專利名稱：一種同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞內(nèi)活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)，具體地說(shuō)是一種同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
活性氧(ROS)與還原型谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的兩類重要信號(hào)分子，與細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)?；钚匝踔饕侵赣赏庠葱匝趸瘎┗蚣?xì)胞內(nèi)有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一類具有很高生物活性的氧分子，如O2-，NO，H2O2，OH等。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)、細(xì)胞缺氧、受損或細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧過(guò)量生成。還原型谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)含量最多的一種強(qiáng)還原劑，主要功能在于可清除體內(nèi)過(guò)量的活性氧類物質(zhì)，防止蛋白巰基氧化，并維持細(xì)胞內(nèi)的氧化-還原平衡。對(duì)細(xì)胞活性氧和還原型谷胱甘肽進(jìn)行測(cè)定是研究氧自由基與應(yīng)激反應(yīng)、及與人類疾病相關(guān)性的重要指標(biāo)。
目前用于活性氧和還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜(HPLC)，熒光法，酶學(xué)法以及流式細(xì)胞儀等。這些方法雖各有所長(zhǎng)，但總體而言，所需樣品用量大，靈敏度不高，且不能對(duì)兩種物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。微流控芯片(又稱芯片實(shí)驗(yàn)室)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)嶄新的分析技術(shù)，它能將生化反應(yīng)過(guò)程中的不同操作單元基本集成在一塊只有幾平方厘米大小的芯片上完成，具有分析速度快、樣品用量小、易于集成等特點(diǎn)，被稱為21世紀(jì)最為重要的前沿技術(shù)之一。原則上它適用于對(duì)核酸、蛋白和小分子等的分離分析，并有可能用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜組分如活性氧和還原型谷胱甘肽的分析測(cè)定。利用微流控芯片對(duì)細(xì)胞活性氧和還原型谷胱甘肽進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種樣品用量少、檢測(cè)靈敏度較高、可同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，本發(fā)明在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩種物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定，分析時(shí)間僅用27秒，樣品用量非常少(3-4uL)，且檢測(cè)靈敏度較高(amol-zmol)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，采用微流控芯片對(duì)細(xì)胞活性氧和還原型谷胱甘肽同時(shí)測(cè)定，微流控芯片電泳采用的緩沖液濃度為20-50mM，緩沖液pH值為8.0-10.1，分離電壓為200-450V/cm，檢測(cè)點(diǎn)距進(jìn)樣通道和分離通道交叉處為1.0-3.0cm。
具體操作內(nèi)容包括微流控芯片設(shè)計(jì)，細(xì)胞內(nèi)活性氧與谷胱甘肽熒光標(biāo)記和提取方法，微流控芯片電泳分離條件和微流控芯片激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)方法。
本發(fā)明以微流控芯片為技術(shù)平臺(tái)，以微流控芯片-激光誘導(dǎo)熒光為檢測(cè)手段，所選激光激發(fā)波長(zhǎng)為473nm，檢測(cè)波長(zhǎng)520nm；采用探針DHR-123和NDA分別來(lái)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)活性氧和還原型谷胱甘肽，采用有機(jī)溶劑(高氯酸和乙晴混合液)來(lái)提取細(xì)胞內(nèi)活性氧和還原型谷胱甘肽；所述高氯酸和乙晴混合液的重量濃度為3.3％高氯酸與乙腈按體積比1∶1混合，其中高氯酸與乙晴的體積比為1∶1微流控芯片的芯片材料可采用玻璃、石英或其它芯片材料；芯片設(shè)計(jì)最好采用雙T型結(jié)構(gòu)，樣品進(jìn)樣采用夾切方式來(lái)確保進(jìn)樣容積的準(zhǔn)確性；緩沖液可為磷酸緩沖液、硼砂緩沖液等，最好為硼砂緩沖液；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為1.本發(fā)明的檢測(cè)方法樣品用量非常少(3-4uL)，在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩種物質(zhì)(細(xì)胞內(nèi)活性氧和還原型谷胱甘肽)的同時(shí)測(cè)定，分析時(shí)間僅用27秒，且檢測(cè)靈敏度較高(amol-zmol)，所優(yōu)化的微流控芯片電泳條件適用范圍較寬(主要包括緩沖液濃度，pH值，電泳進(jìn)樣和分離電壓等條件)。
2.本發(fā)明提供了一通用型的細(xì)胞活性氧和還原型谷胱甘肽的芯片檢測(cè)方法，適用于引起機(jī)體氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)變化的監(jiān)測(cè)，并可適用于不同類型細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞、紅細(xì)胞、神經(jīng)元及胚胎等的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作方便易行，具有可操作性。


圖1為本發(fā)明所采用微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明微流控芯片激光誘導(dǎo)熒光光路設(shè)計(jì)圖；圖3為NB4細(xì)胞中活性氧和還原型谷胱甘肽的微流控芯片電泳圖；圖4為K562細(xì)胞中活性氧和還原型谷胱甘肽的微流控芯片電泳圖，其中坐標(biāo)分別代表相對(duì)熒光強(qiáng)度(mV)和遷移時(shí)間(s)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例
1.微流控芯片設(shè)計(jì)本發(fā)明實(shí)施所采用微流控芯片設(shè)計(jì)如下圖1所示，所采用玻璃芯片為雙T型結(jié)構(gòu)，圖中四個(gè)圓孔分別代表不同溶液池，其中2為緩沖液進(jìn)樣池，4為緩沖液廢液池，1為樣品池，3為樣品廢液池，5為檢測(cè)點(diǎn)。芯片的分離通道長(zhǎng)8.5cm(從緩沖液池至十字交叉處為0.5cm，從十字交叉處至分離廢液池為8.0cm)，進(jìn)樣通道長(zhǎng)為1.0cm(從樣品池至十字交叉處和從十字交叉處至樣品廢液池均為0.5cm)，通道的橫截面近似為半橢圓形，上寬為50μm，檢測(cè)點(diǎn)距十字交叉處為1.0cm。
2.微流控芯片激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器微流控芯片-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器所選用激光激發(fā)波長(zhǎng)為473nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm，采用單點(diǎn)共聚焦檢測(cè)方式，微流控芯片激光誘導(dǎo)熒光光路設(shè)計(jì)圖見(jiàn)圖2，其中6為物鏡，7為半反半透鏡，8為分光鏡，9為第一帶通濾光片，10為凸透鏡，11為針孔，12為光電倍增管，13為芯片，14為第二帶通濾光片，15為激光，16為電感耦合器件。
3.細(xì)胞樣品制備以人急性早幼粒白細(xì)胞系NB4細(xì)胞為例，細(xì)胞培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于5％CO2培養(yǎng)箱37度培養(yǎng)。收集細(xì)胞，于1000rpm離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS溶液(pH 7.4)重懸后離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)后待用。
4.細(xì)胞內(nèi)活性氧和還原型谷胱甘肽熒光標(biāo)記和提取方法分別采用DHR-123和NDA對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧和還原型谷胱甘肽進(jìn)行熒光標(biāo)記，針對(duì)活性氧，DHR-123標(biāo)記濃度為20-30uM。由于NDA與還原型谷胱甘肽反應(yīng)很快，實(shí)驗(yàn)中將NDA加入運(yùn)行緩沖液中達(dá)終濃度0.1-0.5mM來(lái)動(dòng)態(tài)標(biāo)記谷胱甘肽。實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞密度在1×105/mL左右，首先將20uM的DHR-123染料加入細(xì)胞培養(yǎng)液中作用20-30分鐘，然后將細(xì)胞懸液用PBS洗滌三次(800轉(zhuǎn)，6分鐘)，棄上清，保留沉淀，然后加入與沉淀部分等體積的的高氯酸/乙晴混合液(3.3％)，經(jīng)高速(12,000轉(zhuǎn))離心5分鐘。后棄上清，再重復(fù)上述步驟兩次，保留細(xì)胞沉淀，待檢。
5.微流控片電泳分離條件每次運(yùn)行前，需要將芯片通道分別用水、0.1M氫氧化鈉和緩沖液進(jìn)行沖洗。上樣時(shí)盡量保持4個(gè)緩沖池液面處于同一水平位置，然后插入電極。見(jiàn)圖1，在進(jìn)樣過(guò)程中，將樣品廢液池3接地，施加+200V電壓于樣品池1，緩沖液池2和緩沖廢液池4分別施加150V和600V電壓，進(jìn)樣時(shí)間12s。分離過(guò)程中，緩沖廢液池4接地，樣品池1和樣品廢液池3分別施加2kV電壓，在緩沖池2上施加+3kV電壓。首先對(duì)微流控芯片電泳分離條件如緩沖液、pH、分離電壓等條件進(jìn)行考察。經(jīng)優(yōu)化選擇的電泳條件為硼砂緩沖液20-50mM，緩沖液pH值范圍8.0-10.1，分離電壓200-450V/cm。
6.應(yīng)用實(shí)例圖3和圖4分別為NB4細(xì)胞和K562細(xì)胞中活性氧和還原型谷胱甘肽的微流控芯片電泳圖，電泳圖中峰1和峰2分別代表細(xì)胞活性氧和還原型谷胱甘肽。整個(gè)分離時(shí)間僅用27s，實(shí)際樣品消耗量?jī)H用3-4uL，且檢測(cè)靈敏度較高。表1為微流控芯片檢測(cè)活性氧和谷胱甘肽的主要性能指標(biāo).表中可見(jiàn)其檢測(cè)靈敏度較高，對(duì)活性氧和谷胱甘肽檢測(cè)可達(dá)pmol和amol水平。
表1.微流控芯片檢測(cè)活性氧和還原型谷胱甘肽的主要性能指標(biāo)(Table 1.Linearity，reproducibility，and detection limits of ROS and GSH)

權(quán)利要求
1.一種同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，其特征在于采用微流控芯片對(duì)細(xì)胞活性氧和還原型谷胱甘肽同時(shí)測(cè)定，微流控芯片電泳采用的緩沖液濃度為20-50mM，緩沖液pH值為8.0-10.1，分離電壓為200-450V/cm，檢測(cè)點(diǎn)距進(jìn)樣通道和分離通道交叉處為1.0-3.0cm。
2.按照權(quán)利要求1所述同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，其特征在于以微流控芯片為技術(shù)平臺(tái)，以微流控芯片-激光誘導(dǎo)熒光為檢測(cè)手段，所選激光激發(fā)波長(zhǎng)為473nm，檢測(cè)波長(zhǎng)520nm。
3.按照權(quán)利要求1或2所述同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，其特征在于所述微流控芯片為雙T型結(jié)構(gòu)。
4.按照權(quán)利要求1所述同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，其特征在于所述緩沖液為硼砂緩沖液。
5.按照權(quán)利要求1所述同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，其特征在于采用探針DHR-123和NDA分別來(lái)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)活性氧和還原型谷胱甘肽，采用高氯酸和乙晴混合液來(lái)提取細(xì)胞內(nèi)活性氧和還原型谷胱甘肽。
6.按照權(quán)利要求5所述同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，其特征在于所述高氯酸和乙晴混合液的重量濃度為3.3％高氯酸與乙腈按體積比1∶1混合，其中高氯酸與乙晴的體積比為1∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞內(nèi)活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)，具體地說(shuō)是一種同時(shí)測(cè)定細(xì)胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，采用微流控芯片對(duì)細(xì)胞活性氧和還原型谷胱甘肽同時(shí)測(cè)定，微流控芯片電泳采用的緩沖液濃度為20－50mM，緩沖液pH值為8.0－10.1，分離電壓為200－450V/cm，檢測(cè)點(diǎn)距進(jìn)樣通道和分離通道交叉處為1.0－3.0cm。本發(fā)明的檢測(cè)方法樣品用量非常少(3－4uL)，在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧和還原型谷胱甘肽的同時(shí)測(cè)定，分析時(shí)間僅用27秒，且檢測(cè)靈敏度較高(amol－zmol)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1940550SQ20051004728
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者秦建華, 葉囡楠, 姜雷, 謝敏豪, 林炳承 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所