專利名稱：用于改進對抗人類免疫缺陷病毒(hiv)和丙型肝炎病毒(hcv) 的抗體的檢測以及用于在 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及用于檢測通過常規(guī)測定技術檢測為血清陰性的個體的全血中的抗體，并且用于促進HIV和/或HCV抗體產生的改進的方法和試劑盒。更具體地講，本發(fā)明涉及用于檢測可能的逆轉錄病毒感染，如HIV病毒感染的測定方法，該方法將活化劑用于全血中，以便刺激外周血單核細胞的抗體產生。本發(fā)明還涉及改進的測定試劑盒，在用活化劑培養(yǎng)之前，它不需要從全血中分離外周血單核細胞。
背景技術：
在本文中，活化劑表示任何能夠活化B-細胞和/或T-細胞和/或其它白細胞的物質。術語″全血″表示用肝素，EDTA，或任何其它防止凝結和凝固的物質采集的血液。本文所使用的術語全血，還包括用肝素，EDTA，或任何其它防止凝結和凝固的物質從動物或人體內采集的血液?！迦暹€可以表示這樣的血液其中紅細胞業(yè)已裂解，同時保持了剩余的白細胞的活力。
抗多種感染性疾病因子的抗體的血清學檢測，被認為是接觸所述因子和/或被所述因子主動感染的證據。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)商業(yè)試劑盒通常被用作抗體血清學檢測的篩選試驗。業(yè)已開發(fā)出了“快速試驗”形式的其它試驗，利用多種技術檢測特異性抗體-抗原復合物的形成。一般，要對陽性樣品進行兩次再檢測，并且只有在隨后這兩次試驗中至少有一次也能起反應的時候，才被視為“陽性的”。在某些國家，Western印跡技術被用于驗證ELISA-反應性血清樣品。Western印跡技術被認為特異性比ELISA技術更高，但是，它的靈敏度通常較差。
不過，現(xiàn)有血清學技術無法識別受到感染，但是缺乏可檢測水平的反應性抗體的個體。缺乏可檢測水平的反應性抗體的情況的例子包括自身免疫性疾病，其中，抗體可能只在一部分時間內存在，并且在其余時間被抑制，或者，其中抗體與抗原結合形成了免疫復合物，并因此可能不能在血清中檢測到；某些形式的癌，其中，針對腫瘤的抗體產生可能被癌發(fā)展中的某些特殊過程抑制；器官和組織移植，其中，受體不產生抗?jié)撛诠w的抗體，但是會產生快速的移植排斥，因為由于供體抗原與受體以前接觸過的抗原的交叉反應而產生對免疫系統(tǒng)的回憶刺激(recall stimulation)；巨細胞病毒，它導致了抗體產生的減弱；以及，其它感染的宿主，其中，抗體產生隨后被抑制。多種病毒同樣會干擾免疫功能。被誘導的抑制作用可能特異性地與針對所述病毒的免疫反應相關，或可能是非特異性的，并且影響所述宿主的總體免疫系統(tǒng)的很多組成部分。
在世界范圍內，血清學篩選技術被用于檢測所有類型的HIV(HIV-1，HIV-2，HIV-0)?？怪T如HIV的慢性感染的抗體的存在，被視為感染的強指示。目前，在大部分醫(yī)院和篩選實驗室中，ELISA測定被用在血清樣品上，以便進行這種測定。類似的抗體測定方法被用于檢測丙型肝炎(HCV)的存在。如果血清樣品是陽性的，就通過Western印跡測定試劑盒對該樣品的一個等份樣品進行篩選以便驗證，或者進行重復試驗?？顾霾《镜膬蓚€主要蛋白條帶的抗體的存在，或相同樣品的重復試驗呈陽性，被認為有效驗證和確定了所述血清樣品供體是受感染的。
試驗結果表明，目前使用的ELISA測定方法不能檢測所有HIV和HCV感染的個體。這是因為某些HIV感染的個體不具有可檢測水平的抗所述病毒的血清抗體，并且現(xiàn)有技術不能識別缺乏可檢測水平的HIV抗體的個體。研究表明，在HIV感染和血清陽轉之間可能存在較大的時間滯后。另外，某些受到HIV感染的、但是血清陰性的個體可能從來不發(fā)生血清陽轉，但是在他們的整個生命中都保持感染。因此，報導了大量的假陰性。通過利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術，病毒分離技術和原位雜交，業(yè)已證實了HIV感染的但是血清陰性的個體的存在。確定受感染的但是血清陰性的個體的最可悲的方式是通過他們業(yè)已傳播給其它人的感染。由于其高度可傳染性，確定受感染的但是血清陰性的個體對于控制疾病的傳播來說是重要的。另外，來自所述測定方法的數(shù)據對于受感染個體的臨床管理，隨訪和治療，以及保持與受感染個體接觸的衛(wèi)生保健工作人員的安全來說都具有重要意義。在HCV中，“窗口期”--即盡管受到感染，但是血清陰性的狀態(tài)--可能比HIV長得多。
Tamar Jehuda-Cohen博士開發(fā)了用于檢測血清陰性個體中的HIV感染的方法。在該方法中，從血液中分離外周血單核細胞(PBMC)然后接觸活化劑，或使用不同的培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)全血樣品。結果發(fā)現(xiàn)，對于受到HIV感染但是呈血清陰性的患者來說，在存在活化劑的條件下培養(yǎng)分離的PBMC或全血，導致了淋巴細胞分泌對HIV特異性的抗體。因此，這種檢測方法提供了確定大部分業(yè)已受到HIV感染，但是呈血清陰性的患者的可能性。為了早期單獨或與HIV一起檢測HCV，業(yè)已進行了類似研究。
在使用分離的PBMC制劑，并且在臨床上試驗時，存在某些嚴重問題。首先，必須采集來自業(yè)已接觸過HIV的患者的血液，然后進行分部分離，以便分離外周血單核細胞。然后，可能需要除去某些抑制細胞。隨后，必須將這些細胞懸浮在含有活化劑的生長培養(yǎng)基中，并且培養(yǎng)適當?shù)臅r間。所述過程必須在無菌條件下進行。然后檢測上清中HIV特異性抗體的存在。盡管這種措施在研究實驗室中是可以接受的，然而在每周要處理數(shù)百份，并且在某些場合下甚至要處理數(shù)千份血液樣品的臨床實驗室中，就不是這樣了。
本領域需要能夠在血清陽轉之前檢測諸如HIV和/或HCV病毒的特定抗原感染的測定方法。所述測定方法應當包括技術人員對血液的最少接觸，與此同時，提供對大量血液樣品進行病毒感染篩選的安全、方便和廉價的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于檢測通過常規(guī)測定技術檢測為血清陰性的受感染個體的全血中的抗體的改進的測定方法，因此有助于診斷可能的逆轉錄病毒感染。更具體地講，本發(fā)明涉及改進的測定方法和試劑盒，它將活化劑用在全血中，以便刺激以前不可檢測的抗體的產生。
根據本發(fā)明，將血液樣品抽取到裝有有效濃度的活化劑溶液的試管如真空管中，或轉移到裝有合適溶液的組織培養(yǎng)試管中。在存在所述活化培養(yǎng)基的情況下，體外培養(yǎng)要檢測的血液樣品。人B細胞和其它淋巴細胞亞型的任何活化劑，都可用于獲得提高抗體產生水平并且克服免疫抑制作用的相同功能，因此導致了抗體水平的提高和/或在血清陰性的個體中檢測到感染。在培養(yǎng)之后，從液體的頂部取出等份樣品，然后，通過標準ELISA方法和/或Western印跡分析，和/或任何其它用于檢測抗體的測定方法，測定目的抗體的存在。如果所述樣品要在較遲的日期進行測定的話，可以對所述血液進行離心，并且收集上清液體，冷凍并且保藏?？梢酝ㄟ^重復試驗驗證結果。采用聚合酶鏈式反應(PCR)技術，通常能夠證實所述病毒的存在。
或者，可以從要檢測的血液樣品中分離PBMC′s，并且與活化劑一起在培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？梢詥为殞BMC用于檢測抗感染因子、癌表位的“隱藏”抗體或用于匹配移植的供體。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于檢測患者的逆轉錄病毒感染的簡單和靈敏的測定方法，所述患者受到感染，但是對所述病毒是血清陰性的。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于提高抗體水平，并且改善抗體診斷測定的靈敏度和/或特異性的簡單和靈敏的測定方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于預測由于回憶刺激移植受體中的抗體產生而產生器官或組織排斥的可能性的簡單和靈敏的測定方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于早期檢測某些形式的癌癥的方法和試劑盒。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于診斷HIV感染的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供測定試劑盒，該試劑盒是獨立完備的，并且不需要在測定之前分離外周血單核細胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于診斷逆轉錄病毒感染的測定方法和測定試劑盒，通過簡化測定程序，減少對供體樣品的操作，降低了衛(wèi)生保健工作者的風險，并因此降低了感染的風險。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于在血液中的抗體水平低于通過常規(guī)測定系統(tǒng)目前可檢測的水平時檢測抗體的方法。
通過閱讀下面的對所披露的實施方案的詳細說明和所附權利要求書，可以了解本發(fā)明的上述以及其它目的，特征和優(yōu)點。
本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明包括用于檢測通過常規(guī)測定技術檢測呈血清陰性的個體的全血中“隱藏的”抗體的方法和試劑盒。另外，本發(fā)明包括用于檢測業(yè)已感染了HIV，但是對常規(guī)測定技術表現(xiàn)出血清陰性的個體全血中的HIV抗體的方法。該方法包括在存在活化劑的條件下培養(yǎng)血清陰性個體的全血。所述活化劑能導致對外周血單核細胞的刺激以及抗體的產生。然后，可以通過使用任何常規(guī)測定技術，如上文所列舉的技術測定特異性抗體的存在。
在本發(fā)明中，任何活化劑都可用于刺激所述細胞。所述活化劑可以是T-細胞依賴性或T-細胞不依賴性的。可用于實施本發(fā)明的活化劑包括但不局限于凝集素(如伴刀豆球蛋白A和美洲商陸)，細菌內毒素；細菌衍生的脂質A；多種病毒；以及諸如淋巴因子的生物活性劑，包括但不局限于白介素，細胞因子或抗-免疫球蛋白試劑。
培養(yǎng)基表示可用于實施本發(fā)明的任何培養(yǎng)基，優(yōu)選補充了合適的抗生素，谷氨酰胺和其它生長支持成分。可用于實施本發(fā)明的培養(yǎng)基包括但不局限于，Eagles，Dulbecco′s，RPMI，McCoy′s，Media 199和Waymouth′s培養(yǎng)基。 55本發(fā)明還包括試劑盒，它包括其中裝有有效濃度的活化劑的采血容器。所述容器可選擇性地裝有培養(yǎng)基。選的容器是試管。所述采血容器可以是塑料，玻璃，或適合培養(yǎng)血液的任何其它材料。
可以理解的是，本發(fā)明還包括除了血液采集試管以外的血液容納裝置，包括但不局限于微量滴定平板，它包括可以在其中培養(yǎng)血液的孔，組織培養(yǎng)管或瓶，玻璃燒瓶如錐形瓶，以及可以在它里面培養(yǎng)血液的任何其它容器。
本發(fā)明的方法包括任選從血液的液體部分分離血細胞，以便可以確定抗體的存在。從血液的液體部分分離血細胞可以通過本領域普通技術人員所熟知的若干方法中的任意一種實施，包括離心或過濾。應當理解的是，沒有必要從液體中物理分離血細胞，盡管在培養(yǎng)和測定之前可以從血液中分離PBMC′s。在用所述活化劑培養(yǎng)全血(或來自它的細胞)之后，可以從所述血液的頂部方便地吸取液體，并且檢測抗體。任選地，可以通過溫和的滲透壓休克或用溫和的洗滌劑裂解紅細胞。通過這種方法，白細胞保持活力。
在本發(fā)明的一種實施方案中，采集全血(具有抗凝劑)，并且將樣品轉移到裝有培養(yǎng)基和活化劑的試管中。然后，在37℃下，在含有5％CO2的潮濕的氣氛中培養(yǎng)所述血液樣品3-5天。然后對所述血液進行離心，并且收集上清液，并且在大約24小時之內，通過ELISA和/或任何其它抗體檢測技術測定反應性抗體?；蛘撸梢灾苯訌乃鰳悠分腥〕鲆坏确菀后w。每一份樣品都應首先通過ELISA(或快速試驗)篩選抗體，然后可對被認為是陽性的樣品進行重復確證試驗，或進行Western印跡分析。
應當理解的是，本發(fā)明可用于在多種情況下檢測抗體，包括但不局限于針對器官和組織移植中涉及的外來抗原的抗體?？梢园凑毡景l(fā)明的方法制備并且處理來自潛在受體的血液的上清液，然后保藏，以便在發(fā)現(xiàn)潛在供體之時，將來自供體的PBMC與來自受體的上清液混合?？梢酝ㄟ^多種不同的方法測定與供體細胞結合的抗體的存在和水平，這些方法包括但不局限于通過補體裂解或通過鑒別染色和FACS分析。這些檢測抗體的方法為本領域普通技術人員所熟知。
可將本發(fā)明用于確定在微生物感染之后或期間是否存在“隱藏的”抗體，所述微生物包括但不局限于酵母，細菌，病毒，原生動物，以及其它類別的微生物。
將通過以下實施例對本發(fā)明作進一步說明，這些實施例不被視為以任何方式構成對本發(fā)明范圍的限定。相反，顯而易見的是，在閱讀本發(fā)明的說明書之后，在不偏離本發(fā)明的構思和/或所附權利要求書的范圍的前提下，本領域技術人員可以提出并采取各種其它實施方案，改進，以及它們的等同方案。
實施例1分析了來自超過20位不同患者(HIV高危的懷孕女性)的血液中HIV特異性抗體的存在。在本實施例中，從患者體內采集血液，并且從血液中分離PBMC。對每一位患者，在含有活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)全血和PBMC。對于全血來說，將1ml全血與2ml含有活化劑的培養(yǎng)基混合。對于PBMC來說，所述細胞以每毫升2×106細胞的濃度在活化劑的不同制劑中培養(yǎng)。另外，分析了來自每一位患者的血清中HIV抗體的存在。全血和PBMC的培養(yǎng)在無菌試管中進行一式三份，并且在37℃下，在含有5％CO2的潮濕氣氛中培養(yǎng)4天。然后對所述培養(yǎng)物進行離心，采集上清液，并且在24小時之內，通過ELISA和Western印跡試驗，測定HIV-反應性抗體。所使用的ELISA測試是從Sanofi Diagnostic Pasturer購買的。結果如下·8位患者是血清陽性的，在培養(yǎng)之后，所有8位患者仍然是陽性的-＞沒有陽性例丟失·在血清陰性的患者中，有5位患者在培養(yǎng)之后是陽性的。-＞提高了靈敏度·在這5位患者中，有3位在隨后的3-4個月內發(fā)生了血清陽轉，有1位在6個月之后發(fā)生了血清陽轉。-＞早期檢測·在本研究期間，在培養(yǎng)之后檢測呈陰性的患者無一發(fā)生血清陽性-＞良好的特異性。
實施例2
一名衛(wèi)生保健工作者被裝有來自HIV患者的血液的注射器針頭刺傷。
通過常規(guī)的血清學和通過在合適活化劑中培養(yǎng)血液(以及一些分離的PBMC)，檢測HIV狀態(tài)。與所述抗體檢測平行，還通過PCR進行了病毒核酸序列存在的檢測。

從以上數(shù)據中可以看出，在PBMC和全血之間存在極好的相關性。這兩種方法都能夠對所述感染進行非常早期的檢測，所述感染的“窗口期”超過五個月。
當然，應當理解的是，上面所涉及到的只是本發(fā)明的一種實施方案，并且，在不超出所附權利要求書提出的本發(fā)明的構思和范圍的前提下，可以對它進行多種改進或改變。
權利要求
1.一種用于檢測樣品中針對HIV和/或HCV的抗體的方法，包括以下步驟a)獲得全血樣品；b)在存在含有活化劑的培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)所述全血樣品，以誘導外周血單核細胞的特異性和/或多克隆激活，以及HIV和/或HCV特異性抗體的表達；c)讓步驟b)所得到的培養(yǎng)物與HIV和/或HCV抗原接觸，從而使得抗原-抗體免疫復合物形成；和d)檢測步驟c)的抗原-抗體免疫復合物；從而檢測HIV和/或HCV特異性抗體的存在。
2.如權利要求1的方法，其中，步驟b)的培養(yǎng)產生上清液，并且讓所述上清液接觸HIV和/或HCV抗原，從而使得抗原-抗體免疫復合物形成。
3.如權利要求1的方法，其中，所述活化劑包括促分裂原，凝集素，細菌內毒素，病毒，脂質A，細胞因子或淋巴因子。
4.一種用于檢測來自對象的針對HIV和/或HCV的抗體的試劑盒，包括用于采集全血樣品的容器，其中，所述容器裝有含有活化劑的培養(yǎng)基，它能有效誘導外周血單核細胞的特異性和/或多克隆激活，以及全血樣品的HIV和/或HCV特異性抗體的表達。
5.如權利要求4的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括用于檢測HIV和/或HCV特異性抗體的測定。
6.如權利要求5的試劑盒，其中，所述測定是酶聯(lián)免疫吸附測定，western印跡，快速試驗，生物芯片，或免疫熒光測定。
7.如權利要求4的試劑盒，其中，所述容器是由塑料，玻璃或金屬材料制成的。
8.如權利要求4的試劑盒，其中，所述容器是試管或燒瓶。
9.如權利要求4的試劑盒，其中，所述容器具有真空，如真空容器。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測全血中針對人類免疫缺陷病毒(HIV)，和/或丙型肝炎(HCV)的抗體的改進方法和試劑盒，所述全血是從通過常規(guī)測定技術確定為HIV－血清陰性的個體獲得的。從這些個體分離全血，并且直接用活化劑培養(yǎng)，以刺激產生對HIV或HCV特異性的免疫球蛋白的B－淋巴細胞增殖。該方法提供了用于對大量血液樣品進行HIV感染篩選的快速、簡單和廉價的手段，比使用未處理過的血液具有更好的結果。
文檔編號G01N33/531GK1834647SQ20051005501
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月14日 優(yōu)先權日2005年3月14日
發(fā)明者T·杰胡達－科亨 申請人:斯馬特生物技術有限公司