專利名稱：家蠶成品卵中微粒子病病卵及病卵率的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物病害的檢測方法，具體涉及一種家蠶的微粒子病的檢測方法，尤其是家蠶的成品卵中微粒子病病卵率的分子生物學(xué)檢測方法。
背景技術(shù)：
家蠶微粒子病是由微孢子蟲感染所引起的一種傳染性蠶病，該病具有胚種傳染性，是蠶種生產(chǎn)中威脅最嚴(yán)重的傳染性蠶病。
為了制造無毒蠶種，減少胚種傳染的危險，現(xiàn)有技術(shù)中，通常對母蛾進行檢測。1870年，巴斯德首次提出了母蛾顯微鏡檢驗法，分別對每一母蛾進行檢驗，通過淘汰有毒母蛾所產(chǎn)蠶卵的方法杜絕胚種傳染，該方法在蠶種生產(chǎn)實踐中已應(yīng)用了100多年，對家蠶微粒子病的控制起了不可估量的作用。然而，單蛾檢驗工作量大，時間緊，滿足不了蠶種生產(chǎn)發(fā)展的要求。1968年，日本人提出了集團母蛾檢驗法(30蛾/集團)，根據(jù)概率學(xué)原理計算母蛾的帶毒率，大大提高了檢測效率，減輕了勞動強度，縮短了檢測時間。1979年日本農(nóng)林水產(chǎn)省編的《微粒子病檢查指南》中規(guī)定病蛾率0.5％為危險率。80年代初，我國開始采用集團母蛾檢驗方法，1997年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布桑蠶一代雜交種檢驗規(guī)程(NY/T327-1997)，規(guī)定了母蛾檢驗操作規(guī)程和判別標(biāo)準(zhǔn)。
然而，母蛾檢驗只是蠶種生產(chǎn)過程中的中間檢驗或者可稱為過程檢驗，并不能正確反映蠶種的帶毒率。一方面，蠶種的帶毒率不僅與母蛾的帶毒率有關(guān)，而且與母蛾的微粒子病的感染時期、發(fā)病時期、發(fā)病的嚴(yán)重程度、蠶品種有關(guān)，用母蛾帶毒率表達蠶種的帶毒率不夠科學(xué)；另一方面，由于經(jīng)濟利益的驅(qū)動，采用過程檢驗方法，蠶種生產(chǎn)企業(yè)送檢母蛾難以保證其代表性。因此，用種單位、蠶種檢驗部門要求進行成品卵檢驗的呼聲越來越高。
農(nóng)業(yè)部在桑蠶一代雜交種檢驗規(guī)程(NY/T327-1997)中也頒布了家蠶成品卵檢驗的規(guī)定和判別標(biāo)準(zhǔn)，該規(guī)程規(guī)定1個檢驗集團為100粒左右蠶卵，采用顯微鏡鏡檢法，根據(jù)有無微孢子蟲判別該集團是否帶毒。然而，在實踐中，該方法操作比較困難。在蠶卵中，微孢子蟲的數(shù)量遠(yuǎn)低于母蛾中的數(shù)量，采用顯微鏡鏡檢法，其檢出率遠(yuǎn)低于母蛾中微孢子蟲的檢出率，錯判率高，并且，對檢測人員的技術(shù)水平要求高。為解決這一問題，現(xiàn)有技術(shù)中，將蠶卵催青孵化，對蟻蠶進行檢驗，由此可以判定成品卵的帶毒率。但這一過程通常需要10天左右，檢驗周期長，有時難以滿足實際成產(chǎn)需要；同時，對蟻蠶進行顯微鏡鏡檢，通常只能檢出孢子狀態(tài)的微孢子蟲，必須用特殊的染色方法，才能檢出裂殖子狀態(tài)的微孢子蟲，因而實際操作中得出的成品卵帶毒率并不準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一發(fā)明目的是提供一種檢測靈敏度高、檢測周期短的家蠶成品卵中微粒子病病卵的檢測方法；本發(fā)明的第二發(fā)明目的是提供一種檢測靈敏度高、檢測周期短的家蠶成品卵中微粒子病病卵率的檢測方法。
為實現(xiàn)本發(fā)明的第一發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案是一種家蠶成品卵中微粒子病病卵的檢測方法，首先提取待檢家蠶成品卵內(nèi)的總DNA；根據(jù)家蠶微孢子蟲的基因的特異性序列，設(shè)計并合成一對特異性引物，二引物之間的間隔為0.5-2.0kb，以提取的待檢家蠶成品卵內(nèi)的總DNA為模板，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，當(dāng)檢出家蠶微孢子蟲的特異性基因片段時，判定待檢家蠶成品卵為微粒子病病卵。
上述技術(shù)方案中，與現(xiàn)有的顯微鏡鏡檢法主要依靠人工觀測不同，采用的是分子生物學(xué)的檢測方法，由于目前家蠶微孢子蟲的許多基因序列片段均已明了，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)引物設(shè)計規(guī)律，即可設(shè)計、制備針對某一基因序列片段的特異性引物；當(dāng)然，為保證檢測結(jié)果的正確性，選定的微孢子蟲的特異性引物，應(yīng)當(dāng)與蠶的DNA序列無特異性；同時，擴增片段的長度即特異引物間的間隔會影響到檢測，選取特異引物間的間隔過短，難以用普通瓊脂糖電泳法進行鑒別，必須采用復(fù)雜的電泳檢測方法，例如聚丙烯凝膠電泳法，造成檢測成本過大，選取特異引物間的距離過長，又會導(dǎo)致PCR擴增時所需時間過長，因此確定引物之間的間隔在0.5-2.0kb之間。
上述技術(shù)方案中，對待檢家蠶成品卵先進行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括，用堿液處理15-30分鐘，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；所述總DNA的提取過程包括，在蠶卵中加入微孢子蟲發(fā)芽誘導(dǎo)液，勻漿后常溫下誘導(dǎo)0.5小時至2小時，再用發(fā)芽緩沖液處理至少20分鐘，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白質(zhì)，抽提分離，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用無水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；所述特異性引物長度在15-30bp，所述對擴增產(chǎn)物的檢測方法采用瓊脂糖凝膠電泳法。預(yù)處理的目的，一方面是使蠶卵的卵殼軟化，以便于DNA的提取，另一方面可以使蠶自身的DNA發(fā)生降解，減少蠶自身DNA對PCR的干擾；由于微孢子蟲在蠶卵中可處于孢子狀態(tài)，其DNA的提取不便，易導(dǎo)致檢測靈敏度降低，為解決這一問題，由微孢子蟲發(fā)芽誘導(dǎo)液先進行誘導(dǎo)，再用發(fā)芽緩沖液處理，可促使微孢子蟲發(fā)芽形成芽體，從而便于對其DNA的提取。對于蛋白酶K處理過后的抽提分離可用飽和酚、酚/氯仿的混合物、氯仿抽提；對RNA降解后的抽提通常采用酚/氯仿的混合物。
為實現(xiàn)本發(fā)明的第二發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案是一種家蠶成品卵中微粒子病病卵率的檢測方法，包括下列步驟(1)蠶卵的預(yù)處理取80-120粒家蠶成品卵為一個集團，用堿液處理15-30分鐘，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；(2)DNA的提取在上述處理過的蠶卵中加入微孢子蟲發(fā)芽誘導(dǎo)液，勻漿后常溫下誘導(dǎo)0.5小時至2小時，再用發(fā)芽緩沖液處理至少20分鐘，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白質(zhì)，抽提分離，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用無水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；(3)PCR擴增根據(jù)家蠶微孢子蟲的基因序列片段，選擇制備對應(yīng)的一對特異性引物，引物長度在15-30bp，2個引物間的間隔在0.5-2.0kb，用步驟2獲取的DNA為模板，按常規(guī)方法進行PCR擴增；(4)進行瓊脂糖凝膠電泳取上述PCR擴增后的產(chǎn)物，在含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠中進行電泳；(5)電泳結(jié)果判定電泳完成后，在紫外燈下觀察瓊脂糖膠，當(dāng)觀察到家蠶微孢子蟲特異性的DNA條帶時，認(rèn)定該被檢集團為陽性；(6)獲取家蠶成品卵中微粒子病的病卵率對每一被檢集團按上述步驟l至5進行檢測，病卵率由下式確定，
式中，N為1個集團中蠶卵的粒數(shù)。
上述技術(shù)方案中，所述預(yù)處理中的堿液為25-35％的氫氧化鉀溶液；酸液為l摩爾/升的鹽酸；在堿液和酸液處理后分別用水清洗。
上述技術(shù)方案中，所述微孢子蟲的發(fā)芽誘導(dǎo)液選自，0.1摩爾/升的碳酸鉀與0.1摩爾/升的碳酸氫鉀的混合物，0.2摩爾/升的氫氧化鐘，或者是0.01摩爾/升的氫氧化鉀與0.16摩爾/升的氯化鉀的混合物；所述發(fā)芽緩沖液選自，0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值6.8-7.2)，或者pH值為8.0的TEK緩沖液(0.16摩爾/升的氯化鉀，1毫摩爾/升的Tris-HCl，10毫摩爾/升的EDTA)。
由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點1.由于本發(fā)明采用分子生物學(xué)方法，通過檢測微孢子蟲的基因序列實現(xiàn)對微粒子病病卵率的測定，可以對家蠶成品卵直接進行檢測，蠶卵無需催青至孵化，檢測周期短，能夠滿足用種單位的需求；2.本發(fā)明的檢測靈敏度高，經(jīng)實驗證實，樣品中只要有4個微孢子即可檢出，300粒蠶卵中帶有一粒有毒蠶卵也可檢出3.本發(fā)明的蠶卵經(jīng)過預(yù)處理后，蠶卵易勻漿，同時，經(jīng)堿液處理后，可較好地降解蠶的基因組，減少蠶基因組DNA對PCR擴增的干擾，并可提高所提取的DNA的質(zhì)量；4.蠶卵用微孢子蟲發(fā)芽誘導(dǎo)液、發(fā)芽緩沖液處理，可以促進蠶卵中的微孢子蟲發(fā)芽，提高微孢子蟲DNA的得率。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例一家蠶成品卵中微粒子病病卵的檢測。
(1)取50粒待檢家蠶成品卵，在室溫下用25％氫氧化鉀(KOH)0.3毫升處理20分鐘，用水清洗2次，再用0.3毫升1摩爾/升的鹽酸(HCl)中和處理5分鐘，再用水清洗2次；(2)DNA的提取，包括，在上述處理過的蠶卵中加入0.0l摩爾/升的氫氧化鉀與0.16摩爾/升的氯化鉀的混合物0.3毫升，作為微孢子蟲發(fā)芽誘導(dǎo)液，勻漿后常溫下誘導(dǎo)0.5小時，再用pH為8.0的TEK緩沖液作為發(fā)芽緩沖液，處理40分鐘，棄上清，沉淀用0.3毫升的蛋白酶K(終濃度為50微克/毫升)在50℃下消化蛋白質(zhì)30分鐘，用飽和酚抽提分離，再用RNA酶(終濃度為0.01毫克/毫升)降解RNA，用酚/氯仿抽提去除RNA酶后，用預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA，抽干后，將DNA溶于水中；(3)根據(jù)GenBank上已公開的家蠶微孢子蟲16S rRNA基因序列(登記號為U11047)，設(shè)計一對引物，分別為，Nb55’-CACCAGGTTGATTCTGCC-3’；和Nb35’-TTATGATCCTGCTAATGG-3’，2個引物之間的間隔為1.2kb；將步驟2提純的DNA稀釋20倍，取1微升為模板，Nb5和Nb3為引物，按常規(guī)方法進行PCR擴增；(4)瓊脂糖凝膠電泳取PCR產(chǎn)物于含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠中進行電泳。
(5)電泳完畢后，在紫外燈下觀察，如能觀察到1.2kb的特異性DNA條帶，則認(rèn)定被檢物中含有微孢子蟲。
實施例二家蠶成品卵中微粒子病病卵率的檢測。
(1)蠶卵的預(yù)處理以100粒待檢家蠶成品卵為一個檢驗集團，在25℃下用30％氫氧化鉀(KOH)0.5毫升處理30分鐘，用雙蒸水清洗2次，每次1.2毫升，棄水后，再用0.5毫升1摩爾/升的鹽酸(HCl)中和處理5分鐘，再用雙蒸水清洗2次，每次1.2毫升；(2)DNA的提取，包括，在上述處理過的蠶卵中加入0.1摩爾/升的碳酸鉀(K2CO3)與0.1摩爾/升的碳酸氫鉀(KHCO3)的混合物構(gòu)成的微孢子蟲發(fā)芽誘導(dǎo)液0.5毫升，用滅菌牙簽將蠶卵搗碎，常溫下誘導(dǎo)1小時，在3000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，去上清，加入0.5毫升0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH為7.0)，于25℃下放置60分鐘，再在5000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，棄上清，沉淀用0.5毫升的蛋白酶K(50微克/毫升)在37℃下消化60分鐘，然后用飽和酚、酚/氯仿、氯仿抽提，再用RNA酶(0.01毫克/毫升)于37℃消化60分鐘，酚/氯仿抽提去除RNA酶后，加1/10體積3摩爾/升的醋酸鈉(pH＝5.4)及2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，沉淀DNA，抽干后，將DNA溶于雙蒸水(40微升)中，4℃保存；(3)根據(jù)GenBank上已公開的家蠶微孢子蟲16S rRNA基因序列(登記號為U11047)，設(shè)計一對引物，分別為，Nb55’-CACCAGGTTGATTCTGCC-3’；和Nb35’-TTATGATCCTGCTAATGG-3’，2個引物之間的間隔為1.2kb；
將步驟2提純的DNA稀釋20倍，取1微升為模板，Nb5和Nb3為引物，反應(yīng)總體積為25微升，反應(yīng)體系其它各組份的終濃度如下

各組份混合后，按常規(guī)方法進行PCR擴增，PCR擴增條件為94℃預(yù)變性3.5分鐘后，94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，擴增35個循環(huán)；(4)瓊脂糖凝膠電泳取PCR產(chǎn)物10微升，于含有溴化乙錠(終濃度為50微克/100毫升)的1％瓊脂糖凝膠中進行電泳。電泳條件為電泳緩沖液0.5×TBE(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/L EDTA)電流50毫安；電壓100伏；電泳時間30分鐘(5)電泳完畢后，在紫外燈下觀察瓊脂糖膠，如能觀察到1.2kb的特異性DNA條帶，則認(rèn)定該檢驗集團為陽性，即含有微孢子蟲。
(6)按照上述方法，對某一批次蠶種如共抽樣檢驗100個集團，其中3個集團呈陽性，則該批蠶種微粒子病病卵率按以下公式計算

因此，該批蠶種微粒子病病卵率為0.03％。
實施例三家蠶成品卵中微粒子病病卵率的檢測(1)蠶卵的預(yù)處理同實施例二。
(2)DNA的提取同實施例二。
(3)根據(jù)GenBank上已公開的家蠶微孢子蟲16S rRNA基因序列(登記號為AY616662)，設(shè)計一對引物，分別為，Nb1655’-CGAGTGCCAGCAGCCGCGG -3’；和Nb1635’-GCAACCATGTTACGACTTATATCAGA-3’，2個引物之間的間隔為0.8kb；將步驟2提純的DNA稀釋20倍，取1微升為模板，Nb165和Nb163為引物，反應(yīng)總體積為25微升，反應(yīng)體系其它各組份的終濃度如下

各組份混合后，按常規(guī)方法進行PCR擴增，PCR擴增條件為94℃預(yù)變性3.5分鐘后，94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃50秒，擴增35個循環(huán)；(4)瓊脂糖凝膠電泳取PCR產(chǎn)物10微升，于含有溴化乙錠(終濃度為50微克/100毫升)的1％瓊脂糖凝膠中進行電泳。電泳條件為電泳緩沖液0.5×TBE(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/L EDTA)電流50毫安；電壓100伏；電泳時間30分鐘(5)電泳完畢后，在紫外燈下觀察瓊脂糖膠，如能觀察到0.8kb的特異性DNA條帶，則認(rèn)定該檢驗集團為陽性，即含有微孢子蟲。
(6)按照上述方法，對某一批次蠶種如共抽樣檢驗100個集團，其中4個集團呈陽性，則該批蠶種微粒子病病卵率按以下公式計算

因此，該批蠶種微粒子病病卵率為0.04％。
權(quán)利要求
1.一種家蠶成品卵中微粒子病病卵的檢測方法，其特征在于首先提取待檢家蠶成品卵內(nèi)的總DNA；根據(jù)家蠶微孢子蟲基因的特異性序列，設(shè)計并合成一對特異性引物，二引物之間的間隔為0.5-2.0kb，以提取的待檢家蠶成品卵內(nèi)的總DNA為模板，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，當(dāng)檢出家蠶微孢子蟲的特異性基因片段時，判定該被檢家蠶成品卵為微粒子病病卵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶成品卵中微粒子病病卵的檢測方法，其特征在于對待檢家蠶成品卵先進行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括，用堿液處理15-30分鐘，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；所述總DNA的提取過程包括，在蠶卵中加入微孢子蟲發(fā)芽誘導(dǎo)液，勻漿后常溫下誘導(dǎo)0.5小時至2小時，再用發(fā)芽緩沖液處理至少20分鐘，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白質(zhì)，抽提分離，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用無水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；所述特異性引物長度在15-30bp，所述對擴增產(chǎn)物的檢測方法采用瓊脂糖凝膠電泳法。
3.一種家蠶成品卵中微粒子病病卵率的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟(1)蠶卵的預(yù)處理取80-120粒家蠶成品卵為一個集團，用堿液處理15-30分鐘，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；(2)DNA的提取在上述處理過的蠶卵中加入微孢子蟲發(fā)芽誘導(dǎo)液，勻漿后常溫下誘導(dǎo)0.5小時至2小時，再用發(fā)芽緩沖液處理至少20分鐘，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白質(zhì)，抽提分離，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用無水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；(3)PCR擴增根據(jù)家蠶微孢子蟲的基因序列片段，選擇制備對應(yīng)的一對特異性引物，引物長度在15-30bp，2個引物間的間隔在0.5-2.0kb，用步驟2獲取的DNA為模板，按常規(guī)方法進行PCR擴增；(4)進行瓊脂糖凝膠電泳取上述PCR擴增后的產(chǎn)物，在含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠中進行電泳；(5)電泳結(jié)果判定電泳完成后，在紫外燈下觀察瓊脂糖膠，當(dāng)觀察到家蠶微孢子蟲特異性的DNA條帶時，認(rèn)定該被檢集團為陽性；(6)獲取家蠶成品卵中微粒子病的病卵率對每一被檢集團按上述步驟1至5進行檢測，病卵率由下式確定， 式中，N為1個集團中蠶卵的粒數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的家蠶成品卵中微粒子病病卵率的檢測方法，其特征在于所述預(yù)處理中的堿液為25-35％的氫氧化鉀溶液；酸液為1摩爾/升的鹽酸；在堿液和酸液處理后分別用水清洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的家蠶成品卵中微粒子病病卵率的檢測方法，其特征在于所述微孢子蟲的發(fā)芽誘導(dǎo)液選自，0.1摩爾/升的碳酸鉀與0.1摩爾/升的碳酸氫鉀的混合物，0.2摩爾/升的氫氧化鉀，或者是0.01摩爾/升的氫氧化鉀與0.16摩爾/升的氯化鉀的混合物；所述發(fā)芽緩沖液選自，0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，或者pH值為8.0的TEK緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶成品卵中微粒子病病卵的檢測方法，其特征在于首先提取待檢家蠶成品卵內(nèi)的總DNA；根據(jù)家蠶微孢子蟲基因的特異性序列，設(shè)計并合成一對特異性引物，二引物之間的間隔為0.5－2.0kb，以提取的待檢家蠶成品卵內(nèi)的總DNA為模板，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，當(dāng)檢出家蠶微孢子蟲的特異性基因片段時，判定該被檢家蠶成品卵為微粒子病病卵。對家蠶成品卵進行集團檢測，可以確定微粒子病的病卵率。本發(fā)明可以對家蠶成品卵直接進行檢測，蠶卵無需催青至孵化，檢測周期短，檢測靈敏度高，能夠滿足用種單位的需求。
文檔編號G01N27/447GK1687767SQ200510040059
公開日2005年10月26日 申請日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者貢成良, 潘中華, 鄭小堅, 沈衛(wèi)德, 曹廣力, 薛仁宇, 陶維華, 李掌林, 陶鳴, 潘麗芬 申請人:蘇州大學(xué), 江蘇省蠶種管理所