專利名稱：一種簡便可靠的免疫熒光檢測試劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫熒光檢測試劑及其制備方法與應(yīng)用，屬于免疫熒光分析和基因工程應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自標記免疫測定技術(shù)發(fā)展以來，發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用新的標記物一直是免疫測定技術(shù)的主要研究方向之一。開發(fā)和應(yīng)用新的標記物，其目的是為了提高免疫測定的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，使測定過程簡單化、快速化。
在免疫測定中，用酶或熒光物質(zhì)標記抗體/抗原是必需的。傳統(tǒng)的標記方法是將指示物通過化學交聯(lián)法耦聯(lián)到抗體/抗原分子上(如將酶通過具有雙功能或多功能化學基團的交聯(lián)劑結(jié)合到蛋白分子上，最為常用的有過碘酸鈉、戊二醛等)。但這種方法有其缺點大量的抗體或抗原分子、酶作為反應(yīng)物參加耦合；需純化步驟才可獲得抗體-酶耦合物；交聯(lián)后酶活性時常降低；而且在測定過程中因隨機結(jié)合引發(fā)的空間位阻的干擾而影響免疫測定的靈敏度。
基因工程已是一項重要的生物技術(shù)。利用DNA重組技術(shù)在基因水平將標記物與抗體/抗原重組，使之表達為具有雙功能或多功能的融合蛋白分子，即以融合的方式標記抗體/抗原，表達出的融合蛋白既有抗體/抗原活性又有標記物活性的新型免疫親和試劑。利用基因工程技術(shù)直接將抗體或抗原與標記物(如酶)以融合的方式表達，不但避免了繁瑣且低效率的酶與蛋白質(zhì)的化學交聯(lián)，而且無需得到純化的酶和抗體或抗原。
自1994年GFP基因被克隆成功以來，其作為生物標記分子有著巨大的應(yīng)用潛力，主要因為它具有以下特性(1)種屬不依賴性，原核、真核細胞中都可表達為有活性的GFP；(2)熒光的產(chǎn)生不需要反應(yīng)底物與輔助因子；(3)相對較小的分子和單體蛋白使之易于融合；(4)GFP肽鏈中一些特定氨基酸的替代可使之產(chǎn)生不同顏色的熒光，可適應(yīng)于不同研究的需要；(5)GFP可作為一種非侵入方法(無需細胞通透作用，無毒作用)檢測體內(nèi)基因表達或蛋白標記；(6)它構(gòu)象穩(wěn)定，無光漂白作用，熒光強度高；(7)對一系列與GFP的N端或C端融合蛋白的性質(zhì)研究中，已證明融合蛋白具有GFP的熒光性質(zhì)和配體蛋白質(zhì)的生物功能。
GFP可以在很多物種中高效表達，這些物種包括細菌、哺乳動物、酵母、植物等。GFP發(fā)出熒光不需要外加任何底物或共作用因子，熒光性質(zhì)穩(wěn)定；相對分子質(zhì)量小，對細胞無毒性；作為熒光靶使用方便，可直接用于活體測定。
由于GFP產(chǎn)生熒光不需要加入任何外源底物、酶或其他輔助因子，而且，GFP發(fā)射的熒光用肉眼、紫外燈下或熒光顯微鏡就可以檢測到。GFP作為基因標簽，與其他報告基因如β-半乳糖苷酶(LacZ)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、葡萄糖苷酶基因(GUS)、熒光素酶基因(Luc)等相比，具有直觀、及時、應(yīng)用范圍廣的特點。在轉(zhuǎn)入含GFP質(zhì)粒的細菌中表達GFP或融合蛋白可使菌落呈現(xiàn)綠色，便于篩選，可以代替lacZ′的藍/白斑篩選法，且不需要昂貴的底物。
葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞壁分離出的一種分子量為42000的單一多肽鏈。
SPA具有許多生物學活性如激活補體、促有絲分裂、抑制吞噬等。其中SPA可與人和多種哺乳動物血清中IgG的Fc片段非特異性結(jié)合，且這種結(jié)合不影響Fab片段與抗原特異性結(jié)合的免疫活性，利用這一特性，結(jié)合放射、熒光、酶聯(lián)及免疫電鏡等技術(shù)建立了許多敏感、特異、快速、簡便的實驗方法，用于疾病診斷和其它方面的研究。目前SPA除用于免疫球蛋白和單克隆抗體的純化外，以生物素(biotin)、過氧化物酶(peroxidase)、異硫氰酸熒光素(FITC)、膠體金(colloidal gold)等標記蛋白SPA，在免疫組化、免疫電鏡、Western Blotting和ELISA中得到大量應(yīng)用，被稱為“廣泛二抗”。
但是，在所述的諸多免疫熒光檢測試劑中，將增強型綠色熒光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)基因與葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SPA)基因重組，表達既有EGFP熒光活性又有葡萄球菌蛋白A生物學活性的雙功能蛋白質(zhì)并用于制備免疫熒光檢測試劑和進行免疫測定的研究、開發(fā)和應(yīng)用，經(jīng)檢索，還未見相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種簡便可靠的免疫熒光檢測試劑，目的是將增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因與葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SPA)基因重組，表達既有EGFP熒光活性又有葡萄球菌蛋白A生物學活性的雙功能蛋白質(zhì)。利用EGFP的熒光特性使免疫反應(yīng)呈綠色熒光可以直接觀測，同時利用蛋白A能與多種哺乳動物血清中IgG的Fc非特異性結(jié)合，嘗試建立一種特異、靈敏、簡便和快速的新型免疫親和試劑。
本發(fā)明提供的簡便可靠的免疫熒光檢測試劑，由增強型綠色熒光蛋白與葡萄球菌蛋白A的融合蛋白(ProA-EGFP)組成。
上述免疫熒光檢測試劑由下述方法制得，構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)和葡萄球菌蛋白A(ProA)融合基因表達載體，以大腸桿菌E.coli DH5α菌株表達ProA-EGFP融合蛋白；分離純化ProA-EGFP融合蛋白。
其中，所述綠色熒光蛋白(GFP)基因優(yōu)選是增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)，作用表達載體為pEZZ 18，引物按常規(guī)設(shè)計，用PCR擴增EGFP基因片段；在上游引物中設(shè)計有EcoRI內(nèi)切酶酶切位點，在下游引物中設(shè)計有Pst I內(nèi)切酶酶切位點和6×His序列。
在上述免疫熒光檢測試劑的制備方法中，所述引物是上游引物F1 5′GCACGAATTCT ATG GTGAGCAAGGGCG3′下游引物R1 5′GCTACTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCGTCCA3′
在上述免疫熒光檢測試劑的制備方法中，所述表達菌株優(yōu)選的培養(yǎng)方法是挑取pEZZ-EGFP/E.coli單克隆菌落，接種于LB+Amp液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)10～18小時，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分；之后，取活化的菌液，按體積比1∶10～30的接種量，接于新鮮的LB+Amp液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6后，在培養(yǎng)基中加入終濃度為1％Triton X-100和1％甘氨酸，繼續(xù)以30℃，如上振蕩條件，培養(yǎng)24-36小時，然后常規(guī)條件離心培養(yǎng)液，分離純化培養(yǎng)液上清中的ProA-EGFP融合蛋白；其中上述LB+Amp液體培養(yǎng)基的配方及配制方法是胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，溶于800ml去離子水中，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，1.031Mpa高壓滅菌20min；將高壓滅菌后的LB培養(yǎng)基冷卻至60℃±2℃，加入Amp儲存液，使其終濃度為100μg/ml。
在上述免疫熒光檢測試劑的制備方法中，分離純化ProA-EGFP融合蛋白的方法是對少量樣品純化分析時，采用HisTrap Chelating HP(1ml)手動上樣洗脫；對大量ProA-EGFP融合蛋白制備時，采用HisTrap Chelating HP(5ml)HPLC操作系統(tǒng)。
具體方法如下(1)小量樣品分離純化步驟1)準備七種含有不同咪唑濃度的緩沖液。
結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)中咪唑終濃度為10mM，洗脫緩沖液從A-F(以下簡稱A-F)含有逐漸升高的咪唑梯度濃度。
2)用5ml蒸餾水沖洗柱子，取0.5ml 0.1M的硫酸鎳溶液結(jié)合鎳離子后，再用5ml蒸餾水沖洗柱子。
3)用注射器吸取10ml的Binding Buffer平衡柱子。
4)上樣，收集流通液，流通液重復上柱2次。
5)用10ml Binding buffer沖洗，收集流出部分。
6)用5ml A洗提，每管收集1ml洗出液(下同)。
7)用5ml逐漸提高的咪唑梯度濃度的B-F洗提，重復6。
Binding Buffer是第一步最低的咪唑濃度，Binding buffer中使用較高的咪唑濃度可能能得到更純的蛋白質(zhì)。
8)蛋白質(zhì)洗脫后，再生柱子從步驟3開始?，F(xiàn)在柱子可以重新進行純化，不需要再加金屬離子。柱子的再次使用依賴于純化的樣品的性質(zhì)，僅用來純化一種重組蛋白質(zhì)，避免交叉污染。
9)對目的蛋白質(zhì)濃度最大組分以10000rpm離心超慮脫鹽、濃縮。
10)12％SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白質(zhì)。
(2)目的蛋-ProA-EGFP融合蛋白的大量純化制備HisTrap Chelating HP(5ml)處理同上；操作按HPLC系統(tǒng)說明書。流速1ml/min；紫外、熒光檢測儀同時檢測紫外檢測波長為280nm，熒光檢測波長Ex＝489nm/Em＝511nm。每一咪唑梯度都洗脫至(紫外、熒光)檢測儀基線水平(1-2個柱體積)。收集紫外、熒光最大洗脫峰。對目的蛋白質(zhì)濃度最大組分以10000rpm離心超慮脫鹽、濃縮。12％SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白質(zhì)。
上述ProA-EGFP融合蛋白的檢測(1)ProA-EGFP融合蛋白的熒光光譜測定采用F-250日立熒光分光光度計(HITCHI)對純化的ProA-EGFP進行熒光激發(fā)光譜、熒光發(fā)射光譜測定(狹縫5nm×5nm)。
(2)ProA-EGFP融合蛋白的免疫學活性測定采用競爭ELISA測定方法。
經(jīng)交叉試驗法確定包被用抗體、一抗和SPA-HRP最佳工作度。
ProA-EGFP融合蛋白ELISA競爭法的建立1)將山羊IgG抗體用包被稀釋液稀釋后(500ng/ml)包被酶標反應(yīng)板，每孔100μl，4℃溫育過夜，用PBST洗滌3次，每次3min。
2)每孔加入封閉液200μl，于37℃封閉酶標反應(yīng)板1h，PBST洗滌3次，每次3min。
3)每孔加入兔抗山羊IgG抗體(1μg/ml)100μl，于37℃反應(yīng)結(jié)合1h，PBST洗滌3次，每次3min。
4)將待測樣品(ProA-EGFP融合蛋白)適當梯度稀釋后，每樣品加雙孔用于測定過程，每孔加入50μl，再加入SPA-HRP(1∶2000)50μl；對照雙孔各加入SPA-HRP(1∶2000)100μl和樣品稀釋液100μl，于37℃反應(yīng)結(jié)合30-60min，PBST洗滌3次，每次3min。
5)每孔加入TMB底物液100μl，37℃避光顯色10-15min，當對照孔出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)時，每孔加入終止液50μl，于20min內(nèi)測定結(jié)果。
6)結(jié)果測定用酶標儀讀數(shù)，雙波長450/620nm，讀取各孔OD值。
7)數(shù)據(jù)處理以未加ProA-EGFP融合蛋白(加入ProA-HRP)的孔為空白孔，計算百分抑制率(B0-B)/B0％(B0值，即只加SPA-HRP不加ProA-EGFP孔的A450/620；B值，即加入不同稀釋度的ProOA-EGFP與SPA-HRP孔的A450/620)。以ProA-EGFP稀釋度的負對數(shù)(-LogX)為橫坐標，百分抑制率(B0_B)/B0％為縱坐標，繪制ProA-EGFP融合蛋白抑制標準曲線。
本發(fā)明以EGFP作標記物融合標記蛋白A，得到既能發(fā)射熒光又具有“抗體”活性的雙功能融合蛋白，參加抗原抗體反應(yīng)，利用EGFP的熒光特性使免疫反應(yīng)呈綠色熒光從而可以直接觀測，無需顯色步驟，使免疫檢測過程更為簡便、快速，同時也避免了傳統(tǒng)標記技術(shù)中需要分離、純化、化學計量等復雜的過程。由于反應(yīng)體系中無游離標記物的存在，使本底降低，為開發(fā)新型免疫親和試劑提供依據(jù)。
鑒于此，本發(fā)明所述的簡便可靠的免疫熒光檢測試劑在制備免疫學診斷或檢測試劑中，特別是在制備細胞免疫組化診斷或檢測試劑中具有廣泛的應(yīng)用。
利用本發(fā)明所述的免疫熒光檢測試劑-ProA-EGFP融合蛋白進行免疫熒光測試，EGFP在紫外光照射下能夠發(fā)射熒光的特性和ProA與免疫球蛋白G(IgG)的非特異性親和作用，能夠特異和準確地檢測和指示IgG與其抗原(包括此IgG的抗原和第一抗體)的免疫親和反應(yīng)，真正實現(xiàn)了檢測過程的直觀、方便、快捷、準確。
在具體的免疫檢測工作中，利用本發(fā)明涉及的ProA-EGFP融合蛋白一種試劑可以替代現(xiàn)行免疫檢測試劑盒中的兩種以上試劑，且操作更加簡便，穩(wěn)定性、靈敏性和可靠性更好，尤其適用于采用熒光分析儀器進行的如藥物篩選等高通量分析。


圖1ProA-EGFP融合蛋白咪唑梯度洗脫HPLC圖譜圖具體實施方式
實施例1ProA-EGFP融合蛋白的制備方法1.構(gòu)建增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)和葡萄球菌蛋白A(ProA)融合基因表達載體，以大腸桿菌E.coli DH5α菌株表達ProA-EGFP融合蛋白；分離純化ProA-EGFP融合蛋白。
其中作用表達載體為pEZZ 18，引物是上游引物F1 5′GCACGAATTCT ATG GTGAGCAAGGGCG3′下游引物R1 5′GCTACTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCGTCCA3′用PCR擴增EGFP基因片段；在上游引物中設(shè)計有EcoR I內(nèi)切酶酶切位點，在下游引物中設(shè)計有Pst I內(nèi)切酶酶切位點和6×His序列。
2.上述生產(chǎn)ProA-EGFP融合蛋白的培養(yǎng)條件挑取pEZZ-EGFP/E.coli單克隆菌落，接種于LB+Amp(100μg/ml)液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，取活化的菌液以1/10的接種量接于新鮮的LB+Amp(100μg/ml)液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，30℃振蕩培養(yǎng)OD600至0.4-0.6(約6-8h)后，在培養(yǎng)基中加入終濃度1％Triton X-100及1％甘氨酸，繼續(xù)30℃振蕩培養(yǎng)30-36h。培養(yǎng)液離心，提取純化培養(yǎng)上清中的ProA-EGFP。
其中上述LB+Amp液體培養(yǎng)基的配方及配制方法是胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，溶于800ml去離子水中，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，1.031Mpa高壓滅菌20min；將高壓滅菌后的LB培養(yǎng)基冷卻至60℃，加入Amp儲存液，使其終濃度為100μg/ml。
3.ProA-EGFP融合蛋白的分離純化上清液通過0.45μm的濾膜去除細胞碎片及其他物質(zhì)。使用高效液相色譜進行分離純化色譜柱HisTrap Chelating HP(5mL)；流速1mL/min；紫外檢測波長280nm，熒光檢測波長Ex＝489nm/Em＝511nm；室溫；咪唑梯度洗脫。收集紫外、熒光最大洗脫峰。對目的蛋白質(zhì)濃度最大組分以10000rpm離心超濾脫鹽、濃縮，得純化ProA-EGFP融合蛋白。
高效液相分離純化圖譜見圖1。
實施例2蛋白A-綠色熒光蛋白(ProA-EGFP)融合蛋白在免疫酶斑點檢測中的應(yīng)用采用免疫酶斑點測定方法(Dot-ELISA)。
1、蛋白A-辣根過氧化物酶(ProA-HRP)對照實驗a.取NC膜用鉛筆作好加樣方格(5mm×5mm)并作好相應(yīng)標記。
b.將膜浸入0.01mol/L PH7.4的PBS中15～30min，取出用濾紙吸干。
c.將要包被的抗體(兔IgG抗體)0.01mol/L PH7.4的PBS稀釋至工作濃度。
d.加樣1μl于相應(yīng)格內(nèi)，室溫自然干燥。
e.將膜片放入封閉液中振蕩封閉30min。
f.將膜片放入洗滌液中振蕩洗滌3次，每次30min。
g.用濾紙吸干，將膜片放入酶標記抗體(ProA-HRP，1∶2000)溶液中，室溫振蕩30min。
h.將膜片放入洗滌液中振蕩洗滌4次，每次30min。
i.將膜片浸入底物溶液中，在振蕩條件下顯色，一般在15min左右顯色充分，用藍色DAB系統(tǒng)底物時顯色呈藍灰色。
j.用流水沖洗數(shù)分鐘，放入蒸餾水中終止反應(yīng)。
k.結(jié)果判斷可根據(jù)有無顯色反應(yīng)判斷結(jié)果為陽性或陰性。對于需要作半定量判斷的實驗，須與同一次實驗中不同濃度的標準品的灰色深度作比較判斷。
2、ProA-EGFP融合蛋白檢測步驟a-f，同1中a-f。
h.用濾紙吸干，將膜片放入Pro-EGFP(工作濃度約為1mg/ml)溶液中，室溫振蕩30min。
i.將膜片放入洗滌液中振蕩洗滌4次，每次30min。
j.將膜片置于紫外燈(365nm)下觀察。
結(jié)果可根據(jù)有無綠色熒光判斷結(jié)果為陽性或陰性。對于需要作半定量判斷的實驗，須與同一次實驗中不同濃度的標準品的顏色深度作比較判斷。
實施例3Pro-EGFP融合蛋白在細胞免疫組化中的應(yīng)用肌動蛋白(Actin)，是細胞微絲的主要成分，而微絲又是構(gòu)成細胞骨架的主要成分。在所有細胞，尤其是肌細胞中高表達。本實驗選擇體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)細胞作為實驗細胞，以兔抗大鼠Actin多抗為一抗，標記神經(jīng)細胞；以ProA-EGFP來代替經(jīng)典標記的二抗，目的是檢測ProA-EGFP的染色效果。
1、熒光抗體染色實驗a.固定將培養(yǎng)有細胞的飛片取出，0.1M PBS沖洗3次，每次5min；4％多聚甲醛固定15-20min；0.1M PBS沖洗3次，每次5min。
b.增強膜透性用0.3％Triton X-100處理20min；0.1M PBS沖洗3次，每次5min。
c.封閉用正常山羊血清封閉，37℃，40min；d.在被檢標本上滴加第一抗體液，并將其放入濕盒中，4℃過夜。
e.PBS沖洗3次，每次10min。
f.滴加ProA-EGFP工作液，37℃，30min。
h.PBS沖洗3次，每次10min。
i.封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。
同時，設(shè)立陰性對照實驗，不加一抗(兔抗大鼠Actin多抗)，其他操作步驟相同。
結(jié)果熒光顯微鏡下肌動蛋白呈現(xiàn)為綠色熒光，陰性對照無熒光。
實施例4ProA-EGFP融合蛋白在Dot-ELISA中的應(yīng)用將純化ProA-EGFP(1mg/ml)倍比稀釋(20，1，2…)至濃度分別為200ng/μl、100ng/μl、50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl，分別將200ng、100ng、50ng、25ng、12.5ng(1μl)點樣NC膜；在紫外燈(365nm)照射下，可觀察到25ng點樣點發(fā)出的綠色熒光。
取5μl兔IgG抗體(1mg/0.25ml)，加到195μl PBS中，倍比稀釋(20，1，2…)至濃度分別為100ng/μl、50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl、6.25ng/μl和3.13ng/μl，各取1μl包被于NC膜上；則IgG的包被量分別為100ng、50ng、25ng、12.5ng、6.25ng和3.13ng。
以ProA-HRP為酶標抗體和藍色DAB系統(tǒng)底物顯色，可檢測到6.25ng的兔IgG；利用ProA-EGFP檢測，在紫外燈(365nm)下可檢測到50ng的兔IgG。
權(quán)利要求
1.一種簡便可靠的免疫熒光檢測試劑，由增強型綠色熒光蛋白與葡萄球菌蛋白A的融合蛋白(ProA-EGFP)組成。
2.權(quán)利要求1所述的簡便可靠的免疫熒光檢測試劑由下述方法制得，構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)和葡萄球菌蛋白A(ProA)融合基因表達載體，以大腸桿菌E.coli DH5α菌株表達ProA-EGFP融合蛋白；分離純化ProA-EGFP融合蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的簡便可靠的免疫熒光檢測試劑的制備方法，其特征是，所述綠色熒光蛋白(GFP)基因是增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)，作用表達載體為pEZZ 18，引物按常規(guī)設(shè)計，用PCR擴增EGFP基因片段；在上游引物中設(shè)計有EcoR I內(nèi)切酶酶切位點，在下游引物中設(shè)計有Pst I內(nèi)切酶酶切位點和6×His序列。
4.權(quán)利要求2所述的簡便可靠的免疫熒光檢測試劑的制備方法，其特征是，所述表達菌株的培養(yǎng)方法是挑取pEZZ-EGFP/E.coli單克隆菌落，接種于LB+Amp液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)10～18小時，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分；之后，取活化的菌液，按體積比1∶10～30的接種量，接于新鮮的LB+Amp液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6后，在培養(yǎng)基中加入終濃度為1％Triton X-100和1％甘氨酸，繼續(xù)以30℃，如上振蕩條件，培養(yǎng)24-36小時，然后常規(guī)條件離心培養(yǎng)液，分離純化培養(yǎng)液上清中的ProA-EGFP融合蛋白；其中上述LB+Amp液體培養(yǎng)基的配方及配制方法是胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，溶于800ml去離子水中，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，1.031Mpa高壓滅菌20min；將高壓滅菌后的LB培養(yǎng)基冷卻至60℃±2℃，加入Amp儲存液，使其終濃度為100μg/ml。
5.如權(quán)利要求3所述的簡便可靠的免疫熒光檢測試劑的制備方法，其特征是，所述引物是上游引物F1 5′GCACGAATTCT ATG GTGAGCAAGGGCG3′下游引物R1 5′GCTACTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCGTCCA3′
6.權(quán)利要求1所述的簡便可靠的免疫熒光檢測試劑在制備免疫學診斷或檢測試劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的簡便可靠的免疫熒光檢測試劑在制備細胞免疫組化診斷或檢測試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種簡便可靠的免疫熒光檢測試劑，由增強型綠色熒光蛋白與葡萄球菌蛋白A的融合蛋白(ProA－EGFP)組成。同時還公開了該試劑的制備方法，即構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)和葡萄球菌蛋白A(ProA)融合基因表達載體，以大腸桿菌E.coli DH5α菌株表達ProA－EGFP融合蛋白；分離純化ProA－EGFP融合蛋白。本發(fā)明的免疫熒光檢測試劑在制備免疫學診斷或檢測試劑中具有廣泛的應(yīng)用。利用本發(fā)明的ProA－EGFP融合蛋白試劑可以替代現(xiàn)行免疫檢測試劑盒中的兩種以上試劑，且操作更加簡便，穩(wěn)定性、靈敏性和可靠性更好，尤其適用于采用熒光分析儀器進行的高通量分析。
文檔編號G01N33/533GK1731181SQ20051004429
公開日2006年2月8日 申請日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者吉愛國, 唐金寶, 梁浩 申請人:山東大學