專利名稱：制備高密度陣列的方法
背景固定化的天然或合成的目標物質(zhì)的高密度陣列允許在同一時間篩選分析物中是否存在特定的性質(zhì)。已在許多技術領域證明了這種高密度陣列的用途，包括化學、遺傳學、免疫學、材料科學、醫(yī)藥、分子生物學和藥理學。例如，核酸高密度陣列可用于證實基因序列，檢測遺傳突變的存在與否，以及定性和定量檢測基因產(chǎn)物的差異表達。類似地，肽高密度陣列可用于繪制引發(fā)免疫應答的表位序列圖譜。此外，目標物質(zhì)陣列可用于鑒定用來開發(fā)藥物的化合物。
目前，用于構建待測物的高密度陣列的方法一般有兩種。第一種，是將預制的天然或合成目標物質(zhì)(如生物分子)單獨地直接施加于支持物上的特定位置。支持物包括硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚二氟乙烯膜、玻璃、硅或其它材料，可通過將支持物暴露于紫外線照射或通過焙烤支持物或其它技術將目標物質(zhì)固定于支持物上。一種這樣的方法公開于Pietu等人，“通過高密度cDNA陣列的定量雜交揭示的人肌肉中優(yōu)勢表達的新基因轉(zhuǎn)錄子”，基因組研究(Genome Research)，(1996)6492-503，此處全文引入作為參考。已設計了多種設備以使應用方法自動化。
第二種構建高密度陣列的方法涉及，于支持物的特定位點上原位合成單獨的目標物質(zhì)。在一種這樣的方法中，使用光合成化學以在支持物上獨特位點處同時制備一系列不同的目標物質(zhì)。在另一種這樣的方法中，通過物理性地掩蔽或封閉支持物上的所選區(qū)域，且在未掩蔽的支持物上的部分進行所需化學合成反應，合成了目標物質(zhì)。這種方法的實例公開于Fodor等人，“光指導的空間上可確定的平行化學合成”，科學，(1991)，251767-777；美國專利5,436,327；Southern E.M.等人，“通過與寡核苷酸陣列雜交分析并比較核酸陣列；利用實驗模型評價”，基因組學(Genomics)，1992，131008-1017，此處全文引入作為參考。
上述兩種高密度陣列構建方法均有許多缺點。首先，一次僅能制備相對有限數(shù)量的相同陣列。第二，很難在生產(chǎn)中檢查由這些方法制備的陣列以確定生產(chǎn)步驟的完整性。第三，用目前的方法無法將許多潛在的目標物質(zhì)施加于支持物上，也不能于支持物上原位合成。另外，未描述由多于一種化學種類的待測物組成的陣列，如肽和核酸待測物組成的陣列。還有，這些方法僅能在具有相對有限厚度的片層上制備目標物質(zhì)陣列。再者，每種方法只能制備區(qū)域面積尺寸相對有限的目標物質(zhì)陣列。
因此需要制備高密度陣列的替代方法，其不具有已知高密度陣列制備方法中固有的缺陷。例如，該方法應能優(yōu)選地可同時、快速且經(jīng)濟地制備大量相同的陣列。該方法應能使用多種多樣的目標物質(zhì)和支持物，包括不能被目前方法摻入陣列的待測物和支持物。該方法應能以多種厚度和尺寸制備多于二維的陣列，且可為除了平面形狀之外的形狀。另外，該方法應可制備具有多種目標物質(zhì)區(qū)域面積的陣列，包括在一塊陣列上不同目標物質(zhì)的不相類似的尺寸的區(qū)域。而且，該方法應能制備來自不同類型或化學種類的待測物的高密度陣列，如肽和核酸待測物的陣列。此外，該方法應能使用預制的目標物質(zhì)(或需要時于原位合成的目標物質(zhì))以結合這些方法的優(yōu)點。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種制備目標物質(zhì)的高密度陣列的方法，包括切割一束目標線的步驟，其中目標線包含目標物質(zhì)，其中切割得到高密度陣列。該方法也包括穩(wěn)定化線束，向線束中摻入其它物質(zhì)，及檢查高密度陣列的步驟。
本發(fā)明還提供了一種通過切割含有多個目標線的線束制備的高密度陣列，其中多個目標線包含目標物質(zhì)。高密度陣列可具有存在于一個、兩個或三個笛卡爾坐標上的目標物質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種制備高密度陣列的方法，包括將包含目標物質(zhì)線的膜卷曲或堆疊以制備線束的步驟。還提供了利用根據(jù)本發(fā)明制備的高密度陣列確證基因序列、檢測遺傳突變的存在與否、定性或定量檢測基因產(chǎn)物的差異表達、繪制引發(fā)免疫應答的表位序列圖譜、或用于鑒定用來開發(fā)藥物的化合物的方法。
參考下列描述、所附權利要求書及附圖可更好地理解本發(fā)明的特點、方面和優(yōu)點，其中圖1-圖3，描繪用包含本發(fā)明的目標物質(zhì)的纖維束制備高密度陣列；圖4-圖5，描繪用含膜的線束制備高密度陣列，其中膜具有根據(jù)本發(fā)明施加于膜上的目標物質(zhì)的線；圖6-圖8，描繪用包含多個膜的線束制備高密度陣列，其中膜具有根據(jù)本發(fā)明施加于膜上的已知目標物質(zhì)的線；圖9-圖11，描繪用包含卷曲膜的線束制備高密度陣列，其中膜具有根據(jù)本發(fā)明施加于膜上的已知目標物質(zhì)的線；圖12-圖14，描繪用包含管的線束制備高密度陣列，其中根據(jù)本發(fā)明管用目標物質(zhì)填充；圖15是放射自顯影圖，顯示于依本發(fā)明制備的陣列上進行的雜交研究結果；以及圖16是放射自顯影圖，顯示于依本發(fā)明制備的另一個陣列上進行的雜交研究結果。
發(fā)明描述根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了一種制備目標物質(zhì)的高密度陣列的方法，其用于測定分析物的身分或性質(zhì)，或用于測定目標物質(zhì)的身分或性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供了用于測定分析物的身分或性質(zhì)，或用于測定目標物質(zhì)的身分或性質(zhì)的目標物質(zhì)的高密度陣列。
如此處所用，術語“目標物質(zhì)”是指有能力與一種或多種目標分析物相互作用的高密度陣列的成分。目標物質(zhì)可為原子、分子、復合化學物、細胞器、病毒、細胞或其它材料，或這些物質(zhì)的組合，或參考此處所述可為本領域技術人員理解的其它物質(zhì)。例如，依本發(fā)明的高密度陣列的目標物質(zhì)可選自一種或多種原子，如鋅、硫和金；生物分子如多核苷酸、DNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂類、免疫球蛋白及其合成類似物與變異體；病毒；亞細胞成分如顯微解剖的染色體和線粒體；細胞，包括原核細胞、古細菌和真核細胞；以及其它材料，如金屬合金、陶瓷、玻璃、半導體、超導體、塑料、聚合材料、木材、織物和凝結物。
如此處所用，術語“分析物”是指通過在根據(jù)本發(fā)明的高密度陣列上與目標物質(zhì)相互作用待測定身分或性質(zhì)的那些物質(zhì)?；蛘哳愃频?，可使用分析物通過與在根據(jù)本發(fā)明的高密度陣列上與目標物質(zhì)相互作用測定目標物質(zhì)的身分或性質(zhì)。還可從如目標物質(zhì)的相同組中選擇分析物，如蛋白質(zhì)或核酸，或其可是一種物理或環(huán)境條件，如選自溫度、pH或鹽濃度的一種或多種條件。
如此處所用，術語“目標線”是指目標物質(zhì)的線。這些線全部由一種或多種目標物質(zhì)構成，或可含有一種或多種帶有支持物或容器的目標物質(zhì)。目標物質(zhì)可吸附于、結合于、包埋入或包被在支持物上，或含于容器中。例如，目標線包括目標物質(zhì)(如金屬合金、凝結物或塑料)的澆鑄棒(cast rod)，或可包括吸附于玻璃纖維或絲線上的目標物質(zhì)，結合于聚合纖維的、包埋入多孔棒、包被于金屬絲或含于明膠基質(zhì)中的目標物質(zhì)。另外，目標線可包含書寫、刻劃、印制或模壓在玻璃載玻片(或諸如聚合物薄平面板的膜、或等效支持物)上的目標物質(zhì)的線。另外，目標線可包括結合于管內(nèi)側(cè)的目標物質(zhì)。
如此處所用，術語“基質(zhì)”指目標物質(zhì)可包埋入的或可結合于其上的材料以提供額外的結構性支持，作為間隔基，將目標物質(zhì)展示給分析物，或影響目標物質(zhì)與分析物之間的相互作用，如通過將目標物質(zhì)相互之間電絕緣?；|(zhì)可為聚合材料，如一種或多種選自氣溶膠、瓊脂糖、白蛋白、明膠、水凝膠和聚丙烯酰胺的物質(zhì)。
如此處所用，術語“束”指一種有序排列或裝配的目標線。例如，一束可包括一堆目標線，其中每個目標線包含用目標物質(zhì)填充的管，或其中每個目標線包含刻劃于膜上的目標物質(zhì)的線，或其中每個目標線包含目標物質(zhì)的線。
制備高密度陣列的方法依本發(fā)明制備高密度陣列的方法，包括步驟a)裝配目標線束，和步驟b)切割線束產(chǎn)生陣列。另外，該方法可包括穩(wěn)定化目標線或線束的步驟。再有，該方法可包括將一種或多種其它材料摻入高密度陣列的步驟。還有，該方法可包括檢查高密度陣列的步驟。
裝配目標線束可通過多種方法制備陣列束。例如，首先，通過用目標物質(zhì)或與一種基質(zhì)結合的目標物質(zhì)填充管制備目標線束。目標物質(zhì)可不經(jīng)與基質(zhì)化學結合而包封于基質(zhì)中，或可通過共價結合、離子相互作用、氫鍵或其它形式的結合而結合到基質(zhì)上。然后，排列管，將其基本上沿長軸固定形成目標線束。
還可首先通過用目標物質(zhì)包被或包埋一種支持物(諸如膜、纖維、管或棒)；或用自來水鋼筆尖(如用藝術家的鴉羽管)或噴槍(air brush)將目標物質(zhì)溶液加至支持物上；或通過噴墨打印機的方法將目標物質(zhì)溶液模壓于或熱轉(zhuǎn)移于支持物上。然后，將這些支持物堆積、卷曲或折疊以制備目標線束。所得線束含有目標物質(zhì)的行列，其相對于所用目標物質(zhì)的長軸平行排列。
切割線束以制備陣列裝配后，切割線束以制備陣列?？捎蔑@微切片機、激光、鋸、熱線(hot wire)或其它工具，或參照此處公開可為本領域技術人員理解的其它方法切割線束。切割可產(chǎn)生具有多種任意厚度的目標物質(zhì)的高密度陣列。例如，陣列可具有厚度為約0.1μm至約1mm或更厚的目標物質(zhì)。此外，與現(xiàn)有已知的制備陣列的方法不同，此處公開的方法可方便的制備具有目標物質(zhì)厚度大于50μm的陣列。這是一種優(yōu)點，因與在較薄陣列上的目標物質(zhì)產(chǎn)生的信號相比，這樣可增加由目標物質(zhì)產(chǎn)生的信號。
在一個優(yōu)選實施方案中，裝配的線束具有長軸基本上相互平行的目標線，且線束被以基本上垂直于目標線長軸的方式切割，以產(chǎn)生高密度陣列。切割也可以除了基本上垂直于目標線長軸以外的角度進行，例如，從cyclindrical束制備橢圓形陣列。
根據(jù)線束形狀及切割方向，切割步驟可產(chǎn)生具有一種、兩種或三種解析坐標(analytic axe)的高密度陣列，即高密度陣列帶有位于一個、兩個或三個位于笛卡爾坐標的目標物質(zhì)。例如，通過橫切具有位于單一平面上的目標物質(zhì)的線束可得有一個解析坐標軸的陣列。通過橫切具有位于多個平面上的目標物質(zhì)的線束可得有兩個解析坐標軸的陣列。通過結合多個單一解析坐標軸的陣列可制備具有兩個解析坐標軸的陣列。通過結合多個單一解析坐標軸的陣列，或通過結合單一解析坐標軸陣列與兩個解析坐標軸的陣列，或通過結合多個具有兩個解析坐標軸的陣列，可制備具有三個解析坐標軸的陣列。
例如，具有一個解析坐標軸的高密度陣列可通過如此切割這樣的線束制備，其中線束由通過在平面膜上以平行線沉積目標物質(zhì)制成的目標線形成，而切割是在垂直于由線所形成的平面的平面上進行。類似地，具有兩個解析坐標軸的高密度陣列可通過如此切割這樣的線束制備，其中線束由包含堆疊膜的目標線形成，其中每個膜上有以平行線沉積的目標物質(zhì)，而切割是在垂直于目標物質(zhì)線長軸的平面上進行。此外，可通過堆疊由上述切割制備的具有兩個解析坐標軸的多個高密度陣列，制備具有三個解析坐標軸的高密度陣列。
穩(wěn)定化目標線束根據(jù)本發(fā)明制備高密度陣列的方法可還包括穩(wěn)定化目標線束的步驟。穩(wěn)定可改善線束或陣列的形式或功能，如使線束更易于切割，或易于從陣列中將目標物質(zhì)彼此分隔開。可于目標線束裝配過程中或裝配后的任何時間進行穩(wěn)定化步驟，只要適于穩(wěn)定的類型即可。例如，穩(wěn)定可通過將目標線束包埋于如環(huán)氧、聚丙烯或聚苯乙烯基質(zhì)中完成。向高密度陣列摻入其它材料依本發(fā)明制備高密度陣列的方法還可包括在目標線束裝配過程中或之后(包括切割步驟后)向高密度陣列摻入一種或多種其它材料的步驟。這些材料可改善高密度陣列的形式或功能。例如，摻入步驟可包括添加抗氧化劑或微生物抑制劑或其它物質(zhì)，以使高密度陣列在一定時間內(nèi)維持穩(wěn)定。
另外，摻入步驟可包括向基質(zhì)中加入降低背景噪音的物質(zhì)，如非熒光計數(shù)染料(counterstain)，或增加檢測信號的物質(zhì)。類似地，摻入步驟可包括向基質(zhì)中添加閃爍劑以促進放射活性分析物的檢測。還有，摻入步驟可包括向基質(zhì)中加入用于特定檢測模式所需的輔因子，如用于酶促顏色形成所需的次級酶，或可增強熒光標記檢測的能量轉(zhuǎn)移染料。另外，由此處公開的方法制備的高密度陣列的表面可用銀或其它反射性材料包被，以增強可用于檢測的光量。
檢查高密度陣列根據(jù)本發(fā)明制備高密度陣列的方法還可包括檢查高密度陣列的步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，檢查步驟選自用或不用放大的可見光檢查、化學沉積、電探查、機械感應和磁感應。在另一實施方案中，檢測步驟包括將陣列置于緊鄰一系列叉指型(interdigitated)電極處，測量由于高密度陣列上的目標物質(zhì)與叉指型電極相互作用造成的電容改變。
從包含纖維的線束中制備高密度陣列在一個實施方案中，從包含纖維(fiber)或線(thread)的目標線束中制備高密度陣列。所述纖維或線可含有天然或合成材料(選自棉、絲、尼龍或聚酯)，或是參照此處公開可為本領域技術人員理解的其它材料。
在一個優(yōu)選實施方案中，目標線束是通過直接將纖維浸滲目標物質(zhì)的水溶液中制備的。將一系列這種纖維用不同的目標物質(zhì)浸滲，于數(shù)據(jù)庫中記錄每種纖維所含目標物質(zhì)的身分。洗滌纖維以洗脫未結合的目標物質(zhì)，并用非干擾性物質(zhì)封閉纖維及固定化的目標物質(zhì)上的非特異性結合位點。干燥纖維以將封閉劑固定于纖維及固定化的目標物質(zhì)上。
將纖維裝配成線束，并將每一纖維及其結合的固定化目標物質(zhì)記錄于數(shù)據(jù)庫。優(yōu)選地通過包埋或?qū)⒕€束浸入基質(zhì)來穩(wěn)定纖維束，從而提供了對線束的結構性支持。
然后利用適當?shù)难b置以基本上垂直于纖維長軸的方式切割線束，提供多個高密度陣列。優(yōu)選地，切割得到了多個相同的高密度陣列。每一陣列上的目標物質(zhì)的身分和位置均通過數(shù)據(jù)庫中的信息顯示蹤跡。這些陣列可用于在同一時間篩選分析物中特定性質(zhì)的存在與否，或結合此處的公開如本領域技術人員所理解可用于其它目的。
參照圖1-3，其中分別顯示了目標線10包含一系列用已知目標物質(zhì)浸滲的經(jīng)包被的纖維12；包埋于基質(zhì)14的目標線10并被裝配成線束16；以及經(jīng)切割的線束16以制備多個相同的高密度陣列18，其中每一陣列具有位于兩個解析坐標軸上的目標物質(zhì)。
從包含膜的線束中制備高密度陣列在一個實施方案中，從包含膜的線束中制備高密度陣列。膜可包含聚合物質(zhì)的薄平面片層，或可包含參照此處公開可為本領域技術人員理解的其它材料。
在一個優(yōu)選實施方案中，線束是通過將含有目標物質(zhì)的組成成分之線通過書寫、刻劃、印制或模壓施加于膜上而制備的。于數(shù)據(jù)庫中記錄每種目標物質(zhì)的身分和位置。如需要可處理膜，以將目標物質(zhì)固定于膜上。
可切割以此種方法制備的膜，以制備多個高密度陣列，每一陣列具有以一個解析坐標軸排列的目標物質(zhì)。參照圖4和5，其中分別顯示了線束20包含具有其上施加了已知目標物質(zhì)24的線的膜22；以及經(jīng)切割的線束20以制備多個高密度陣列26，其中每一陣列具有位于一個個解析坐標軸上的目標物質(zhì)。
或者，可將如此制備的多個膜以如數(shù)據(jù)庫中記錄的每一固定化的目標物質(zhì)之身分和位置裝配入線束。裝配可包括卷曲或折疊膜，或可包括堆疊多個浸滲了目標物質(zhì)的膜。如需要，通過將線束包埋或浸滲入基質(zhì)中穩(wěn)定線束，以提供對線束的結構性支持。
然后利用適當?shù)难b置以基本上垂直于膜上目標物質(zhì)線的長軸的方式切割線束，提供多個高密度陣列，其中每一陣列具有排列于兩個解析坐標軸上的目標物質(zhì)。優(yōu)選地，切割得到了多個相同的高密度陣列。目標物質(zhì)的身分和位置均通過數(shù)據(jù)庫中的信息顯示蹤跡。這些陣列可用于在同一時間篩選分析物中特定性質(zhì)的存在與否，或結合此處的公開如本領域技術人員所理解可用于其它目的。
參照圖6-8，其中分別顯示了多個膜28具有施加于各個膜28上的目標物質(zhì)線30；堆疊并穩(wěn)定膜28以形成線束32；以及切割線束32以制備多個高密度陣列34，其中每一陣列具有排列于兩個解析坐標軸上的目標物質(zhì)28。
參照圖9-11，其中分別顯示了膜36具有施加于膜36上的已知目標物質(zhì)線38；卷曲并穩(wěn)定膜36以形成線束40；以及切割線束40以制備多個高密度陣列42，其中每一陣列具有排列于兩個解析坐標軸上的目標物質(zhì)38。
從包含管的線束中制備高密度陣列在一個實施方案中，從包含管的目標線中制備高密度陣列。管可包括聚酰亞胺、尼龍、聚丙烯、聚氨基甲酸乙酯、硅酮、乙基乙烯基乙酸酯、不銹鋼、銅、玻璃或熔凝硅石，或是參照此處公開可為本領域技術人員理解的其它材料。
在一個優(yōu)選實施方案中，通過用目標物質(zhì)的水溶液包被管內(nèi)側(cè)制備目標線，使得目標物質(zhì)被吸附、結合或共價結合于管的內(nèi)表面?；蛘撸捎煤谢虿缓裼诨|(zhì)中的目標物質(zhì)之目標物質(zhì)填充管。通過用不同目標物質(zhì)包被或填充管制備一系列這種管，并將每一目標線及其含有的目標物質(zhì)的身分記錄于數(shù)據(jù)庫。
依記錄在數(shù)據(jù)庫中的每一管的位置及其結合的目標物質(zhì)將各個管裝配成線束。優(yōu)選地通過將線束包埋于基質(zhì)中來穩(wěn)定管的線束，從而對線束提供結構性支持。
然后利用適當?shù)难b置以基本上垂直于管的長軸的方式切割線束，提供多個高密度陣列。優(yōu)選地，切割得到了多個相同的高密度陣列。目標物質(zhì)的身分和位置均通過數(shù)據(jù)庫中的信息顯示蹤跡。這些陣列可用于在同一時間篩選分析物中特定性質(zhì)的存在與否，或結合此處的公開如本領域技術人員所理解可用于其它目的。
參照圖12-14，其中分別顯示了目標線44包含一系列用已知目標物質(zhì)48填充的管46；包埋于基質(zhì)50中的目標線44被裝配成線束52；以及經(jīng)切割的線束52用于制備高密度陣列54，其中每一陣列具有位于兩個解析坐標軸上的目標物質(zhì)48。
實施例1 含有DNA包被的線之高密度陣列的制備及用途根據(jù)本發(fā)明從含有纖維或線的線束中制備高密度陣列的方法用于制備如下DNA目標物質(zhì)的高密度陣列。通過將線浸入水中評估了棉線的可濕潤性。在線表面上成珠的水表明其表面上帶有可對用于制備線束的線的可濕潤性產(chǎn)生負面影響的結合物、油或其它材料。如果在可濕潤性檢測中存在成珠現(xiàn)象，則應將線于甲醇、乙醇或其它適當?shù)目膳c水混溶的溶劑中進行洗滌，以除去不希望的材料。然后將線置于水中，經(jīng)過數(shù)次水交換，直至每一線均充分濕潤。
然后，將線轉(zhuǎn)移入諸如聚L-賴氨酸的聚合陽離子物質(zhì)的水溶液中，與聚L-賴氨酸溶液平衡數(shù)小時。從聚L-賴氨酸溶液中移出線并干燥，將聚L-賴氨酸固定于線的表面。固定后，于緩沖液中洗滌線，更換緩沖液數(shù)次。從緩沖液中移出線并干燥。
然后，根據(jù)待構建的線束尺寸將線束切割成從數(shù)厘米至數(shù)米的不同長度。優(yōu)選的將用于線束的每一線切割成相同長度。
然后，將每一切割的線置于具有特定已知序列DNA(待固定化的目標物質(zhì))的溶液中。優(yōu)選地，對每一線而言DNA序列不同。如果用于核酸雜交研究，所用的DNA優(yōu)選地為單鏈，但也可為雙鏈形式。DNA可來自天然來源如質(zhì)粒制劑、酵母人工染色體、BAC文庫、YAC文庫或其它DNA文庫(如表達序列標簽，EST)，也可通過聚合酶鏈反應或其它合成方法合成制備。將線與DNA溶液溫育數(shù)分鐘至數(shù)小時的時間，這可根據(jù)DNA充分浸潤線上可得的結合位點的需要。
于約60℃的灶中干燥DNA包被的線一段足以將DNA固定至線上的時間?；蛘?，可通過將干燥的DNA包被的線用100％乙醇或甲醇濕潤數(shù)分鐘然后使線干燥，將DNA固定于線上。將每一線的身分和其固定化DNA目標物質(zhì)的序列記錄于數(shù)據(jù)庫。然后，單獨于諸如1x TE緩沖液(10mMTris，1mM EDTA，pH7.6)中洗滌線以從線上除去未結合的DNA。再次干燥DNA包被的線。
然后，根據(jù)記錄在數(shù)據(jù)庫中之線束中每一線的位置及其結合的DNA，通過將線平行并彼此相鄰地排列，裝配DNA包被的線的線束。通過將其包埋于下列基質(zhì)中穩(wěn)定線束，這些基質(zhì)如聚甲基丙烯酸酯、環(huán)氧樹脂、聚乙二醇、石蠟、橡膠、聚丙烯酰胺和其它材料，可優(yōu)選地于高溫下以液體形式處理，或以適于包埋線的非聚合形式處理。使包埋的線硬化，或使其交聯(lián)以賦予線束剛性結構。
在一個優(yōu)選實施方案中，通過用基質(zhì)不能滲透的諸如明膠、蔗糖或聚乙烯醇的物質(zhì)包被線，以防止線被包埋基質(zhì)完全浸滲或隔絕固定化的DNA。通過將帶有固定化的DNA之線于含有約0.01％-約10％重量百分比的所述物質(zhì)之溶液中濕潤，并在被包埋入基質(zhì)前使線干燥來實現(xiàn)這一點。
然后用顯微切片機或類似儀器以垂直于線長軸的方式切割穩(wěn)定化的線束，產(chǎn)生優(yōu)選地具有厚度約為0.1至100μm的多個高密度陣列。每一所得高密度陣列具有位于陣列上特定空間區(qū)域或區(qū)帶的相同DNA模式，目標物質(zhì)排列在兩個解析坐標軸上。
這種DNA陣列的一種用途，是在與陣列中單鏈DNA目標物質(zhì)互補之樣品中檢測標記的DNA序列，方法是通過在雜交條件下將樣品與陣列溫育足以使雜交發(fā)生的一段時間。洗滌除去未雜交的DNA。然后檢測標記，測定產(chǎn)生信號的區(qū)帶。將這些區(qū)帶與含有陣列上DNA目標物質(zhì)身分的數(shù)據(jù)庫比較，確立樣品中標記DNA的身分。
實施例2 含有肽包被的線之高密度陣列的制備及用途根據(jù)本發(fā)明從含有纖維或線的線束中制備高密度陣列的方法用于制備如下肽目標物質(zhì)的高密度陣列。通過將線浸入水中評估了棉線的可濕潤性。在線表面上成珠的水表明其表面上帶有可對用于制備線束的線的可濕潤性產(chǎn)生負面影響的結合物、油或其它材料。如果在可濕潤性檢測中存在成珠現(xiàn)象，則應將線于甲醇、乙醇或其它適當?shù)目膳c水混溶的溶劑中進行洗滌，以除去不希望的材料。然后將線置于水中，經(jīng)過數(shù)次水交換，直至每一線均充分濕潤。
然后，將線轉(zhuǎn)移入諸如聚L-賴氨酸的聚合陽離子物質(zhì)的水溶液中，與聚L-賴氨酸溶液平衡數(shù)小時。從聚L-賴氨酸溶液中移出線并干燥，將聚L-賴氨酸固定于線的表面。固定后，于緩沖液中洗滌線，更換緩沖液數(shù)次。從緩沖液中移出線并干燥。
然后，根據(jù)待構建的線束尺寸將線束切割成從數(shù)厘米至數(shù)米的不同長度。優(yōu)選的將用于線束的每一線切割成相同長度。通過水溶液的可濕潤性評價棉線。將線轉(zhuǎn)移入含有諸如聚L-賴氨酸的聚合陽離子物質(zhì)的水溶液中，與聚L-賴氨酸溶液平衡數(shù)小時。從聚L-賴氨酸溶液中移出線并干燥，將聚L-賴氨酸固定于線的表面。固定后，于緩沖液中洗滌線，更換緩沖液數(shù)次。從緩沖液中移出線并干燥。
然后，將每一切割的線置于具有特定已知序列的肽(待固定化的目標物質(zhì))的二甲亞砜(DMSO)溶液中。優(yōu)選地，對每一線而言肽不同。用做目標物質(zhì)的單獨的肽可為市售，或可用Merifield合成制備(如Bodanszky，M和Troust，B.編輯，肽合成原理，第2版，Springer-Verlag，紐約，1993，此處引入作為參考)，參照此處的公開可為本領域普通技術人員所理解。將每一線與肽溶液溫育數(shù)分鐘至數(shù)小時的時間，這可根據(jù)肽充分浸潤線上可得的結合位點的需要。
吸干肽包被的線，使之不含過量DMSO溶液，然后與混合的戊烷或等同物一起溫育，將肽沉淀于線表面。于室溫或約60℃-70℃下(真空或非真空)干燥肽包被的線。將每一線的身分和其固定化肽目標物質(zhì)的序列記錄于數(shù)據(jù)庫。然后，于諸如0.1-1M Tris(pH7.0)或磷酸緩沖鹽液(pH7.0)、諸如120mM氯化鈉、2.7mM氯化鉀和10mM磷酸鹽(獲自Sigma化學有限公司，St.Louis，MO，美國)洗滌肽包被的線，以從線上除去未結合的肽。室溫下或約60℃-70℃下(真空或非真空)再次干燥線。
然后，根據(jù)記錄在數(shù)據(jù)庫中之線束中每一線的位置及其結合的肽，通過將線平行并彼此相鄰地排列裝配肽包被的線的線束。通過將其包埋于下列基質(zhì)中穩(wěn)定線束，這些基質(zhì)如聚甲基丙烯酸酯、環(huán)氧樹脂、聚乙二醇、石蠟、橡膠、聚丙烯酰胺和其它材料，可優(yōu)選地于高溫下以液體形式處理，或以適于包埋線的非聚合形式處理。使包埋的線硬化，或使其交聯(lián)以賦予線束剛性結構。
在一個優(yōu)選實施方案中，通過用基質(zhì)不能滲透的諸如明膠、蔗糖或聚乙烯醇的物質(zhì)包被線，以防止線被包埋基質(zhì)完全浸滲或隔絕固定化的肽。通過將帶有固定化的肽之線于含有約0.01％-約10％重量百分比的所述物質(zhì)之溶液中濕潤，并在被包埋入基質(zhì)前使線干燥來實現(xiàn)這一點。
然后用顯微切片機或類似儀器以垂直于線長軸的方式切割穩(wěn)定化的線束，產(chǎn)生優(yōu)選地具有厚度約為0.1至100μm的多個高密度陣列。每一所得高密度陣列具有位于陣列上特定空間區(qū)域或區(qū)帶的相同肽模式。
這種肽陣列的一種用途，是從樣品中檢測抗體分析物，樣品中的抗體至少可結合于陣列上的一種肽目標物質(zhì)。檢測抗體分析物存在與否的方法是通過在適當條件下于足以使抗體分析物與肽發(fā)生結合的一段時間中將樣品與陣列溫育。洗滌除去未結合的樣品。根據(jù)本領域技術人員知曉的技術用生物素化第二抗體及標記的鏈親和素(如堿性磷酸酶標記、熒光素標記或金標記的鏈親和素)檢測結合的抗體。參考數(shù)據(jù)庫，確立顯示結合的區(qū)帶上肽目標物質(zhì)的身分。結合表明存在具有針對區(qū)帶上的肽的表位結構域之抗體。如樣品來自患者血清，這種結合可為接觸或感染某種生物的證據(jù)。
實施例3 帶有浸滲于膜上的DNA的高密度陣列的制備及用途根據(jù)本發(fā)明制備目標物質(zhì)的高密度陣列的方法用于從如下浸滲于膜上的DNA制備陣列。使用斯坦福大學(Palo Alto，California，美國)的酵母屬基因組數(shù)據(jù)庫作為用于鑒定天然存在的基因組序列的信息來源。使用這些信息，從酵母基因組中隨機選取了16個具有相似熔解溫度的寡核苷酸作為目標物質(zhì)。每一序列在28-35個核苷酸之間，根據(jù)公開于Gait，M.J.編輯，寡核苷酸合成實用指南，IRL出版社，Oxford，1984中的方法用標準氰乙基氨基亞磷酸酯化學方法合成。每一目標物質(zhì)序列在3’端具有100個胸苷以促進寡核苷酸向膜的結合。見如，Erlich，Henry，A.和Bugawan，Teodorica，L.，II類HLA基因多態(tài)性基因分型、進化、和于疾病易感性的關系，PCR技術DNA擴增的原理及應用，Stockton出版社，紐約，193-208，1989，此處全文引入作為參考。標記為#1至#16的16個目標物質(zhì)分別溶解于焦碳酸二乙酯處理過的水中至終濃度為10微克/微升。
使用具有容積為11微升儲液槽的加樣尖施加目標物質(zhì)，其中儲液槽與加樣尖通過小容積導管連接。使用加樣尖于20cm×20cm的HybondTMN+帶電膜(Amersham，Arlington Heights，IL，美國)上以約1mm至3mm的間距劃目標物質(zhì)線。用一種Eppendorf2-10微升加樣器以10.5微升前16個目標物質(zhì)的溶液填注加樣尖儲液槽。
將第一張膜(#1膜)置于潔凈平整的臺面，其中在膜與臺面之間放置的制造商包裹中以一張大于膜的蠟紙用做分隔物。排列加樣尖使得毛細導管的兩側(cè)均接觸到距膜邊緣1cm的蠟紙，使用尺作為引導，手工在蠟紙和膜上平滑劃動加樣尖，劃出與膜的一個邊緣平行的目標物質(zhì)的直線。目標物質(zhì)溶液從加樣尖移出，在劃出約12-16cm長的線后耗盡。在第一張膜上對每一目標物質(zhì)溶液重復這一循環(huán)，直至#1膜含有相互間隔約1mm至3mm的不同DNA目標物質(zhì)的16條平行線。
重復這一步驟再制備兩張膜#2膜和#3膜，除了順序三次施加每一種DNA目標物質(zhì)，在#2膜和#3膜上得到總共48條目標物質(zhì)平行線。在所有膜上標記目標物質(zhì)的每一條線用于鑒別。
含有目標物質(zhì)DNA線的膜空氣干燥約2小時，然后通過使用Stratagene 2400 Stratalinker(Stratagene，La Jolla，CA，美國)應用1200微焦耳的UV電磁輻照35秒進行交聯(lián)。從含有目標物質(zhì)線前導邊緣的膜的邊緣開始，從三張膜的每一張中切下寬約2cm長約20cm的條帶，使目標物質(zhì)線與條帶的2cm邊緣平行。
使用標準技術制備互補于目標物質(zhì)#1和#7的序列的放射性標記的DNA探針。使用標準技術試圖在放射性標記的探針與從#1膜制備的陣列之間進行雜交?？傊?，根據(jù)制造商指示，用γ-32P-ATP(ICN放射化學公司，Irvine，CA，美國)使用Ready-to-go KinaseTM試劑盒標記DNA寡核苷酸。根據(jù)制造商指示，用NickTM柱(Pharmacia)純化標記的探針，稀釋至約1×106cpm/ml。
根據(jù)制造商指示，用10毫升HyperHybTM緩沖液(Research Genetics，Inc.Huntsville，AL，美國)在Mini-6TM(Hybraid，Ltd.，Middlesex，英國)雜交爐中42℃各自預雜交和雜交一小時。用10毫升1x SSC，0.01％十二烷基硫酸鈉(SDS)42℃下洗滌15分鐘，共進行3次，完成雜交后的洗滌。最終的洗滌在100毫升1x SSC(0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉，pH7.2)，0.01％SDS(Sigma)中42℃下洗滌15分鐘。在10毫升1x SSC緩沖液中進行最后漂洗。室溫下空氣干燥膜1-2小時。
室溫下，將陣列與BiomaxTMMS或MR x-射線膠片(Eastman Kodak，Rochester，NY，美國)接觸進行放射自顯影約0.5-4小時，直至獲得期望的影像強度。所有與陣列上適當?shù)哪繕宋镔|(zhì)雜交的探針證明，DNA目標物質(zhì)已結合到膜上，可用于探查，且這種探查可得到特異性的確定的雜交結果。
然后，如下使用#1膜、#2膜和#3膜之剩余的20cm×18cm部分制備陣列。將膜浸入3％硬骨魚類明膠(Sigma)的去離子水溶液中，室溫下溫育過夜以封閉膜。再將膜于600毫升去離子水中洗滌三次，除去未結合的明膠。將膜于兩層903吸水紙之間(Schleicher and Schuell，Keene，NH，美國)吸去過量水分，室溫下空氣干燥過夜。
從#1膜、#2膜和#3膜三張膜每一張上以垂直于目標物質(zhì)線的方式切割2cm×20cm的條帶，使2cm邊緣與目標物質(zhì)線平行。將每一條帶沿平行于目標物質(zhì)線的軸緊緊卷曲，制備使未施加目標物質(zhì)的膜部分為圓柱體最內(nèi)部的一種圓柱體。使用透明指甲油封閉3mm寬的自由條帶邊緣以防止圓柱體松開。每一圓柱體浸入1.25cm×7.5cm的塑料球中，其中灌注了根據(jù)制造商指示制備的非聚合LR WhiteTM軟包埋基質(zhì)(Sigma)，直到圓柱體被基質(zhì)充分浸滲。然后將每一圓柱體置于灌注有基質(zhì)的球的底部，居中并使之于60℃聚合過夜。移出每一含有經(jīng)包埋的圓柱體的球，置于環(huán)境溫度，觀察到聚合完全。
然后通過以垂直于其長軸的方式，即垂直于每一目標物質(zhì)線的長軸反復切割每一包被的圓柱體，制備厚度約10μm的多個陣列。使用DK-10型手動顯微切片機(Edmund Scientific，Barrington，NJ，美國)完成切割。
使用標準技術制備互補于目標物質(zhì)#1和#7的序列的放射性標記的DNA探針。使用標準技術試圖在放射性標記的探針與從#1膜制備的陣列之間進行雜交?？傊?，根據(jù)制造商指示，用γ-32P-ATP(ICN放射化學公司，Irvine，CA，美國)使用Ready-to-go KinaseTM試劑盒標記DNA寡核苷酸。根據(jù)制造商指示，用NickTM柱(Pharmacia)純化標記的探針，稀釋至約1×106cpm/ml。
根據(jù)制造商指示，用10毫升HyperHybTM緩沖液(Research Genetics，Inc.Huntsville，AL，美國)于1.5毫升螺帽離心管中在Mini-6TM(Hybraid，Ltd.，Middlesex，英國)雜交爐中42℃各自預雜交和雜交一小時。每次用1.5ml 1x SSC，0.01％十二烷基硫酸鈉(SDS)42℃下洗滌15分鐘，共進行3次，完成雜交后的洗滌。最終的洗滌在100毫升1x SSC(0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉，pH7.2，Research Genetics)，0.01％SDS緩沖液(Sigma)中42℃下洗滌15分鐘。在10毫升1x SSC緩沖液中進行最后漂洗。室溫下空氣干燥陣列約15-30分鐘。室溫下，將陣列與BiomaxTMMS或MR x-射線膠片(Eastman Kodak，Rochester，NY，美國)接觸，進行放射自顯影約0.5-4小時，直至獲得期望的影像強度。制備顯色的放射自顯影照片。
使用標準技術試圖在放射性標記的探針與從#1膜制備的陣列之間進行雜交。所有與陣列上適當?shù)哪繕宋镔|(zhì)雜交的探針證明，DNA目標物質(zhì)已結合到膜上，可用于探查，且這種探查可得到特異性的確定的雜交結果。
如下測試陣列的功能。使用互補于目標物質(zhì)#1的放射性標記的DNA探針探查由膜#2制備的陣列。參考圖15，可見所得放射自顯影結果的照片。由此可見，探針與含有目標物質(zhì)#1的陣列上三個區(qū)帶之間發(fā)生雜交，與表示剩余15個DNA目標物質(zhì)的其它45個區(qū)帶的交叉雜交極小。因此，該陣列證明同時具有用于雜交研究的功能性和特異性。
然后，使用互補于目標物質(zhì)#1和#7的放射性標記的DNA探針探查由膜#3制備的陣列。參考圖16，可見所得放射自顯影結果。由此可見，探針與陣列上六個區(qū)帶之間發(fā)生雜交，與表示剩余14個DNA目標物質(zhì)的其它42個區(qū)帶的交叉雜交極小。
盡管參照特定的實施例，已十分詳細的討論了本發(fā)明，但其它實施方案也是可能的。因此，所附權利要求的范圍不應局限于此處所描述的
權利要求
1.一種制備目標物質(zhì)的高密度陣列的方法，包括切割目標線的線束的步驟；其中目標線包括目標物質(zhì)；其中在線束中每個目標物質(zhì)的位置均記錄于數(shù)據(jù)庫，其中切割得到高密度陣列。
2.權利要求1的方法，其還包括穩(wěn)定線束的步驟。
3.權利要求1的方法，其還包括向線束中摻入其它材料的步驟。
4.權利要求1的方法，其還包括檢查高密度陣列的步驟。
5.權利要求1的方法，其中在切割步驟中的至少一種目標物質(zhì)選自鋅、硫、金、多核苷酸、DNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂類、免疫球蛋白、病毒、染色體、線粒體、原核細胞、古細菌、真核細胞；金屬合金、陶瓷、玻璃、半導體、超導體、塑料、聚合材料、木材、織物和凝結物。
6.權利要求1的方法，其中在切割步驟中的線束包含如下目標線，其選自目標物質(zhì)的澆鑄棒、吸附于玻璃纖維上的目標物質(zhì)、吸附于絲線上的目標物質(zhì)、結合于聚合物纖維上的目標物質(zhì)、包埋于多孔棒中的目標物質(zhì)、包被于金屬絲上的目標物質(zhì)、含于明膠基質(zhì)中的目標物質(zhì)、刻劃于玻璃載玻片上的目標物質(zhì)線、刻劃于膜上的目標物質(zhì)線以及結合于管內(nèi)側(cè)的目標物質(zhì)。
7.權利要求1的方法，其中切割是用選自顯微切片機、激光、鋸和熱線的切割裝置進行。
8.權利要求1的方法，其中進行切割使所得高密度陣列具有從0.1μm至1.0mm的厚度。
9.權利要求1的方法，其中進行切割使所得高密度陣列具有大于50μm的厚度。
10.權利要求2的方法，其中通過將線束包埋于選自環(huán)氧、聚丙烯和聚苯乙烯的材料進行穩(wěn)定。
11.權利要求3的方法，其中其它材料選自抗氧化劑、微生物抑制劑、非熒光計數(shù)染料、第二種酶以及反射性物質(zhì)。
12.權利要求4的方法，其中檢查步驟包括選自可見光檢查、化學沉積、電子探查、機械感應、磁感應的活動，且測量由于高密度陣列上的目標物質(zhì)與叉指型電極之間的相互作用造成的電容改變。
13.一種根據(jù)權利要求1的方法生產(chǎn)的高密度陣列。
14.權利要求13的高密度陣列，其中目標物質(zhì)存在于一個笛卡爾坐標軸上。
15.權利要求13的高密度陣列，其中目標物質(zhì)存在于兩個笛卡爾坐標軸上。
16.權利要求13的高密度陣列，其中目標物質(zhì)存在于三個笛卡爾坐標軸上。
17.一種通過切割包含多個目標線的線束制備的目標物質(zhì)的高密度陣列，其中多個目標線包含目標物質(zhì)，其中在線束中每個目標物質(zhì)的位置記錄于數(shù)據(jù)庫。
18.權利要求17的高密度陣列，其中至少一種目標物質(zhì)選自鋅、硫、金、多核苷酸、DNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂類、免疫球蛋白、病毒、染色體、線粒體、原核細胞、古細菌、真核細胞；金屬合金、陶瓷、玻璃、半導體、超導體、塑料、聚合材料、木材、織物和凝結物。
19.權利要求17的高密度陣列，其中線束包含如下目標線，其選自目標物質(zhì)的澆鑄棒、吸附于玻璃纖維上的目標物質(zhì)、吸附于絲線上的目標物質(zhì)、結合于聚合物纖維上的目標物質(zhì)、包埋于多孔棒中的目標物質(zhì)、包被于金屬絲上的目標物質(zhì)、含于明膠基質(zhì)中的目標物質(zhì)、刻劃于玻璃載玻片上的目標物質(zhì)線、刻劃于膜上的目標物質(zhì)線以及結合于管內(nèi)側(cè)的目標物質(zhì)。
20.權利要求17的高密度陣列，其還包含選自環(huán)氧、聚丙烯和聚苯乙烯的材料。
21.權利要求17的高密度陣列，其還包含選自抗氧化劑、微生物抑制劑、非熒光計數(shù)染料、第二種酶以及反射性物質(zhì)。
22.權利要求17的高密度陣列，其中目標物質(zhì)存在于一個笛卡爾坐標軸上。
23.權利要求17的高密度陣列，其中目標物質(zhì)存在于兩個笛卡爾坐標軸上。
24.權利要求17的高密度陣列，其中目標物質(zhì)存在于三個笛卡爾坐標軸上。
25.權利要求17的高密度陣列，其具有從0.1μm至1.0mm的厚度。
26.權利要求17的高密度陣列，其具有大于50μm的厚度。
27.一種確證基因序列、檢測遺傳突變存在與否、定量或定性檢測基因產(chǎn)物差異表達、繪制引發(fā)免疫應答的表位序列的圖譜、或鑒定用于藥物開發(fā)的化合物的方法，包括提供根據(jù)權利要求13的高密度陣列的步驟。
28.一種確證基因序列、檢測遺傳突變存在與否、定量或定性檢測基因產(chǎn)物差異表達、繪制引發(fā)免疫應答的表位序列的圖譜、或鑒定用于藥物開發(fā)的化合物的方法，包括提供根據(jù)權利要求17的高密度陣列的步驟。
全文摘要
一種制備目標物質(zhì)的高密度陣列的方法，包括切割一束目標線的步驟，其中目標線包含目標物質(zhì)，其中切割得到多個高密度陣列，此外，本發(fā)明方法可包括額外的步驟，如穩(wěn)定化目標線或線束，向高密度陣列中摻入一種或多種其它材料，及檢查高密度陣列。同樣，制備了根據(jù)本方法的高密度陣列。
文檔編號G01N37/00GK1677079SQ20051006883
公開日2005年10月5日 申請日期1998年5月19日 優(yōu)先權日1997年9月11日
發(fā)明者J·R·小哈德森, E·P·道森 申請人:生物風險公司