專利名稱：碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，提供了一種碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法。
背景技術：
碼絹金龜Maladera sp.隸屬鞘翅目、絨金龜科、絹絨金龜屬，是取食為害煙草等作物的主要金龜子類害蟲，由于該蟲與其它絹絨金龜屬金龜子形態(tài)特征極相似，目前單純依靠形態(tài)鑒定法尚不能準確鑒定，因此對碼絹金龜?shù)姆诸惾詢H停留在屬上，尚未定種。然而，形態(tài)鑒定法對于形態(tài)極為相似的同屬金龜子則無法準確鑒定，在對于不具備分子生物學實驗條件者來說，分子生物學鑒定法也受到一定的制約，而對于利用核型分析法則尚無成功的染色體制作觀察方法，利用目前現(xiàn)有染色體的制作方法后無法清晰觀察到該蟲的染色體形態(tài)及記數(shù)。

發(fā)明內容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術的不足，提供了一種準確、方便的碼絹金龜染色體的制作觀察方法。
本發(fā)明的步驟是1、取材和預處理將碼絹金龜成蟲固定在解剖蠟盤上，取出精巢，放入0.04～0.06％秋水仙素溶液中處理6～14h，秋水仙素0.1～0.3％的原液保存于冰箱中。
2、溶液配制Giemsa試劑1g，甘油50ml，甲醇50ml，先將Giemsa試劑1g放入研缽中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀，再加入甘油，混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇；3、玻片標本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出，用蒸餾水沖洗，再在解剖鏡下分開每條精巢小管，剔除精巢小管周圍的蛋白質等雜質，先在0.4％KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)內經30～60min后，移入70％酒精內，置于冰箱中，從固定液中取出精巢小管，在載片上放一條精巢小管，用吸水紙吸干，然后用蒸餾水洗3遍，吸干，滴上0.05％秋水仙液一滴，蓋上蓋玻片，輕輕敲擊使精巢小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸，將載玻片直接放在平展的桌面上，取兩層干凈吸水紙蓋在上面，在蓋玻片位置上垂直施壓；4、染色用磷酸緩沖液(PH6.8)將Giemsa(PH6.7～7.0)原液稀釋10倍，染色10～20min；5、鏡檢將制得的玻片標本在顯微鏡下觀察、計數(shù)，碼絹金龜精巢染色體呈短桿狀；其中將碼絹金龜成蟲精巢放入0.04～0.06％秋水仙素溶液中處理10～14小時，在固定液中固定時間為46～60min，染色時間為15～20min。
按照此發(fā)明方法以碼絹金龜成蟲精巢為材料，經過秋水仙素預處理，經KCl溶液低滲處理、固定，用Giemsa染色后，制作觀察碼絹金龜染色體，細胞分裂中期相多，且清晰，因此染色體清晰可見，能準確、直觀記數(shù)染色體的數(shù)量，可用于碼絹金龜染色體核型分析及種類鑒定。
具體實施例方式
實施例一取碼絹金龜成蟲精巢放入0.05％秋水仙素溶液中處理6小時。
秋水仙素溶液濃度為0.1％；Giemsa溶液的配制由Giemsa試劑1g，甘油50ml，甲醇50ml，先將Giemsa試劑1g放入研缽中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀，再加入甘油，混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇。
玻片標本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出，沖洗后在解剖鏡下分成精巢小管，先在0.4％KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)內經30min后，取出精巢小管，在載玻片上放一條精巢小管，滴上0.05％秋水仙液一滴，蓋上干凈的蓋玻片，敲擊使精小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸。
染色用磷酸緩沖液(PH6.8)將Giemsa(PH6.7～7.0)原液稀釋10倍，染色10min，在蓋玻片位置上垂直施壓。
鏡檢玻片標本在顯微鏡下觀察、計數(shù)。
結果碼絹金龜精巢細胞染色體分裂中期細胞，n＝9者占85％，染色體均呈短桿狀。
實施例二取碼絹金龜成蟲精巢，放入0.05％秋水仙素溶液中處理14小時。
秋水仙素溶液濃度為0.3％，Giemsa溶液的配制由Giemsa試劑1g，甘油50ml，甲醇50ml，先將Giemsa試劑1g放入研缽中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀，再加入甘油，混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇。
玻片標本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出，沖洗后在解剖鏡下分成精巢小管，先在0.4％KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)內經60min后，取出精巢小管，在載玻片上放一條精巢小管，滴上0.05％秋水仙液一滴，蓋上干凈的蓋玻片，敲擊使精小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸。
染色用磷酸緩沖液(PH6.8)將Giemsa(PH6.7～7.0)原液稀釋10倍，染色20min，在蓋玻片位置上垂直施壓。
鏡檢玻片標本在顯微鏡下觀察、計數(shù)。
結果碼絹金龜精巢細胞染色體分裂中期細胞，n＝9者占85％，染色體均呈短桿狀。
實施例三取碼絹金龜成蟲精巢，放入0.05％秋水仙素溶液中處理10小時。
秋水仙素溶液濃度為0.2％，Giemsa溶液的配制由Giemsa試劑1g，甘油50ml，甲醇50ml，先將Giemsa試劑1g放入研缽中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀，再加入甘油，混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇。
玻片標本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出，沖洗后在解剖鏡下分成精巢小管，先在0.4％KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)內經45min后，取出精巢小管，在載玻片上放一條精巢小管，滴上0.05％秋水仙液一滴，蓋上干凈的蓋玻片，敲擊使精小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸。
染色用磷酸緩沖液(PH6.8)將Giemsa(PH6.7～7.0)原液稀釋10倍，染色15min，在蓋玻片位置上垂直施壓。
鏡檢玻片標本在顯微鏡下觀察、計數(shù)。
結果；碼絹金龜精巢細胞染色體分裂中期細胞，n＝9者占85％，染色體均呈短桿狀。
權利要求
1.一種碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法，其步驟是(1)取材和預處理將碼絹金龜成蟲固定在解剖蠟盤上，取出精巢，放入0.04～0.06％秋水仙素溶液中處理6～14h，秋水仙素0.1～0.3％的原液保存于冰箱中；(2)溶液配制Giemsa試劑1g，甘油50ml，甲醇50ml，先將Giemsa試劑1g放入研缽中，再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀，再加入甘油，混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇；(3)玻片標本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出，用蒸餾水沖洗，再在解剖鏡下分開每條精巢小管，剔除精巢小管周圍的蛋白質等雜質，先在0.4％KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min，移入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)內經30～60min后，移入70％酒精內，置于冰箱中，從固定液中取出精巢小管，在載片上放一條精巢小管，用吸水紙吸干，然后用蒸餾水洗3遍，吸干，滴上0.05％秋水仙液一滴，蓋上蓋玻片，輕輕敲擊使精巢小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸，將載玻片直接放在平展的桌面上，取兩層干凈吸水紙蓋在上面，在蓋玻片位置上垂直施壓；(4)染色用磷酸緩沖液(PH 6.8)將Giemsa(PH 6.7～7.0)原液稀釋10倍，染色10～20min；(5)鏡檢將制得的玻片標本在顯微鏡下觀察、計數(shù)，碼絹金龜精巢染色體呈短桿狀。
2.根據(jù)權利要求1所述的碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法，其特征是步驟(1)中的碼絹金龜成蟲精巢放入0.04～0.06％秋水仙素溶液中處理10～14小時。
3.根據(jù)權利要求1所述的碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法，其特征是步驟(3)中的在固定液中固定的時間為46～60min。
4.根據(jù)權利要求1所述的碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法，其特征是步驟(4)中的染色時間為15～20min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法，屬于生物技術領域。本發(fā)明的技術方案是以碼絹金龜(Maladera sp.)成蟲精巢細胞為材料，將金龜子精巢用秋水仙素預處理6～14h，經0.4％KCl溶液低滲30min，甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定30～60min，用Giemsa染色10～20min后，獲得的精巢細胞染色體形態(tài)清晰，分散性較好，采用顯微操作技術，獲得了著色清晰的生殖細胞染色體，進行染色體數(shù)目的計數(shù)統(tǒng)計，得到了碼絹金龜染色體數(shù)目n＝9。本發(fā)明的效果用途是能提供碼絹金龜精巢染色體的制作觀察方法，為碼絹金龜精巢染色體形態(tài)觀察和染色體數(shù)計數(shù)提供技術支撐。
文檔編號G01N1/30GK1828296SQ20051004872
公開日2006年9月6日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權日2005年12月22日
發(fā)明者陳斌, 李正躍, 桂富榮, 孫躍先, 嚴乃勝 申請人:云南農業(yè)大學