專利名稱：雞傳染性支氣管炎病毒s1重組蛋白抗原、制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒S1重組蛋白抗原、制備方法及其用途。
背景技術：
傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒(infectiou bronchitis virus，IBV)引起的家禽的一種急性，高度接觸性傳染病，傳染性支氣管病毒為單鏈正義，不分節(jié)段的RNA病毒，是當前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要病原之一。自1931年在美國被發(fā)現(xiàn)以來，分離到的傳染性支氣管病毒已達100多株，30多種血清型，而且它們在組織嗜性、毒力等方面存在較大的差異，給診斷和預防該病帶來極大的難度。目前，防制該病的主要措施就是應用滅活疫苗和減毒活疫苗對雞群進行免疫接種。實踐表明，這三種疫苗都在一定程度上存在著不足，原因是傳支病毒血清型眾多且各血清型間缺乏或僅有較弱的交叉保護，用此三類疫苗只能針對一種血清型，不能有效的控制該病的發(fā)生和流行。再加上滅活疫苗的免疫效果不佳，致弱苗容易散毒且可能與野毒發(fā)生基因重組而產(chǎn)生新的變異株，因而存在著潛在的危險性。核酸疫苗的研究還剛剛起步，在短期內(nèi)不可能推廣應用，而且其免疫效果和安全性還有待于進一步的深入研究。因而，建立特異敏感的診斷方法及研制開發(fā)有效基因工程亞單位蛋白疫苗預防該病顯得十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雞傳染性支氣管炎病毒S1重組蛋白抗原、制備方法及其用途。
雞傳染性支氣管炎病毒S1重組蛋白抗原IBV核糖核酸為模板，通過反轉錄聚合酶鏈式反應擴增獲得截短IBV S1核苷酸序列，并克隆于大腸桿菌原核表達載體pET-28a，轉化入大腸桿菌BL21宿主細胞后用IPTG誘導表達，經(jīng)Ni-NTA Argarose純化，獲得截短表達的IBVS1蛋白抗原；所述的IBV S1核苷酸序列具有SEQ ID No.1～3所示的核苷酸序列；雞傳染性支氣管炎病毒S1重組蛋白抗原的制備方法的步驟如下1)分別以IBV ZJ971株或M41株或J株的核糖核酸為模板，分別以pIBV-ZJ971-S1D5’-GGAATTCGTTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’；pIBV-ZJ971-S1D5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’；或pIBV-M41-S1D5’-GGGATCCGCTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’；pIBV-M41-S1D5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’；或pIBV-J-S1D5’-GGGATCCAATTTGTTTGATTCTGATAAT-3’；pIBV-J-S1D5’-GAAGCTTTTAACAATGTGTAGCAAACAC-3’；為引物，通過反轉錄聚合酶鏈式反應方法擴增分別獲得三株IBV截短的S1核苷酸序列；2)將上述三株IBV截短S1核苷酸序列分別插入到原核表達載體pET-28a，分別獲得含有三株IBV截短的S1核苷酸序列的重組原核表達載體；3)將含上述三株IBV截短的S1核苷酸序列的重組載體分別轉化宿主細胞BL21(DE3)，并用IPTG誘導表達；4)誘導表達的蛋白分別經(jīng)Ni-NTA Argarose純化得到純的三株IBV截短表達S1蛋白抗原。
雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原應用于酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IBV感染產(chǎn)生的抗體或者用于制備IBV基因工程亞單位蛋白疫苗。
本發(fā)明的優(yōu)點1)經(jīng)用IBV陽性血清檢測，表達的三種截短的IBV S1蛋白均具有良好的抗原反應性，可作為診斷抗原應用于瓊擴診斷技術，酶聯(lián)免疫吸附試驗，免疫熒光檢測，免疫組織化學和免疫印跡等檢測IBV感染后產(chǎn)生的抗體。此外，這三種截短的IBV S1蛋白還可用于制備單克隆抗體或多克隆抗體以檢測IBV抗原的存在以及配以適當疫苗佐劑制備基因工程亞單位蛋白疫苗；2)國內(nèi)對于IBV診斷和流行病學調查多采用傳統(tǒng)的血凝實驗，血凝抑制實驗，瓊脂擴散實驗以及PCR、RFLP等方法等對病原進行檢測。這些方法有的耗時耗力，有的容易造成假陽性結果，所以用ELISA對IBV病原和血清中抗體進行檢測具有上述實驗方法不可替代的優(yōu)勢；3)S1蛋白是IBV主要的宿主保護性抗原，具有很強的免疫原性。通過軟件預測得知，S1蛋白的抗原表位和親水區(qū)域主要位于S1蛋白基因的氨基末端，尤其是S1基因信號肽后的288bp和309bp的區(qū)域。本發(fā)明在此方面取得了進步；4)此三種重組蛋白具有顯著的抗原反應性，通過PCR技術從以前構建好的重組載體上拉出288bp和309bp目的序列，利用原核表達載體pET-28a克隆并表達了三株IBV部分S1基因，并通過雞IBV陽性血清的間接ELISA，證實了重組蛋白的抗原反應性；5)此三種重組蛋白具有良好的免疫原性。利用原核表達系統(tǒng)表達的三株IBV部分S1蛋白經(jīng)純化后制備鼠源單克隆抗體，將此單克隆抗體和IBV混合接種9～11日齡雞胚，多數(shù)雞胚未發(fā)生病變和死亡，進一步證明了所表達的重組S1部分蛋白具有較強的免疫原性。


圖1ZJ971 S1288表達載體構建圖，S1288代表插入到載體pET-28a中的ZJ971 S1288基因；圖2M41 S1288表達載體構建圖，S1288代表插入到載體pET-28a中的J S1288基因；圖3 J S1309表達載體構建圖，S1309代表插入到載體pET-28a中的J S1309基因；圖4重組質粒pET-ZJ971-S1288的PCR和雙酶切鑒定圖；圖5重組質粒pET-M41-S1288的PCR和雙酶切鑒定圖；圖6重組質粒pET-J-S1309的PCR和雙酶切鑒定圖；圖7 ZJ971S1288蛋白SDS-PAGE(聚丙烯凝膠電泳)及Western-blotting(蛋白印跡)。ohr代表沒有加入誘導劑IPTG所取的樣品。1hr，2hr，3hr，4hr分別代表加入誘導劑后1，2，3，4小時所取樣品。蛋白印跡所用的一抗為鼠源抗His的單克隆抗體，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體。HRP的顯色底物為TMB.；圖8 M41 S1288 SDS-PAGE(蛋白聚丙烯凝膠電泳)及Western-blotting(蛋白印跡)。ohr代表沒有加入誘導劑IPTG所取的樣品。1hr，2hr，3hr，4hr分別代表加入誘導劑后1，2，3，4小時所取樣品。蛋白印跡所用的一抗為鼠源抗His的單克隆抗體，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體。HRP的顯色底物為TMB.；圖9J S1309 SDS-PAGE(蛋白聚丙烯凝膠電泳)及Western-blotting(蛋白印跡)。ohr代表沒有加入誘導劑IPTG所取的樣品。1hr，2hr，3hr，4hr分別代表加入誘導劑后1，2，3，4小時所取樣品。蛋白印跡所用的一抗為鼠源抗His的單克隆抗體，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體。HRP的顯色底物為TMB。
具體實施例方式截短表達的三株雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原，利用原核表達系統(tǒng)表達了三株IBVS1蛋白基因氨基端288bp、309bp部分，S1基因前的信號肽序列以及部分羧基端被去除，只保留靠近氨基端的288bp和309bp部分，并在大腸桿菌中得到表達。
截短表達的三株雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原的用途該三種截短的重組S1蛋白抗原可應用于瓊脂擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗，免疫熒光檢測、免疫組織化學、免疫印跡等檢測IBV感染后產(chǎn)生的抗體；截短表達的三株雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原可用于制備鼠源單克隆抗體或其他動物來源的多克隆抗體，應用血凝抑制實驗等來檢測IBV抗原的存在；截短表達的三株雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原可用于制備預防IBV的發(fā)生和流行的亞單位蛋白疫苗。
實施例1IBV S1蛋白抗原的截短表達與純化過程；一、IBV ZJ971(M41、J)培養(yǎng)及RNA的提取取ZJ971(M41、J)株種毒經(jīng)尿囊腔途徑接種于9-11日齡SPF雞胚，37℃溫箱孵育，收集24h-72h之間雞胚尿囊液，粗離后去除雜質，上清用30％PEG6000(含7.85％NaCl)沉淀，沉淀再用TEN(pH8.0)懸浮，RNA提取按Trizol試劑盒說明書進行；提取的RNA用于RT-PCR。
二、ZJ971-S1D(M41-S1D、J-S1D)基因的RT-PCR1、IBV ZJ971(M41、J)反轉錄取上述病毒RNA，加入12μmol/L的IBV ZJ971-S1D(M41-S1D、J-S1D)下游引物1μl，置70℃孵育5分鐘，取出置冰上；然后加入5×reaction buffer 4μl、20U/μl Rnasin 1μl、10mM dNTPs2μl，混勻后置37℃孵育5分鐘，取出置冰上；再加入200U/μlAMV-Rnase 1μl，混勻后置42℃孵育1小時。最后置70℃水浴10分鐘滅活AMV-Rnase，取出后立即用于PCR。
2、ZJ971-S1D(M41-S1D、J-S1D)基因的PCRPCR反應體系(25μl體系)10×PCR Buffer2.5μldNTPs Mixture 0.5μl上游引物 0.5μl下游引物 0.5μlcDNA模板 2ulddH2O 19μlPCR反應條件95℃預變性3min；94℃25s，45℃25s、72℃45，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min結束。
pIBV-ZJ971-S1D(P1)5’-GGAATTCGTITTGTATGACAGTAGTTCT-3’pIBV-ZJ971-S1D(P2)5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’pIBV-M41-S1D(P3)5’-GGGATCCGCTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’pIBV-M41-S1D(P4)5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’pIBV-J-S1D(P5)5’-GGGATCCAATTTGTITGATTCTGATAAT-3’pIBV-J-S1D(P6)5’-GAAGCTTTTAACAATGTGTAGCAAACAC-3’三、pET-ZJ971-S1D(pET-M41-S1D、pET-J-S1D)表達載體的構建1.PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，利用T-A克隆策略直接連接于pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉化E.coli TOP10感受態(tài)細胞，挑取單克隆，進行PCR鑒定。
2.以PCR鑒定正確的陽性克隆再進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進行純化后，經(jīng)EcoR I(BamH I)、Hind III雙酶切，回收目的片段并亞克隆于表達質粒pET-28a的EcoR I(BamH I)+Hind III酶切位點之間，構建重組表達質粒pET-ZJ971-S1D(pET-M41-S1D、pET-J-S1D)，轉化感受態(tài)宿主菌TOP10，抽取重組質粒進行PCR、雙酶切鑒定和序列測定。
四、IBV S1蛋白抗原基因的誘導表達將鑒定正確的重組質粒轉化BL21(DE3)宿主菌，挑取單克隆接種到含Kan抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例將培養(yǎng)物接種于含Kan抗性的液體LB培養(yǎng)基中，250rpm/min振蕩培養(yǎng)2小時左右，使OD600≈0.5，再按1∶100的比例加入終濃度為1mMIPTG誘導表達4小時，離心收集菌體。將菌體加入適量的1×SDS上樣緩沖液，采用15％的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，考馬斯亮蘭染色，觀察結果。結果在帶有pET-28a質粒的細菌經(jīng)誘導后表達了約14kD的融合蛋白。而對照細菌沒有相應的條帶。薄層掃描分析，該蛋白可占菌體蛋白總量的20-25％。
五、重組蛋白的測定Western-blotting分析表達蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素膜(NC)上，用含有5％(w/v)脫脂奶粉的PBS(PH＝7.4)37℃溫育1-2小時封閉NC膜；然后加入用5％脫脂奶粉稀釋的抗His鼠源單克隆抗體于37℃溫育1小時；PBST洗滌膜3次后，再加入用含5％(w/v)脫脂奶粉稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG二抗于37℃溫育1小時；PBST洗滌膜3次后，加入TMB顯色液進行顯色，結果能觀察到特異性的反應條帶。
截短表達的三株雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原，利用原核表達系統(tǒng)克隆表達了三株禽傳染性支氣管炎S1蛋白基因氨基端288bp和309bp部分，表達產(chǎn)物經(jīng)純化后用作診斷IBV感染的抗原，S1基因信號肽序列和部分羧基端去除，只保留了位于信號肽序列后的近氨基端部分S1基因，并在大腸桿菌中表達。
六、重組蛋白的純化按已經(jīng)優(yōu)化的表達條件，表達IBV-ZJ971-S1D(IBV-M41-S1D、IBV-J-S1D)菌液100ml，收獲菌液4℃，以8000rpm/min，離心20min，菌體沉淀用裂解液Buffer B(pH8.0)重懸，超聲波處理40次，冰上放置10分鐘，然后轉入細胞培養(yǎng)瓶中振搖1.5小時，然后4℃，10000rpm，離心15min，棄沉淀保留上清。將上清過裝有1mL瓊脂糖填料的Ni-NTA Argarose純化柱中，依次用洗滌液Buffer C(pH6.3)、洗脫液Buffer D(pH5.9)和Buffer E(pH4.5)，分別收集用洗脫液洗下來的樣品D1、D2、D3、D4和E1、E2、E3、E4然后進行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析表明，目的蛋白在洗脫下來的E1～E4中，其中以E2和E3中的含量最高。
實施例2截短表達的三株雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白作為診斷抗原具體過程將重組菌誘導大量表達后，離心收集菌體用裂解液Buffer B(pH8.0)重懸沉淀，超聲波破碎后離心，上清用Ni-NTA Argarose柱純化，用此純化的表達產(chǎn)物用PH8.5 Tris-Cl包被緩沖液稀釋后包被酶標反應板，先在37℃孵育2小時，然后在4℃吸附16～18小時。PBST洗滌3次，每次10分鐘。用含5％脫脂奶粉的PBST封閉2小時，同上洗滌。將待測IBV陽性血清和SPF雞的陰性血清分別用PBS作2倍倍比連續(xù)稀釋后加入孔中，在37℃作用1小時，同上洗滌。用辣根過氧化物標記的羊抗雞IgG的二抗(1∶3000)加入各孔中，作用1小時，同上洗滌。然后加入用底物緩沖溶液稀釋的TMB，顯色10～15分鐘。最后每孔加入50μL的2M H2SO4終止反應。酶標檢測儀在450nm波長下讀取各孔的光密度值，P/N比值＞2.1判為陽性。結果重組表達的蛋白可與待檢雞陽性血清發(fā)生反應，但與陰性血清不反應。本項發(fā)明可取代IBV全病毒用于檢測IBV感染以及IBV疫苗免疫所產(chǎn)生的抗體水平。
實施例3三種截短的重組S1蛋白抗原具有較強的免疫原性，可制備IBV基因工程亞單位蛋白疫苗利用此三種截短的重組S1蛋白抗原制備的鼠源單抗和IBV共同接種9～11日齡的SPF雞胚，同時設單獨接種IBV實驗對照組，每組6枚雞胚，結果接種有鼠源單克隆抗體組中有4枚得到了有效保護，而實驗對照組的雞胚發(fā)生傳染性支氣管炎特征性的病變或死亡，有力地證實了所表達的重組蛋白抗原具有較強的免疫原性，能產(chǎn)生中和IBV感染的中和抗體，從而可用截短的重組S1蛋白抗原可制備IBV的基因工程亞單位蛋白疫苗。
序列表(1)SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征長度288個堿基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞傳染性支氣管炎病毒(d)序列描述SEQ ID NO.1SEQ ID NO.1GTTTTGTATGACAGTAGTTCTTACGTGTACTACTACCAAAGTGCCTTCAGACCACCTGATGATTGGCATTTACATGGGGGTGCGTATGCGGTTGTTAATATTTCTAGTGAATCTAATAATGCAGGCTCTTCATCTGGGTGTACTGTTGGTATTATTGATGGTGGTCGTGTTGTTAATGCTTCTTCTATAGCTATGACGGCACCGTCATCAGGTATGGCTTGGTCTAGCAGTCAGTTTTGTACTGCATACTGTAACTTTTCAGATACTACAGTGTTTGTTACACATTGT(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征長度288個堿基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞傳染性支氣管炎病毒(d)序列描述SEQ ID NO.2SEQ ID NO.2GCTTTGTATGACAGTAGTTCTTACGTTTACTACTACCAAAGTGCCTTTAGACCACCTAATGGTTGGCATTTACACGGGGGTGCTTATGCGGTAGTTAATATTTCTAGCGAATCTAATAATGCAGGCTCTTCACCTGGGTGTATTGTTGGTACTATTCATGGTGGTCGTGTTGTTAATGCTTCTTCTATAGCTATGACGGCACCGTCATCAGGTATGGCTTGGTCTAGCAGTCAGTTTTGTACTGCACACTGTAACTTTTCAGATACTACAGTGTTTGTTACACATTGT(3)SEQ ID NO.3的信息(a)序列特征長度309個堿基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞傳染性支氣管炎病毒(d)序列描述SEQ ID NO.3SEQ ID NO.3AATTTGTTTGATTCTGATAATTATGTGTACTACTACCAAAGTGCCTTTAGACCACCAAATGGATGGCATTTGCATGGGGGTGCTTATGCAGTAGTGAATTCTACTACTAAAACTAACAATGCAGGCGACGCTGCCGAGTGTTCTGTAGGTGTTCTTTTTAATTATACTAACGGAAAAGACGTTGGTTATAATAATAATGCTTCTTCCGTAGCCATGACAGCACCGTTGTCTGGTATGTCTTGGTCTAAATCAGAATTTTGTACTGCCCACTGTAACTTTTCGGATTTTACAGTGTTTGCTACACATTGT(4)SEQ ID No.4的信息(a)序列特征長度96個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性(b)分子類型多肽(c)序列描述SEQ ID No.4SEQ ID NO.4VLYDSSSYVYYYQSAFRPPDDWHLHGGAYAVVNISSESNNAGSSSGCTVGIIDGGRVVNASSIAMTAPSSGMAWSSSQFCTAYCNFSDTTVFVTHC(5)SEQ ID No.5的信息(a)序列特征
長度96個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性(b)分子類型多肽(c)序列描述SEQ ID No.5SEQ ID NO.5ALYDSSSYVYYYQSAFRPPNGWHLHGGAYAVVNISSESNNAGSSPGCIVGTIHGGRVVNASSIAMTAPSSGMAWSSSQFCTAHCNFSDTTVFVTHC(6)SEQ ID No.6的信息(a)序列特征長度96個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性(b)分子類型多肽(c)序列描述SEQ ID No.6SEQ ID NO.6NLFDSDNYVYYYQSAFRPPNGWHLHGGAYAVVNSTTKTNNAGDAAECSVGVLFNYTNGKDVGYNNNASSVAMTAPLSGMSWSKSEFCTAHCNFSDFTVFATHC
權利要求
1.一種雞傳染性支氣管炎病毒S1重組蛋白抗原、其特征在于IBV核糖核酸為模板，通過反轉錄聚合酶鏈式反應擴增獲得截短IBV S1核苷酸序列，并克隆于大腸桿菌原核表達載體pET-28a，轉化入大腸桿菌BL21宿主細胞后用IPTG誘導表達，經(jīng)Ni-NTA Argarose純化，獲得截短表達的IBV S1蛋白抗原。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎病毒S1重組蛋白抗原，其特征在于所述的IBV S1核苷酸序列具有SEQ ID No.1～3所示的核苷酸序列，并分別編碼具有SEQ IDNo.1～3所示的多肽序列。
3.一種雞傳染性支氣管炎病毒S1重組蛋白抗原的制備方法，其特征在于，方法的步驟如下1)分別以IBV ZJ971株或M41株或J株的核糖核酸為模板，分別以pIBV-ZJ971-S1D5’-GGAATTCGTTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’；pIBV-ZJ971-S1D5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’；或pIBV-M41-S1D5’-GGGATCCGCTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’；pIBV-M41-S1D5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’；或pIBV-J-S1D5’-GGGATCCAATTTGTTTGATTCTGATAAT-3’；pIBV-J-S1D5’-GAAGCTTTTAACAATGTGTAGCAAACAC-3’；為引物，通過反轉錄聚合酶鏈式反應方法擴增分別獲得三株IBV截短的S1核苷酸序列；2)將上述三株IBV截短S1核苷酸序列分別插入到原核表達載體pET-28a，分別獲得含有三株IBV截短的S1核苷酸序列的重組原核表達載體；3)將含上述三株IBV截短的S1核苷酸序列的重組載體分別轉化宿主細胞BL21(DE3)，并用IPTG誘導表達；4)誘導表達的蛋白分別經(jīng)Ni-NTA Argarose純化得到純的三株IBV截短表達S1蛋白抗原。
4.一種雞傳染性支氣管炎病毒S1重組蛋白抗原的用途，其特征在于，雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白抗原應用于酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IBV感染產(chǎn)生的抗體或者用于制備IBV基因工程亞單位蛋白疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞傳染性支氣管炎病毒S1重組蛋白抗原、制備方法及其用途。這些核苷酸序列分別由SEQ ID NO.1～3所示。本發(fā)明提供了含有編碼3種截短S1蛋白的原核表達方法，分別能夠表達三株IBV(ZJ971株，M41株，J株)S1蛋白氨基端288bp或309bp部分片段，提供了三株IBV S1蛋白表達產(chǎn)物的純化方法。用IBV陽性血清檢測，表達的部分S1蛋白具有很好的抗原反應性，可作為診斷抗原應用于瓊脂擴散診斷技術，酶聯(lián)免疫吸附試驗，免疫熒光檢測，免疫組織化學檢測等檢測IBV感染或免疫產(chǎn)生的抗體。此外，表達的部分S1蛋白還可進一步制備單克隆抗體、多克隆抗體利用ELISA等實驗方法來檢測IBV抗原的存在或配以適當疫苗佐劑制備亞單位疫苗。
文檔編號G01N33/535GK1763085SQ20051006137
公開日2006年4月26日 申請日期2005年11月2日 優(yōu)先權日2005年11月2日
發(fā)明者周繼勇, 吳建祥, 胡金強, 張德勇 申請人:浙江大學