專利名稱：一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的試劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定血清成分的試劑及制備方法，特別是測(cè)定血清中的低密度脂蛋白中膽固醇的試劑及制備方法，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血清(漿)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與心腦血管疾病的發(fā)生率呈正相關(guān)已經(jīng)流行病學(xué)和相關(guān)臨床證實(shí)，檢測(cè)低密度脂蛋白膽固醇還可廣泛應(yīng)用于相關(guān)的臨床診治，并作為脂類代謝異常的危險(xiǎn)指標(biāo)之一。
對(duì)低密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法有已知的超速離心法和電泳法以及中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司編制的《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第二版281頁(yè))所推薦的Friedewald公式法和聚乙烯硫酸沉淀法。Friedewald公式法雖簡(jiǎn)便，但如果總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)中有一項(xiàng)測(cè)定不準(zhǔn)或當(dāng)甘油三酯大于4.52mmol/L時(shí)，采用該公式法計(jì)算LDL-C的結(jié)果是不準(zhǔn)確的。聚乙烯硫酸沉淀法是用聚乙烯硫酸(PVP)選擇性沉淀血清中的LDL-C，測(cè)定上清液中的膽固醇代表HDL-C和VLDL-C之和，用TC減去上清液膽固醇即得LDL-C的值。上述這些已知的方法由于都不能在全自動(dòng)生化分析儀上直接檢測(cè)，近幾年，直接在全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)的LDL-C試劑也相繼出現(xiàn)，如日本專利6-242110公開了專門測(cè)定目標(biāo)脂蛋白中膽固醇的方法，該方法是使目標(biāo)脂蛋白以外的脂蛋白凝集，來(lái)控制與酶的反應(yīng)，從而測(cè)定目標(biāo)脂蛋白(LDL)，該方法在實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化方面是很有實(shí)用性的，但只能從除HDL外的脂蛋白中分級(jí)分離出的LDL，而不能從VLDL(極低密度脂蛋白)和CM(乳糜微粒)的混合物中定量和分級(jí)測(cè)定LDL，所以還是不能不借助分離手段測(cè)定LDL膽固醇。目前還有利用聚陰離子和二價(jià)金屬鹽復(fù)合物與非測(cè)量脂蛋白形成絮狀復(fù)合物，從而進(jìn)行測(cè)量脂蛋白的測(cè)定，但這些二價(jià)金屬鹽復(fù)合物檢測(cè)完畢后，在全自動(dòng)生化分析儀的排液管道中易與其他堿性試劑廢液反應(yīng)形成沉淀，堵塞管道，對(duì)全自動(dòng)生化分析儀造成不良影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述背景技術(shù)的不足，提供一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的試劑及制備方法的改進(jìn)，該試劑應(yīng)具有檢測(cè)簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、試劑性質(zhì)穩(wěn)定、適用各種型號(hào)的全自動(dòng)生化分析儀的特點(diǎn)。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的試劑，包括適量緩沖液、穩(wěn)定劑和色原，該試劑還包括以下成分A、高親合性酶化合物，該酶化合物，由酶和活化物反應(yīng)而得，其中活化物是甾類糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種與活化劑混合、活化后獲得，化合物的濃度為1-100毫克/毫升，化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶20；所采用的酶是膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶二者摩爾比10∶1-1∶10；上述化合物與酶反應(yīng)時(shí)的摩爾配比為1∶1-20∶1；B、表面活性劑，其加入比例為每升試劑10-50克，所述的表面活性劑是聚氧乙烯月桂基醚、多烷基酚聚氧乙烯月桂胺、烷基聚氧乙烯醚羥丙基磺酸鈉、聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚中的一種或任意比例混合的多種。
所述的緩沖液是GOOD’S緩沖液或磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液或檸檬酸緩沖液或硼酸鹽緩沖液，緩沖液的PH值為5-9，緩沖液的濃度是50-200mmol/L。
該試劑中還有適量催化劑、防腐劑和抗干擾物質(zhì)。
所述的低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑的制備方法包括以下步驟一、化合物活化選擇所述的甾類糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種，在水介質(zhì)中用公知的疊氮法或碳化二亞胺法或丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法進(jìn)行活化，活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶20，溫度0-25℃，PH在3-11范圍內(nèi)，時(shí)間0.1-24小時(shí)；二、酶溶解選擇所述的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，溶解在緩沖液中；三、混合反應(yīng)活化后的活化物與溶解后的酶溶液混合，該溶液在0-25℃的溫度下反應(yīng)18-24小時(shí)；四、配置反應(yīng)后的酶化合物與表面活性劑混合，并加入緩沖液、穩(wěn)定劑、用于顯色測(cè)定的色原和催化劑。
所述的甾類糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素預(yù)先置于以下有機(jī)溶劑混合物中溶解二甲亞砜或甲酰替二甲胺或六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物，或者，甲酰替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物；化合物與有機(jī)溶劑混合物的重量比例為1∶30-1∶0.01。
該試劑中還加入防腐劑和抗干擾物質(zhì)。
本發(fā)明所提供的低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑的制備方法及試劑，能夠直接在各種型號(hào)的全自動(dòng)生化分析儀上對(duì)低密度脂蛋白膽固醇進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需樣本離心、沉淀等繁雜步驟，大幅度減輕了檢測(cè)工作量、減少了檢測(cè)時(shí)間、降低了檢測(cè)成本；試劑的性質(zhì)穩(wěn)定在2-8℃可穩(wěn)定12個(gè)月以上；而且特異性好，檢測(cè)的準(zhǔn)確率較高，與國(guó)家推薦的Friedewald公式法檢測(cè)結(jié)果比較，相關(guān)性達(dá)到0.98以上。


圖1至圖3分別是本發(fā)明的實(shí)施例1至實(shí)施例3的測(cè)得值與《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第二版279頁(yè))所推薦的Friedewald公式法計(jì)算所得值的相關(guān)性示意圖。其中，各圖中的縱坐標(biāo)是Friedewald公式計(jì)算值，橫坐標(biāo)是各實(shí)施例的測(cè)得值。
具體實(shí)施例方式
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)用經(jīng)制備的高親合性膽固醇酯酶化合物和高親合性膽固醇氧化酶化合物以及只選擇性對(duì)低密度脂蛋白膽固醇具有較強(qiáng)作用的表面活性劑配制的試劑用來(lái)測(cè)定經(jīng)超速離心分離出的HDL、LDL、VLDL及CM各組份脂蛋白時(shí)，上述各組份脂蛋白膽固醇的反應(yīng)性顯示出不同。其反應(yīng)性表現(xiàn)為L(zhǎng)DL＞VLDL＞CM＞HDL。
當(dāng)表面活性劑的濃度達(dá)一定時(shí)，HDL、VLDL、CM脂蛋白組分在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不參加測(cè)定LDL的反應(yīng)。也就是在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)只有LDL脂蛋白組份反應(yīng)，因此本發(fā)明得到完成。
由此，本發(fā)明提供了一種低密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，其特征是樣本中的低密度脂蛋白膽固醇在高親合性膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶以及只選擇性對(duì)低密度脂蛋白膽固醇作用的表面活性劑的作用下生成4-膽甾-3-烯酮和過(guò)氧化氫(H2O2)，H2O2在過(guò)氧化物酶作用下與4-氨基安替比林(4-APP)、酚類或苯胺類衍生物反應(yīng)，生成有色的醌類化合物，利用比色分析原理即可在全自動(dòng)生化分析儀上得出樣本中LDL-C的含量。
為此，本發(fā)明提供的試劑及其制備方法是一、制備高親合膽固醇酶化合物(一)選擇酶和化合物該酶化合物，由酶和活化物制備而得，其中制備活化物的化合物選自甾類糖苷，該甾類糖苷在其結(jié)構(gòu)中具有作為配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇的甾環(huán)酶，以及具有含3-10個(gè)線狀或分支結(jié)構(gòu)單糖的低聚糖酶；或者選自三萜烯糖苷，該三萜烯糖苷在其結(jié)構(gòu)中具有α-或β-胡椒烷、羊毛脂甾烷等的配基，以及具有由2-8個(gè)分支或線狀結(jié)構(gòu)基構(gòu)成的低聚糖；或者選自能夠有選擇地與膽固醇形成復(fù)合物的疏水蛋白質(zhì)；或者選自能夠有選擇地與膽固醇形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)毒素；或者選自能夠有選擇地與膽固醇形成復(fù)合物的多烯抗菌素，上述化合物可以單獨(dú)使用也可以兩種或幾種混合使用，沒(méi)有特別的限制，只要制得的酶化合物對(duì)低密度脂蛋白膽固醇的反應(yīng)必比其它脂蛋白膽固醇的反應(yīng)性強(qiáng)。
本發(fā)明中使用的甾類糖苷實(shí)例有天門冬苷、毛地黃皂苷、龍舌苷、羊毛蠟苷、脫糖毛地黃皂苷等等。
三萜烯糖苷的實(shí)例有七葉素、茶皂苷等。
疏水蛋白質(zhì)實(shí)例有脂蛋白的脫水蛋白質(zhì)、溶酶體的蛋白質(zhì)等等。
蛋白質(zhì)毒素可由細(xì)菌、海洋微生物等獲得，作為實(shí)例有鏈球菌溶血素O、腦酮溶細(xì)胞素等。
多烯抗菌素實(shí)例有兩性霉素B、菲律賓菌等。
為了提高檢測(cè)的專一性，本發(fā)明中采用的酶是膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，當(dāng)然也可以選用其它的酶，只要制得的酶化合物對(duì)低密度脂蛋白中膽固醇的反應(yīng)必比其它脂蛋白膽固醇的反應(yīng)性強(qiáng)。
(二)高親合膽固醇酯酶化合物的制取將前述化合物中的一種或幾種混合物在水介質(zhì)中用公知的疊氮法、碳化二亞胺法、丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法進(jìn)行活化，選用的方法最好能夠最大限度地保持制備的酶化合物的活性。眾所周知，其中的活化劑，在疊氮法、碳化二亞胺法、丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法中分別是疊氮化物、對(duì)環(huán)己基-2-(4-嗎啉)乙基-碳化二亞胺-甲基-對(duì)甲苯磺酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺以及高碘酸鈉?；衔锏臐舛葹?-100毫克/毫升?；罨瘲l件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶20，溫度0-25℃，PH3-11，時(shí)間0.1-24小時(shí)；膽固醇酯酶溶解在PH＝5-9的緩沖液中，膽固醇酯酶與緩沖液的配比沒(méi)有限定要求，只要膽固醇酯酶溶解充分即可；化合物與膽固醇酯酶的配比是1∶1-20∶1(摩爾比)；活化后的活化物與溶有膽固醇酯酶的緩沖液混合，該溶液在0-25℃的溫度下反應(yīng)18-24小時(shí)，為了提高膽固醇酯酶化合物的高親合性，還可向溶液中加入能改變膽固醇酯酶化合物中的氨基的高分子聚合物。制備的酶化合物不需純化，檢測(cè)其活性后直接使用。
(三)高親合膽固醇氧化酶化合物的制取膽固醇氧化酶溶解在PH＝5-9的緩沖液中，膽固醇氧化酶與緩沖液的配比沒(méi)有限定要求，只要膽固醇氧化酶溶解充分即可；將前述化合物中的一種或幾種混合物在水介質(zhì)中用公知的疊氮法、碳化二亞胺法、丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法進(jìn)行活化，選用的方法最好能夠最大限度地保持制備的酶化合物的活性。眾所周知，其中的活化劑，在疊氮法、碳化二亞胺法、丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法中分別是疊氮化物、對(duì)環(huán)己基-2-(4-嗎啉)乙基-碳化二亞胺-甲基-對(duì)甲苯磺酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺以及高碘酸鈉?；衔锏臐舛葹?-100毫克/毫升?；罨瘲l件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶20，溫度0-25℃，PH3-11，時(shí)間0.1-24小時(shí)；化合物與膽固醇氧化酶的配比是1∶1-20∶1(摩爾比)，活化后的活化物與溶有膽固醇氧化酶的緩沖液混合，該溶液在0-25℃的溫度下進(jìn)行18-24小時(shí)，為了提高膽固醇氧化酶化合物的高親合性，還可向溶液中加入能改變膽固醇氧化酶化合物中的氨基的高分子聚合物。制備的酶化合物不需純化，檢測(cè)其活性后直接使用。
上面所述的某些化合物，如甾類糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素極少或不溶于水，為使它們完全溶解，可預(yù)先將它們?nèi)芙庠谝韵虏唤o出質(zhì)子的極性有機(jī)溶劑中二甲亞砜、甲酰替二甲胺、六甲醇、甲酰替二甲胺與甲苯按2∶1混合的混合物、甲酰替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物。
以上高親合膽固醇酯酶化合物和高親合膽固醇氧化酶化合物是分別制備，也可先將膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶混和后再制成酶化合物。
二、選用表面活性劑本發(fā)明所使用的對(duì)低密度脂蛋白膽固醇具有較強(qiáng)作用的表面活性劑，可以是聚氧乙烯月桂基醚、多烷基酚聚氧乙烯月桂胺、烷基聚氧乙烯醚羥丙基磺酸鈉、聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚等。表面活性劑可以單獨(dú)使用也可以混合使用，其用量因具體成份而定，通常使用范圍為每升試劑10-50克。
三、配置反應(yīng)后的酶化合物與表面活性劑混合，并可酌情加入緩沖液、穩(wěn)定劑、用于顯色測(cè)定的色原和催化劑。
在本發(fā)明中為了保持酶化合物和試劑的穩(wěn)定性，可以加入防腐劑、防霉劑或其它的醇類、高分子化合物，如乙二胺四乙酸二鈉(EDTA.2Na)、血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、二價(jià)金屬離子、乙二醇等。
在本發(fā)明中用于顯色測(cè)定的色原可以是N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-5-2甲氧基苯胺(HDAOS)、TODP、TOOS等。
本發(fā)明所使用的緩沖液，可以是GOOD’S緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、檸檬酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液等，緩沖液的種類和濃度因具體成份而定，這里不作限制，只要在PH為5-9的范圍內(nèi)保證較大的緩沖作用且不抑制酶活性的一種或幾種。一般濃度可在50-200mmol/L，本發(fā)明優(yōu)選100mmol/L的GOOD’S緩沖液。
本發(fā)明中為了防止其它非測(cè)量物質(zhì)的干擾，可加入抗壞血酸氧化酶等抗干擾物質(zhì)。
本發(fā)明在配置時(shí)所加入的緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑、色原和催化劑的數(shù)量根據(jù)需要確定，沒(méi)有限定要求。
以上所述的所有的生化試劑、原料均可外購(gòu)獲得。
本發(fā)明所提供的試劑在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)試時(shí)的主要調(diào)定參數(shù)如下

實(shí)施例1使用毛地黃皂苷化合物與酶制備的高親合酶化合物和表面活性劑-壬基酚聚氧乙烯醚硫酸胺鈉配制的試劑測(cè)定LDL膽固醇試劑I(R1)緩沖液MES(PH7.0) 100mmol/L穩(wěn)定劑MgCL.6H2O2mmol/L色原 4-AAP 0.25mmol/L防腐劑NaN3 5mmol/L穩(wěn)定劑BSA 0.5g/L催化劑膽酸鈉20mmol/L高親合性膽固醇酯酶化合物1500U/L高親合性膽固醇氧化酶化合物 3000U/L抗干擾物質(zhì) 抗壞血酸氧化酶 1000U/L表面活性劑 聚氧乙烯月桂基醚13g/L(當(dāng)試劑I與試劑II混合時(shí)含量為10g/L)試劑II(R2)
緩沖液 MES(PH7.0) 100mmol/L穩(wěn)定劑 BSA 0.5g/L防腐劑 NaN3 5mmol/L穩(wěn)定劑 MgCL.6H2O 2mmol/L催化劑 辣根過(guò)氧化物酶950U/L色原TOPS 2mmol/L(其中制備高親合性膽固醇酯酶化合物以及高親合性膽固醇氧化酶化合物時(shí)毛地黃皂苷化合物的濃度為50毫克/毫升?；罨瘲l件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶10，溫度25℃，PH3，時(shí)間24小時(shí)；化合物與酶分別反應(yīng)時(shí)的摩爾配比為1∶1)表1為本發(fā)明實(shí)施例1與Friedewald公式法的測(cè)定值對(duì)照表。
圖1根據(jù)表1數(shù)據(jù)制成，本實(shí)施例1測(cè)得值與Friedewald公式法測(cè)得值的相關(guān)性r2為0.9901，說(shuō)明相關(guān)性良好。
實(shí)施例2使用七葉素與酶制備的高親合酶化合物和表面活性劑-烷基聚氧乙烯醚羥丙基磺酸鈉配制的試劑測(cè)定LDL膽固醇試劑I(R1)緩沖液MOPS(PH6.7) 50mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na 2mmol/L色原 4-AAP 0.20mmol/L防腐劑NaN3 5mmol/L穩(wěn)定劑BSA0.5g/L催化劑膽酸鈉 15mmol/L高親合性膽固醇酯酶化合物 350U/L高親合性膽固醇氧化酶化合物 3500U/L抗干擾物質(zhì) 抗壞血酸氧化酶 1000U/L表面活性劑 烷基聚氧乙烯醚羥丙基磺酸鈉 30g/L(當(dāng)試劑I與試劑II混合時(shí)含量為
22.5g/L)試劑II(R2)緩沖液MOPS緩沖液(PH6.7)50mmol/L穩(wěn)定劑BSA0.5g/L防腐劑NaN3 5mmol/L穩(wěn)定劑MgCL.6H2O 2mmol/L催化劑辣根過(guò)氧化物酶 850U/L色原 TOPS 3mmol/L(其中制備高親合性膽固醇酯酶化合物以及高親合性膽固醇氧化酶化合物時(shí)七葉素化合物的濃度為1毫克/毫升。活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶20，溫度10℃，PH6，時(shí)間10小時(shí)；化合物與酶分別反應(yīng)時(shí)的摩爾配比為20∶1)表2為本發(fā)明實(shí)施例2與Friedewald公式法的測(cè)定值對(duì)照表。
圖2根據(jù)表2數(shù)據(jù)制成，本實(shí)施例2測(cè)得值與Friedewald公式法測(cè)得值的相關(guān)性r2為0.9889，說(shuō)明相關(guān)性良好。
實(shí)施例3使用脂蛋白的脫水蛋白質(zhì)與酶制備的高親合酶化合物和表面活性劑-聚氧乙烯高級(jí)醇醚配制的試劑測(cè)定LDL膽固醇。
試劑I(R1)緩沖液 PIPES(PH6.7)200mmol/L穩(wěn)定劑 MgCL.6H2O 2mmol/L色原4-AAP 0.25mmol/L防腐劑 NaN3 5mmol/L穩(wěn)定劑 BSA 0.5g/L催化物 膽酸鈉20mmol/L
高親合性膽固醇酯酶化合物 2600U/L高親合性膽固醇氧化酶化合物260U/L抗干擾物質(zhì) 抗壞血酸氧化酶1000U/L表面活性劑 聚氧乙烯高級(jí)醇醚 66g/L(當(dāng)試劑I與試劑II混合時(shí)含量為50g/L)試劑II(R2)緩沖液 PIPES(PH6.7)200mmol/L穩(wěn)定劑 BSA 0.5g/L防腐劑 NaN3 5mmol/L穩(wěn)定劑 MgCL.6H2O 2mmol/L催化劑 辣根過(guò)氧化物酶1000U/L色原TOPS 2mmol/L(其中制備高親合性膽固醇酯酶化合物以及高親合性膽固醇氧化酶化合物時(shí)脫水蛋白質(zhì)化合物的濃度為100毫克/毫升?；罨瘲l件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1，溫度0℃，PH11，時(shí)間0.1小時(shí)；化合物與酶分別反應(yīng)時(shí)的摩爾配比為10∶1)表3為本發(fā)明實(shí)施例3與Friedewald公式法的測(cè)定值對(duì)照表。
圖3根據(jù)表3數(shù)據(jù)制成，本實(shí)施例3測(cè)得值與Friedewald公式法測(cè)得值的相關(guān)性r2為0.9814，說(shuō)明相關(guān)性良好。
表1(本發(fā)明方法實(shí)施例1測(cè)定值與Friedewald公式計(jì)算法比較)



表2(本發(fā)明方法實(shí)施例2測(cè)定值與Friedewald公式計(jì)算法比較)


表3(本發(fā)明方法實(shí)施例3測(cè)定值與Friedewald公式計(jì)算法比較)


權(quán)利要求
1.一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的試劑，包括適量緩沖液、穩(wěn)定劑和色原，其特征在于該試劑還包括以下成分A、高親合性酶化合物，該酶化合物，由酶和活化物反應(yīng)而得，其中活化物是甾類糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種與活化劑混合、活化后獲得，化合物的濃度為1-100毫克/毫升，化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶20；所采用的酶是膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶二者摩爾比是10∶1-1∶10；上述化合物與酶反應(yīng)時(shí)的摩爾配比為1∶1-20∶1；B、表面活性劑，其加入比例為每升試劑10-50克，所述的表面活性劑是聚氧乙烯醚月桂基醚、多烷基酚聚氧乙烯月桂胺、烷基聚氧乙烯醚羥丙基磺酸鈉、聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚中的一種或任意比例混合的多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的試劑，其特征在于所述的緩沖液是GOOD’S緩沖液或磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液或檸檬酸緩沖液或硼酸鹽緩沖液，緩沖液的PH值為5-9，緩沖液的濃度是50-200mmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的試劑，其特征在于該試劑中還有適量催化劑、防腐劑和抗干擾物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇試劑的制備方法，其特征在于所述的低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑的制備方法包括以下步驟一、化合物活化選擇所述的甾類糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種，在水介質(zhì)中用公知的疊氮法或碳化二亞胺法或丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法進(jìn)行活化，活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶20，溫度0-25℃，PH在3-11范圍內(nèi)，時(shí)間0.1-24小時(shí)；二、酶溶解選擇所述的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，溶解在緩沖液中；三、混合反應(yīng)活化后的活化物與溶解后的酶溶液混合，該溶液在0-25℃的溫度下反應(yīng)18-24小時(shí)；四、配置反應(yīng)后的酶化合物與表面活性劑混合，并加入緩沖液、穩(wěn)定劑、用于顯色測(cè)定的色原和催化劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇試劑的制備方法，其特征在于所述的甾類糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素預(yù)先置于以下有機(jī)溶劑混合物中溶解二甲亞砜或甲酰替二甲胺或六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物，或者，甲酰替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物；化合物與有機(jī)溶劑混合物的重量比例為1∶30-1∶0.01。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇試劑的制備方法，其特征在于該試劑中還加入防腐劑和抗干擾物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定血清中的低密度脂蛋白中膽固醇的試劑及制備方法。本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的試劑及制備方法的改進(jìn)，該試劑應(yīng)具有檢測(cè)簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、試劑性質(zhì)穩(wěn)定、適用各種型號(hào)的全自動(dòng)生化分析儀的特點(diǎn)。提供的技術(shù)方案是一種測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的試劑，包括適量緩沖液、穩(wěn)定劑和色原，該試劑還包括以下成分A、高親合性酶化合物；由酶和活化物反應(yīng)而得；B、表面活性劑，其加入比例為每升試劑10－50克；該試劑中還有適量催化劑、防腐劑和抗干擾物質(zhì)。所述的低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑的制備方法包括以下步驟一、化合物活化；二、酶溶解；三、混合反應(yīng)；四、配置。該試劑中還加入防腐劑和抗干擾物質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N21/31GK1696659SQ20051004991
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月1日
發(fā)明者王賢理, 蒙凱, 蔡其浩 申請(qǐng)人:王賢理