體物質(zhì)包括牛血清白蛋白、卵清白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、甲狀腺球蛋白、L-多聚賴氨酸等。另外，載體物質(zhì)也可以是具有活性基團(tuán)的其他合成或天然聚合物，如白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、酵母、尼龍、右旋葡聚糖、纖維素等，同樣也可以用來制備檢測(cè)用抗原。第二種屬動(dòng)物蛋白指非抗體來源屬動(dòng)物的蛋白，例如，抗體為鼠源性，則第二種屬動(dòng)物蛋白可以是卵清白蛋白、兔血清白蛋白等雞、兔或其他非鼠源性動(dòng)物蛋白。
本發(fā)明所描述的試紙的各部分處理與功能如下背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。
樣液吸收部分制備將濾紙或玻璃纖維紙浸入pH7.0-8.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即作為樣液吸收部分，檢測(cè)時(shí)起吸收樣品溶液的作用，便于樣品溶液向上移動(dòng)。
膠體金標(biāo)記部分的制備該部分起固定膠體金標(biāo)記的抗原或抗體的作用。制備步驟包括膠體金溶膠的制備、膠體金標(biāo)記鏈霉素抗體或鏈霉素抗原、膠體金標(biāo)記部分處理。
(1)膠體金溶膠的制備將氯金酸(HAuCL4)用超純水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超純水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加熱至沸騰，加入1-5mL的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱到出現(xiàn)透明的橙紅色為止，即為膠體金溶膠。
(2)膠體金標(biāo)記鏈霉素抗體將鏈霉素單克隆抗體或多克隆抗體和第二種屬動(dòng)物蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)溶解稀釋至2-4mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1-3mL 2-4mg/mL的鏈霉素抗體和1-1.5mL 2-4mg/mL第二種屬動(dòng)物蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-100002mL，振蕩5min，8000-15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)復(fù)溶，以6000-13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)稀釋500-2000倍，產(chǎn)物作為金標(biāo)鏈霉素抗體(GAb)。
(3)膠體金標(biāo)記鏈霉素抗原將鏈霉素檢測(cè)用抗原和第二種屬動(dòng)物蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0-8.4)溶解稀釋至2-4mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1-3mL 2-4mg/mL的檢測(cè)用抗原和1-1.5mL 2-4mg/mL第二種屬動(dòng)物蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-100002mL，振蕩5min，8000-15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)復(fù)溶，以6000-13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)稀釋500-2000倍，產(chǎn)物作為金標(biāo)記的鏈霉素抗原(GAg)。
(4)膠體金標(biāo)記部分處理將GAb或GAg倒入一槽中，將玻璃纖維紙或?yàn)V紙浸入1min，取出，室溫干燥后，即作為膠體金標(biāo)記部分。
檢測(cè)反應(yīng)部分制備用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜30min，取出，37℃烘干，上邊包被1-3條不同濃度的鏈霉素檢測(cè)用抗原線或鏈霉素抗體線作為檢測(cè)線，同時(shí)包被1-3條不同濃度的抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG線作為參考線。當(dāng)膠體金標(biāo)記部分標(biāo)記對(duì)象為鏈霉素抗體和第二種屬動(dòng)物蛋白時(shí)，檢測(cè)線則包被鏈霉素檢測(cè)用抗原；當(dāng)膠體金標(biāo)記部分標(biāo)記對(duì)象為鏈霉素檢測(cè)用抗原和第二種屬動(dòng)物蛋白時(shí)，檢測(cè)線則包被鏈霉素抗體；檢測(cè)線和參考線不能同時(shí)多于1條，組合線數(shù)2-4條。此即為檢測(cè)反應(yīng)部分，該部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。
吸水部分制備將玻璃纖維紙或?yàn)V紙或吸水紙室溫干燥后，即作為吸水部分。該部分主要作用在于將移動(dòng)上來的多余的樣品溶液吸收。
試紙組裝在背襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分和吸水部分，即成鏈霉素免疫層析半定量檢測(cè)試紙。
檢測(cè)原理檢測(cè)原理因膠體金標(biāo)記的對(duì)象不同，而稍有差異。
當(dāng)膠體金標(biāo)記部分的標(biāo)記對(duì)象為鏈霉素抗體和第二種屬動(dòng)物蛋白時(shí)，如果樣品中含有鏈霉素，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收并通過毛細(xì)作用上移到達(dá)膠體金標(biāo)記部分，樣品溶液中的鏈霉素與膠體金標(biāo)記的鏈霉素抗體反應(yīng)形成結(jié)合物，結(jié)合物繼續(xù)上移到檢測(cè)線，因膠體金標(biāo)記的鏈霉素抗體只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，樣品溶液中的鏈霉素與之結(jié)合后，檢測(cè)線上的檢測(cè)用抗原就不能再與膠體金標(biāo)記的鏈霉素抗體結(jié)合，于是檢測(cè)線無色；當(dāng)樣品中沒有鏈霉素時(shí)，膠體金標(biāo)記的鏈霉素抗體到達(dá)檢測(cè)線時(shí)被檢測(cè)用抗原捕獲，則形成肉眼可見紅色，此即為陰性。無論樣品中是否含有鏈霉素，膠體金標(biāo)記的第二種屬動(dòng)物蛋白上移到達(dá)參考線時(shí)都可被參考線上包被的抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅色，此即為參考線。
當(dāng)膠體金標(biāo)記部分的標(biāo)記對(duì)象為鏈霉素檢測(cè)用抗原和第二種屬動(dòng)物蛋白時(shí)，如果樣品中含有鏈霉素，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收并通過毛細(xì)作用上移，樣品中的游離鏈霉素分子量小移動(dòng)速度快，先到達(dá)檢測(cè)線，先與檢測(cè)線上包被的鏈霉素抗體結(jié)合，因檢測(cè)線上包被的鏈霉素抗體只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而且樣品中游離的鏈霉素結(jié)合能力比偶合態(tài)的鏈霉素檢測(cè)用抗原強(qiáng)，于是膠體金標(biāo)記的檢測(cè)用抗原不能再被檢測(cè)線上的鏈霉素抗體捕獲，于是檢測(cè)線無色，此即為陽性；如果樣品中無鏈霉素，則膠體金標(biāo)記的鏈霉素檢測(cè)用抗原到達(dá)檢測(cè)線后就被檢測(cè)線上包被的鏈霉素抗體捕獲，形成肉眼可見的紅色，此即為陰性。無論樣品中是否含有鏈霉素，膠體金標(biāo)記的第二種屬動(dòng)物蛋白上移到達(dá)參考線時(shí)都可被參考線上包被的抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅色，此即為參考線。
以上兩種方式的試紙，在試紙制備時(shí)通過調(diào)節(jié)檢測(cè)線和參考線包被物濃度，控制檢測(cè)時(shí)檢測(cè)線和參考線的顯色深淺，并將其顯色深淺或顯色條數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對(duì)應(yīng)起來，即可達(dá)到半定量檢測(cè)目的。


圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1為樣液吸收部分、2為膠體金標(biāo)記部分、3為檢測(cè)反應(yīng)部分、4為檢測(cè)線、5為參考線、6為吸水部分。
具體實(shí)施例方式(1)1條檢測(cè)線+1條參考線形式的試紙檢測(cè)線包被有濃度為0.1-30μg/mL的鏈霉素單克隆抗體或鏈霉素檢測(cè)用抗原1條，寬1mm；參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG 1條，寬1mm；兩條線之間間隔2-6mm。當(dāng)檢測(cè)線顏色與參考線顏色相同時(shí)，則樣品為陰性；當(dāng)檢測(cè)線比參考線顏色淺時(shí)，則樣品為陽性，濃度大于Aμg/kg，A為設(shè)定的檢測(cè)限，可以是大于或等于10μg/kg的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(2)2條檢測(cè)線+1條參考線形式的試紙2條檢測(cè)線包被有0.01-30μg/mL鏈霉素單克隆抗體或鏈霉素檢測(cè)用抗原，第2條檢測(cè)線上包被物的濃度小于第1條檢測(cè)線參考線包被物濃度；參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG，寬1mm；各條線之間間隔2-6mm。當(dāng)兩條檢測(cè)線都呈現(xiàn)顏色時(shí)，則樣品為陰性；當(dāng)檢測(cè)線第1條檢測(cè)線呈色，第2條檢測(cè)線不呈色時(shí)，則樣品中鏈霉素濃度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；當(dāng)兩條檢測(cè)線都不呈色時(shí)，樣品中鏈霉素濃度大于Bμg/kg。A、B為設(shè)定的檢測(cè)限，可以是大于或等于10μg/kg的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(3)3條檢測(cè)線+1條參考線形式的試紙3條檢測(cè)線包被有0.01-30μg/mL鏈霉素單克隆抗體或鏈霉素檢測(cè)用抗原，三條檢測(cè)線上包被物的濃度依次遞減；參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG；各條線之間間隔2-6mm。當(dāng)3條檢測(cè)線都呈現(xiàn)顏色時(shí)，則樣品為陰性；當(dāng)檢測(cè)線第1，2條檢測(cè)線呈色，第3條檢測(cè)線不呈色時(shí)，則樣品中鏈霉素濃度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；當(dāng)?shù)?條檢測(cè)線呈色，第2，3條檢測(cè)線都不呈色時(shí)，樣品中鏈霉素濃度大于Bμg/kg，小于Cμg/kg；當(dāng)3條檢測(cè)線都不呈色時(shí)，樣瓶中鏈霉素含量大于Cμg/kg；A、B、C為設(shè)定的檢測(cè)限，可以是大于或等于10μg/kg的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(4)1條檢測(cè)線+3條參考線形式的試紙檢測(cè)線上包被有0.01-30μg/mL鏈霉素單克隆抗體或鏈霉素檢測(cè)用抗原，檢測(cè)線之后包被有3條參考線，參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG，調(diào)節(jié)參考線包被物濃度和膠體金標(biāo)記的第2種屬動(dòng)物蛋白的標(biāo)記濃度，使3條參考線的顏色分別與標(biāo)準(zhǔn)樣品中鏈霉素含量為C、B、Aμg/kg時(shí)檢測(cè)線的顏色相同，依此確定參考線包被物濃度；各條線之間間隔2-6mm；當(dāng)檢測(cè)線顏色深于第3條參考線顏色時(shí)，表明樣品為陰性；當(dāng)檢測(cè)線顏色深于第3條參考線顏色淺于第2條檢測(cè)時(shí)，表明樣品中鏈霉素濃度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；當(dāng)檢測(cè)線顏色深于第2條參考線顏色淺于第1條參考線時(shí)，表明樣品中鏈霉素濃度大于Bμg/kg，小于Cμg/kg；當(dāng)檢測(cè)線不呈色時(shí)，表明樣品中鏈霉素濃度大于Cμg/kg。
(5)1條檢測(cè)線+2條參考線形式的試紙檢測(cè)線上包被有0.01-30μg/mL鏈霉素單克隆抗體或鏈霉素檢測(cè)用抗原，檢測(cè)線之后包被有2條參考線，參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG，調(diào)節(jié)參考線包被物濃度和膠體金標(biāo)記的第2種屬動(dòng)物蛋白的標(biāo)記濃度，使2條參考線的顏色分別與標(biāo)準(zhǔn)樣品中鏈霉素含量為B、Aμg/kg時(shí)檢測(cè)線的顏色相同，依此確定參考線包被物濃度；各條線之間間隔2-6mm；當(dāng)檢測(cè)線顏色深于第2條參考線顏色時(shí)，表明樣品為陰性；當(dāng)檢測(cè)線顏色深于第2條參考線顏色淺于第1條檢測(cè)時(shí)，表明樣品中鏈霉素濃度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；當(dāng)檢測(cè)線顏色深于第1條參考線顏色淺于第1條參考線時(shí)，表明樣品中鏈霉素濃度大于Bμg/kg。
下邊以1條檢測(cè)線+2條參考線結(jié)合方式為例進(jìn)一步說明鏈霉素偶合抗原合成鏈霉素偶合抗原分為免疫用抗原和檢測(cè)用抗原，前者用于免疫動(dòng)物，后者用于抗體制備中抗體的檢測(cè)篩選和試紙制備中的膠體金標(biāo)記或檢測(cè)線包被。
免疫用抗原制備將500mg牛血清白蛋白溶解在10mL碳酸鹽緩沖液中，(pH11.2，0.5mol/L)，加入100mg 1，4-丁二醇雙縮水甘油醚，室溫?cái)嚢柽^夜，將反應(yīng)液離心(1500r/min，15min)，棄上清，加入PBS(0.1mol/L，pH7.8)10mL，再離心一次，補(bǔ)充PBS(0.1mol/L，pH7.8)10mL，精確稱取硫酸鏈霉素22mg，加入，混合，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，反應(yīng)液用PBS(0.1mol/L，pH7.8)透析48h，離心(10000r/min，15min)mL，上清調(diào)整濃度至2mg/mL，分裝，即得鏈霉素免疫用抗原。
檢測(cè)用抗原用卵清白蛋白OVA取代牛血清白蛋白BSA，其余步驟同免疫用抗原制備。
鏈霉素單克隆抗體制備取健康5周齡雌性二級(jí)Balb/c小鼠6只進(jìn)行免疫。第一次基礎(chǔ)免疫將0.1mL鏈霉素免疫用抗原與等量完全弗氏佐劑用攪拌器充分混勻乳化，進(jìn)行腹腔注射，注射量0.2mL/只。四周后開始進(jìn)行加強(qiáng)免疫，佐劑換為不完全弗氏佐劑，每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，末次免疫3d后取脾臟融合。
先將HAT培養(yǎng)液、IMDM不完全培養(yǎng)液、IMDM完全培養(yǎng)液和50％PEG-6000溶液于37℃水浴中預(yù)溫，同時(shí)將另一盛水的燒杯放入37℃水浴中預(yù)溫。將上述制備好的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞按1∶5的比例混合，在50mL塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200r/min離心8min，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。置37℃水浴中，將吸管插入管底，在90s內(nèi)邊攪拌邊加入預(yù)熱的1mL、50％PEG-6000。靜置90s后，于37℃水浴中60s內(nèi)加入10mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)液。輕輕懸浮一次，以1000r/min離心6min，棄去上清，先用6mL左右完全培養(yǎng)液輕輕懸浮。根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)液到76.8mL，輕輕混勻，將混勻懸液接種于有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，每孔0.1mL，一次接種8塊板。將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后7d，用HT培養(yǎng)液半量換液1次，在13d后根據(jù)增殖情況改用20％NBS的完全培養(yǎng)液。約7d后出現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞集落，細(xì)胞大、圓且透亮。待集落長(zhǎng)至孔底1/3時(shí)，在培養(yǎng)板的蓋板上畫上克隆生長(zhǎng)的標(biāo)記，此時(shí)即可取上清檢測(cè)相應(yīng)的特異性抗體。細(xì)胞完全克隆化后，將細(xì)胞注入小鼠腹腔，間隔一段時(shí)間等腹水足夠多時(shí)，取腹水，將腹水用蛋白A免疫親和層析純化后，即得到鏈霉素單克隆抗體。
樣液吸收部分處理將濾紙或玻璃纖維紙等浸入0.1mol/L pH7.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即成樣液吸收部分。
膠體金標(biāo)記部分的制備和處理膠體金標(biāo)記部分的制備和處理包括膠體金溶膠制備、膠體金標(biāo)鏈霉素抗體、膠體金標(biāo)記部分處理。
膠體金溶膠制備將氯金酸(HAuCL4)用超純水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超純水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加熱至沸騰，加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱到出現(xiàn)透明的橙紅色為止，即為膠體金溶膠。
膠體金標(biāo)記鏈霉素單克隆抗體制備將鏈霉素單克隆抗體和豬血清白蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀釋至3mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1mL 4mg/mL的鏈霉素單克隆抗體和1mL 2mg/mL豬血清白蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-100002mL，振蕩5min，15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)復(fù)溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.5)稀釋1000倍，產(chǎn)物作為金標(biāo)鏈霉素單克隆抗體。
膠體金標(biāo)記部分處理將金標(biāo)鏈霉素單克隆抗體倒入一槽中，將玻璃纖維紙或?yàn)V紙浸入1min，取出，室溫干燥或真空冷凍干燥，即成為膠體金標(biāo)記部分。
1條檢測(cè)線+2條參考線組合形式的試紙檢測(cè)反應(yīng)部分處理用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜30min，取出，37℃烘干，上邊用噴涂機(jī)噴涂包被1條鏈霉素檢測(cè)用抗原線作為檢測(cè)線，濃度為3μg/mL；包被2條羊抗豬血清白蛋白的IgG線作為參考線，靠近下端的濃度為2μg/mL，另一條為1μg/mL。此即為檢測(cè)反應(yīng)部分，檢測(cè)線和參考線組合形式為1條檢測(cè)線+2條參考線。
吸水部分處理及試紙組裝將吸水紙室溫干燥后，即作為吸水部分。
在背襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分和吸水部分，即成組合形式為1條檢測(cè)線+2條參考線的鏈霉素快速半定量檢測(cè)試紙。
檢測(cè)牛奶樣給試紙檢測(cè)部分直接滴2滴牛奶，約100μL，2min后，觀察顏色。若2條檢測(cè)線都呈現(xiàn)顏色，表明樣品為陰性；若第1條檢測(cè)線呈色，第2條不呈色，則表明樣品中鏈霉素含量為80μg/kg以上；若第1條檢測(cè)線與第2條檢測(cè)線都不顯色，則表明樣品中鏈霉素含量為190μg/kg以上。無論樣品中鏈霉素含量如何，參考線應(yīng)該顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
動(dòng)物肝臟、腎臟、肌肉等組織樣品移去脂肪的10g組織樣搗碎，加入30mL PBS(0.01mo/L pH7.4)中，在80℃孵育30min，然后置于冰浴10min，離心，小心去除表面的脂肪層，上清作為檢測(cè)液。余下操作同牛奶樣。
其他組合形式的試紙檢測(cè)方法與前類似，不再贅述。
本發(fā)明的積極效果①特異性強(qiáng)。該試紙檢測(cè)方法特異性極強(qiáng)，與青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、磺胺二甲嘧啶、氯霉素、紅霉素等藥物基本沒有交叉反應(yīng)，避免了其它藥物對(duì)檢測(cè)的干擾，但與二氫鏈霉素交叉反應(yīng)率達(dá)到98％以上，這使得該試紙可以同時(shí)檢測(cè)鏈霉素和二氫鏈霉素單一藥物或混合藥物，符合農(nóng)業(yè)部同時(shí)檢測(cè)鏈霉素和二氫鏈霉素混合藥物的要求。
②靈敏度高。盡管我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的牛奶中鏈霉素、二氫鏈霉素最大殘留量為200μg/kg，但如果需要，也可根據(jù)檢測(cè)要求在制備試紙時(shí)提高檢測(cè)下限，本試紙最低檢測(cè)限為10ug/kg。
③能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測(cè)。本檢測(cè)方法不但能夠定性檢測(cè)，更重要的的是根據(jù)檢測(cè)線顏色與參考線顏色對(duì)比或根據(jù)檢測(cè)線呈色條數(shù)達(dá)到半定量檢測(cè)目的。
④操作簡(jiǎn)單方便。對(duì)牛奶、動(dòng)物尿液可直接檢測(cè)，肉類等組織樣品簡(jiǎn)單處理后即可檢測(cè)。本試紙不需任何專業(yè)培訓(xùn)，不需任何儀器設(shè)備，普通非專業(yè)人員都可操作，只要將試紙插入檢測(cè)液中，用肉眼判讀。因此，本方法適用面寬，衛(wèi)生檢驗(yàn)監(jiān)督部門、動(dòng)物養(yǎng)殖單位、屠宰場(chǎng)以及消費(fèi)者個(gè)人均可使用。
⑤速度快，通量大，顏色穩(wěn)定。試紙插入樣液中，3min以后便可觀察結(jié)果，一個(gè)人可以同時(shí)、連續(xù)檢測(cè)，檢測(cè)通量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HPLC法，比鏈霉素ELISA試劑盒檢測(cè)速度則快40-160倍以上，并且其顏色可永久保存，而不會(huì)象ELISA底物那樣很快就變色。
⑥溫度適宜范圍寬。在4-40℃均可使用，結(jié)果正常，不需在低溫下進(jìn)行，不需采取保溫措施，室內(nèi)野外均可使用。
⑦試紙保質(zhì)期長(zhǎng)。據(jù)加速老化試驗(yàn)結(jié)果，干燥條件下試紙保質(zhì)期可達(dá)2年。
⑧成本低廉。本方法檢測(cè)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于鏈霉素ELISA試劑盒檢測(cè)法，隨著規(guī)?；a(chǎn)后，其成本還會(huì)大幅度降低。
權(quán)利要求
1.鏈霉素免疫層析半定量試紙檢測(cè)方法，在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分及吸水部分，其特征在于膠體金標(biāo)記部分被標(biāo)記的物質(zhì)為第二種屬動(dòng)物蛋白與鏈霉素抗體的混合物，或第二種屬動(dòng)物蛋白與鏈霉素檢測(cè)用抗原的混合物，檢測(cè)反應(yīng)部分上面包被有鏈霉素檢測(cè)用1-3條作為檢測(cè)線，或包被有鏈霉素抗體1-3條作為檢測(cè)線，同時(shí)包被有抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG1-3條作為參考線，檢測(cè)線和參考線組合時(shí)不能同時(shí)多于1條，組合線數(shù)為2-4條；各種組合形式的試紙，在試紙制備時(shí)通過調(diào)節(jié)檢測(cè)線和參考線包被物濃度，控制檢測(cè)時(shí)檢測(cè)線和參考線的顯色深淺，并將其顯色深淺或顯色條數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對(duì)應(yīng)起來，達(dá)到半定量檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測(cè)方法，其特征在于鏈霉素檢測(cè)用抗原為鏈霉素與載體物質(zhì)形成的偶合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說的載體物質(zhì)，為蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或合成多肽或半合成多肽或多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測(cè)方法，其特征在于第二種屬動(dòng)物蛋白質(zhì)為非抗體來源屬動(dòng)物的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測(cè)方法，其特征在于檢測(cè)線和參考線的組合方式為1條檢測(cè)線和1條參考線、1條檢測(cè)線和2條參考線、1條檢測(cè)線和3條參考線、2條檢測(cè)線和1條參考線、3條檢測(cè)線和1條參考線5種形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鏈霉素免疫層析半定量試紙檢測(cè)方法。本方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分及吸水部分。檢測(cè)反應(yīng)部分上包被有鏈霉素抗體1－3條或檢測(cè)用抗原1－3條作為檢測(cè)線，同時(shí)包被有抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG 1－3條作為參考線，組合時(shí)檢測(cè)線和參考線不能同時(shí)多于1條，組合線條數(shù)為2－4條。該快速檢測(cè)試紙條特異性強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測(cè)，4－40℃都可使用，3min以后便可觀察結(jié)果，適合于衛(wèi)生、質(zhì)監(jiān)、海關(guān)、家畜養(yǎng)殖場(chǎng)等單位或個(gè)人對(duì)牛奶、肉類等樣品中的鏈霉素藥物進(jìn)行快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/77GK1811446SQ200510035249
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2005年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月20日
發(fā)明者孫遠(yuǎn)明, 雷紅濤, 黃曉鈺, 王弘, 吳青, 諶國(guó)蓮, 潘科, 肖治理 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)